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8/2/2019 iodisponibilidad_flavonoides_cerveza_73

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Febrero 2005Dra. Victoria Valls BellsDra. Pilar Codoer FranchDra. M Luisa Gonzlez San-JosDra. Pilar Muiz Rodrguez

Biodisponibilidadde los flavonoides de

la cerveza. Efecto

antioxidante in vivo

Departamento de Pediatra, Obstetricia y GinecolFacultad de Medicina. Universidad de Vale

Departamento de Biotecnologa y Ciencia de los AlimeFacultad de Ciencias. Universidad de Bu


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Biodisponibilidad de los

flavonoides de la cerveza.

Efecto antioxidante in vivo

Este trabajo ha sido dirigido por el siguiente grupo de investigacin:

Dra. Victoria Valls Bells

Dra. Pilar Codoer Franch

Departamento de Pediatra, Obstetricia y Ginecologa. Facultad de Medicina.

Universidad de Valencia

Dra. M Luisa Gonzlez San-Jos

Dra. Pilar Muiz Rodrguez

Departamento de Biotecnologa y Ciencia de los Alimentos. Facultad deCiencias. Universidad de Burgos


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Ttulo:

Biodisponibilidad de los flavonoides de la cerveza. Efecto antioxidante in viv

Autores:

Este trabajo ha sido realizado por el siguiente grupo de investigacin:

Dra. Victoria Valls Bells

Dra. Pilar Codoer Franch

Da. M Carmen Torres Rodrguez

Da. Laura Boix GarcaDr. Roberto Hernndez Marco

Da. Ana Beln Lpez Jan

Departamento de Pediatra, Obstetricia y Ginecologa.

Facultad de Medicina. Universidad de Valencia

Dra. Pilar Muiz Rodrguez

Dra. M Luisa Gonzlez San-JosDa. M Dolores Rivero Prez

Departamento de Biotecnologa y Ciencia de los Alimentos.

Facultad de Ciencias. Universidad de Burgos


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SUMARIO

INTRODUCCIN ........................................................................................6

1.1. Composicin de la cerveza...............................................................6

1.2. Estrs oxidativo y defensa antioxidante...........................................13

1.3. Dieta y estrs oxidativo.................................................................30

1.4. Actividad antioxidante de la cerveza ...............................................32

1.5. Efecto sobre el metabolismo de los xenobiticos: Adriamicina ...........38

MATERIALES Y MTODOS .........................................................................44

2.1. Materiales ...................................................................................442.2. Mtodos .....................................................................................45

2.3. Anlisis Estadstico ......................................................................60

RESULTADOS ..........................................................................................61

3.1. Ensayos In Vitro ........................................................................61

3.2. Ensayos In Vivo en animales de experimentacin ..........................68

3.3. Estudios en humanos con hiperlipemia............................................87

3.4. Conclusiones................................................................................93

BIBLIOGRAFA ...................................................................................97

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INTRODUCCI

La cerveza es una bebida de baja graduacin alcohlica, que resulta de f

mentar, mediante levadura seleccionada, el mosto procedente de malta de

bada, aromatizado con flores de lpulo. Este mosto puede tambin mezcla

con otros productos amilceos transformables en azcares por digestin en

mtica o coccin. Los constituyentes de la cerveza provienen por tanto de

cuatro principales materias primas: malta, lpulo, agua y levadura.

1.1.1. AGUA

Es el componente ms abundante en la cerveza representando aproxima

mente el 90% de ella. El agua se utiliza para preparar el mosto y su com

sicin es de gran importancia para la calidad y caractersticas de la cerve

Las sales que contiene el agua modifican el pH de la malta y del mosto, y p

ello son necesarios tratamientos previos para adecuarlas a las condiciones

elaboracin.

1.1.2. ETANOL Y OTROS ALCOHOLES

El etanol se produce durante la fermentacin del mosto por accin de las

vaduras, ejerciendo una gran influencia sobre el aroma y el sabor de la cer

za. Su concentracin depende del extracto de mosto inicial, oscilando entr

y 6 %(v/v), en las cervezas comunes (Bulinski et al., 1986).

Durante la fermentacin, adems de etanol se producen cantidades va

bles de alcoholes superiores como el 3-metilbutanol, 2-metilbutanol, 2-me

propanol y 2-feniletanol. Los alcoholes superiores se forman por desami

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1.1. COMPOSICIN DE LA CERVEZA


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cin o descarboxilacin de los aminocidos del mosto, o bien por sntesis a

partir de carbohidratos. La produccin de estos alcoholes vara notablemente

con las diferentes cepas de levaduras formndose en mayores cantidades a al-

tas temperaturas.

1.1.3. CARBOHIDRATOS

La proporcin de carbohidratos es de 3-5%, aunque en muchas cervezas fuer-

tes la cantidad es mayor. El 75-80% del total son dextrinas, que provienen de

la degradacin enzimtica del almidn por accin de las enzimas de la malta.El resto de los carbohidratos son azcares sencillos como ribosa, arabinosa, xi-

losa, glucosa, fructosa y galactosa; disacridos como maltosa e isomaltosa;

trisacridos como panosa, isopanosa y maltotriosa. Adems existen pequeas

cantidades de glicerol y mioinositol. Tambin aparecen b-glucanos que ejercen

una accin estabilizadora de la espuma. Estos compuestos proceden de la pa-

red celular del endospermo del grano de cebada y su concentracin vara en-

tre 50 y 700 mg/L (Sendra et al., 1989).

1.1.4. COMPUESTOS NITROGENADOS

Los compuestos nitrogenados representan entre 0,15-0,7%, y proceden fun-

damentalmente de las protenas del material de partida y de las levaduras

(Hough et al., 1982). Gran parte de las protenas se degradan durante el

malteado, originando aminocidos y pptidos solubles. Las protenas de alto

peso molecular son las responsables del enturbiamiento en fro, mientras que

los aminocidos presentes en el mosto sirven de nutrientes a las levaduras,

siendo el ms importante el cido glutmico por su influencia en el sabor de

la cerveza.

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1.1.5. CIDOS

El cido actico es el mayoritario en la cerveza comprendiendo del 40 al 80%

los cidos totales. Su nivel vara considerablemente y tiene una gran influen

sobre el pH final de la cerveza (4,7 en una cerveza oscura fuerte y 4,1 en una c

veza rubia). Est producido por las levaduras durante el proceso fermentativo

puede provenir de la oxidacin del etanol, si bien esto ltimo es poco proba

por las condiciones del medio. Tambin aparecen pequeas cantidades de c

carbnico, cido lctico, frmico, succnico y 9,10,13-trihidroxioctadecanoic

9,12,13-trihidroxioctadecanoico, procedentes de la malta o de la actividad tablica de la levadura.

1.1.6. LPIDOS

La cerveza contiene una pequea proporcin de lpidos a partir de la malta y

lpulo as como resultantes del metabolismo de la levadura en el proceso de

mentacin. Fundamentalmente son cidos grasos (0,33-0,76 mg/L), mono, d

triglicridos (en conjunto hasta 0,4 mg/L), junto a trazas de esteroles y fosfpidos. El contenido de lpidos en las materias primas es bastante superior, p

se elimina durante el proceso de elaboracin, de tal forma que el producto fi

slo contiene las cantidades reseadas.

1.1.7. SALES MINERALES

El contenido de sales minerales representa el 0,3-0,4%, siendo los principales

potasio y los fosfatos. Adems pueden encontrarse calcio, magnesio, hierro, c

ruros, sulfatos, carbonatos y silicatos. Tambin se ha descrito la presencia de h

rro, plomo, cobre, cinc y estao que producen turbidez en la cerveza.

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La mayora de estos componentes proceden exclusivamente de las materias pri-

mas de partida, especialmente de la cebada malteada y de los cereales usados

como adjuntos. Sin embargo, tanto la actividad de la levadura como el proceso de

elaboracin modifican la relacin de estos compuestos en la cerveza (Casares et

al., 1979).

1.1.8. SUSTANCIAS AROMTICAS

Un gran nmero de sustancias, provenientes de distintos orgenes, contribuyen al

sabor y aroma de la cerveza.Estos compuestos aromticos pueden proceder de la malta, originados durante

el horneado, como los productos de Maillard. Los compuestos voltiles producidos

en esta etapa son principalmente compuestos heterocclicos como carbonilos, fu-

ranos y piranos como el maltol y derivados, que proporcionan el aroma al maltea-

do. Los compuestos N-heterocclicos, entre los que estn las pirazinas y pirroles,

tambin estn presentes. Los derivados de la prolina como las pirrolidinas, azepi-

nas y oxacina de malta son importantes por su amargor. Tambin es probable en-

contrar intermediarios de la reaccin de Maillard, tales como el 5-hidroximetil-2-furaldehdo, la metilreductona y los a-dicarbonilos. Durante el malteado se origina

la S-metilmetionina (SMM), un importante compuesto del aroma en la cerveza la-

ger. La SMM es el precursor del dimetilsulfuro (DMS), el cual se forma durante la

coccin del mosto encontrndose en una concentracin de 30-100 g/L. Otros

compuestos responsables del aroma y del sabor provienen del lpulo, como las

isohumulonas que proceden de la isomerizacin de las humulonas durante la coc-

cin del mosto. Estos compuestos proporcionan un sabor amargo. Los aceites esen-

ciales del lpulo confieren diferentes aromas como el humulenol II, los diepxidos

de humuleno y, en menor grado, los monoepxidos de humuleno y elterpineol

que son los que confieren aroma a hierbas y a especias.

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Un tercer grupo de compuestos aromticos son los originados durante la f

mentacin, como son los steres que poseen fuertes aromas afrutados. Los s

res de mayor relevancia son el acetato de etilo, acetato de isobutilo, caproato

etilo y acetato de 2-feniletilo, que son productos secundarios del metabolis

anaerobio de los azcares.

1.1.9. VITAMINAS

La cerveza contiene pequeas cantidades de vitaminas del grupo B, tiamina,

boflavina, cido pantotnico, piridoxina, biotina, cianocobalamina y niaciTambin contiene cido flico y sus derivados (folatos). Estas vitaminas proced

de la malta, y su contenido aumenta en la germinacin de la cebada, no dest

yndose durante el tostado (Piendl, 1990).

