L. Chávez, L.M. González MECANISMOS MOLECULARES ... · de K+ y Na+ es de vital importancia en...

Separata ITEA

INFORMACIÓN TÉCNICA ECONÓMICA AGRARIA, VOL. 105 N.º 4 (231-256), 2009

L. Chávez, L.M. González

MECANISMOS MOLECULARES INVOLUCRADOS EN LA TOLERANCIADE LAS PLANTAS A LA SALINIDAD

L. Chávez y L.M. González ITEA (2009), Vol. 105 (4), 231-256 231

Mecanismos moleculares involucrados en la tolerancia de lasplantas a la salinidad

L. Chávez, L.M. González

Instituto de Investigaciones Agropecuarias “Jorge Dimitrov”. Carretera Vía Manzanillo Km 17. Bayamo.Granma. Cuba. E-mail: [email protected]

ResumenLa salinidad es uno de los factores abióticos más importantes por sus impactos negativos en las cose-chas a nivel mundial, reduciendo el rendimiento de los principales cultivos de importancia económicaen más de un 50 por ciento. Se describen los mecanismos moleculares fundamentales que utilizan lasplantas para su adaptación a condiciones salinas estresantes, entre ellos se encuentran el manteni-miento de la homeostasis iónica, la síntesis de compuestos osmoprotectores, la reducción del daño porestrés oxidativo y el papel del ácido abscísico.

Palabras clave: Estrés salino, Plantas trangénicas, ABA, Homeostasis iónica.

SummaryMoleculars mechanisms in plant salt toleranceSalinity is one of the most important abiotic factors for its negative impacts on yield crops around theworld with a reduction higher than 50 percent in many crops of economic importance. The funda-mental molecular mechanism for the plant adaptation to saline conditions as the maintenance of theionic homeostasis, the syntesis of osmotic protector compounds, the reduction of damage for oxidati-ve stress and the abscisic acid role are described in plant salt tolerance.

Key words: Saline stress, Transgenic plants, ABA, Ionic homeostasis.

Introducción

El desarrollo de plantas tolerantes a la sali-nidad es una necesidad para mantener yelevar la producción agrícola (Munns et al.,2006). Los programas de mejoramiento con-vencional para obtener plantas que tolerenel estrés salino han obtenido un éxito muylimitado debido a la complejidad del carác-ter. El lento progreso en los programas demejora puede atribuirse al pobre conoci-miento o entendimiento de los mecanismosmoleculares de tolerancia a la salinidad.Además, comprender las bases molecularesde la tolerancia de las plantas a la salinidad

también ayudará a mejorar la tolerancia ala sequía y a las temperaturas extremas,porque el estrés osmótico es común a estosestreses abióticos (Chinnusamy et al., 2005).

Las plantas responden al estrés salino a tresniveles diferentes: celular, tisular y de plan-ta completa (Munns y Tester, 2008). Es porello que para entender satisfactoriamentela tolerancia de las plantas a la salinidad, losmecanismos a cada nivel deben estudiarseindividualmente (Larcher, 2003).

El objetivo de este trabajo es describir algunosde los mecanismos moleculares fundamenta-les que utilizan las plantas para su adaptación

a condiciones salinas estresantes, entre ellos,el mantenimiento de la homeostasis iónica,la síntesis de compuestos osmoprotectores,la reducción del daño por estrés oxidativo yel papel del ácido abscísico.

La salinidad y sus efectos nocivos sobre loscultivos

El estrés salino afecta al desarrollo de laplanta, incluyendo la germinación, el creci-miento vegetativo y el desarrollo reproduc-tivo. También limita indirectamente la pro-ductividad de las plantas a través de susefectos adversos en microorganismos sim-bióticos beneficiosos.

La salinidad afecta el crecimiento y produc-ción de los cultivos porque reduce el poten-cial hídrico de la solución del suelo, por loque disminuye la disponibilidad de agua, ycrea un desequilibrio nutritivo, dada la ele-vada concentración de elementos (Na+, Cl-)que pueden interferir con la nutrición mine-ral y el metabolismo celular (Amini et al.,2007). En consecuencia, los diversos efectosobservados a distinta escala, desde reduc-ción de turgencia y crecimiento, hasta lapérdida de la estructura celular por desor-ganización de membranas e inhibición de laactividad enzimática, son el producto com-binado del estrés hídrico, la toxicidad iónicay el desequilibrio nutricional (Parida y Das,2005; Vijayan, 2008).

La salinidad afecta la fotosíntesis (Chaves,2009), principalmente a través de la reduc-ción del área foliar, el contenido de clorofilay la conductancia estomática, y en menorextensión a través de una disminución de laeficiencia del fotosistema II (Chinnusamy et.al., 2005). Los efectos adversos de la salini-dad pueden atribuirse al efecto del estréssalino sobre el ciclo celular y la diferencia-ción. La salinidad detiene temporalmente el

ciclo celular reduciendo la expresión y acti-vidad de ciclinas y proteínas quinasa depen-dientes de ciclinas, lo que trae como resulta-do menos células en los meristemos, y uncrecimiento limitado.

Tolerancia de las plantas a la salinidad

De acuerdo con la tolerancia a las condicio-nes de salinidad en el suelo, las plantas pue-den ser clasificadas en aquellas que requie-ren o toleran altas concentraciones de sales,o halófitas, y las que no toleran la presenciaexcesiva de sales, o glicófitas. Existen cate-gorías intermedias entre ambos grupos–pseudohalófitas–, así como plantas que, sinser halófitas, requieren sodio como elemen-to esencial. La sensibilidad de las plantas alas sales varía durante el desarrollo fenoló-gico, dependiendo de la especie, el cultivary factores ambientales (Munns, 2002).

Se ha planteado que en la evolución de losmecanismos de tolerancia y adaptación delas plantas al estrés salino así como a dife-rentes factores abióticos estresantes, puedeobservarse la existencia de grados de sus-ceptibilidad y de tolerancia muy diferentes,tanto desde el punto de vista de los meca-nismos, como de la amplitud y distribuciónentre las diversas especies, e incluso varie-dades y ecotipos dentro de un misma espe-cie. Esto evidencia la diversidad de estrate-gias que han desarrollado las plantas, paramantener una respuesta altamente refina-da ante la amplia gama de estrés a que sonexpuestas las mismas (González, 2002).

La mayoría de las especies comestibles degranos y vegetales son glicófitas muy suscep-tibles a la salinidad del suelo, aún cuando laconductividad eléctrica sea menor de 4dS/m.Especies tales como: frijoles (Phaseolus vulga-ris), berenjena (Solanum melongena), maíz(Zea mays), papa (Solanum tuberosum), y

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caña de azúcar (Saccharum oficinarum), sonmuy susceptibles; mientras que la remolachaazucarera (Beta vulgaris) y la cebada (Hor-deum vulgare), pueden tolerar una CE demás de 7 dS/m. La remolacha y la cebada, sinembargo, son muy sensibles durante la fasede germinación, en cambio son muy toleran-tes durante las fases posteriores de desarro-llo (Chinnusamy et al., 2005).

La respuesta adaptativa, para lograr tolerarla salinidad, debe interconectar tres aspec-tos en la actividad de la planta. El primeroes prevenir o reparar el daño o la detoxifica-ción. El segundo es el control de la homeos-tasis, incluye la homeostasis iónica y laosmótica que deben ser re-establecidasfrente a las nuevas condiciones de estrés. Entercer lugar, el control del crecimiento,debe reanudarse pero con una tasa reduci-da (Zhu, 2001).

Para que una planta se adapte a las condi-ciones salinas, se deben activar múltiplesmecanismos: debe aumentarse la capacidadde obtener y/o retener agua, y debe resti-tuirse la homeostasis iónica (Bargmann etal., 2009). Estos mecanismos de adaptaciónse reflejan macroscópicamente como unmenor crecimiento, modificación de la rela-ción parte aérea/raíz, limitación de la expan-sión foliar, y son consecuencia de cambiosbioquímicos (incremento de la síntesis deácido abscísico y solutos osmoprotectores) yfisiológicos (alteración de la permeabilidadde las membranas a los iones y al agua, cie-rre estomático, disminución de transpiracióny fotosíntesis, etc). Esta respuesta adaptativaestá gobernada por señales moleculares queregulan la relación con el medio externo(por ejemplo, cambios en la actividad decanales y transportadores de membranas) ypor la activación y transcripción de genesentre cuyos efectos está la modificación derutas biosintéticas que resultan en ajusteosmótico y la protección de las estructurascelulares (Zhou et al., 2007).

