Iván Palomo
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Universidad de TalcaFacultad de Ciencias de la Salud
Depto.de Bioquímica Clínica e Inmunohematología
Iván Palomo
LMC
SMP
• Leucemia Mieloide Crónica (LMC)
• Mielofibrosis con metaplasia mieloide
• Policitemia Vera
• Trombocitemia esencial
Enf. Hematológicas malignas Incidencia
Leucemia Incidencia (/100.000)
TodasTodas 6–106–10
LMCLMC 1–21–2
LLCLLC 2–32–3
LMALMA 2–32–3
LLALLA 1–21–2
EPIDEMIOLOGíA
• 15-20% de las leucemias (adultos)
• 3-5% " " (niños)
• 25-50 años (promedio 40)
• 10 años más jóvenes que LLC
LMC
CARACTERÍSTICAS GENERALES
• Desorden clonal de una célula troncal Crom. Philadelphia (Ph) se encuentra en granulocitos,
megacariocitos, monocitos y cél. eritroides.
• Gran aumento del pool granulocítico
• Enfermedad bifásica
• Fase crónica • Fase acelerada
• Fase aguda (Crisis blástica)
LMC
ETIOLOGÍA
5% causa conocida
• Radiaciones• Agentes químicos
• Benzol y derivados• Solventes• Insecticidas
LMC
Enf. con alteración molecular única
LMC– Enf. proliferativa de stem cells hematopoyéticas– Curso clínico característico
Cromosoma de Philadelphia (Ph) Alteración cromosómica única
Tirosina kinasa Bcr-Abl– Alteración molecular única– Causa transformación de una Stem cells hematopoyética en
clon maligno
LMC
Crom. Philadelphia (Ph) y gen bcr-ablLMC
bcr-abl
ablProteína de
fusión
Actividad Tirosina Kinasa
22
bcr
Ph(or 22q-)
99 q+
1
p210Bcr-Abl
p185Bcr-Abl2-11
2-11
Chromosome 9
c-bcr
Chromosome 22
c-abl
2-11
Exons
Introns
CML Breakpoints
ALL Breakpoints
Translocación recíproca
t(9;22) (q34;q11)bcr-abl gene structure
Proteínas normales Bcr y Abl y sus contrapartes post-translocaciónProteínas normales Bcr y Abl y sus contrapartes post-translocación
Actividad tirosina kinasa de la proteína Abl
Actividad tirosina kinasa de la proteína Abl
Tirosinas kinasas
-Fosforilan tirosina
-Actividad controlada en
dominio N-terminal.
En región C-terminal dominio une a DNA y a los filamentos de actina (regular ciclo celular)
Funciones de la proteína BcrFunciones de la proteína Bcr
Serina-treonina kinasa.
Tiene homología a proteínas G.
Puede participar en reparación del DNA.
bcr-abl: Transducción de señales
Bcr-AblCytoskeletal
proteins
P
MYC
?
Nucleus
P
RAS-GAP
RAS-GTP
SAPKP
CBL CRK
PI3K P
BAD
14-3-3
P
BCLXL
14-3-3Mitochondria
BCLXL
BAD
RAS-GDP
AKT
ERKP
STAT1+5P
GRB-2
SOS
SHC DOK CRKL
PMEK1/2
PRAF-1
TYROSINE KINASE ACTIVITY
Proliferación
Apoposis
Adhesión(alteración)
LMC 95
LLA Adulto 15–30 Niños 5
LMA 2
Cromosoma Ph Prevalencia en Leucemias
Curso clínico: Fases de la LMC(pre-Imatinib)
Chronic phase
Median duration 5–6 years
Accelerated phase
Median duration6–9 months
Blast crisis
Median survival3–6 months
Advanced phases
Fase Crónica
CLÍNICA
Síntomas Inespecíficos y graduales:
Astenia, fatiga, cefalea, pérdida de peso, anorexia Signos Esplenomegalia (80%) Hepatomegalia (20%)
Normal
Normal
LMC
Laboratorio
• Hemograma
• Estudio citogenético• Cariograma• Fish
• RT-PRC bcr-abl
• FAN• Citometría de flujo
LMC
Laboratorio: Parámetros típicos(según fase)
ParameterParameter ChronicChronic AcceleratedAccelerated Blast CrisisBlast Crisis
