UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANNIV PRCTICACURVA DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS (LCTICAS)CURVA DE SNTESIS DEL PRODUCTO (CIDO LCTICO)

I. OBJETIVO

Estudiar la curva de crecimiento de bacterias lcticas y al mismo tiempo construir la curva de sntesis de acido lctico.

Comparar los resultados de una cepa con fecha de vencimiento vencida con una de fecha no vencida.

II. FUNDAMENTO TERICO

LACTOBACILLUS BULGARICUS:A diferencia de otras bacterias de aplicacin industrial, los lactobacilos son exigentes en cuanto a los nutrientes que necesitan para multiplicarse, pues adems de azcares (fuente de energa) y sales minerales, que aportan elementos como nitrgeno, fsforo y potasio, deben proporcionarse protenas, aminocidos y vitaminas.Es importante mencionar que la seleccin del medio en el que se cultiven, debe basarse en los requerimientos de cada especie, en su capacidad para mantener el crecimiento microbiano y alcanzar conteos finales de clulas adecuados al proceso de que se trate, por ejemplo obtencin de probiticos, as como del costo pues esto repercutir en el del producto. Un medio que se usa frecuentemente es la leche descremada, la que provee de varios nutrientes a las bacterias lcticas. Sin embargo no resulta del todo adecuada para escalas industriales pues debe pasteurizarse, puede generar slidos que dificulten la recuperacin de las clulas microbianas y en general no se alcanzan conteos mayores a 1 x 107 clulas/mL, que son valores bajos si se pretende tener concentrados celulares ms altos puesto que deber trabajarse entonces con fermentadores de ms volumen.Otro medio de cultivo adecuado para las bacterias lcticas es un preparado comercial, conocido como MRS, que contiene protenas hidrolizadas provenientes de diferentes fuentes, glucosa y sales (figura 2). En ste se alcanzan cuentas microbianas de hasta 1 x 1012 clulas/mL, dependiendo de la especie, pero su elevado costo lo hace poco apto para volmenes industriales.

Figura 2. Siembra en nivel de laboratorio en agar MRS y micrografa de bacterias cido lcticasEl medio de cultivo puede disearse de acuerdo al objetivo del proceso, es decir, si se desea obtener biomasa microbiana o algn producto como cido lctico o bacteriocinas. En general los nutrientes que debe incluir un medio para bacterias lcticas se dividen en cuatro grupos:1. Nutrientes complejos como extracto de levadura, licor de maz, hidrolizados de protenas de soya, casena o suero de leche. Tambin se incluyen aqu la leche descremada y los concentrados de suero de leche.2. Nutrientes simples que se subdividen en orgnicos como los azcares (glucosa, lactosa, sacarosa) y vitaminas. Los inorgnicos incluyen las sales que aportan elementos como fsforo, potasio, nitrgeno, azufre, etc.3. Amortiguadores o buffers.4. Antiespumantes para reducir la espuma formada como resultado de la agitacin y de las protenas presentes, usualmente se utiliza silicn.Como se mencion anteriormente los componentes del medio se eligen no solamente por el aporte de nutrientes al microorganismo sino tambin por su estado fsico (slidos en suspensin, concentracin, etc.), la disponibilidad durante el ao y el precio.Adems del medio de cultivo hay otros aspectos que influyen en el crecimiento de los lactobacilos, como son la temperatura, el pH, el oxgeno presente en el medio y la sal que se utilice para neutralizar el cido formado al crecer las bacterias. La temperatura a la que se efecte el cultivo est relacionada con el valor ptimo para el crecimiento, si son mesfilas o termfilas, por ello puede variar desde 26 a 42C aproximadamente, para las cepas mas importantes en la industria.La aeracin no es un factor limitante en el cultivo de bacterias lcticas en fermentadores, puesto que stas se consideran microaeroflicas y no toleran altas concentraciones de oxgeno. Nuevamente esto es variable para cada especie pues en algunos casos el oxgeno promueve el crecimiento microbiano, como sucede con Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides y Lactobacillus delbrueckii. Tambin la produccin de cido lctico puede estimularse en Lactobacillus helveticus por medio de la alimentacin de aire.El pH inicial del medio de cultivo puede ajustarse sin mayor problema pero conforme transcurre la fermentacin la produccin de cido lctico provoca que descienda. Hay un efecto inhibitorio en el crecimiento de los microorganismos por lo que el pH se controla mediante la adicin de neutralizantes, que usualmente son bases como el hidrxido de sodio o de amonio. Existen diversos reportes en la literatura sobre el efecto de las diferentes bases en el desarrollo de las bacterias, en general se considera que el hidrxido de amonio es mejor como agente neutralizante.Finalmente el equipo en el que se llevan a cabo estos procesos son fermentadores convencionales, con agitacin mecnica y sistema de control de temperatura. Deben contar con chaqueta o serpentn para poder esterilizarlos dado que los medios de cultivo son ricos en nutrientes y por consiguiente se contaminan fcilmente. Si se alimenta aire tambin este se esteriliza por medio de filtros. El volumen de los fermentadores depende el propsito del cultivo de las bacterias lcticas, si el objetivo es producir clulas o cido lctico, por ejemplo, de la cantidad deseada y de los rendimientos.Un proceso tpico parte del cultivo conservado ya sea en caja Petri o en tubo de ensaye con un medio slido (v.g. agar MRS), una etapa de propagacin en tubo o matraz y etapas de pre inculo e inculo para el fermentador de produccin. El nmero de pasos lo determinan el volumen de ste as como el porcentaje o la concentracin inicial de clulas que constituyen el inculo. En la siguiente figura se ejemplifica lo anterior, en la produccin de cido lctico.