El interés por mejorar la tolerancia de loscultivos a la salinidad ha ido creciendo enlos últimos años, empleando métodos demejora y selección tradicionales o la produc-ción de organismos modificados genética-mente (Cuartero et al., 2006) .La incorpora-ción de genes procedentes de parentalessilvestres tolerantes, la domesticación deplantas halófilas silvestres, y la identifica-ción de caracteres relacionados con toleran-cia empleando marcadores moleculares(Owuso, 2008), o bien la incorporación degenes cuya expresión modifica mecanismosbioquímicos y fisiológicos involucrados en latolerancia (Sairam y Tyagi, 2004).

A continuación nos referiremos a algunosmecanismos moleculares que son utilizadospor las plantas para su tolerancia al estréssalino.

Mecanismos moleculares implicados en latolerancia de las plantas a la salinidad

Mantenimiento de la homeostasis iónica

Como hemos expresado con anterioridad elestablecimiento de la homeostasis iónica esun requerimiento esencial para que las plan-tas sobrevivan en condiciones de estrés salino(Bargmann et al., 2009). La regulación delflujo iónico es necesaria para que las célulasmantengan adecuada concentración deiones esenciales y baja la concentración deiones tóxicos (Senadheera, 2009). Bajo estréssalino, el mantenimiento de la homeostasisde K+ y Na+ es de vital importancia en célulasvegetales. Estas necesitan mantener altas lasconcentraciones de K+, entre 100 y 200 mM,para realizar de forma adecuada las reaccio-nes metabólicas (Rodríguez-Pérez, 2006); porlo que se puede plantear que la tolerancia ala salinidad requiere no solo la adaptación ala toxicidad provocada por el Na+, sino tam-bién, a la adquisición de K+, cuya toma por la


planta se afecta debido a la semejanza quími-ca entre ambos iones (Wang et al., 2007). Deahí que las membranas y sus componentesnecesarios para la toma y distribución deiones y solutos, se consideran determinantesen el desarrollo de plantas tolerantes al lasalinidad (Senthilkulmar et al., 2005). Lostransportadores, canales, simportes y anti-portes, son los principales involucrados en elfenómeno de transporte a nivel de planta.Por otro lado los niveles de sodio, deben sermenores que 1mM en el citoplasma, cual-quier exceso tiene que ser excluido fuera dela célula o almacenado dentro de la vacuola(Vera-Estrella et al., 2005).

Daños causados por el exceso de Na+:

1. Interrupción del equilibrio iónico: elinflujo de Na+ disipa el potencial demembrana y facilitan la toma de Cl- encontra del gradiente químico.

2. El Na+ es tóxico al metabolismo celular ytiene efecto deletéreo en el funciona-miento de algunas enzimas.

3. Altas concentraciones de Na+ causan des-balance osmótico, desorganización de lamembrana, reducción en el crecimiento,inhibición de la división y expansión celular.

4. Altos niveles de Na+ también conducen ala reducción en la fotosíntesis y al incre-mento en la producción de especies reacti-vas del oxígeno (Mahajan y Tuteja, 2005).

Mientras que, como hemos visto, el excesode Na+ en las células, conduce a respuestasfisiológicas que afectan los proceso de divi-sión y crecimiento a nivel celular (Tester yDavenport, 2003; Zhu, 2003; Shi et al., 2003),el potasio, es uno de los elementos minera-les esenciales en las células vegetales.

Las funciones del K+ en la célula vegetal son:

1. Mantener el balance osmótico.

2. Participar en los procesos de apertura ycierre estomático.

3. Ser cofactor esencial para muchas enzi-mas tales como la piruvato quinasa.

4. Mantener la turgencia celular.

5. Unir los ARNt a los ribosomas, de ahí suimportancia en la síntesis de proteínas(Chinnusamy et al., 2005).

El mantenimiento de altas concentracionesde K+ y bajas concentraciones de Na+ en elcitosol se logra a través de una regulacióncoordinada de los transportadores para H+,K+, Ca++, Na+. Las H+-ATPasas de la mem-brana plasmática, sirven como bombas pri-marias, que generan un gradiente protóni-co, que facilita el transporte de otrossolutos, incluyendo el Na+ y K+ (Zhao et al.,2008). Este sistema es un componente de larespuesta de la planta a la salinidad. Lascélulas vegetales emplean, además deltransporte activo primario, mediado porH+-ATPasas, el transporte activo secundario,mediado por canales y cotransportadores,para mantener en el citosol concentracionesaltas de K+ y bajas de Na+ (Bartels y Raman-julu, 2005).

Existe una mayor comprensión sobre los sis-temas de transporte y mecanismos regula-torios que median la relación Na+/K+ encélulas vegetales; éstos corresponden a lossistemas de transporte de alta y baja afini-dad ubicados en el plasmalema y en el tono-plasto (Demidchik et al., 2002; Zhu, 2002;Zhu, 2003). Las proteínas integrales demembrana actúan como transportadoras,sufriendo un cambio corformacional duranteel transporte del ión y operando en contrade gradientes de concentración energizadospor gradientes electroquímicos (antiporteNa+/H+, simporte K+/H+, simporte K+/Na+)(Berthomieau et al., 2003; Sul et al., 2003).Un tipo de transportador de los iones Na+ yK+ bien reconocido es el perteneciente a lafamilia de los HKT, identificado y evaluadoen Arabidopsis (Rus et al., 2004), arroz(Fukuda et al., 2004) y trigo (Laurie et al.,


2002), entre otros. El HKT, transportador dealta afinidad para K+ y descrito en Arabi-dopsis, funciona acoplado al Na+ y contri-buye al suministro de este ión en suelos sali-nos. Bajo concentraciones altas de Na+, elHKT puede tener más importancia fisiológi-ca en el transporte de Na+ que en el de K+(Rus et al., 2004).

En arroz (Oryza sativa cv. Nipponbare) sedemostró que el suministro de Na+ y K+está mediado por diferentes transportado-res y que el K+ se bloquea por el transpor-tador de Na+. La expresión del OsHKT1 yel HKT4 demuestra que éstos son transpor-tadores de alta y baja afinidad para Na+.Los transportadores OsHKT están involu-crados en el transporte de Na+ en arroz, yel OsHKT1 media específicamente el sumi-nistro de Na+ en las raíces cuando estasplantas son deficientes en K+ (Fukuda,2004).

Existen transportadores muy selectivos parael K+, con una elevada afinidad por este ion(10-50 mM), pero que también puedentransportar Na+ con baja afinidad y ser blo-queados por altas concentraciones de Na+

en el medio (Rodríguez-Navarro, 2000).Entre estos transportadores están los detipo KUP-HAK de cebada y Arabidopsis. Porel contrario, Los transportadores de HKTmanifiestan una alta afinidad por Na+ y ensistemas heterólogos se comportan comosimportes Na+/K+ o uniportes de Na+ (Horieet al., 2001). Su función fisiólogica es incier-ta pero la evidencia genética indica que laproteína HKT1 de Arabidopsis es una víasustancial de entrada de Na+ en la planta(Rus et al., 2001). El transportador de bajaafinidad, LCT1, también es permeable alNa+, pero su contribución relativa a la cap-tación de Na+ es desconocida.

Los canales iónicos constituyen otro sistemade transporte que permite la disipaciónrápida de un gradiente iónico establecido a

través del plasmalema. Se conocen trestipos de canales que pueden mediar en laentrada o salida de iones como K+ y Na+ através del plasmalema (Rodríguez-Navarro,2000), denominados canales rectificadoresde entrada de K+ (KIRC), canales rectificado-res de salida de K+ (KORC), y canales inde-pendientes del voltaje (VIC) (Rubio et al.,2004). La selectividad K+/Na+ de estos cana-les iónicos varía ampliamente (Demidchik,2007). Los canales KIRC y KORC son alta-mente selectivos para K+ en condicionesfisiológicas de crecimiento. Sin embargo, loscanales de tipo KIRC pueden permitir unaentrada significativa de Na+ a largo plazoen un medio salino, debido a que en esascondiciones presentan una conductividadiónica máxima y el gradiente electroquími-co de Na+ es elevado (Amtmann y Sanders,1999). Por el contrario, aunque los canalesde tipo VIC representan una pequeña frac-ción de la conductividad total de la mem-brana, no discriminan entre Na+ y K+. Consi-derando en su conjunto la abundancia ycaracterísticas funcionales de los distintoscanales iónicos, se ha estimado que los VICconstituyen la vía principal de entrada deNa+ en las células vegetales (Amtmann ySanders, 1999). La actividad de los VIC pare-ce modulada por nucleótidos cíclicos (cAMPy cGMP), por lo que podrían ser equivalentesa los canales de tipo CNCG (cyclic nucleotide-gated channels) caracterizados originalmen-te en células animales y que también estánpresentes en las células vegetales (Donalsonet al., 2004).