WBC countWBC count 20 x 1020 x 1099/L/L — — — —
BlastsBlasts 1%–15%1%–15% 15% 15% 220%0%
BasophilsBasophils 20% 20% — —
PlateletsPlatelets or normal or normal or or
Bone marrowBone marrow Myeloid hyperplasia Myeloid hyperplasia
CytogeneticsCytogenetics Ph+Ph+
Bcr-AblBcr-Abl ++
Laboratorio: Fase crónica (cont)
• Leucocitosis Fórmula leucocitaria alterada Basofilia
Eosinofilia
• Anemia NN
• Trombocitosis
DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL
• Reacción leucemoide• Sepsis, inflamación, Ca, hemólisis• Granulación tóxica, Cuerpos de Döhle• FAN aumentadas• Ph (-)
• Mielofibrosis con metaplasia mieloide• Poiquilocitosis (GR en lágrima)• FAN aumentadas • Fibrosis medular• Ph (-)
LMC
Estudio citogenético
Cariograma
Menos sensible que RT-PCR abl-bcr
LMC
9
22
Métodos moleculares para detectar bcr-abl cromosoma PhMétodos moleculares para detectar bcr-abl cromosoma Ph
FISHFluorescence in situ hybridisation
RT-PCRReverse Transcriptasa Polimerase Chain Reaction
Interphase MetaphaseLabeled DNA probe(fluorescent)
Nuclear DNA
bcr-abl geneSeparate DNA strands and add labeled probe
Labeled bcr-abl gene
Fluorescence in situ hybridisation (FISH)Fluorescence in situ hybridisation (FISH)
FISH en MO y sangre periféricaAlta correlación resultadosFISH en MO y sangre periféricaAlta correlación resultados
Peripheral Blood
Mar
row
% Ph+100
80
60
40
20
00 20 40 60 80 100
% Ph+
AMPLIFICACIÓN DE GEN abl/bcr
RT-PCR (Reverse Transcriptasa Polimerase Chain Reaction)
• Más sensible que Cariograma (detecta 1 cél. malig. en >106 cél. N)
Detección cél. Ph+ ( Diagnóstico y post-trasplante MO)
MÉTODO• Obtención Cél. Mononucleares de MO ( grad. de densidad)
• Obtención de RNA
• Transcripción reversa (obtención cDNA)• Transcriptasa reversa, “Primers”
• Amplificación• DNA polimerasa, “Primers”, Oligonucleótidos , • Termociclador
• Visualización del producto amplificado • Electroforesis Gel agarosa , • Bromuro de Ethidio , UV
Etapas del RT-PCRPlasma
LinfocitosFICOLL; d 1.077
PMN GR,
LMC
PM Cont – Ph+ N DNA
RT-PCR bcr-ablLMC
CRISIS BLÁSTICA
Periferia
• Anemia• Trombocitopenia • Leucocitosis (>20% Blastos)
Leucopenia, Trombocitosis Marcada displasia
Médula Ósea•Infiltración (mieloblastos)•Disminución series normales
LMC
Opciones terapéuticas
Trasplante alogénico de Progenitores Trasplante alogénico de Progenitores hematopoyéticos.hematopoyéticos.
Tratamientos basados en IFN-Tratamientos basados en IFN-αα
Quimioterapia: Hidroxiurea, BusulfanQuimioterapia: Hidroxiurea, Busulfan
Imatinib, Gleevec (STI571)Imatinib, Gleevec (STI571)
LMC
•Transfusión GR (Anemia grave)
•Transfusión plaquetas (Trombopenia marcada)
•Antibióticos (Infecciones)
Imatinib, Gleevec (STI-571)
Tirosina Kinasa 210 kDa
Tirosina Kinasa 210 kDa
(STI-571)
LMC LMC
EGF-R EGF-R
Ser474 Ser474
Imatinib: Mecanismo de acción(Inhibidor de tirosina kinasa)
Imatinib: Mecanismo de acción (cont)
Trasplante de progenitores hematopoyéticos:Alta morbilidad y mortalidadTrasplante de progenitores hematopoyéticos:Alta morbilidad y mortalidad
Survival by Disease Stage, June 2001, based on transplants 1987 – Feb 2001.