1.1.10. COMPUESTOS FENLICOS

Provienen mayoritariamente de la malta, y en menor medida del lpulo, e incid

en las caractersticas sensoriales y funcionales de la cerveza (Sendra y Carbon1999). Son principalmente cidos fenlicos como el glico, cinmico, cumri

vainllico y ferlico y flavonoides de varios tipos, como los flavanoles o fam

de las catequinas, las leucoantocianidinas, las chalconas y los antocianos en

los que estn la pelargonidina y la malvidina (estos ltimos slo presentes en c

vezas elaboradas con frutas rojas), los flavonoles como el kaempferol y la qu

cetina, y las isoflavonas como la daidzena y la genistena. Tambin aparec

compuestos ms complejos como los taninos siendo los ms importantes las p

antocianidinas de diverso grado de polimerizacin, los galotaninos y los lignan

Sin embargo, el contenido final no depende slo de las materias primas, sino q

tambin influye el proceso de las distintas etapas de elaboracin. As, los con

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nidos finales de fenoles descritos en la bibliografa varan entre 150 y 350 mg/L

(Narziss et al., 1972), destacando por su abundancia las proantocianidinas (has-

ta 100 mg/L), seguido de las catequinas (hasta 20 mg/L) y de los otros grupos de

flavonoides y de los lignanos y elagitaninos (hasta 10 mg/L).

1.1.11. MELANOIDINAS

Las melanoidinas son compuestos formados en los alimentos durante su trata-

miento trmico. Se originan mediante las reacciones de Maillard entre los grupos

amino de los pptidos y protenas y los grupos aldehdo del azcar (Vernin y Par-kanyi, 1982).

Esta reaccin consta de tres etapas. La etapa inicial, en la que se produce la

condensacin entre un compuesto carbonlico y un grupo amino en medio cido

(Namiki, 1988). A partir de esta condensacin se origina una glicosilamina N-sus-

tituida, y posteriormente una serie de compuestos denominados de Amadori

(ARPs). Los productos de Amadori juegan un papel importante en el desarrollo del

sabor y color de muchos productos tratados trmicamente (Van den Ouweland et

al., 1978).La segunda etapa sera una intermedia de descomposicin de los reactivos de

Amadori para dar lugar a una serie de molculas voltiles y otras no voltiles de

bajo peso molecular.

La ltima etapa es aqulla en la que muchos de los compuestos formados du-

rante la etapa intermedia tales como los derivados enaminol, los anlogos de az-

car de bajo peso molecular y productos carbonlicos insaturados sufren reacciones

de polimerizacin para dar lugar a polmeros pardos o melanoidinas como produc-

to final de la reaccin (Hodge, 1953; Namiki, 1988).

En resumen, de la reaccin de Maillard se obtienen al menos dos grandes gru-

pos de compuestos, unos de peso molecular inferior a 1.000 Da y las melanoidi-

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nas con un peso molecular superior variable desde 5.000 a 100.000 Da (Ho

mann, 1998).

En la mayora de los pases las bebidas como cerveza o vino son una parte

tegral de la dieta. La cerveza es una bebida muy popular en Espaa con una

gesta de aproximadamente 150.4 mL de cerveza por da/por persona (Pulido

al., 2003). Los efectos positivos de la cerveza sobre la salud estn asociadas

presencia de compuestos como antioxidantes, minerales, vitaminas, fibra y ba

niveles de etanol. En la tabla 1 se presentan la composicin nutricional de la c

veza publicada por Bamforth et al. (2002) donde se observa el contenido de

taminas B as como de cido flico y de selenio. Por otro lado la relativa relacpotasio sodio (4:1) est aconsejada con una dieta baja en sodio. Asimismo,

demos observar el contenido de calcio.

Tabla 1. Composicin nutricional de la cerveza

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Rango por L de cerveza

Energa (Kcal) 150-450Protena (g) 3-5Carbohidratos (g) 0-61

Vitamina C (mg) 30Tiamina (mg) 0,003-0,08Riboflavina (mg) 0,02-0,8Niacina (mg) 3-8Vitamina B6(mg) 0,07-1,7Folato (g) 40-600Vitamina B12(g) 3-30

Rango por L de cervez

Biotina (g) 2-15Calcio (mg) 40-140Fsforo (mg) 90-400

Magnesio (mg) 60-200Potasio (mg) 330-1.100Sodio 40-230Hierro (mg) 0,1-0,5Zinc (mg) 0,01-1,48Selenio (g)


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Aparte de los valores nutricionales de esta bebida, hay que considerar sus

propiedades funcionales y, de entre ellas, su actividad antioxidante; por tan-

to determinados componentes de la cerveza juegan un importante papel ante

el estrs oxidativo.

Los principales radicales libres son las especies oxignicas reactivas del ox-

geno (ROS) y del nitrgeno (RNS). Entre estas especies reactivas cabe destacar

los radicales como el in superxido (O2.-), radical hidroxilo (.OH), alcoxilo

(RO.), peroxilo (ROO.) y xido de nitrgeno (NO.) y los no radicales como el pe-rxido de hidrgeno (H2O2), oxgeno singlete (1O2) y peroxinitrito (ONOO

-).

Junto a los radicales del oxgeno existen otros derivados o centrados en

tomos de hidrgeno, carbono, nitrgeno, azufre, cloro, etc., que indiscuti-

blemente contribuyen a la propagacin y mantenimiento de nuevas reaccio-

nes que conducen a la formacin de radicales.

Estas especies reactivas se pueden generar endgenamente:

1. A travs de la cadena de transporte de electrnico mitocondrial. La reduc-

cin monovalente de la molcula de oxgeno da lugar a la formacin de la

mayora de estos compuestos y constituye la principal fuente generadora

de ROS (Figura 1). Sin embargo, el 95% del oxgeno que respiramos es re-

ducido a H2O por la accin de la citocromo oxidasa-a-3, ltimo eslabn de

la cadena de transporte electrnico, mediante un mecanismo en el que

participan cuatro centros redox, proporcionando, adems, la principal

fuente de energa (ATP) al organismo. Tambin se puede formar el O2.- a

nivel del complejo I y del complejo quinona-semiquinona-ubiquinol (Q10)

que actan como aceptor de electrones (Figura 1).

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1.2. ESTRS OXIDATIVO Y DEFENSA ANTIOXIDANTE


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Figura 1. Generacin de especies oxignicas reactivas (ROS) en la reduccin mono

lente del oxgeno y en la cadena de transporte electrnico

2. Transporte electrnico no fosforilante, el retculo endoplsmico, es decir, la fr

cin microsomal de la clula, contiene sistemas de transporte electrnico no f

forilante. Dicho sistema participa en diversas reacciones de hidroxilacin y de

turacin que pueden tener carcter biosinttico o degradativo (Figura 2).

Figura 2. Sistema hidroxilante microsomal heptico (Mataix y Battino, 2002)

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NADHNAD

Succinato Fumarato

Pi + ADP

H2O + ATP

I

IIFADH2

III IV

CoQCyt c

H2 O2, HO.

H2 O2, HO.

O2.-

H2 O2HO.

O2

O2.-

O2 O2.-

e- e- e- e-

2H+ H+OH-

H2 O2 H2 OHO.

O2.- O2

S-OH + H2

P450

S

NADPH

NADP+

NADPHCitocromo P450 Reductasa

(esteroidescidos graso

NADPHCitocromo P 450 Reductasa

FAD

FADH2

O2.-

P450-S

Fe2+

O2

P450-S

Fe3+

1e-

1e-

1e-

P450-S

Fe2+

P450-S

Fe3+


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3. Las clulas fagocitarias (neutrfilos, monocitos o macrfagos) utilizan el sistema

de la NADPH oxidasa generando directamente O2.- (Figura 3). Por otra parte, di-

chas clulas tambin generan xido ntrico (NO), por accin de la xido ntrico

sintasa sobre la arginina intracelular, como mecanismo de defensa. La combina-

cin del O2.- con el NO da lugar a la formacin del ONOO- capaz de inducir pero-

xidacin lipdica en las lipoprotenas (Nathan and Xie, 1994).

Figura 3. Sistema oxidante en las clulas fagocitarias

4. La autooxidacin de compuestos de carbono reducido como los aminocidos, pro-

tenas, lpidos, glcidos y cidos nucleicos, da lugar tambin a la formacin de es-

tos compuestos.

5. La activacin cataltica de diversas enzimas del metabolismo intermediario ce-

lular, como la hipoxantina y xantina oxidasa, aldehdo oxidasa, monoamino

oxidasa, ciclooxigenasa originan tambin radicales libres (Halliwel and Gutte-

ridge, 1989).

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O2 Arginina

O2.- NO.

SOD

NO Sintasa

H+

Catalasa

Radiacin

CTE

(Reduccin -)e

H2O2

O2

H2O

.OH

LP

RHRROO.

ONOO-

NO3-.OH + NO2

Fe+2 libre


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Como ejemplo en la figura 4 se puede observar la generacin de ROS a partir

la xantina oxidasa. Durante la isquemia se suprime el aporte de oxgeno, lo q

implica una inhibicin en la cadena de transporte electrnico. Una de las v

que se utiliza como alternativa para el suministro de energa es el ciclo de

purin nucletidos, mediante la activacin del enzima adenilato quinasa. A c

secuencia de una serie de variaciones electrnicas se produce una hipercalce

que conduce a la activacin de varias proteasas citoplasmticas que transform

la xantina DHasa en santina oxidasa, la cual en presencia de O2 formar el O

(Figura 4).

Figura 4. Esquema de la conversin de xantina deshidrogenasa en xantina oxid

Los agentes exgenos tambin pueden contribuir a un incremento de los

dicales libres. Por ejemplo, el humo del tabaco, radiacin electromagntica,

solar, ozono, xenobiticos, contaminantes, aditivos, etc.

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ATP

AMP

HX HX

XDH XO

X X

XDH XO

cido rico

2ADP

AK

AK= Adenilato kinasaHX= HipoxantinaX= XantinaXDH= Xantina DHasa

XO= Xantina Oxidasa

O2

O2.-

NAD+

NADH

O2

O2.-

NAD+

NADH

Proteasa

Proteasa


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A bajas concentraciones, estos radicales libres son necesarios para el buen fun-

cionamiento celular pudiendo actuar como segundos mensajeros, estimulando la

proliferacin celular y/o actuando como mediadores para la activacin de las c-

lulas. Sin embargo, en los procesos como fagocitosis, infeccin, inflamacin, o so-

breexposicin a un ambiente estresante pueden acumularse hasta niveles txicos,

producindose diversas acciones sobre el metabolismo de los principios inmedia-

tos, que pueden ser el origen del dao celular.