Si se produce una entrada importante deNa+ en el citosol, la relación K+/Na+ fisiológi-ca debe ser restablecida para evitar el efec-to tóxico del Na+ (Anil et al., 2007). Esto seconsigue en algunas especies con un siste-ma de transporte localizado en la membra-na vacuolar (tonoplasto), que permite acu-mular Na+ en la vacuola de manera activa,en contra del gradiente electroquímico del


Na+. Este sistema consiste en un antiporta-dor Na+/H+ (denominado NHX) que acoplala entrada de Na+ a la salida de H+. La pre-sencia de una actividad antiportadoraNa+/H+ se detectó primero en tonoplasto deespecies tolerantes a salinidad como remola-cha y cebada, donde se inducía por la pre-sencia de NaCl en el medio (Barkla y Pantoja,1996). No obstante, la evidencia moleculardisponible indica que estas proteínas sonubicuas en las plantas. En el genoma de Ara-bidopsis thaliana, completamente secuen-ciado, se reconocen hasta 6 isoformas dife-rentes de genes NHX (Maser et al., 2001;Yokoi et al., 2002). La compartimentacióndel Na+ en la vacuola, al tiempo que liberaal citosol del exceso de Na+, contribuye adisminuir el potencial osmótico y ajustar elpotencial hídrico celular para permitir laabsorción de agua durante el estrés salino.Además, la proteína NHX1 de Arabidopsistiene la capacidad de transportar tanto Na+como K+, pudiendo contribuir al balanceosmótico celular y tisular en cualquier con-dición de crecimiento de la planta (Leidi yPardo, 2002).

Verma y colaboradores (2007) clonaronuna nueva isoforma del antiporte vacuolarNa+/H+ en Pennisetum glaucum (PgNHX1),la cual contiene cinco dominios transmem-brana en contraste con la isoforma de Ara-bidopsis AtNHX1 que contiene nuevedominios transmembranales. La sobreex-presión de PgNHX1 en arroz también con-fiere tolerancia a la salinidad debido a quelas plantas transgénicas desarrollan un sis-tema radical más extenso y completan suciclo de vida en presencia de 150 mM deNaCl.

Otro sistema importante para conseguir lareducción del Na+ citosólico es la expulsiónal medio extracelular, proceso tambiénconocido como extrusión (Flowers y Colmer,2008). La extrusión de Na+ se produce enhongos y algunas especies de algas marinas

por bombas (ATPasas) transportadoras deNa+ (Gimmler, 2000), mientras que en lamayoría de las algas y en plantas superioresestá mediada por antiportadores Na+/H+ delplasmalema (Blumwald et al., 2000; Shi etal., 2000). La actividad de antiportadoresNa+/H+ en el plasmalema, que expulsan Na+

al exterior de la célula en un intercambiopor H+, requiere un gasto energético ya quedebe efectuarse en contra de un gradientede potencial electroquímico. La inducciónen tomate de una ATPasa transportadora deH+ de plasmalema por el estrés salino podríaresponder a la necesidad de generar el gra-diente de protones requerido por el anti-portador Na+/H+ (Kalampanayil y Wimmers,2001).

Se ha sugerido que la extrusión de Na+

podría constituir a largo plazo un serio pro-blema en las células de algunos tejidos,como las hojas, ya que la acumulaciónextracelular de Na+ podría ser aún más dañi-na que su inclusión al generar un déficithídrico extremo (Yeo, 1998). Además dereducir el contenido celular de Na+, el anti-portador Na+/H+ del plasmalema de Arabi-dopsis, SOS1, también media en el transpor-te de Na+ desde la raíz al mesófilo foliar y esesencial para la redistribución del Na+ entrelos tejidos vegetales (Shi et al., 2002). Unfactor determinante del daño celular enarroz es la deshidratación producida por laacumulación de sales en el espacio extrace-lular (Flowers et al., 1991) de la que podríano ser ajena la actividad de ese antiporte.Sin embargo, el balance neto de la actividadantiportadora Na+/H+ en el plasmalemadeber ser positivo para la planta ya que losmutantes sos1 de Arabidopsis, carentes dedicha actividad, son extremadamente sensi-bles a NaCl. Por razones todavía desconoci-das, los mutantes sin SOS1 o en los que suactividad está disminuida (mutantes SOS2 ySOS3) son incapaces de tomar K+ a bajasconcentraciones exteriores (Zhu, 2000).


Papel del calcio en la respuesta de la plantaal estrés salino

El papel del ión Ca2+ en la respuesta de lasplantas a salinidad resulta esencial, por supapel señalizador, su función estructural enla membrana y su efecto sobre la actividadde algunos transportadores iónicos (Klimec-ka y Muszynska, 2007). La presencia de Ca2+

puede reducir la magnitud del efecto nega-tivo de la salinidad en el crecimiento, fenó-meno que se ha atribuido al efecto estabili-zador de la membrana y al mantenimientode su capacidad selectiva (Marschner, 1995).El Ca2+ extracelular podía reducir la pérdidade K+ inhibiendo los canales de salida KORC(Murata et al., 2000), y disminuir la entradade Na+ mediante la inhibición de canalesKIRC y sobre todo VIC (Maathuis y Amt-mann, 1999). Por otra parte, el Ca2+ intrace-lular tendría un papel no menos esencial enla absorción de K+ y la selectividad K+/Na+

en condiciones salinas mediante la modula-ción de otros transportadores iónicos comoSOS1 (Zhu, 2000). La expresión del gen SOS1es dependiente del complejo SOS2/SOS3,donde SOS2 es una proteína quinasa y SOS3es una proteína sensora de Ca2+ (Hussain etal., 2008). Se conoce que el papel del Ca2+ escomplejo, ya que actúa como intermediarioen la cascada de señales que conducen a latranscripción de numerosos genes involu-crados en la respuesta adaptativa (Chinnu-samy et al., 2005).

Proteínas LEA, HSP y poliaminas

Proteínas LEA

La salinidad, así como las altas temperaturasy la sequía, pueden causar la desnaturaliza-ción y la pérdida de sus funciones en nume-rosas proteínas. Las HSP (siglas en inglés:heat shock protein) y las proteínas LEA(siglas en inglés: late embryogenesis abun-

dance) ayudan a proteger las proteínascelulares contra el estrés, controlando elplegamiento y la conformación de las pro-teínas estructurales y enzimas (Wang et al.,2004). Además se ha demostrado que lasproteínas LEA y las chaperonas están involu-cradas en la protección de moléculas, talescomo enzimas, lípidos y ARNm, de la deshi-dratación (Sairam y Tyagi, 2004).

Durante el desarrollo y la maduración,cuando tiene lugar una desecación natural,las semillas acumulan transcriptos y proteí-nas en una concentración relativamentealta, por esta razón, donde primero seencontraron estas proteínas, fueron llama-das LEA (Kalemba y Pukacka, 2007). Las pro-teínas LEA son un grupo de proteínas indu-cibles por el ABA y originalmente se sugirióque pueden estar asociadas con la toleranciaa la desecación durante la maduración de lasemilla y también inducidas por la salinidady el déficit de agua (Vital Vas et al., 2007).Las proteínas LEA se agrupan en al menosseis familias, en base a homologías en susecuencia aminoacídica. El déficit de agua, laalta osmolaridad y bajas temperaturas, con-llevan a la acumulación de un grupo de pro-teínas LEA. Actualmente se ha demostradoque estas proteínas pueden preservar laestructura proteica (Umezawa et al., 2006)y la integridad de la membrana, preservan-do el agua, impidiendo la desnaturalizaciónde proteínas y renaturalizando las proteí-nas ya desplegadas, además secuestrandoiones en los tejidos estresados (Sairam yTyagi, 2004).

Se han identificado varios grupos de proteí-nas LEA en cereales, de las cuales las perte-necientes al grupo 2, también llamadasdehidrinas son las proteínas solubles máseminentes, inducidas por el estés osmótico(Roychoudhury y Basu, 2008).

El gen HVA1 que codifica para la proteínaLEA es inducido por el ABA y varios tipos de


estrés, por ejemplo la salinidad. Plantastransgénicas de arroz que expresan el HV1,conducida por un promotor constitutivo delgen de la actina, mostraron un incrementosignificativo de la tolerancia a la salinidad(Xu et al., 1996). Los mecanismos involucra-dos en la acción de este gen no están clarospero los autores proponen que el incremen-to de la tolerancia a la salinidad pudieradeberse a la estabilización de estructurascelulares.