Se sabe que las bacterias se dividen por fision binaria, la celula madre al alcanzar un determinado volumen

RELACIONES ENTRE VELOCIDAD DE CRECIMIENTO Y TAMAO CELULAREs fcil comprobar en los cultivos bacterianos que cuanto ms rico es un medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generacin (g), mayor es el tamao medio de las clulas.1. bacterias creciendo en un medio relativamente pobre (supongamos que en este medio g=60 min, C+D=g);2. si transplantamos una clula recin dividida procedente del cultivo anterior a un medio ms rico (por ejemplo, que permite un tiempo de generacin g=35 min) podemos observar que:a. la primera divisin ocurre C+D (60 minutos) despus; es decir, con un tiempo idntico al que tena en el medio anterior;b. pero como en este medio g=35 min, la iniciacin de una nueva ronda de replicacin ocurre antes de dicha replicacin celular (es decir, C y D se superponen);c. se observa que se alcanza un nuevo equilibrio, con un tamao celular mayor que en el medio pobre, y una masa de inicio (tras la divisin celular) mayor, alterndose igualmente el tiempo de inicio.

III. MATERIALES Un vaso de precipitado de 1 lt. Estril Pipetas de 10, 5,5,1 ml. Placas Petri Tubos de ensayo. Cepas de Lactobacillus. Agar Rogosa Equipo de incubacin anaerbica Equipo para determinacin de acidez titulable.

IV. PROCEDIMIENTOSembrar la leche con Lactobacillus. Incubar a 43C. Controlar el proceso de fermentacin. Realizar las siembras y titulaciones necesarias.Utilizar una cepa con fecha de vencimiento recientemente vencida. Comparar con los resultados anteriores. Graficar los resultados vs. Tiempo.

TABLKA N1: Resultados de cepas con fecha de vencimiento no vencidaNHora de anlisisD (acidez)Recuento de Ufc/ml

110:251816*105

211:052042*105

311:302170*105

412:033075*105

512:364385*105

613:0850110*105

713:4055220*105

814:2060530*105

915:0060

TABLA N 2: Curva de crecimiento de bacterias lcticas. (bioflora ,cepa comprada en Tienda Bocchio donde estuvo congelada). Con fecha de vencimiento 2014

HoraD Produccin de cido lcticoRecuento bacterias lcticas ufc/ml de leche (X).------x106