Frente a la accin txica de los radicales libres los organismos han desarrolla-

do numerosos mecanismos de defensa conocidos como antioxidantes que permi-

ten su eliminacin o transformacin en molculas estables (Davies, 1995).Los sistemas biolgicos estn en un estado de equilibrio entre prooxidantes y

la capacidad antioxidante de los sistemas biolgicos (Sies, 1985). El desequilibrio

a favor de la accin prooxidante es lo que se conoce como estrs oxidativo. De

hecho, el dao oxidativo solamente se produce cuando los mecanismos oxidantes

superan la capacidad de los sistemas de defensa. Por lo tanto, la supervivencia de

las clulas aerbicas precisa de mecanismos que contrarresten los efectos negati-

vos de los radicales libres donde los sistemas antioxidantes permitan mantener un

balance favorable entre los productos deletreos y antioxidantes celulares.

1.2.1. DAO OXIDATIVO A BIOMOLCULAS

Son muchas las especies oxignicas que actan como oxidantes biolgicos. La ca-

pacidad de cada radical o especie oxignica reactiva viene determinada, desde el

punto de vista qumico, por cuatro caractersticas bsicas como son: reactividad,

especificidad, selectividad y difusibilidad. El HO2. es el mayor reductor, la simple

adicin de un protn da lugar a la formacin de O2.-, convirtindose en un agen-

te oxidante muy activo, selectivo y especfico (Figura 5). El O2.- no es particular-

mente reactivo con lpidos, glcidos o cidos nucleicos y exhibe reactividad limi-

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tada con determinadas protenas. Esta evidencia constata que el O2.- reacci

con protenas que contienen metales en su grupo prosttico. El OH., sin emb

go, reacciona con cualquier molcula que tenga cerca, sin especificidad algun

el peligro radica en la importancia funcional del compartimento celular en el q

se origina o la molcula a la que ataque. As pues, si ataca al DNA puede prod

cir o generar graves alteraciones. Por el contrario, si la produccin del radical

ne lugar en un entorno como el plasma y la molcula daada es una enzima

se encuentra presente en gran cantidad, el dao biolgico real ser prcticam

te imperceptible. Los tres componentes con mayor capacidad de difusin son O

< H2O2 < OH., capaces de reaccionar con molculas que se encuentran alejadel lugar de origen incluso con capacidad de atravesar membranas celulares.

Figura 5. Reactividad de las especies oxignicas reactivas

Las especies oxignicas reactivas producen diversas acciones sobre el metabo

mo de los principios inmediatos, que pueden ser el origen del dao celular, as ac

an (Figura 6):

1. Sobre los lpidos poliinsaturados de las membranas produciendo prdida de f

dez y lisis celular como consecuencia de la peroxidacin lipdica. La peroxidac

lipdica se inicia tras la abstraccin de un tomo de hidrgeno en la cadena

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O2.- + H+ + e- HO2.

O2.- + HO2. H2O2 + O2

HO2. + HO2. + H+ H2O2 + O2

O2.- + O2.- + H+ H2O2 + O2

O2.- + H2O2 OH. + OH- + O2


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drocarbonada de los cidos grasos poliinsaturados, cuya estructura vinilo-metano

representa la diana y lugar de iniciacin del proceso peroxdico. En un ambiente

aerobio se produce interaccin del radical carbonilo (R.) con el O2 dando lugar a

la formacin del ROO.. Posteriormente puede sustraer un nuevo H (reaccin se-

cuencial) y puede dar lugar al ROOH que por descomposicin formar el radical al-

coxilo (RO.). A este primer proceso acontece una serie de reacciones de propaga-

cin y terminacin para dar finalmente productos ms estables, como el malon-

dialdehido (MDA) y otros productos carbonados que son eliminados de las clulas

(Halliwell y Gutteridge, 1989).

2. Sobre la molcula de colesterol, produciendo hidroperxidos de colesterol y oxis-

teroles que estn implicados en la aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares.

3. Sobre los glcidos, alterando las funciones celulares tales como las asociadas a la

actividad de las interleuquinas y la formacin de prostaglandinas, hormonas y neu-

rotransmisores.

4. Sobre las protenas, produciendo inactivacin y desnaturalizacin.

5. Sobre los cidos nucleicos, mediante la modificacin de bases produciendo muta-

gnesis y carcinognesis (Griffith, 1988). Las alteraciones oxidativas interrumpen

la transcripcin, traslacin y replicacin aumentando el nmero de mutaciones.

Por otra parte, el aumento de dao oxidativo es un proceso natural que en con-

diciones fisiolgicas normales produce una modificacin en las bases, siendo su

relacin de 1/130000 bases en el DNA nuclear y 1/8000 en el DNA mitocondrial,

puesto que se encuentra ms prximo a los lugares de generacin de ROS. El sis-

tema reparador del DNA esta constituido por endonucleasas y gliosilasas. Estas ba-

ses oxidadas se han encontrado en orina lo que nos indica que sufren un proceso

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de escisin y excrecin del DNA oxidado in vivo. En la actualidad, son muc

las bases modificadas que se pueden detectar mediante tcnicas de HPLC con

teccin electroqumica, pero una de las ms estudiadas e indicativa de dao o

dativo es la 8-hidroxideoxiguanosina. (Demple and Harrison, 1994).

Figura 6. Dao inducido a biomolculas

Este dao oxidativo a macromolculas ha sido implicado en distintas enferm

dades, y an no siendo el factor que inicia la enfermedad, su progresin puede vse influida significativamente como consecuencia del estrs oxidativo. Entre las

tologas en las que estn implicados los radicales libres estn mutagnesis, tra

formacin celular, cncer, arteriosclerosis, infarto de miocardio, procesos de isq

mia/reperfusin, diabetes, asfixia del neonato, enfermedades inflamatorias, tr

tornos del sistema nervioso central, envejecimiento, etc. Un 70% de estas enf

medades crnicas se pueden prevenir a travs del control de los radicales libres a

gurando los niveles ptimos de antioxidantes y de "barredores" (scavengers)

radicales libres a travs del aporte de antioxidantes naturales presentes en la di

(vegetales, legumbres, bebidas, o productos derivados de ellos, etc.) y evitando

exposicin innecesaria a agentes contaminantes ambientales y xenobiticos.

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PROTENASLPIDOS DNA

PEROXIDACIN DEGRADACIN Y DESACTIVACIN MUTACIN

PROBLEMAS CARDIOVASCULARES

Dao a las membranas y componetes celulares,tales como las lipoprotenas

Especies oxignicas reactivas


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1.2.2. DEFENSA ANTIOXIDANTE

No cabe duda que todos los sistemas biolgicos en ambientes oxigenados han de-

sarrollado mecanismos de defensa, tanto a nivel fisiolgico como bioqumico. Los

sistemas antioxidantes se encuentran prcticamente en la totalidad de las clulas

aerbicas en mayor o menor cantidad; su misin consiste en disminuir la produc-

cin de especies reactivas.

En su definicin del termino "antioxidante", Halliwell y Gutteridge (1989) lo

definieron como cualquier sustancia que presente a bajas concentraciones, cuan-

do se compara con su sustrato oxidable, disminuye significativamente o inhibe laoxidacin. Un buen antioxidante se caracteriza por su alta efectividad, su varia-

bilidad operativa y versatilidad para poder combinarse con una importante varie-

dad de especies radicales libres. As pues, entre los sistemas antioxidantes cabe

destacar:

1. A nivel fisiolgico: El sistema microvascular, cuya funcin es mantener los ni-

veles tisulares de O2, siempre dentro de presiones parciales relativamente ba-

jas.

2. A nivel bioqumico: La defensa antioxidante puede ser enzimtica, no enzi-

mtica as como sistemas reparadores de molculas.

1.2.2.1. SISTEMA ENZIMTICO

Los organismos aerobios han desarrollado enzimas antioxidantes tales como: su-

perxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatin peroxidasa (GPx) y DT-diafo-

rasa. La SOD es la responsable de la reaccin de dismutacin del O2.- a H2O2, que

una reaccin posterior catalizada por la catalasa o GPx detoxificar formando H2O

u n o

21


22/107

u n o

y O2. La catalasa se encuentra principalmente en los peroxisomas, y su princi

funcin es eliminar el H2O2 generado en la beta-oxidacin de los cidos gras

mientras que la GPx degradar el H2O2 citoplasmtico. La DT-diaforasa, cataliza

reduccin de quinona a quinol y participa en la reduccin de drogas de estruc

ra quinnica (Davies, 1995; Muiz et al., 2000) (Figura 7).

1.2.2.2. SISTEMA NO ENZIMTICO

Un segundo grupo de antioxidantes son los de naturaleza no enzimtica, entre

que se agrupan diversos tipos de molculas, cuya accin defensiva dependeralgunos casos de una interaccin directa sobre la especie reactiva para ren

complejos estables o de menor reactividad. Entre ellos se encuentran los antio

dantes endgenos como el glutation, el cido rico y ciertas protenas plasm

cas (ceruloplasmina, ferritina).

El glutation reducido (GSH) es un tripptido compuesto de cistena, cido g

tmico y glicina. Su distribucin es universal al estar presente tanto en teji

de plantas como animales y juega un papel principal en la proteccin celular c

tra los efectos txicos de los radicales libres. Est presente en las clulas prinpalmente en su forma reducida, y gran parte de sus funciones se deben a la p

sencia del grupo tilico reducido que le confiere la cistena y que promueve

estabilidad intracelular. En la defensa celular contra los radicales libres tiene

papel importante como antioxidante, al ser capaz de interaccionar y estabili

radicales hidrxilo, superxido, H2O2 y perxidos lipdicos, adems de regene

otros antioxidantes (-tocoferol) y donar hidrgenos para reparar el DNA daa

Por otra parte, acta de cosustrato de enzimas antioxidantes como la glutat

peroxidasa. Adems de ser un antioxidante endgeno tambin es exgeno, ya

el GSH de la dieta puede ser parcialmente absorbido en el intestino delgado,

como ser sintetizado de novo (Figura 7).

22


23/107

Figura 7. Esquema de la generacin de ROS y defensa antioxidante

Un segundo grupo de antioxidantes no enzimticos son los de origen exgeno pro-

venientes principalmente de la dieta como vitaminas (C, E, carotenoides), flavonoi-

des, melanoidinas, selenio, etc.