Otros investigadores evaluaron la tercerageneración de plantas trangénicas de avena(Avena sativa L.) que expresan el gen HVA1de cebada, el gen de la ß-glucuronidasa(uidA; gus) y el gen de resistencia a herbici-das bar. En comparación con las plantascontrol, las plantas transgénicas mostraronmayor crecimiento y un significativo incre-mento en la tolerancia a condiciones salinasestresantes (200 mM NaCl) para característi-cas como: altura de la planta, área foliar,longitud de la raíz, longitud de la panícula,número de espigas por panícula, número detallos por planta, entre otras características.Plantas transgénicas de tabaco expresan elgen Rab16A, proveniente de la variedadindia de arroz Pokkali, que codifica parauna proteína LEA del grupo 2. La expresióndel gen está controlada por un promotorinducible por la salinidad, lo que conlleva auna acumulación de la proteína en las hojasde las plantas transgénicas sometidas a estetipo de estrés. Las mismas mostraron unincremento significativo en la tolerancia ala salinidad y tasas de crecimiento sosteni-das bajo condiciones estresantes. Adicional-mente mostraron un incremento en la pro-ducción de osmolitos tales como azúcaresreducidos, prolina y poliaminas. Tambiénmostraron una mejor maquinaria antioxi-dante y un balance mineral más favorable,lo que se reflejó en los reducidos niveles deperóxido de hidrógeno y de peroxidaciónlipídica, menor pérdida de clorofila, así

como menor acumulación de sodio y mayoracumulación de potasio. Estos resultadosestablecen el posible papel del gen Rab16Aen conferir tolerancia a la salinidad sin afec-tar el crecimiento y el rendimiento de lasplantas transformadas. También sugieren elconsiderable potencial de los genes quecodifican para el grupo 2 de proteínas LEA,para obtener plantas tolerantes a la salini-dad a través de la ingeniería genética (Roy-Choudhury, 2007).

HSP

La familia de proteínas Dnak/Hsp70, chape-ronas moleculares pueden unirse a otrasproteínas en estado no nativo y ayudarlas aalcanzar su conformación funcional, en lamayoría de los casos con gasto de ATP (Bos-ton et al., 1996). Tabaco transgénico trans-formado con el gen Dnak1, que proviene dela cianobacteria halotolerante Aphanothe-se halophytica, que sobreexpresan estasproteínas en el citosol (Sugino et al., 1999).Después de tres días de tratamiento con 0.6M de NaCl, la tasa de fijación de CO2, fuemarcadamente mejor en las plantas trans-génicas. El contenido de sodio en las plantascontrol se incrementó después del trata-miento salino, mientras que permanecióconstante en las plantas transgénicas.

Se han descrito correlaciones positivas entrelos niveles de varias HSP y la tolerancia alestrés (Wang et al., 2004). Zhou y colabora-dores (2007) encontraron la inducción decinco genes homólogos, inducidos por elestrés salino en plántulas de tomate, confunciones de chaperona, entre los cuales seencontraban las HSP (U217418, U218323).Por otro lado se ha estudiado ampliamenteel incremento en la expresión de HSP bajocondiciones de estrés abiótico, a través de lagenómica funcional y la proteómica, endiferentes especies de plantas (Kore-eda etal., 2004).


Poliaminas

Las poliaminas (PAs) son moléculas nitrogena-das alifáticas presentes en todos los organis-mos vivos y ubicuas en el reino vegetal (Mos-chou et al., 2008). En los últimos años se hanrecopilado numerosas evidencias respecto alrol que estos compuestos juegan en la res-puesta de las plantas al estrés biótico y abióti-co, y respecto a su función como potencialescompuestos antioxidantes. La diamina putres-cina, la triamina espermidina y la tetraaminaespermina son las tres principales poliaminasque se encuentran en los organismos vivos. ApH fisiológico se encuentran cargadas positi-vamente y esta propiedad les permite interac-tuar con macromoléculas que poseen carganegativa, como el ADN, el ARN, proteínas yfosfolípidos. De esta manera las PAs estánimplicadas en la regulación de las propieda-des físicas y químicas de la membrana, laestructura de los ácidos nucleicos y la modula-ción de actividades enzimáticas, además deser reconocidas como esenciales en los proce-sos de proliferación y diferenciación celular.En las plantas, la putrescina se forma median-te la decarboxilación de la arginina o de laornitina, reacción catalizada por la argininadecarboxilasa (ADC) o por la ornitina descar-boxilasa, respectivamnente (Liu et al., 2006).

La diamina putrescina y las poliaminas,espermidina y espermina están presentesprobablemente en todas las plantas, mien-tras que la diamina cadaverina, aparece den-tro de la familia Leguminossae. En condicio-nes de salinidad y sequía, las poliaminas y lasactividades enzimáticas involucradas en susíntesis se incrementan sustancialmente. Sufunción en situaciones de estrés salinopudieran ser, estabilizar el ADN mitocon-drial y cloroplástico, estimulación de la bio-síntesis proteica y estabilización de bio-membranas (Roy y Wu, 2000).

En los últimos años se ha utilizado la ingenie-ría genética para incrementar la biosíntesis de

varias poliaminas específicas, lo que ha posibi-litado obtener plantas tolerantes al estrés sali-no. El aumento en la expresión de la enzimaarginina descarboxilasa, induce un incremen-to significativo en los niveles de putrescina ypequeño incremento en los niveles de esper-mina y espermidina (Vinocourt, 2005).

Kasubaba y colaboradores (2004) trabaja-ron para sobreexpresar el ADNc de la enzi-ma espermidina sintasa de Curcubita ficifo-lia en Arabidopsis thaliana y obtuvieronelevados niveles de espermidina y conse-cuentemente un incremento en la toleran-cia a varios tipos de estreses.

La acumulación de putrescina durante elestrés ambiental se correlaciona con el incre-mento de la actividad de la enzima argininadescarboxilasa en avena. Estudios con zana-horia transgénica, que expresa la enzimaornitín descaboxilasa (ODC) mostraron queestas plantas fueron significativamente mastolerantes al estrés salino y a la sequía (Bon-hert et al., 1995).

Las poliaminas han ganado importancia enel escape de las plántulas de condicionesadversas. Lin y Kao (1995) señalaron unincremento en los niveles de espermidinaen condiciones salinas, pero un bajo nivelde putrescina en el tallo y las raíces de plán-tulas de arroz. La acumulación de espermi-dina espermina con el incremento de la acti-vidad de la enzima ADC en plántulas dearroz juega un papel específico en la tole-rancia a la salinidad.

Plantas transgénicas de arroz con el ADNcde ADC, mostraron un incremento de la bio-masa en condiciones de estrés salino, com-parados con las plantas utilizadas comocontrol. Plantas de maíz sometidas a estréssalino durante 8 días incrementan su conte-nido de putrescina y espermidina en sus raí-ces y hojas, siendo el incremento en lashojas mayor que el de las raíces (Caldevia etal., 1999).


Síntesis de compuestos osmoprotectores

El ajuste osmótico mantiene el contenidocelular de agua cuando se presenta unareducción en el potencial osmótico, comoconsecuencia de la acumulación de solutosorgánicos en el citoplasma y en la vacuolaen situaciones de estrés por salinidad en elsuelo (Serraj y Sinclair, 2002). Los solutoscompatibles (osmolitos, citosolutos) sonmetabolitos hidrofílicos, entre los que sedestacan azúcares (sacarosa y fructosa),aminoácidos (prolina y betaína), glicerol,manitol y otros metabolitos de bajo pesomolecular (Chen y Murata, 2002; Pommerre-nig et al., 2007). Los solutos compatibles nointerfieren con el metabolismo normal delas células; se acumulan en el citoplasma yen la vacuola en altas concentraciones bajocondiciones de estrés osmótico, tienen unpapel primario en el mantenimiento de ladisminución del potencial osmótico en elcitosol y están involucrados en la estabili-dad de proteínas y estructuras celulares(Zhu, 2003; Bartels y Ramanjalu, 2005). Engeneral, son varios los efectos de los solutoscompatibles en las plantas: los azúcares, porejemplo, interactúan con las cabezas pola-res de los fosfolípidos para prevenir lafusión de la membrana (Chen y Murata,2002); los aminoácidos, por su parte, pue-den actuar como osmolitos en la regulacióndel transporte de iones y tienen efecto en lasíntesis y la actividad enzimática (Ray, 2002).