9:05181000000

9:4018,50

10:20201000000

11:00324000000

11:40506000000

12:206417000000

13:007234000000

13:507868000000

14:208075000000

Nota: La leche se tuvo que recalentar a las 11 :00 a 43 C . La temperatura ambiente = 15-17 C, obteniendo buen resultado. En un inicio la temperatura de incubacin era de 37-39 C, lo cual impidi el buen desarrollo.CLCULOS:Para la tabla n 1 tenemos:XYLn de Y

10:25182,89037176

11:05202,99573227

11:30213,04452244

12:03303,40119738

12:36433,76120012

13:08503,91202301

13:40554,00733319

14:20604,09434456

15:00604,09434456

Grfico n 1:

De este primer grafico podemos decir que la cepa produjo su mxima cantidad de acido lctico rpidamente hasta las 12:36 y se fue equilibrando en el punto (Y 55) y a partir del penltimo tiempo medio hasta el ltimo este se mantuvo constante. Para hacer la comparacin tambin obtuvimos un grfico para lo que es la segunda tabla:XY

10:251600000

11:054200000

11:307000000

12:037500000

12:368500000

13:0811000000

13:4022000000

14:2053000000

15:000

Obtenindose en Excel el grafico n 2: Tiempo vs. Cant. De producto.

Del grfico se puede deducir que de acuerdo al lineamiento que tiene la curva se puede decir que a horas 13:40 hasta la 14:20 se dio la mayor produccin de ufc/ml de parte de la cepa. En tal caso a este periodo se le denominara el periodo de crecimiento exponencial.

Para la segunda muestra con fecha de vencimiento 2014 se tiene que, de la primara tabla para esta muestra es:XYln

9:05182,89037176

9:4018,52,91777073

10:20202,99573227

11:00323,4657359

11:40503,91202301

12:20644,15888308

13:00724,27666612

13:50784,35670883

14:20804,38202663

Y el grafico correspondiente a este es:

Para hacer lectura de la cantidad de bacterias desarrolladas en cada tiempo tomado tambin se hizo:XY

9:051000000

9:400

10:201000000

11:004000000

11:406000000

12:2017000000

13:0034000000

13:5068000000

14:2075000000

Cuyo grafico en Excel nos arrojo: Tiempo vs. Ufc/ml

De lo que se desprende que la mayor produccin denominada logartmica est entre el antepenltimo y penltimo punto; despus de este como que cesa un poco el crecimiento.

V. CONCLUSIONES Se desarrollaron las curvas de desarrollo de cepa as como tambin la produccin de acido lctico a partir de dos cepas del mismo gnero sino que de diferentes fechas de vencimiento; siendo su nombre Lactobacillus. Al comparar las graficas de produccin de acido lctico nos podremos dar cuenta que la relacin que guardan son muy similares por lo que no se encuentra diferencias en ello entre la cepa de fecha de vencimiento no vencida con la cepa que vence el 2014. Para el caso desde crecimiento o desarrollo exponencial manifestado en ufc/ml se traduce de comparar ambos ltimos grficos de cada tabla: En la cepa de fecha de vencimiento no vencida este desarrollo ptimamente hasta un penltimo punto y luego descendi bruscamente quizs porque se dio la muerte progresiva de la cepa. Para el segundo caso, el desarrollo de la cepa tambin fue bueno e incluso al tomar el ltimo tiempo se mostraba crecimiento aunque en el inicio se retraso un poco debido a que se dieron con la sorpresa que al traerla de la estufa al laboratorio para sembrarla esta haba sufrido un enfriamiento y se debi de nuevo calentar la leche. La actividad especfica de las cepas (K) resulta para cada uno de la siguiente manera: Cepa1: 1,879*10-6 Cepa 2: 2,38*10-7Lo que nos dice que la segunda cepa tuvo menor actividad especfica.VI. BIBLIOGRAFA

http://www.hablemosclaro.org/Temas/5/40/Producci%C3%B3n_de_Bacterias_%C3%81cido_L%C3%A1cticas#.VGYnxsV5OE4 fuente.uan.edu.mx/publicaciones/03-07/1.pdf https://micro.cornell.edu/.../fisin-binaria-e-otras-formas-de-reproducco...

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