La Vitamina E est considerada como el principal antioxidante secuestrador de ra-dicales lipoflicos in vivo en fase lipdica y en la parte externa de las lipoprotenas,

por tanto, opera a nivel de membranas o lipoprotenas. Se conocen 8 homlogos, alfa,

beta, gamma, delta-tocoferoles y tocotrienoles y su accin antioxidante viene dada

por el grupo OH del anillo aromtico de la vitamina que puede experimentar reac-

ciones de oxidacin. Una de sus funciones ms importantes es la inhibicin de la pe-

roxidacin lipdica, actuando de scavenger del radical peroxilo (Figura 8). Otra re-

accin importante es la reduccin del radical del-tocoferol por otros antioxidantes

como la vitamina C, CoQ y glutation (GSH) y esto es muy importante ya que regene-

ra o ahorra vitamina E y tambin reduce el carcter prooxidante del radical de vita-

mina E (Brigelius-Floh and Traber, 1999; Abudu et al., 2004). De esta forma, prote-

u n o

23

Sistemas reparadores

"Scavengers"

Sistema enzimticoantioxidante

Dao a DNA y Protenas

O2.-

OH.

ROO.

ROOHO2

.-

Activacin

H2O2

NO ONOO-

1O2

Vit E

Vit E.Vit C.

Vit C

GSSG

GSSG

GSH

NADPH

NADP

HexosasROH

GPx(Se)

GR(Riboflavina)

(Mg, Zn, Folato, Vit. B12,riboflavina, niacina)

Ubiquinol(cido lipico)

Vitamina AVitamina CCarotenoidesFlavonoides

IsoflavonoidesMelanoidinasEtc,

Activacincarotenoides

Licopeno-caroteno

Dienos conjugadosEpxidosCarbonilos

SOD(Cu/Zn, Mn)

Catalasa

(Fe)GPx(Se)

H2O

Fe, Cu

DIETA


24/107

u n o

ge a las clulas de la peroxidacin de membranas y su posterior degeneracin, im

de el dao oxidativo de LDL, protenas celulares, y DNA (Topinka, 1989) (Figura

Una dieta deficiente de vitamina E est relacionada con una reduccin de la act

dad de catalasa heptica, GSH peroxidasa, y glutation reductasa, induce la peroxi

cin lipdica en hgado y causa desrdenes cardiovasculares y neurolgicos. La v

mina E tambin puede actuar de prooxidante. Segn la teora que apoya la func

prooxidante, sta produce una peroxidacin en la LDL y facilita la transferencia d

reaccin de los radicales de la fase acuosa al interior del ambiente lipdico. Para in

tivar esta peroxidacin mediada por el-tocoferol, son necesarios los adecua

agentes reductores, llamados coantioxidantes, siendo los ms eficaces el cido ascbico en ambientes hidroflicos y el CoQ en los hidrofbicos (Muller, 1990; Carr, 200

Figura 8. Esquema de la actividad antioxidante y prooxidante de la vitamina E

Vitamina C o cido ascrbico es una vitamina hidrosoluble que se encuentra

una concentracin muy elevada en numerosos tejidos y plasma. Es uno de los an

xidantes ms potentes en fase acuosa, que acta a nivel extracelular y citoslico.

acciona con el O2.-, H2O2, ROO., .OH y 1O2 oxidndose a dehidroascorbato (Dhre

et al., 2001). Acta sinrgicamente con otros scavengers como la vitamina E o el G

24

Prooxidante

ROO.

PL

cido ascrbicoQH2

ROOH

-tocoferol

Radicaltocoferoxilo

Ascorbato

Radicaldehidroascorbato

GSH

GSSG

QH2

QH.

LDL LDL


25/107

para regenerarlos, al reducirlos volvindolos a su estado activo. La absorcin est en

funcin de la ingesta, mayor ingesta menor absorcin y viceversa. Tambin puede ac-

tuar de prooxidante en presencia de metales de transicin (Cu, Fe), generndose el ra-

dical hidroxilo. Este efecto prooxidante del cido ascrbico no tiene lugar, normal-

mente, in vivo dado que en situaciones no patolgicas no hay cobre ni hierro libres

en los fluidos extracelulares (Chen et al., 2000; Gaetke and Chow, 2003) (Figura 9).

Figura 9. Esquema de la actividad antioxidante y prooxidante de la vitamina C

Carotenoides se dividen en dos grupos, compuestos hidrocarbonados y las xantofi-

las. Los carotenos como el o -carotenos o el licopeno contienen solo tomos de car-

bono e hidrgeno, mientras que las xantofilas como la criptoxantina, cantaxantina y la

lutena tienen al menos un tomo de oxgeno en su estructura. Debido a la presencia

de mltiples enlaces conjugados, los carotenoides y en particular los 4-oxo derivados

tales como astaxantina y cantaxantina actan como captadores de radicales libres. Son

u n o

25

NADPH

GSSG

NADP

NADH

NAD

2GSH

DHA reductasa

Dao celular

DHA

ASC

ASCDHA

H2O2 ROOH

O2.-

Fe2+

Fe3+

ROO.

H2O2

OH.

H2O + ROH

prooxidante

antioxidante


26/107

u n o

eficientes antioxidantes contra el oxgeno singlete y los radicales perxido, contri

yendo de este modo al sistema de defensa antioxidante lipoflico del organismo.

presencia de radicales peroxilos finaliza la cadena oxidativa, siempre y cuando se m

tengan las presiones parciales de O2 bajas; si la presin parcial no es baja prosigue

proceso oxidativo. Por tanto las condiciones fisiolgicas determinan el carcter de

tioxidante o prooxidante de estos compuestos (Young and Lowe, 2001) (Figura 10

Figura 10. Esquema de la actividad antioxidante y prooxidante de la vitamina A

El cido lipoico como lipoamida, es considerado como un antioxidante idea

universal, se obtiene a partir de la dieta y es antioxidante frente a una elevada ctidad de radicales libres (hidroxilo, cido hipocloroso, oxgeno singlete) en med

lipdicos y acuosos. Tiene adems actividad quelante de metales y acta sinrg

mente con otros antioxidantes.

Los compuestos fenlicos, entre ellos los flavonoides, son un grupo de s

tancias naturales que se encuentran en el reino vegetal. Se han descubierto ms

4.000 especies diferentes de flavonoides, encontrndose en frutas, verduras, se

llas, tallos y flores y son, por tanto, constituyentes importantes de la dieta hum

na. Los flavonoides ms abundantes en la dieta son los flavanoles (catequinas, p

antocianidinas), las antocianinas y los productos de oxidacin derivados de el

La principal fuente de polifenoles son: frutas y bebidas (zumos de frutas, vino,

y cerveza) y en menor cantidad, verduras, legumbres y cereales.

26

ROO.

ROOH

ROO.

O2

VIT. A

VIT. A.VIT. A-OO. (prooxidante)

Producto final no reactivo

pO2

pO2


27/107

Como media, una dieta mixta occidental proporciona aproximadamente 1 g de fla-

vonoides por da. Estructuralmente los flavonoides son derivados benzo--pironas, su

estructura bsica es de difenilpiranos: dos anillos bencenos unidos a travs de un ani-

llo pirona o pirano heterocclico (Bravo, 1998). La estructura qumica de los com-

puestos fenlicos es la que les confiere su capacidad para actuar como captadores de

radicales libres (Heim et al., 2002). El tipo de compuesto, el grado de metoxilacin

y el nmero de grupos hidroxilo son algunos de los parmetros que determinan su ac-

tividad antioxidante. As, segn Rice-Evans et al. (1996) los compuestos con mayor

actividad son aqullos que presentan dos grupos hidroxilo en posicin orto en el ani-

llo B, lo que confiere una alta estabilidad al radical que se forma despus de la re-accin de captura del radical libre; los que contienen un doble enlace 2,3 en conju-

gacin con el 4-oxo (C=O) en el anillo C, y aquellos compuestos que tienen grupos

OH- en 3 y 5 y el grupo oxo (C=O) en 4 en los anillos A y C. Se combinan con az-

cares para formar glicsidos, siendo sta la forma ms habitual en la que se encuen-

tran en la naturaleza, sin embargo, se ha visto que los agliconas muestran una acti-

vidad antioxidante ms elevada que sus correspondientes glicsidos (Figura 11).

Poseen actividad antioxidante tanto en sistemas hidroflicos como lipoflicos y el

mecanismo de la actividad antioxidante parece ser doble, actuando como captadoresde radicales libres y teniendo capacidad de quelar iones metlicos. As, se ha obser-

vado que pueden actuar de dadores de hidrgenos o quelar iones metlicos como el

hierro y el cobre, impidiendo la oxidacin de las lipoprotenas de baja densidad (LDL),

las cuales estn implicadas en la patognesis de las enfermedades coronarias (Hertog

et al., 1997), inhiben la agregacin plaquetaria (Hubbard et al., 2003) y protegen al

DNA del dao oxidativo. En experimentacin animal se ha estudiado el efecto de la

epicatequina en hepatocitos aislados de rata y se ha observado que inhiben la pero-

xidacin lipdica y aumentan la viabilidad celular (Valls et al., 2002). Asimismo, la ca-

tequina previene de los efectos txicos del antineoplsico adriamicina, y la fraccin

de flavonoides de la cerveza, tanto rubia como negra, disminuye la oxidacin de lpi-

dos y protenas, al mismo tiempo que aumenta la viabilidad celular en clulas hepti-

u n o

27


28/107

OH

OH

OH

OH

R3

R5

Flavonoles(quercitina, mirecitina,

kaempferol)

O

O

OH

OH

OH

OH

Flavonoles(catequina, epicatequina)

O

O

OH

OH

OHIsoflavonas

(daidzeina, genisteina)

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

OH O

OH

OH

R3

R5

R4

Flavononas(naringenina, hesperetina)

O

O

OH

OHOH

OH

Flavonas(luteonina, apigenina)

O

O

OH

OH

OH

OH

R5O+

Antocianidinas(cianidina, pelargonidina,

malvidina)

R6

OR4

OH

R3

R3

R5

R5 R4R3

OA C

B

OH

OH

OHOH O

OHOH

OH

OHOH O

Procianidinas

u n o

cas tras la induccin de un estrs oxidativo producido por ella (Gonzlez San-Jos

al., 2001). Por otra parte, estos compuestos presentes en la dieta pueden favore

la defensa de antioxidantes endgena a travs de los elementos de respuesta a

tioxidantes (ARE) encontrados en los promotores de algunos genes, que son indu

bles por el estrs oxidativo. Algunos quimiopreventivos cancergenos se piensa

actan a travs de los ARE, al incrementar los antioxidantes y la detoxificacin.

Figura 11. Estructura qumica de los flavonoides

28


29/107

Tambin se ha comprobado que los flavonoides de forma combinada presentan

mayor poder antioxidante que de forma aislada. Recientemente se ha observado que

los flavonoides estimulan la P-glicoprotena, la cual participa en el mecanismo de de-

fensa celular contra de la accin de los xenobiticos.