En los siguientes epígrafes haremos referen-cia individual a varios compuestos osmopro-tectores y cómo sus rutas metabólicas, tantode síntesis como de degradación, han sidoobjeto de manipulación a través de la inge-niería genética para la obtención de plantastolerantes al estrés salino.

Prolina

La prolina es un aminoácido que constituye elcompuesto osmoprotector más común que se

acumula en las plantas en respuesta al estréshídrico y a la salinidad (Chen et al., 2007).Aunque la prolina puede sintetizarse a partirdel glutamato o la ornitina, el glutamato es elprincipal precursor en la síntesis de la prolina,en células osmóticamente estresadas (Hur etal., 2004). La ruta biosintética de la prolinaincluye dos enzimas importantes: pirrolín car-boxilato sintetasa (P5CS) y pirrolín carboxilatoreductasa (Parvaiz y Satyawati, 2008). Lostranscriptos correspondientes a los ADN com-plementarios que codifican para estas enzi-mas, se acumulan en la célula como respuestaal tratamiento con NaCl. Ambos pasos catalíti-cos son claves para el desarrollo de estrategiaspara la aumentar la producción de prolina endeterminadas plantas. Además, los interme-diarios en la biosíntesis y el catabolismo de laprolina, tales como la glutamina y el pirrolín-5-carboxilato, pudieran incrementar la expre-sión de varios genes regulados osmóticamenteen el arroz (Iyer y Caplan, 1998).

La acumulación de prolina se ha provocadoen diferentes especies de plantas incremen-tando su síntesis o impidiendo su degrada-ción, mediante la manipulación de las enzi-mas P5CS y prolina deshidrogenasa. Lasobreexpresión en tabaco del gen P5CS pro-venientes de frijol mungo resultó en la acu-mulación de prolina 18 veces más que lasplantas control, incrementando la produc-ción de biomasa en condiciones de estréssalino (Kishor et al., 1995)

La expresión del transgén de la enzima P5CSde frijol, bajo el control de un promotorinducible por el estrés, conduce a la sobre-producción inducida por estrés de la enzimaP5CS y la acumulación de prolina en plantastransgénicas de arroz. La segunda genera-ción de plantas transgénicas mostraron unincremento en la biomasa bajo estrés salino(Zhu et al., 1998).

La transformación genética de plantas deArabidopsis con la enzima prolina deshidro-genasa antisentido (Mani et al., 2002) o


“knockout” de esta enzima (Nanjo et al.,2003), conllevó al incremento de la acumu-lación de la prolina libre y a un mejor creci-miento bajo condiciones salinas. En trigo seobserva que la actividad de la enzima gluca-nil kinasa (GK), y las concentraciones deprolina y glicin betaína se incrementandurante el estrés y tienen mayor actividaden los brotes que en las raíces (Nayyar,2003). En plantas de maíz se observa unincremento considerable en la acumulaciónde prolina; igualmente, se presenta unincremento en la actividad de la enzimaprolina deshidrogenasa (PDH), tanto enmaíz como en trigo.

Glicín-betaína

La glicín betaína se sintetiza a partir de lacolina en dos pasos, el primero es catalizadopor la enzima colina monooxigenasa condu-ciendo a la síntesis de aldehído de betaína,el cual es posteriormente oxidado por laenzima betaín aldehído deshidrogenasa. Elestrés por salinidad induce ambas activida-des enzimáticas (Sairam y Tyagi, 2004). Se hademostrado que la acumulación de glicín–betaína en células de un número de halófi-tas y bacterias es una respuesta adapatativaa la salinidad. La oxidación de la colina aaldehído de betaína es la ruta biosintéticapredominante en los organismos producto-res de betaína (Rhodes y Hanson, 1993). Elprimer paso difiere entre varios organismosacorde al tipo de enzima. Este paso es catalizado por una flavoproteína-oxidasa(COXEC1.1.3.17) en algunas bacterias y hon-gos, por una monooxigenasa soluble depen-diente de ferreodoxina (CMO) en los cloro-plastos de plantas superiores, o por unacolina deshidrogenasa asociada a membranapobremente caracterizada (CDHEC1.1.99.1)(Huang et al., 2000).

Se ha informado por Lilius y colaboradoresque plantas de tabaco transgénico con un

gen de E. Coli que codifica para la enzimacolina deshidrogenasa, fueron más toleran-tes a condiciones salinas que las plantas sinmodificar, la tolerancia se midió como dife-rencia en el peso seco (Lilius et al., 1996). Liy colaboradores (2003) clonaron el gen de laenzima betaína aldehído deshidrogenasaproveniente de Suaeda liaotungensis y loutilizaron para mejorar la tolerancia a lasalinidad en plantas transgénicas de tabaco.

Por otro lado se ha comprobado que existenevidencias genéticas de que la glicín betaínamejora la tolerancia a la salinidad en cebaday en maíz (Arakawa, 1990). Líneas isogénicasde cebada que contienen diferentes nivelesde glicín betaína, muestran diferentes capa-cidades para el ajuste osmótico.

El gen cod A, aislado de la bacteria del sueloArtrobacter globiformis, codifica la colinaoxigenasa. Esta enzima convierte la colinaen glicín betaína. La transformación deplantas de Arabidopsis thaliana con el gencodA, posibilita que las plantas acumulenglicín betaína y se incremente la toleranciaal estrés salino (Hayashi et al., 1997). Lassemillas de estas plantas transgénicas soncapaces de germinar en 300 mM de NaCl,mientras las semillas de tipo silvestre nofueron capaces de germinar. Además lasplantas transgénicas mantienen la actividaddel fotosistema II bajo estrés salino.

Plantas transgénicas de arroz que expresanel gen codA, pero con la proteína codificadadirectamente en los cloroplastos, son mástolerantes que las plantas transgénicas queexpresan la enzima en el citosol. Este resul-tado sugiere que la función protectora de laglicín betaína es más eficiente cuando esproducida en el organelo fotosintético.

Otro paso en la síntesis de de glicín betaínaes catalizado por la enzima betaín deshidro-gensa (BADH). Plantas transgénicas de taba-co que expresan el gen BADH acumularonuna mayor cantidad de glicín betaína en el


citosol y en los cloroplastos, exhibiendo unincremento en la tolerancia al estrés salino(Holmstrom et al., 2000). También mostraronuna disminución de la fotoinhibición duran-te el estrés salino lo que causó un incrementoen el peso fresco relativo, en relación delfenotipo silvestre. Similares resultados deobtuvieron en plantas transgénicas de taba-co que sobreexpresan la enzima BADH deespinaca, en lugar de la BADH de un organis-mo procariota (Sakamoto et al., 1998).

Los niveles de glicín betaína en especies de lafamilia Poaceae se correlacionan con la tole-rancia a la salinidad. Los géneros altamentetolerantes Spartina y Distichlis acumulan losmayores niveles de glicín betaína, las espe-cies moderadamente tolerantes acumularonniveles intermedios y las especies sensiblesacumulan bajos niveles de glicín betaína o nola sintetizan (Sairam y Tyagi, 2004).

Alcoholes- azúcares

Manitol

El polialcohol manitol es una molécula quepuede actuar como osmoprector. Plantas detabaco transgénico transformadas con el genmtlD de E. Coli, que codifica para la enzimamanitol-1-P deshidrogenasa, acumularonmanitol y mostraron un incremento en el cre-cimiento de las plantas sometidas a estréssalino, en comparación con las plantas con-trol (Tarczynski et al., 1993). Estudios poste-riores revelaron que el incremento en el con-tenido de manitol no fue suficiente paraexplicar la tolerancia, basándose solamenteen el ajuste osmótico por lo que se asignó aesta molécula una posible función antioxi-dante (Karakas et al., 1997). Plantas de Ara-bidopsis transformadas con el mismo gen,fueron capaces de germinar en presencia deuna concentración inhibitoria de sales. Sinembargo, a diferencia de las plantas de taba-co transformadas, las plantas de Arabidopsisno toleraron el estrés salino prolongado.

Otros investigadores obtuvieron tres líneastrasgénicas de arroz con el mencionado genmtlD y demostraron que la biosíntesis y laacumulación de manitol en plantas se correla-ciona con la tolerancia al estrés salino de lasmismas (Su et al., 1999). Plantas de trigo trans-génico con este gen fueron más tolerantes alestrés por sequía y por salinidad (Abebe et al.,2003). Las plantas transformadas mostraronun incremento en la biomasa altura de la plan-ta y número de tallos secundarios. Sin embar-go la cantidad de manitol acumulado fue muypequeña para tener en cuenta su efecto comoosmolito y se sugiere que pudiera actuar comodesactivador de radicales libres, aunque tam-bién pudiera actuar como protectores y estabi-lizadores de enzimas, o estructuras de mem-branas que son sensibles a deshidratación odaños inducidos por el exceso de algunosiones (Parvaiz y Satyawati, 2008).