P=.0001
LMC
IFN-IFN- IFN- tiene efectos biológicos múltiples:
– Inhibe proliferación celular
– Regula expresón de otras citoquinas
– Modula el Sistema immune
Respuesta citogenética: puede ocurrir a 12 a 18 meses
Mejor sobrevida en casos Fase Crónica temprana
IFN- combinada con cytarabina (Ara-C): mejor respuesta
LMC
IFN- Buen resultado en fase crónica tempranaIFN- Buen resultado en fase crónica temprana
CHR = complete haematological response; MCR = major cytogenetic response.
Phase Patients(n)
CHR(%)
MCR(%)
Chronic <12 mo 274 80 38
>12 to <36 mo 72 62 8
>36 mo 42 49 8
Accelerated 61 52 7
Blast Crisis 5 20 0
Quimoterapia es solo paliativaQuimoterapia es solo paliativa
Fármacos citotóxicos orales– Hydroxyurea– Busulfan
Respuesta Hematológica: 90%
Respuesta citogenéticas: 1%–5%
No modifica progresión de enfermedad
LMC
Bcr-Abl: Target terapéuticoBcr-Abl: Target terapéutico
Bcr-Abl: 95% pacientes
Bcr-Abl: Asociada a causa
Tirosina kinasa Bcr-Abl:
Requerida para función celular de LMC.
LMC
Imatinib: Inhibe selectivamente kinasasImatinib: Inhibe selectivamente kinasas
Kinases Inhibited Kinases Not Inhibited
v-Ablv-Abl 0.1–0.30.1–0.3 Flt-3Flt-3 >10>10p210Bcr-Ablp210Bcr-Abl 0.250.25 c-Fms, v-Fmsc-Fms, v-Fms >10>10p185Bcr-Ablp185Bcr-Abl 0.250.25 EGF receptorEGF receptor >100>100TEL-AblTEL-Abl 0.350.35 c-erbB2c-erbB2 >100>100PDGF-RPDGF-R 0.10.1 Insulin receptorInsulin receptor >100>100TEL-PDGF-RTEL-PDGF-R 0.15 0.15 IGF-1 receptorIGF-1 receptor >100>100c-Kitc-Kit 0.1 0.1 v-Srcv-Src >10>10
JAK-2JAK-2 >100>100
Imatinib inhibe crecimiento de células Bcr-Abl positivasImatinib inhibe crecimiento de células Bcr-Abl positivas
*Bcr-Abl–negative cell lines.
†Bcr-Abl–positive cell lines.
Imatinib Concentration (M)
U937*KG1*SU DHL1*
KCL22†
K562†
KU812†
Imatinib: Resistencia ocurre principalmente en fase avanzadaImatinib: Resistencia ocurre principalmente en fase avanzada
Estados avanzados de Cas: multiples cambios genéticos
En fase acelerada: A menudo recaen con resistencia a quimioterapia.
En crisis blástica: Algunos rsponden pero recaen
F. crónica F. blástica Recaida
Ph+
Ph+ blastsPh-negative
Ph+ imatinib-resistant blasts
Hae
mat
opoi
etic
diffe
rent
iatio
n
Bone m
arrow to peripheral blood
LMC
Cytogenetic Response
Imatinib (n=553)
IFN- + Ara-C (n=553)
Major (35% Ph+, MCR)* 457 (83%) 112 (20%)
Complete (0% Ph+)* 375 (68%) 41 (7%)
Partial (1%–35% Ph+) 32 (15%) 71 (13%)
Imatinib: Induce mayor respuesta citogenética
*P<.001.
Con Imatinib: Respuesta hematológica completa más rápida Con Imatinib: Respuesta hematológica completa más rápida
94%
55%
Imatinib
IFN- + Ara-C
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Months Since Randomisation0 3 6 9 12 15 18 21
% R
esp
ond
ing
Con Imatinib:
Cambios citogenéticos más rápidos
Imatinib
IFN- + Ara-C
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Months Since Randomisation0 3 6 9 12 15 18 21
% R
esp
ond
ing
83%
20%