Las melanoidinas son otro grupo de sustancias con actividad antioxidante que

est presente de forma importante en determinados alimentos (caf, malta, bollera,

cerveza) siendo ingeridos en cantidades considerables en la dieta habitual, con una

media de ingesta del orden de varios gramos por da. Son unos pigmentos marrones,

polmeros formados principalmente a partir de las interacciones entre carbohidratos

y compuestos que poseen un grupo amino libre (aminocidos, pptidos y protenas)a travs de la reaccin de Maillard. sta es una de las reacciones ms importantes en

cambios qumicos de los componentes de los alimentos durante el almacenaje y pro-

cesado de los mismos, donde como producto final se forman las melanoidinas (Fried-

man, 1996). Entre los distintos efectos fisiolgicos se han descrito que poseen acti-

vidad antimicrobiana, anti/mutagnica, anti/tumorales, antioxidantes y prooxidan-

tes, producen supresin de crecimiento celular tumoral e inhibicin de enzimas di-

gestivas. Su papel como antioxidante in vivo no es conocido aunque distintos es-

tudios in vitro apoyan su papel beneficioso como antioxidante del radical hidroxi-lo, superxido y peroxilo, actan adems como quelantes de metales como el zinc y

el cobre. Chuyen et al. (1998) observaron que los niveles de peroxidacin lipdica en

hgado de ratas wistar alimentadas durante 6 semanas con alimentos ricos en mela-

noidinas (miso) eran inferiores a los del grupo control. En una lnea similar, nuestro

grupo de investigacin (Valls et al., 2004), utilizando melanoidinas procedentes de

sntesis, a partir de glucosa-glicina, encontr efecto como antioxidante frente a la

toxicidad inducida en hepatocitos aislados de rata por el agente antitumoral adria-

micina. Se observ una disminucin en los niveles de TBARS y en los niveles de LDH

liberados al medio extracelular, a la vez que se produca un incremento en los nive-

les de ATP. Otros estudios mostraron el papel protector de los productos de Maillard

u n o

29


30/107

u n o

contra el dao oxidativo al ser capaz de inhibir la oxidacin de las lipoprotenas

baja densidad (LDL) humanas in vitro (Dittrich, et al., 2003).

En definitiva, todos estos antioxidantes provienen de la dieta directa o indir

tamente.

1.2.2.3. SISTEMAS REPARADORES

Directo: Reduccin de los grupos (S-S) de los aminocidos azufrados de las prot

nas por enzimas especficos como la disulfuro reductasa y la sulfxido reductasa

Indirecto: En primer lugar, se reconoce el dao molecular siendo ste eliminad

degradado, y en segundo lugar, se sintetiza la parte eliminada. Esto ocurre tanto

las protenas oxidadas y peroxdicos lipdicos de las cadenas carbonadas como en

oxidaciones del DNA y RNA.

La composicin de la dieta juega un papel importante en el estrs oxidativo ya

puede contribuir tanto en el dao oxidativo, como sobre los mecanismos de defe

antioxidante. Esto explica, al menos en parte, la relacin entre dieta y algunas

fermedades crnicas como son la aterosclerosis y el cncer. Ms de 2.000 estud

epidemiolgicos muestran que la mayora de los efectos protectores contra una

riedad de enfermedades principalmente cardiovasculares y cncer, estn correlac

nados con una elevada ingesta de frutas y verduras. Tradicionalmente, la nutricin

ha reconocido como un factor importante en la modulacin de distintas enferme

des y de la longevidad. La dieta, particularmente a travs de la fruta, vegetales, f

tos secos y bebidas procedentes de vegetales tales como la cerveza y el vino, ap

30

1.3. DIETA Y ESTRS OXIDATIVO


31/107

tan antioxidantes como vitaminas y otros fitoqumicos, los cuales son una importan-

te fuente exgena capaz de aumentar la respuesta celular al estrs oxidativo.

Los estudios realizados con suplementos farmacolgicos de antioxidantes en el ser

humano, en contraste con los datos obtenidos en la experimentacin animal, no

muestran una evidencia consistente sobre los efectos beneficiosos de esta suplemen-

tacin. Segn los estudios llevados a cabo en la Unin Europea en el proyecto EU-

ROFEDA, 2002 (Lindsay and Astley, 2002), en el cual se han llevado a trmino y/o re-

copilado muchos estudios epidemiolgicos sobre suplementacin farmacolgica de

antioxidantes, concretamente sobre vitaminas tales como la vitamina E, C y beta-ca-

roteno, se plantean problemas en cuanto a la relacin causa-efecto, ya que la mayo-ra de estudios son a largo plazo y estn interferidos por patologas crnicas o agu-

das. Adems, hay que tener en cuenta que el abuso de suplementos es peligroso de-

bido a su posible papel como prooxidantes. Por otra parte, faltan estudios prospecti-

vos y controlados. Por tanto, la falta de datos no permite la recomendacin de forma

sistemtica de suplementos de antioxidantes.

Sin embargo,en los estudios epidemiolgicos de Gey et al. (WHO/Proyecto Mni-

ca, 1991), donde determinaron los antioxidantes plasmticos (-tocoferol, ascorba-

to, vitamina A, carotenoides y selenio) en 16 poblaciones europeas, la incidencia demortalidad por cardiopata isqumica muestra una relacin inversa con el nivel de -

tocoferol (P=0,002). Los estudios realizados sobre ingesta de frutas y vegetales en Eu-

ropa pone de manifiesto la alta diferencia en el consumo entre el norte y sur de Eu-

ropa. Estos estudios han demostrado una menor incidencia de enfermedades cardio-

vasculares y cncer, en los pases del sur de Europa, donde se consume una dieta me-

diterrnea, en relacin a los pases nrdicos, efecto atribuido en la hiptesis de par-

tida a las vitaminas. Hoy se sabe que las frutas y verduras contienen otros compues-

tos, incluso con mayor actividad antioxidante que las vitaminas, los flavonoides

(Vant Veer et al., 2000). En el estudio Rotterdam se investig la relacin entre el

consumo alimentario de flavonoides y vitaminas antioxidantes y el riesgo de acciden-

u n o

31


32/107

u n o

te cerebrovascular (ACV) isqumico durante un promedio de 6 aos, observnd

que un alto consumo alimentario de antioxidantes est asociado con un menor rie

de ACV. Ha sido epidemiolgicamente demostrado que un elevado aporte diettico

frutas y vegetales produce una reduccin del 50% en el riesgo de cnceres digesti

y de las vas respiratorias (Lindsay and Astley, 2002). Estos estudios avalan la hi

tesis de que los antioxidantes naturales procedentes de los alimentos pueden pro

ger a las clulas del estrs oxidativo.

Adems, debemos tener presente que no todos los efectos son debidos a las v

minas antioxidantes y flavonoides, sino que en los alimentos se encuentran ot

compuestos que contribuyen de forma indirecta a la reduccin de estas patologcomo por ejemplo: los niveles elevados en plasma de homocistena son un factor

riesgo para las enfermedades cardiovasculares, en cambio los folatos reducen los

veles de homocistena en plasma, as pues el folato procedente de la dieta contri

ye indirectamente a la reduccin del riesgo de enfermedades cardiovasculares.

La actividad antioxidante de la cerveza juega un papel crucial en la estabilidad de

sabor, a la vez que retarda o previene los procesos de oxidacin y contribuye pos

vamente sobre la salud al actuar como scavenger de radicales hidroxilo y perox

Adems tiene actividad quelante de metales, inhibiendo las reacciones de Fento

Haber-Weiss, los cuales son importante fuentes de radicales oxignicos activos. S

distintos los trabajos que sealan la elevada capacidad antioxidante de la cerv

como donador de hidrgeno, y su elevado poder reductor y actividad quelante (Go

zlez San-Jos et al., 2001; Lugasi et al., 2003).

El contenido de antioxidantes en la cerveza est influenciado por factores ge

ticos y medio ambientales de su materia prima y tambin es el resultado de los p

32

1.4. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA CERVEZA


33/107

cesos tecnolgicos durante la elaboracin de la misma, los cuales determinan las ca-

ractersticas de las distintas variedades de cerveza (negra, rubia o sin alcohol). Entre

los componentes de la cerveza que estn implicados en la actividad antioxidante es-

tn: compuestos fenlicos, cidos fenlicos (ferlico, glico o sirngico), flavonoles,

catequina, procianidinas, taninos y calconas (Lugasi, 2003), carotenoides y vitaminas

que, aunque muy abundantes en la materia prima, sus niveles se ven disminuidos a

consecuencia del procesamiento al que se ven sometidos, estando presentes en can-

tidades variables, y melanoidinas que se forman a partir de azcares y aminocidos

por la reaccin de Maillard resultado del tratamiento trmico.

Los mecanismos de absorcin gastrointestinal de los polifenoles no estn total-mente conocidos. Por su naturaleza hidroflica se piensa que tienen que estar impli-

cados transportadores de membrana que faciliten su absorcin, aunque en la actuali-

dad solamente se ha identificado un mecanismo de transporte activo dependiente de

Na+, implicado en el transporte de cidos fenlicos (Ader, 1996).

En el caso de los flavonoides, con excepcin de los flavanoles, se encuentran en

la forma glicosilada y la glicosilacin influye en su absorcin. Las agliconas pueden

ser absorbidas desde el intestino delgado (Hollman and Katan, 1999) y los glicsidos

que resisten la hidrlisis del estmago, no pueden ser absorbidos en su forma nativay deben de ser hidrolizados por las enzimas intestinales o por la microflora del colon

para ser absorbidos (Day et al., 2000). En muchos casos cuando la flora est implica-

da, la eficiencia de absorcin puede verse reducida porque tiene lugar una degrada-

cin de las agliconas que son liberadas en forma de cidos aromticos. Una excepcin

en cuanto a su absorcin son aquellos flavonoides conjugados con glucosa que pue-

den utilizar el sistema de transporte activo de la glucosa dependiente de Na+ (SGLT1)

a nivel del enterocito para ser absorbidos y posteriormente hidrolizados en el interior

de las clulas por una b-glucosidasa (Hollman, 1995; Day, 1998). Otra va implicada

en la hidrlisis de algunos glucsidos es por accin de una enzima glucosidasa que se

encuentra en la membrana de las microvellosidades de las clulas intestinales y cata-

u n o

33


34/107

u n o

liza la hidrlisis extracelular facilitando la difusin de las agliconas al interior de

clulas (Day et al., 2000).