Sorbitol

Este azúcar alcohol de glucosa se encuentraen una variedad de especies, usualmentecomo constituyente de la semilla. La acumula-ción de sorbitol se ha reportado en muchasplantas de cultivo (Kuo et al., 1990). En elgénero Rosaceae, su función es servir comocarbohidrato de translocación. En la plantahalotolerante Plantago maritima se haencontrado en partes vegetativas (Pomme-ring, 2007). En esta planta el incremento dela salinidad de 0 a 400molm3 conlleva a unincremento de 8 veces la concentración desorbitol en los tejidos del tallo y de 100veces en los tejidos de la raíz. La acumula-ción de sorbitol en esta planta tiene funciónosmorreguladora y su acumulación en semi-llas sugiere que puede contribuir a la tole-rancia a la desecación del embrión maduro.

Pinitol-ononitol

Los alcoholes cíclicos pinitol y ononitol sealmacenan en una variedad de especies


expuestas a condiciones salinas, o acumula-das en especies tolerantes cuando se expo-nen a un ambiente salino. Plantas halófitasfacultativas tales como M crystallinum, acu-mulan estos compuestos solamente cuandose someten a estrés hídrico y salino. La rutasintética propuesta consiste en la metilacióndel mioinositol para obtener el intermedia-rio ononitol, seguido d la epimerización apinitol (Sairam y Tyagi, 2004). Se aisló unADN complementario que codifica para laenzima inositol-metil- transferasa, inducidaen plantas de Mesembryanthemum por elNaCl (Vernon et al., 1992). Se obtuvieronplantas transgénicas de tabaco que expre-san esta enzima. El crecimiento de las plan-tas transformadas y sin transformar es simi-lar en ausencia de estrés, pero en presenciade condiciones salinas las plantas trangéni-cas mostraron ventajas con respecto a lasplantas control.

Trealosa

El metabolismo del carbono y los niveles deazúcares específicos se afectan severamentepor el estrés abiótico. La trealosa es un disa-dárido no reductor presente en muchas bac-terias y hongos, así como en muchas plantassuperiores tolerantes al estrés hídrico. Lasfunciones que se sugieren para la trealosason proteger las membranas y proteínas delas células expuestas al estrés hídrico y redu-cir la agregación de proteínas desnaturali-zadas (Parvaiz y Satyawati, 2008).

Pequeños aumentos en los niveles de trea-losa en plantas transgénicas conllevan a unamayor tasa fotosintética y a una disminu-ción del daño fotooxidativo durante elestrés. Se supone que la trehalosa protegelas biomoléculas del estrés salino y otrostipos de estrés ambientales, por su capaci-dad reversible de absorción de agua y evitarlos daños producidos por la desecación(Pena, 2003).

Plantas que expresan enzimas relacionadascon la síntesis de la trealosa (ots A) mostra-ron un incremento en la tolerancia a la sali-nidad (Pilon-Smith et al., 1998). El gen delevadura que codifica la enzima trehalosa-6-P-sintetasa introducido en tabaco y melónmejora la tolerancia al estrés salino, medidacomo el aumento del crecimiento de laplanta. Sin embargo los autores observaronmuchos efectos pleiotrópicos en estas plan-tas transgénicas, lo que sugiere que estamolécula está involucrada en otros procesosfisiológicos de la planta (Borsani, 2003).

Mecanismos de defensa frente al estrésoxidativo

La salinidad como causa del estrésoxidativo

Un efecto secundario de la salinidad es laformación de especies reactivas del oxígenoo radicales libres (Koprivova et al., 2008).Durante la fase luminosa de la fotosíntesisse genera oxígeno molecular. Factores abió-ticos estresantes que inhiben las funcionesdel ciclo de Calvin (como la fijación de CO2 yel consumo de NADPH2) agravan la situa-ción. El estrés salino induce el cierre de losestomas, limitando la disponibilidad de CO2en la célula (Sirichandra et al., 2009) mien-tras que al mismo tiempo prosigue el trans-porte electrónico provocado por la luz. Laabsorción de luz por las hojas excede enton-ces la demanda de la fotosíntesis, y el exce-so de energía de excitación conduce a unasobrereducción de la cadena de transporteelectrónico. En términos moleculares, undesbalance en el consumo del NADPH2, enla asimilación (durante la fijación del carbo-no) y la necesidad de la cadena de transpor-te electrónico de regenerar el aceptor elec-trónico en el fotosistema I (NADP), puedeconducir a la transferencia del electrón aaceptores alternativos. La formación de


especies reactivas del oxígeno se iniciaentonces por la reducción univalente deloxígeno, o por la transferencia del excesode energía de excitación al oxígeno. Latransferencia de electrones (uno, dos o tres)conduce a la generación del radical superó-xido, peróxido de hidrogeno, o al radicalhidroxilo, respectivamente (Mittler, 2002).

En resumen podemos plantear que la secuen-cia más probable de eventos que ocurrencon el incremento de la salinidad es: déficitfisiológico de agua, cierre de los estomasregulados por el ABA, baja disponibilidadde CO2, sobrerreducción de la cadena detransporte electrónico y finalmente la gene-ración de radicales libres. Esta condición lla-mada estrés fotooxidativo o estrés oxidati-vo, es también un término subrayado en larespuesta de las plantas a otros tipos deestrés como la sequía, temperaturas extre-mas y exceso de luz (Jithesh et al., 2006).

Después del tratamiento estresante con NaClocurre el estrés oxidativo en muchas especiesde plantas (del Río, 2006). Se ha señalado elpapel importante del radical superóxido y elperóxido de hidrógeno en los daños quesufre la planta sometida a estrés salino, enVigna unguiculata, Vigna catjand y Oryzasativa. Otros estudios han establecido la rela-ción entre el incremento de la capacidadantioxidante y la tolerancia a la salinidad endiferentes especies tales como chícharo,tomate y cítricos (Jithesh et al., 2006). Todosestos estudios confirman que en plantassometidas a estrés salino existe un desbalan-ce entre la producción de especies reactivasdel oxígeno y la actividad antioxidante, con-duciendo a un daño por estrés oxidativo.

Mecanismos de defensa de las plantasfrente al estrés oxidativo

Las especies reactivas del oxígeno en ausen-cia de mecanismos protectores pueden cau-

sar daños serios en diferentes estructuras yfunciones celulares (Del Río, 2006). El radi-cal hidroxilo es un radical libre altamentetóxico, capaz de iniciar la peroxidación lipí-dica y dañar el ADN, las proteínas y otrasmoléculas pequeñas (Liu et al., 2008). Lasplantas por tanto deben ser protegidas ade-cuadamente por un número de mecanismosantioxidantes para eliminar los radicaleslibres. Las vías de la planta para enfrentar elestrés oxidativo comprenden dos compo-nentes, los enzimáticos y los no enzimáticos(Dastidar et al., 2006).

Los componentes no enzimáticos son antio-xidantes tales como el tocoferol (Liu et al.,2008), carotenoides, ascorbato y glutatión,que son moléculas scavengers o desactiva-dores de radicales libres (Hung et al., 2005).Los componentes enzimáticos comprendenenzimas tales como: superóxido dismutasa(SOD), catalasa, ascorbato peroxidasa (APX)(Gulen et al., 2008), monohidroascorbatoreductasa (MHAR) y glutatión reductasa(GR) (Stafandiari et al., 2007).

Varios grupos de trabajo han desarrolladoplantas transgénicas, que sobreexpresangenes relacionados con la respuesta al estrésoxidativo, y en muchos casos se ha logradocorroborar la correspondencia entre la tole-rancia a la salinidad y los niveles de com-puestos antioxidantes (Kellós et al., 2008).Tanaka y colaboradores examinaron el papelpotencial de la enzima SOD en la proteccióncontra el estrés salino. En presencia de altasconcentraciones de sal, las plantas transgéni-cas tuvieron una elevada actividad APX, alre-dedor de 1.5 veces mayor que las plantascontrol. La actividad SOD total se mantuvo aniveles elevados. Se encontró que la activi-dad del fotosistema II y el transporte electró-nico en los cloroplastos, fueron mayores enlas plantas transgénicas bajo estrés salinocomparados con las plantas nativas. Estosresultados sugieren que un incremento enlos niveles de APX y SOD, son factores impor-


tantes para la tolerancia a la salinidad enarroz (Tanaka et al., 1999).

Se han obtenido plantas transgénicas detabaco que sobreexpresan la enzima gluta-tion-S-transferasa (GST) y glutatión peroxi-dasa (GRX). Las plantas transformadas mos-traron las actividades específicas de GST yGPX dos veces mayor que las plantas sintransformar. No obstante el incremento enel pool de glutatión oxidado, las plántulastransgénicas exhiben un incremento de sutolerancia a la salinidad (Roxas et al., 1997).Se había reportado previamente que lasobreexpresión de la enzima GR en plantastransgénicas conduce a elevados niveles deglutatión reducido, incrementando la tole-rancia a la salinidad y al estrés oxidativo enhojas (Fayer et al., 1991). Por tanto podemosplantear que la influencia del estado oxida-tivo del glutatión en la tolerancia al estréssalino en plantas aún no está determinada.

Una estrategia alternativa para eliminar eldaño oxidativo bajo estrés salino podría sersuprimir la producción de especies reactivasdel oxígeno. Aunque el papel de la fotorres-piración en condiciones de estrés es todavíamuy controversial, pudiera funcionar comouna posible ruta de disipación del exceso deenergía luminosa (Osmond y Grace, 1995).Numerosos estudios sugieren que el pasolimitante en la fotorrespiración es la reasi-milación del amonio catalizada por la enzi-ma glutamin-sintetasa cloroplástica GS2(Wallsgrove et al, 1987). Cuando las plantasde arroz se transformaron con la GS2 (Has-hida et al., 2000) acumularon 1.5 veces másGS2 que las plantas control. Estas plantastransgénicas tienen aumentada su capaci-dad para realizar la fotorrespiración y unincremento en la tolerancia al estrés salino.

El incremento en las actividades de las enzi-mas SOD, APX, CAT y GR en condiciones desalinidad y de otros tipos de estrés abiótico,y su comparativamente mayor actividad en

genotipos tolerantes de trigo se ha reporta-do por Sairam y colaboradores (Sairam et al,1997). El incremento de la actividad de SOD,APX, GR, DHAR, CAT y POX en respuesta alestrés salino, así como su mayor actividadantioxidante en especies y variedades tole-rantes se ha reportado por varios investiga-dores, (Roxas et al., 2000).

Sairam y Srisvastava 2002, reportaron com-parativamente mayores actividades de lasenzimas Cu/Zn SOD, Fe-SOD, APX y GR en lafracción cloroplástica y la activiodad Mn-SOD en la fracción mitocondrial, en genoti-pos tolerantes de trigo, en respuesta alestrés salino. Otros investigadores reporta-ron un incremento producido por el NaCl, laexpresión de ARNm y en la actividad de lasenzimas Mn-SOD, APX, DHAR y GR, en chí-charo cultivar Granada, mientras que en elcultivar sensible Chillis, no se observaroncambios significativos en los niveles deARNm ni en la actividad de las enzimas estu-diadas (Hernández et al., 2000).

Muy pocos trabajos se han hecho en el des-arrollo de plantas transgénicas que sobreex-presen actividad enzimática antioxidantebajo estrés salino (Sairam y Tyagi, 2004).Roxas y colaboradores reportan la sobreex-presión en tabaco de la enzima glutatión-S-transferasa y GPX sometidas a una variedadde estreses. El tratamiento con estrés salinoinhibe el crecimiento del genotipo silvestre ycausó un incremento en la peroxidación lipí-dica, mientras que en las plantas transforma-das no ocurrió peroxidación lipídica (Roxas etal., 2000). Estudios con arroz transgénico quesobreexpresa la enzima SOD proveniente delevadura mostraron un incremento en losniveles de ascorbato peroxidasa y SOD cloro-plástica en las plantas transformadas compa-radas con el genotipo silvestre, mostrando asu vez mayor tolerancia a la salinidad.

Otros investigadores han estudiado el papeldel sistema de la glioxalasa en la tolerancia


al estrés. El sistema de la glioxalasa es ubicuoen la naturaleza y consiste en dos enzimas,la glioxalasa I y II, que actúan coordinada-mente para convertir el 2-oxoaldehído en 2-hidroxiácido, utilizando el glutatón reduci-do. Su función primaria parece ser, eliminarel metilglioxal, sustrato primario de la glio-xalasa I, un compuesto tóxico conocido quedisminuye el crecimiento y reacciona con elADN y las proteínas. Plantas de tabaco setransformaron con ADN complementario deGly I proveniente de Brassica Juncea. Lasplantas transgénicas mostraron significativatolerancia al estrés salino, lo que se correla-cionó con el grado de expresión de Gly I. Lainducción del gen de la glioxalasa I en res-puesta al estrés salino y estrés osmótico,también se observó en tomate (Espartero etal., 1995). Plantas transgénicas que sobreex-presan la glioxalasa mostraron un incre-mento en la tolerancia a la salinidad.

Papel del ABA en la tolerancia al estréssalino

ABA y la señalización del estrés abiótico

El ABA fue descubierto en la década de1960, en frutos jóvenes de algodón, inicial-mente con el nombre de abscisina. Desdeentonces esta hormona se ha encontradoen gran número de especies de plantas. Lasfunciones del ABA más documentadas son:intervenir en los procesos de maduración dela semilla (Feurtado y Kermode, 2007),adquisición de tolerancia a la desecación,dormancia de la semilla y retardo en su ger-minación, así como promover el cierre delos estomas. El ABA, en realidad, ayuda a lassemillas a sobrepasar las condiciones deestrés y germinar solamente cuando las con-diciones son propicias para la germinación yel crecimiento (Himmelbach et al., 2003). ElABA también impide la germinación precozde embriones prematuros.

Durante el crecimiento vegetativo el ABA esla principal hormona que confiere toleran-cia al estés abiótico, fundamentalmente a lasalinidad y la sequía (Mahajan y Tuteja,2005; Rosado et al., 2006). El cierre estomá-tico, promovido por el ABA, en condicionesde sequía, previene la pérdida de agua delinterior de la célula y por tanto el ABA esllamada la hormona del estrés.

Los procesos que activan la síntesis de ABA yla inhibición de su degradación conllevan ala acumulación de ABA. Muchos genes invo-lucrados en la biosíntesis del ABA se hanclonado, los cuales incluyen la zeazantinaepoxidasa, conocido como ABA1 en Arabi-dopsis (Mari et al., 1996), 9-cis-epoxicarote-noide dioxigenasa (NCED) (Tan et al., 1997),ABA aldehído oxidasa y ABA3 conocidocomo LOS 5 (Xiong et al., 2001). La ruta bio-sintética de esta hormona ha sido completa-mente dilucidada con la identificación delgen ABA4 que codifica para la enzima neo-xanthina sintasa, que parece esencial parala biosíntesis de novo del ABA durante elestrés hídrico (North et al., 2007).

Se sabe que la salinidad, así como la sequíay el frío causan un incremento en la biosín-tesis y acumulación del ABA, activandogenes que codifican para las enzimas queparticipan en la biosíntesis del ABA, las cua-les pueden ser catabolizadas al terminar elestrés. Muchos genes de respuesta al estrésson activados por el ABA, y este a su vezpuede estimular la retroalimentación de losgenes de su propia biosíntesis, aunque pro-bablemente a través de fosfoproteínasdependientes de calcio (Rodríguez, 2005).

Desde el punto de vista de la tolerancia a lasalinidad y otros tipos de estrés la funcióndel ABA, parece ser la regulación del balan-ce hídrico en la planta y la tolerancia alestrés osmótico.

Por otro lado numerosos experimentos indi-can que existen vías dependientes e inde-


pendientes de ABA para la inducción de losgenes relacionados con el estrés abiótico(Shinozaki y Yamaguchi-Shinozaki, 2007).La expresión inducida de ABA frecuente-mente depende de la presencia de elemen-tos que actúan en cis llamados ABRE, a loscuales se unen factores de transcripciónbZIP conocido como proteínas que unenABRE (AREB) o factores AREB (Wasilewska,et al., 2008). Análisis genéticos muestranque no está clara la línea divisoria entre lasvías dependiente e independiente de ABA.