Las proantocianidinas difieren de la mayora de los otros polifenoles por su na

raleza polimrica y alto peso molecular, lo cual limita su absorcin por cuanto los

gmeros de ms de tres unidades es improbable que sean absorbidos a nivel del

testino delgado en su forma nativa. Slo dmeros y trmeros son capaces de atra

sar el epitelio intestinal. As, las proantocianidinas, las cuales son los polifenoles m

abundantes de la dieta, se absorben en muy escasa cantidad, pero pueden ejercer

efectos localmente en el tracto gastrointestinal, o mediar su actividad a travs de

cidos fenlicos producidos resultado de la degradacin microbiana. Esta accin cal es muy importante, al estar el intestino particularmente expuesto a agentes o

dantes, y verse afectado por inflamaciones y degeneracin cancergena.

Las concentraciones de polifenoles pueden alcanzar cantidades elevadas a pa

de su absorcin intestinal, y dentro de los otros antioxidantes, slo los carotenoi

provenientes de la dieta estn presentes en el colon, ya que la vitamina C y E se

sorben en partes superiores del intestino.

Los efectos del conjunto del alimento sobre la biodisponibilidad de los polife

les no est estudiada, e interacciones entre polifenoles y otros componentes coprotenas y polisacridos pueden ocurrir, ocasionando interferencias en la absorci

Otros efectos ms indirectos de la dieta seran parmetros como el pH, la fermen

cin intestinal, excrecin biliar, etc. que pueden tener consecuencias sobre la abs

cin de los polifenoles. Esto hace que la medida de los efectos antioxidantes in vi

de un compuesto flavonoide simple sea difcil, excepto cuando tiene lugar a con

mo muy alto. Adems hay que tener en cuenta la mezcla o efecto sinrgico entre

distintos componentes presentes en alimentos que puede tener o no efectos ben

ciosos.

En cuanto al metabolismo de los antioxidantes procedentes de la dieta es

tenso y pueden actuar como sustratos de diferentes enzimas. Los compuestos

34


35/107

lifenlicos se modifican por enzimas de biotransformacin de la fase I y los de la

fase II que pueden cambiar considerablemente la funcin de un componente par-

ticular, al modificarlo para su eliminacin posterior o generando compuestos ms

bioactivos. La biotransformacin en el hgado por medio de reacciones de fase I

introducen o exponen grupos polares mientras que la que tiene lugar en el colon

mediante reacciones de fase II por los microorganismos, degrada los flavonoides

no absorbidos. Las reacciones de conjugacin de los grupos hidroxilo con el ci-

do glucurnico, sulfato, glicina o la metilacin son los pasos ms frecuentes en

la metabolizacin de los flavonoides (Stahl et al., 2002), afectando alguna de es-

tas reacciones a la capacidad antioxidante in vivo. La metilacin en la posicin3 de cianidina-3-glucosida y de la quercetina disminuyen la capacidad antioxi-

dante del metabolito. La conjugacin con glucurnido o sulfato puede afectar a

la capacidad antioxidante dependiendo de la posicin en la que tenga lugar la

conjugacin. Incluso se piensa que la quercetina se conjuga durante el proceso de

absorcin, y parece retener actividad antioxidante.

El transporte de los polifenoles en plasma est asociado a protenas. Los poli-

fenoles no se encuentran libres en sangre, siendo la principal transportadora la al-

bmina. La concentracin plasmtica de los polifenoles despus de un consumoelevado vara de acuerdo a la naturaleza y fuente de los polifenoles. Con respec-

to a la eliminacin de los metabolitos de los polifenoles puede seguir dos vas de

excrecin: la va biliar y la urinaria. Los metabolitos conjugados son principal-

mente eliminados por la bilis mientras que los monosulfatos principalmente por

orina.

Los polifenoles por su estructura presentan gran actividad antioxidante con

unos efectos metablicos importantes. Con una solubilidad intermedia entre la vi-

tamina C y la vitamina E es de esperar que acten en la interfase agua-lpido y

puedan estar implicados en la regeneracin oxidativa de ambas vitaminas. La glu-

curonidacin y sulfatacin de polifenoles ms hidroflicos, pueden afectar al sitio

u n o

35


36/107

u n o

de accin y a su interaccin con otros antioxidantes. Tambin pueden most

efectos indirectos sobre la salud porque son metabolizados por la misma va

algunos xenobiticos u hormonas endgenas. Boyle et al. (2000) realizaron un

tudio sobre el consumo de flavonoides presentes en alimentos como cebolla y

mate y sus efectos antioxidantes, y observaron que flavonoides glucosida

como la quercetina-glucosidada y isorhamnetina-glucosidada incrementaban

niveles en plasma despus de una ingesta de cebolla. Adems, este incremento

asoci con un incremento en la resistencia del DNA de los linfocitos a la escis

de cadena y a una disminucin de los niveles de la base modificada 8-hidroxi

deoxiguanosina en orina a las 4 horas de haber ingerido cebolla. El mismo esdio pero combinando tomate y cebolla observ que la presencia del flavono

quercetina en plasma se relacion con una disminucin en la oxidacin de ba

endgenas. Sin embargo, no se observaron cambios en los niveles de malond

dehido (MDA) en orina. Otros estudios llevados a cabo por Cao et al. (1998)

humanos encontraron que despus de una comida de fresas, espinacas o vino

salcoholizado (todos ellos alimentos ricos en antioxidantes de naturaleza fen

ca), la capacidad antioxidante en suero utilizando tres mtodos (el ORAC, Tro

y la habilidad de reducir el hierro) se vea incrementada. En otro estudio realido por Nagyova et al. (1998) se observ en vegetarianos que los TBARS en

LDL estaban reducidos y la capacidad antioxidante total en plasma incrementa

Los carotenoides: su absorcin va paralela a la de los lpidos, sufriendo

proceso de emulsificacin, incorporacin en micelas que por difusin pasiva

tran en los enterocitos principalmente a nivel del intestino proximal. Su tra

porte a los tejidos tiene lugar desde los enterocitos donde se incorporan en

quilomicrones y son transportados a la circulacin va sistema linftico.

Poco es conocido sobre la biodisponibilidad de las melanoidinas pero es

dios en ratas han permitido saber que se absorben a travs del tracto gastro

testinal. Con respeto a su biotransformacin, se cree que las enzimas de la f

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37/107

II facilitan el trnsito metablico de las melanoidinas formadas en los alimentos

(Faist and Erbersdober, 2001). Con relacin al mecanismo a travs del cual estos

compuestos pueden ejercer sus efectos a nivel celular no es conocido, pero a este

respecto sabemos que los compuestos de la reaccin de Maillard se absorben por

difusin y son captados en el hgado, rin, msculo y eliminados en la orina (Er-

bersdobler and Faist, 2001.) Por otro lado, distintos trabajos apuntan a que el

efecto de las melanoidinas en las clulas pueda estar mediado por los RAGE (re-

ceptor for advanced glycation end products) receptores que fueron originalmente

identificados y caracterizados basndose en la capacidad de unir los productos de

glicosilacin avanzada (AGEs).Una vez absorbidos estos compuestos presentes en la cerveza son capaces de

contribuir a la capacidad total antioxidante del plasma y posiblemente de otros

compartimentos del cuerpo reforzando las defensas contra el estrs oxidativo. As,

Ghiselli y colaboradores (2000) observaron que la cerveza induce a un incremen-

to significativo de la capacidad antioxidante del plasma. Otros estudios han mos-

trado que la cerveza presenta efectos antitumorales y antimutagnicos con capa-

cidad de inhibir carcinognesis de colon inducida en ratas (Nozawa et al., 2004).

Algunos estudios demuestran un efecto preventivo de la cerveza sobre la carcino-gnesis experimental, mostrando que la ingesta de cerveza disminuye los tumores

gastrointestinales inducidos por dietil-hidrazina en ratas y de los tumores indu-

cios con azoximetano (Hamilton 1987). La ingesta de cerveza tambin reduce la

presencia de aductos de DNA en hgado de ratn inducidos con Trp-p2 (Arimoto et

al., 1999).

Tenemos que tener presente que no todos los efectos son debidos a los antio-

xidantes, sino que en la cerveza se encuentran otros compuestos que contribuyen

de forma directa o indirecta a la prevencin de distintas patologas (Bamforth,

2002) como son por ejemplo el cido flico. El cido flico, aunque no acte como

antioxidante, juega un papel en la reparacin del DNA y es sabido que reduce los

u n o

37


38/107

1.5. EFECTO SOBRE EL METABOLISMODE LOS XENOBITICOS: ADRIAMICINA

u n o

niveles de homocistena en plasma. Mayer et al. (2001) han demostrado que

cerveza es una fuente de cido flico, llevando a la disminucin de homociste

contenida en sangre (la hiperhomocisteinemia es un factor de riesgo signific

vo para las enfermedades vasculares). La cerveza tambin es citada por ser

fuente de selenio o por su importante efecto diurtico mayor que el agua.

En la actualidad est bien establecido que diversos componentes de la dieta p

den afectar o modular enzimas que metabolizan drogas. Esta propiedad sugi

que componentes de los alimentos, como los flavonoides, pueden tener con

cuencias farmacolgicas, disminuyendo los efectos txicos de los xenobitico

facilita la eliminacin biliar y urinaria al incrementar su potencial hidroflico.

Estudios realizados con flavona, flavanona y tangeretina en la dieta de las

tas demuestran que inducen, de una manera dependiente de su concentracin

actividad de enzimas como las de alquilasas, GST y flucuronil transferasas. mismo tienen la capacidad de activar e inducir la sntesis de enzimas prima

implicados en el metabolismo de varios xenobiticos lipoflicos tales como ca

ngenos, drogas, insecticidas, etc. Quizs la actividad anticarcinognica de al

nos flavonoides est relacionada con su capacidad de inducir enzimas que me

bolizan los carcingenos (Middelton et al., 2000).

La adriamicina o doxorrubicina es un antibitico quinnico que pertenece

grupo de las antraciclinas (Figura 12). Clnicamente es usado como un pote

agente antineoplsico, que presenta actividad ante una gran variedad de cn

res humanos incluido linfomas, leucemias y tumores slidos. Los tumores que m

jor responden son el de mama, carcinomas de esfago, osteosarcoma, sarcoma

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39/107

Kaposi, y linfomas de Hodgking y no-Hodgking (Murphy, et al., 1995; Wienik et

al., 1992), estando su uso limitado por sus efectos secundarios agudos y crnicos

(Lefrak, 1973). Los efectos agudos tales como mielosupresin, naseas, vmitos

y arritmias son reversibles o clnicamente manejables. Sin embargo, los efectos se-

cundarios crnicos especialmente cardiomiopatas y posterior insuficiencia card-

aca son irreversibles y tienen mal pronstico. Adems, dichos efectos son dosis-

dependiente.

Figura 12. Estructura de la adriamicina

Se han propuesto diferentes mecanismos para explicar la accin citosttica y ci-totxica de este antibitico. Entre ellos se incluye la intercalacin en el DNA con la

consecuente inhibicin de la biosntesis macromolecular, dao en el DNA mediante

inhibicin de topoisomera II, interferencia con la separacin de las hebras de DNA

y con la actividad helicasa, formacin de radicales libres, etc. (Gewirtz, 1999; Sin-

gal, 1987).

En la actualidad se acepta que el estrs oxidativo y la produccin de radicales li-

bres, adems de estar implicados en el mecanismo de accin de la doxorrubicina o

adriamicina, en sus efectos antitumorales, tambin lo estn en los efectos cardio-

txicos. Un mecanismo a travs del cual este antibitico induce la formacin de ra-

dicales libres es resultado de su reduccin a semiquinona por el complejo I mito-

u n o

39

D

Me O

C

O O

O

B

OH

OH NH2

OH

OHA

O

O


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u n o

condrial (Davies and Doroshow, 1986) (Figura 13) o por el complejo P450 micro

mal (Goodmand and Hochstein, 1977) dando lugar a una liberacin del anin

perxido y perxido de hidrgeno, producindose finalmente una inactivacin en

cadena de transporte electrnico. Otra va de formacin de los radicales libres e

mediada por metales como el Fe o el Cu en estado oxidado, que reaccionan con

adriamicina y, a travs de una reaccin redox, reduce el oxgeno e induce la form

cin de especies oxignicas activas como el radical superxido, oxgeno singlet

perxido de hidrgeno (Wallace, 1986).

Figura 13. Ciclo redox de las antraciclinas

Estas ROS inducen el dao oxidativo resultado de la peroxidacin de los lpi

de membrana, inactivacin de enzimas crticos, inhibicin del DNA, RNA, lo que

plica una inhibicin en la funcin mitocondrial y finalmente dao celular ( Gut

ridge and Quinlan, 1985; Bagchi, 1995 ) (Figura 14).

40

NADHNAD+

Succinato FumaratoAT

H2OO2

CoQ

Cyt c

IVIIII

IIFADH2

H2 O2, HO.

O2O2.-

AntraciclinaRadical (A.)

Antraciclina (AH)

AD


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Figura 14. Esquema del dao oxidativo a los componentes mitocondriales

Este dao oxidativo a los distintos componentes celulares y el estado redox se

cree que es el suceso clave en el desarrollo de la toxicidad irreversible de la adria-

micina, lo cual limita su utilidad clnica en la terapia de enfermedades neoplsicas

(Bagchi et al., 1995).

A pesar de sus efectos txicos, la adriamicina se usa ampliamente por su graneficacia como anticancergeno. Habindose ensayado distintos antioxidantes como

proteccin, obteniendo diferentes resultados, entre ellos molculas como transferri-

nas, metallotioneina, deferrioxamina o bilirrubina, cido rico, etc. Otro grupo de

antioxidantes que se han estudiado son aquellos que derivan de la dieta como vi-

tamina E, vitamina C, vitamina A, coenzima Q, flavonoides etc (Quiles et al., 2002).

En la actualidad, se le presta un gran inters al grupo de los flavonoides debi-

do a sus propiedades como quelante y scavenger de radicales libres, que los ha-

cen ser considerados como protectores potenciales de la cardiotoxicidad causada por

la doxorrubicina. Adems de sus efectos beneficiosos sobre la salud es sabido que

pueden inhibir los efectos negativos de la doxorrubicina sin afectar a la actividad

u n o

41

MITOCONDRIA SANA MITOCONDRIA DAADA

DAO CELULAR

Nutrientesoxgeno

Matriz

Membranainterna ADN

Nutrientesoxgeno

Complejomolecular

maquinariaproductora de

energa

Especies oxigenativas reactivas

ATP

EORs

ATPADRIAMICINA


42/107

u n o

antitumoral, reduciendo as nicamente los efectos txicos. Entre los estudios r

lizados en este campo se encuentran los llevados a cabo por el grupo de van Ac

et al. (1997, 2000), que demostraron que flavonoides sintticos de la subclase

los flavonoles como el mono-HER (7-monohydroxietilrutoside) aportan una prot

cin dosis dependiente contra la cardiotoxicidad inducida en ratones por la do

rrubicina. Estos autores observaron que la administracin del flavonoide sintt

monoHer intraperitonealmente una hora antes de la doxorrubicina disminua sig

ficativamente la cardiotoxicidad del antibitico sin verse afectados sus efectos

titumorales. Sadzuka et al. (1997) observaron que el incremento en el nivel de

rxidos lpidos y las disminucin de la enzima antioxidante, glutation peroxidainducida por la doxorrubicina se ve normalizada por la accin combinada de fla

noides como la rutina y luteolina. De todas formas, no todos los flavonoides mu

tran un efecto cardioprotector, algunos incluso muestran toxicidad moderada po

mismos. Por lo tanto, adems de la capacidad antioxidante o quelante de es

compuestos es necesario que presenten otras caractersticas como baja citotox

dad, facilidad del transporte a travs de membrana, etc. Otros efectos tambin

lacionados con los flavonoides es su actividad antiproliferativa, o la capacidad

incrementar la actividad antitumoral de la doxorrubicina potenciando los efecquimioteraputicos de la droga (Bagchi, 2003).

El estado beneficioso frente a la toxicidad de la adriamicina tambin se ha

servado con extractos de compuestos de origen vegetal. En estudios con un extra

de proantocianidinas de semillas de uva (Ray et al., 2000; Bagchi et al., 2003)

observ que un pretratramiento a ratones con dicho extracto inhiba significati

mente la cardiotoxicidad inducida por la doxorrubicina, aprecindose una dismi

cin en la actividad de la creatina quinasa de suero, en el dao al DNA y camb

histopatolgicos en el tejido cardaco de ratn. Nuestro grupo de investigacin

cientemente valor los efectos de un extracto de cerveza sobre la citotoxicidad

la adriamicina en hepatocitos de rata. Los resultados mostraron que el extracto

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43/107

un buen agente citoprotector frente a la toxicidad de la adriamicina al inhibir el

dao a membrana, disminuir la liberacin de LDH, peroxidacin lipdica y el dao a

protenas en hepatocitos aislados de rata (Gonzlez et al., 2001).

Estos y otros estudios permiten postular que la ingesta de alimentos ricos en fla-

vonoides pueden llevar a cabo una disminucin de los efectos colaterales del agen-

te antitumoral.

En el presente trabajo hemos estudiado:

a. La composicin de los diferentes componentes de la cerveza que presentan acti-vidad antioxidante y el efecto de la cerveza en la inhibicin del ion superoxido.

b. Estudios in vitro sobre el material gentico.

c. Ensayos in vivo en animales de experimentacin:

1. Biodisponibilidad de los polifenoles tras la ingesta de cerveza.

2. Efecto de un concentrado de cerveza sin/con alcohol como suplemento die-

ttico evaluando su papel frente a la cardiotoxicidad y hepatotoxicidad indu-

cida por la adriamicina.

d. Estudios en humanos: efecto de la cerveza sin alcohol en pacientes con hiperli-

pemia.

u n o

43


44/107

d o s

MATERIALES Y MTODO

2.1.1. REACTIVOS

Los reactivos para las soluciones tamponadas, enzimas, coenzimas, DNA de timo

ternera, 8-Hydroxydeoxyguanosina (8-OHdG), cido L-ascrbico, cido glico, ca

quina 6-hydroy-2,5,7,8, -tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) son prop

cionados por Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA). La adriamicina fue suminis

da por Pharmacia-Upjohn (Milan, Italia), el N, N-dimethyl-p-phenylenediamine di

drochloride (DMPD) de Fluka (Seelze, Germany), la agarosa de Bio-Rad (RichmoCA, USA), disolventes y otros reactivos de ScharLau (Barcelona, Espaa) y Me

(Darmstadt, Germany). Los kits de antioxidantes totales son de Randox (United Ki

dom, BT29 4QY), los de la 8-OHdG y MDA+ HAE son de OXIS, (OXIS Health Produ

Inc. 6040 N Cutter Circle, Suite 317 Portland, OR 97217-3935 USA) y los de la

oxidada son de Biomdica Medizinprodukte (GMBH and Co KGA-1210, Wien). El ag

utilizada en todas las determinaciones es de grado Milli-Q (Millipore).

2.1.2. ANIMALES

Se utilizan ratas Wistar hembras de 3-4 meses de edad y peso comprendido entre 2

300 g, instaladas en jaulas individuales y condiciones apropiadas del animalario

clos de 12h/12h luz y oscuridad a temperatura de 22C), alimentadas con dieta

tndar IPM R-20 comercializada por Panlab (Barcelona, Espaa) y agua ad libitum

2.1.3. CERVEZA

Las cervezas que empleamos, tanto rubia como sin alcohol, estn comerci

zadas en Espaa. Se mantienen refrigeradas hasta su utilizacin, e inmedia

44

2.1. MATERIALES


45/107

mente, antes de ella, se procede a su anlisis para prevenir una posible oxida-

cin de los fenoles. Las muestras que se usaron como suplemento diettico se

obtienen a partir de una concentracin en vaco a una temperatura inferior a

35C (10 veces concentradas de la cerveza original).

2.2.1. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LAS CERVEZAS SEGN EL MTODO QUMICO DMPD

Se utiliza el mtodo de Fogliano et al. (1999). Este mtodo se basa en la capacidad

que tienen los polifenoles de reaccionar con los radicales libres. Se usa el N,N-dime-

til-p-fenilendiamina (DMPD) como reactivo, compuesto que, en presencia de un agen-

te oxidante, da lugar al radical DMPD con una coloracin prpura (medible a 505 nm).

La adicin de un agente antioxidante capaz de transferir hidrgeno provoca una de-

coloracin de la solucin. De este modo, la decoloracin del medio es proporcional a

la cantidad de agente antioxidante presente en l.

Se toma 1mL de cromforo y se aade 50 L de muestra o de patrn (vitamina Co Trolox). La reaccin tiene lugar a 25C, mantenindose en agitacin continua du-

rante 10 minutos. Tras este tiempo se procede a la medida del valor de la absorban-

cia a 505 nm (Af), determinndose adems el valor de absorbancia del cromforo ini-

cial (Ao). A partir de estos valores de absorbancia se define un parmetro que es el

porcentaje de inhibicin:

% Inhibicin 505 nm = (1-Af/Ao)*100

Las curvas de calibrado se calculan con soluciones estndar de Trolox (un anlogo

de -tocoferol), en un rango de concentraciones de 0,2 a 6 g, y de vitamina C des-

d o s

45

2.2. MTODOS


46/107

d o s

de 0,05 a 2 g. Por tanto, los resultados de actividad antioxidante se expresan

TEAC (Capacidad Antioxidante Equivalente de Trolox) y en CEAC (Capacidad Antio

dante Equivalente de vitamina C).