La aplicación del ABA a las plantas imita elefecto de una condición de estrés. Comomuchos tipos de estrés abiótico conducen enúltima instancia a la desecación de la célula ya un desbalance osmótico, existe un solapa-miento entre los patrones de expresión de losgenes del estrés después del frío, la sequía, lasalinidad y la aplicación del ABA. Esto tam-bién sugiere que varias señales del estrés y elABA comparten elementos comunes en susvías de señalización, y estos elementos comu-nes se entrelazan unos con otros para mante-ner la homeostasis (Leung y Giraudat, 1998).

Se han reportado estudios con numerososmutantes de Arabidopsis deficientes deABA, nombrados aba1, aba2, aba3 (Koorn-neef et al.,1998) y aba4 (North, 2007). Tam-bién se han informado mutantes deficientesde ABA en especies como el tabaco, tomatey maíz (Liotenberg et al., 1999). Sin el trata-miento estresante, el crecimiento de estosmutantes es comparable con el fenotipo sil-vestre. Bajo estrés salino los mutantes mues-tran pobre crecimiento (Xiong et al., 2001).Los mutantes sometidos a estrés por sequíase marchitan rápidamente y mueren si elestrés persiste. Mientras que bajo estrés sali-no los mutantes deficientes de ABA mues-tran pobre crecimiento.

Los mutantes abi1 y abi2 de Arabidopsis sondominantes y mostraron insensibilidad alABA exógeno durante la germinación. Estos

mutantes también exhiben mal funciona-miento de los estomas. Los genes ABI1 y ABI2codifican las enzimas homologas serina/treo-nina proteín fosfatasa 2C (Xiong y Zhu, 2001)y pueden tener funciones solapadas.

El papel del ABA en la tolerancia al estrésosmótico es bien conocido (Rock et al., 2000;Zhu, 2002) y también existen varias eviden-cias del papel del ABA en el control de lahomeostasis iónica. Por ejemplo, el conteni-do de ABA se incrementó ligeramente sola-mente en las hojas de los cultivares de arroztolerantes al salinidad versus los cultivaressensibles. Este incremento en el contenidode ABA se acompañó por una mejor razónK/Na (Bhora et al., 1995). También el trans-porte y la acumulación de K en raíces deplantas superiores está regulado por elABA. Otros resultados indican que la activi-dad de los canales de K, regulada por elABA en raíces de maíz y Arabidpsis, que laregulación de K en las raíces es, al menos enparte, mediada por el canal iónico.

Muchas plantas responden a los altos nivelessalinos secuestrando iones dentro de lavacuola. Este proceso está mediado por unantiporte vacuolar Na/H que utiliza el gra-diente protónico para concentrar iones encontra de su gradiente (Verma et al., 2007).Una caracterización de cinco antiportes deNa/H, mostró que dos transcriptos de ellos,AtNHX1 y AtNHX2, se acumulan en respues-ta al ABA. Sin embargo esta acumulación noocurre en mutantes aba1-2 indicando que larespuesta al estrés de estos genes dependedel ABA (Yokoi et al., 2002). Se han aisladonumerosos ADN complementarios que codi-fican para bombas iónicas de membranastales como ATPasas y V-ATPasa. La acumula-ción de estos transcriptos se provoca debidoa la salinidad, alguno de ellos siendo regula-dos por el ABA (Tsiantis et al., 1996). Tambiénes importante para la homeostasis iónica elincremento del Ca++ citoplasmático libre quees inducido por el ABA, un evento regulado


por la ADP ribosa cíclica (Wu et al., 1997). Laidentificación de ARNm inducidos por elestrés o por el ABA, que codifican una prote-ína de membrana que se une al calcio (Fran-sen et al., 1996) y una fosfolipasa C específicapara el fosfatidilinositol en A. thaliana (Hira-yama et al., 1995), respectivamente, propor-cione evidencia indirecta de la participacióndel calcio en la señalización del ABA en teji-dos vegetativos. El aislamiento del genRD20, una proteína que une el calcio queestá inducida por el ABA y el estrés salino,sugiere una relación entre el estrés salino, elABA y las vías señalizadoras del calcio.

Como hemos dicho en capítulos anteriores,los genes que codifican enzimas involucra-das en la biosíntesis de prolina, glicín betaí-na y el el pinito/ononitol, se expresan envarias especies de plantas como respuesta alestrés salino. El gen P5CS, involucrado en labiosíntesis de la prolina a partir del gluta-mato, se acumula en Oryza sativa y A. tha-liana en respuesta al estrés salino y al ABA(Sairam y Tyagi, 2004).

Algunos de los genes encargados de la res-puesta a la salinidad son aquellos que codi-fican proteínas involucradas en la regula-ción de otros genes de respuesta a lasalinidad. Los genes reguladores son en sumayoría factores de transcripción y proteí-nas quinasas. En Arabidopsis thaliana, laexpresión del gen del receptor semejante aproteína quinasa se induce en respuesta a lasalinidad y al ABA (Mahajan y Tuteja, 2005).

Otro gen que codifica la fosfolipasa C espe-cífica del fosfatidil inositol, se expresa enrespuesta a la salinidad y a la sequía. Estaenzima hidroliza el fosfatidil inositol 4,5-bifosfato, para producir inositol 1,4,5- tri-fosfato (IP3) y 1,2- diacilglicerol. El IP3 abrelos canales de Ca2+ en la membrana del retícu-lo endoplasmático, causando el eflujo deeste catión hacia el citoplasma. Este gen

también se expresa en presencia del ABA(Mahajan y Tuteja, 2005).

El IP3 tiene una función crucial en las oscila-ciones citosólicas del Ca2+ durante la señali-zación del ABA y el estrés salino. Los análisisde expresión transiente revelaron que el IP3y los canales de Ca2+, activados por la ADPribosa cíclica, participan en las oscilacionescitosólicas del Ca2+ mediadas por el ABA.Esta hormona induce la expresión y activi-dad de la enzima ADP ribosil ciclasa, la cualsintetiza la ADPIC. Se ha demostrado ade-más, la relación de una proteína G hetero-trimérica, en la transducción de la señal delABA durante la regulación de las célulasacompañantes (Chinnusamy et al., 2005)

El análisis genético de los mutantes deficien-tes de ABA los5/ aba3 y los6/aba1 de Arabi-dopsis mostró que el ABA juega un papelcentral en la expresión de genes reguladospor el estrés osmótico (Xiong, 2001). Laexpresión de los genes de respuesta al estréstales como RD29A, RD22, COR15A, COR47 yP5CS se redujo severamente o se bloqueócompletamente en el mutante los5; mien-tras que en los6, la expresión de RD29A,RD19, COR15A, COR47, KIN1 y ADH, fuemenor que en el fenotipo silvestre. Por tantose plantea que la vía dependiente de ABAtiene una función esencial en la expresiónde los genes de respuesta al estrés osmótico.

Consideraciones finales

La aplicación de la ingeniería genética en elmejoramiento de los cultivos para su tole-rancia a la salinidad es decisiva para la pro-ducción de alimentos y la seguridad alimen-taria de la humanidad. Sin embargo elprogreso obtenido en este sentido ha sidolimitado, por la carencia de un conocimientocompleto de las bases moleculares de la


tolerancia y la poca disponibilidad de genesque confieren tolerancia al estrés.

Aunque el progreso en el mejoramiento dela especies cultivadas para su tolerancia alestrés salino ha sido lento, existen razonesconsiderables para el optimismo. Estasincluyen el desarrollo reciente en el área dela biología molecular vegetal, específica-mente el desarrollo de marcadores molecu-lares (Owuso, 2008), el secuenciamiento degenomas completos de plantas modelotales como Arabidopsis, la disponibilidad deherramientas para la aplicación de la gené-tica reversa, que ofrecen soluciones a lascomplejas interrogantes que plantea latolerancia de las plantas al estrés salino(Hussain, 2008).

Desafortunadamente, a pesar de los gran-des avances alcanzados, aun permanecenmuchas interrogantes por responder, enrelación con la respuesta de la planta frentea la salinidad, por lo cual se impone conti-nuar los esfuerzos encaminados a lograrmayores progresos en la compresión deestos fenómenos, como una vía para laobtención de plantas tolerantes y lograr ladisminución de los perjudiciales efectos quela salinidad provoca en la producción agrí-cola internacional.

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(Este artículo científico fue aprobado por el Conse-jo Editorial del Instituto de InvestigacionesAgroprecuarias “Jorge Dimitrov” en fecha 15de Noviembre de 2008 y no ha sido publicadocon anterioridad en ningún tipo de publicación)

(Aceptado para publicación el 2 de julio de 2009)


L. Chávez, L.M. González MECANISMOS MOLECULARES ... · de K+ y Na+ es de vital importancia en...

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