2.2.2. DETERMINACIN DE LAS FAMILIAS FENLICAS

Las familias fenlicas analizadas son: polifenoles totales, catequinas y proan

cianidinas. En todos los casos se tiene en cuenta la posible sobrevaloracin

bido a la presencia de azcares y dextrinas.

2.2.2.1. DETERMINACIN DE LOS POLIFENOLES TOTALES EN LA CERVEZA Y EN PLASMA

A DIFERENTES TIEMPOS TRAS LA INGESTA DE CERVEZA

Se aplica el mtodo Folin-Ciocalteus. Esta reaccin se basa en la oxidacin,

medio bsico (Na2CO3), de los grupos hidroxilos de los compuestos fenlicos

el reactivo de Folin, una mezcla de cido fosfowolfrmico y fosfomolbdico,

se reducen dando una mezcla de xido de wolframio y xido de molibdeno, de

lor azul. El complejo azul que se forma se mide a 750 nm y es directamente pporcional a la cantidad de polifenoles totales presentes en el medio (Single

and Rossi, 1965).

2.2.2.2. DETERMINACIN DE CATEQUINAS

Se basa en la propiedad de estos compuestos de dar reacciones de condensac

con los grupos carbonilos en medio cido. Se emplea el aldehdo vainllico (v

nillina) como compuesto carbonlico, que reacciona con los ciclos bencnicos

tivados de las catequinas originando un cromforo rojo que se mide a 500

(Swain and Hillis, 1959).

46


47/107

2.2.2.3. DETERMINACIN DE PROANTOCIANIDINAS

Su determinacin se basa en la capacidad de las proantocianidinas de transformarse

en antocianidinas al calentarse en medio cido y en presencia de oxgeno. El color

rojo formado, fruto de la hidrlisis de las proantocianidinas, se mide a 550 nm (Ri-

breau-Gayn and Stonestreet, 1966).

2.2.3. AISLAMIENTO DE MELANOIDINAS

Las melanoidinas se aslan de las cervezas en estudio por un mtodo de dilisis,utilizando una membrana de celulosa, que retiene aquellas molculas de peso mo-

lecular 12.000 Da. En cada tubo de dilisis se introducen 15 mL de cerveza que

se colocan en un vaso con 1 L de agua MiliQ. Esta solucin se mantiene en agi-

tacin continua durante 12 horas a 5C. Al cabo de las cuales se realiza el cam-

bio del agua del vaso, dejndose de nuevo otras 12 horas en agitacin. El volu-

men final retenido en el tubo de dilisis (dializado) se lleva a un volumen de 50

mL con agua MiliQ (Ames et al., 1999).

2.2.4. CUANTIFICACIN DE LAS MELANOIDINAS

La cuantificacin de melanoidinas, tanto en la cerveza original como en el dializado,

se efecta tal y como se detallar a continuacin. El patrn de melanoidinas se ob-

tiene a partir de glucosa y glicina, siguiendo el mtodo descrito por Hofmann (2000).

Se disuelven 0,05 moles de glucosa y 0,05 moles de glicina en 100 mL de agua des-

tilada. Posteriormente se liofiliza la disolucin a temperatura inferior a 30C. Se ca-

lienta la mezcla a 125C durante 2 horas. Se enfra hasta temperatura ambiente. Pos-

teriormente, se toman 0,5 g de la muestra y se disuelven en 25 mL de agua destila-

da, filtrndose a travs de un filtro Whatman n 4 (dimetro de poro 20-25 m) y re-

d o s

47


48/107

d o s

cogindose el filtrado que contiene las melanoidinas solubles. Se lava el residuo

veces y se mezclan ambos lavados con el filtrado original, siguiendo el mismo p

cedimiento descrito para las cervezas. Posteriormente se liofiliza y conserva a 80

Se realiza el espectro UV-visible de una disolucin de esta sustancia patrn en

rango de 200-600 nm utilizando agua como blanco, teniendo que observarse un p

caracterstico a 345 nm (Prez-Magario et al., 2000). Por ello los valores de abs

bancia a 345 se utilizan para cuantificar las melanoidinas presentes tanto en las c

vezas como en los dializados.

2.2.5. ENSAYO DEL RADICAL SUPERXIDO

El radical superxido se genera mediante la oxidacin del fenazin metasulfato

nicotinamida adenina dinucleotido por el NADH y se determina por la reducc

del nitroazul tetrazolium (NBT). En nuestro experimento, el radical superxido

gener en 3 mL de tampn Tris/ClH 16 mM a pH: 8.0 que contiene 78 M

NADH, 50 M de NBT y 10 M PMS y cerveza (0,5, 1, 5 y 10 l). Al reacciona

radical superxido y el NBT se produce una coloracin que se detectada a una

560 nm (Liu et al., 1997).

2.2.6. DISEO EXPERIMENTAL EN RATAS WISTAR

Se establecieron 4 grupos de animales para cada tipo de cerveza (con/sin alcoh

Grupo estudio (Adriamicina + Cerveza): La suplementacin con cerveza se inici

das antes del tratamiento con el quimiosttico, y se contina hasta una semana d

pus de finalizar dicho tratamiento. El suplemento diettico de cerveza (con/sin

cohol) consiste en un concentrado (10 veces) de una cantidad equivalente

400ml/da para una persona de 70 kg de peso. A estos animales se les adminis

48


49/107

dos dosis de adriamicina de 5 mg/kg de peso por va intraperitoneal (que es la dosis

establecida en humanos y utilizada en otros estudios) (Hong et al., 2002). As pues,

el da 7 de la suplementacin se administra la primera dosis de adriamicina y el da

14 la segunda, y el aporte diettico de cerveza se mantiene hasta el da 21, proce-

diendo en ese da a la toma de muestras biolgicas.

Grupo adriamicina (Adriamicina + H2O): Durante los 21 das que dura el experi-

mento, a los animales se les suplementa con agua en vez de cerveza y se sigue el

mismo tratamiento con la adriamicina, igual que en el grupo anterior.

Grupo testigo (Suero fisiolgico + Cerveza): Durante 21 das se sigue la suple-

mentacin diettica con cerveza y la adriamicina es sustituida por suero fisiolgico.

Grupo control (Suero fisiolgico + H2O): Durante los 21 das las ratas se suple-

mentan nicamente con agua y en vez de adriamicina se administra suero fisiolgi-

co.

2.2.7. DISEO EXPERIMENTAL DEL ESTUDIO CLNICO

Para tal objetivo se ha elegido a un grupo de humanos de sexo masculino con ni-

veles elevados de colesterol (hiperlipemias), a los cuales se les suplementa su die-

ta con 660 mL/da de cerveza sin alcohol durante un periodo de tiempo de 28 das.

2.2.8. DETERMINACIN DE ANTIOXIDANTES TOTALES EN PLASMA, A DIFERENTES TIEMPOS,

TRAS LA INGESTA DE CERVEZA

Para la determinacin de los niveles de antioxidantes totales se utiliza el kit: To-

tal Antioxidant Status de Randox (United Kingdom, BT29 4QY), de la forma si-

d o s

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50/107

d o s

guiente: El 2,2-azino-di-3-etilbenzotiazoln sulfonato (ABTS) se incuba con pe

xidasa y H2O2 para dar lugar a la formacin del radical ABTS+. Este radical pres

ta una coloracin verde-azulada relativamente estable, que se mide a 600 nm.

presencia de antioxidantes en la muestra produce una supresin de la coloraci

siendo esta supresin, proporcional a la concentracin de antioxidantes.

2.2.9. AISLAMIENTO DE MITOCONDRIAS DE HGADO Y CORAZN DE RATA

Para el aislamiento de las mitocondrias se utiliza el mtodo descrito por San

et al. (2002). Las ratas se anestesian con halotano. Posteriormente se realuna extraccin de sangre de la vena yugular, la cual se procesa para la obt

cin de plasma, realizando en l las correspondientes pruebas bioqumicas

continuacin seccionamos longitudinalmente el animal para extraer los rga

(hgado y corazn), los lavamos y homogeneizamos con la solucin tampn

(sacarosa 250 mM, EGTA 1 mM y Hepes-KOH 5 mM a pH 7,4) para proceder a

obtencin de las mitocondrias puras.

Corazn.- Homogeneizamos el corazn con 5 mL de tampn 1 en fro y a

dimos Nagarse (1mg/mL de tampn). Posteriormente llevamos el volumen ha30 mL y centrifugamos a 11.000 g durante 10 a 4 C. Decantamos el sobre

dante y disolvemos el pellet con 15 mL de tampn 1, centrifugamos a 900 g

rante 10 (este paso se repite tres veces). Finalmente, resuspendemos con ta

pn 2 (Sacarosa 250 mM, Hepes/KOH 5 mM, EGTA 0.5 mM a pH 7,4) con lo q

se obtienen las mitocondrias que se congelan a -80C hasta que sean utiliza

para realizar los ensayos bioqumicos.

Hgado.- Lavamos el hgado con la solucin tampn 2. Homogeneizamos

5 mL del tampn 2 y posteriormente aadimos 15 mL de la misma solucin ta

pn. Centrifugamos a 900 g durante 10 minutos a 4C, filtramos el sobrenad

te con una gasa doble y volvemos a centrifugar a 9.000 g durante 10 minuto

50


51/107

4C (este paso se repite dos veces). Finalmente se resuspende el pellet con tam-

pn 2 y congelamos las mitocondrias obtenidas a -80C hasta que se realicen las

correspondientes pruebas bioqumicas.

2.2.10. DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD NADH-UBIQUINONA OXIDORREDUCTASA

(COMPLEJO I) EN MITOCONDRIAS DE HGADO Y CORAZN DE RATA

La actividad de la NADH-ubiquinona oxidorreductasa se cuantifica siguiendo es-

pectrofotomtricamente la oxidacin del NADH. La muestra se somete a 2-3 ci-

clos de congelacin y descongelacin con la finalidad de romper las membranas.Se utilizaron 25 L de muestra a una concentracin de protena de 1mg/mL. Se

incub durante 1 minuto a 25C con tampn fosfato potsico 50 mM a pH7,4,

EDTA

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