LA CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y EL PARDEAMIENTO …
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-r UNAP AL-15 NO SALEA DOMICIU!c!ültad de Industrias Alimentarias ESCUELA DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS MEMORIA DESCRIPTIVA 11 LA CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y EL PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO" PRESENTADO POR EL BACHILLER: GUILLERMO ÁLVAREZ GARCÍA REQUISITO PARA LA OBTENCION DEL TITULO PROFESIONAL DE INGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS !QUITOS- PERU 2009
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NO SALEA DOMICIU!c!ültad de
Industrias Alimentarias
ESCUELA DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
MEMORIA DESCRIPTIVA
11LA CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Y EL
PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO"
PRESENTADO POR EL BACHILLER:
GUILLERMO ÁLVAREZ GARCÍA
REQUISITO PARA LA OBTENCION DEL TITULO PROFESIONAL
DE INGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
!QUITOS- PERU
2009
JURADO CALIFICADOR
Memoria Descriptiva aprobada en Sustentación Pública en la ciudad de lquitos, en
las instalaciones del Auditorio de la Facultad de Agronomía de la Universidad
Nacional de la Amazonía Peruana, sustentada el día 16 de Agosto del2002, siendo
miembros del Jm·ado Calificador los abajo firmantes:
Miembro
DEDICATORIA
A mis padres Guillermo y Carlota
IN MEMORIAN, eterna gratitud
por sus consejos, cariño y sacrificio
A Doris, mi esposa, por su comprensión,
y apoyo permanente. A mis hijos, que
son el tesoro más bello que Dios me dio.
A mis hermanos, hombres y mujeres de
bien, a quienes estimo, valoro y aprecio.
Todos ellos ocupan un lugar especial en
mi vida y llenan de gozo mi co..azón.
AGRADECIMIENTO
A los Docentes de la Facultad de Industrias Alimentarias de la Universidad
Nacional de la Amazonía Peruana, por los conocimientos impartidos durante el
proceso de mi formación profesional.
Tema
Lista de tablas
Lista de figuras
Resumen
l. Introducción
ll. Revisión de literatura.
2.1 Enzima
2.2 Definición
2.3 Clasificación
2.3.1 Hidrolasas
2.3.1.1. Esterasas
2.3.1.2. Carbohidrasas
2.3.1.2.1 Po1iasas
2.3.1.2.2 Clic~sidasas o hcxosidasás
INDICE
2.3 .1.3 Enzimas proteoliticos o proteasas
2.3.1.3.1 Proteinasas
2.3.1.3.2 Peptidasas (carboxipeptidasa y aminopeptidasas)
2.3.1.3.3 Amidasas
2.3.2 Desmolasas
2.3.2.1 Oxidorreductasas
2.3.2.2 Oxidasas
2.3.2.3 Deshídrogenasas
2.3.3 El grupo prostetico
2.3 .3 .1 Desbidrogenadas
2.3.3.2 El enlace proteína-coenzíma
2.3.3.3 Descarboxilasas
2.4 Enzimas que catalizan reacciones de transferencia
2.4.1 Especificidad de los enzimas
2.4.1.1 Hay varios .tipos de especificidad enzimática
2.4.1.1.1 Estervospecificidad
2.4.1.1.2 Otros tipos de especificidad
2.4.2 Enzimas no proteicos
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2.4.3 Inactivación de los enzimas por el calor
2.4.4 Usos de los enzimas en la industria de los alimentos
2.4.4 1 La diástasa de la malta
2.4.4.2 Los enzimas industrialmente
2.4.4.3 Enzimas industriales fuente microbiana
2.5 Cinética enzimática
2.5.1 Termodinámica
2.5.2 Energía de activación
2.5.3 Influencia de la temperatura
2.5.4 El complejo enzima-sustrato
2.5.5 Número de recambio (Turnover number)
2.5.6 Velocidad de las reacciones enzimáticas
2.5.7 Concentración de sustrato
2.5.7 La ecuación de Michaelis
2.5.8 Oxidación bíológiga-empardeamiento enzímático
2.5.9 Tipos de oxidación
2.5.10 Combinación directa del oxígeno molecular con otro átomo
2.5.11 Oxidación anaeróbica. o deshidrogenación
2.5.12 Transferencia de electrones
2.5.13 Propiedades de los enzimas oxidantes
2.5.14 Sustratos fenolicos y pigmentos
2.6 Enzimas y mecanismos de las reacciones
2.6.1 Potencial Redox
2.6.2 Ciclo climatérico
2.6.3 Tejido vegetal disgregado
2.6.4 Función fisiológica de las polifenol oxidaxas
y de las reacciones de pardeamiento enzimático
2.6.5 Empardeamiento enzimático
2.6.6 Mecanismo del empardeamiento enzimatico
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Conclusiones
Recomendaciones
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Lista de tablas
Tabla N° 1: diferencias entre la energía de activación de enzimas
Tabla N° 2: número de recambio de un enzima
Tabla W 3: temperaturas de actividad de estos enzimas.
Tabla N° 4: valores aproximados de H
Tabla N° 5: la desaparición del ácido málico en el jugo de manzanas
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Lista de figuras
Figura N° 1: Formula estructural de TPN
Figura N° 2: Fórmula del flavinmononucleótido (FMN)
Figura N° 3: flavinadenindinucleótido (F AD
Figura N° 4: Grupo prostetico unido al apoenzima
Figura N° 5: Presentación esquematica de la unión de la mitad
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porfirina a la proieína en el Citocromo e 11
Figura N° 6: Reacción de polimerización 14
Figura N° 7: Canalización y transformación del acido succinico en fumárico 17
Figura N° 8: Representación esquemática del complejo enzima-sustrato 18
Figura N° 9: Esquema que ilustra la hipótesis de la "poliafinidad". 19
Figura N° 10: Degradación de la L-arginina 20
Figura ~ ll: Conversión de ácido láctico L-( +) a ácido pirúvico 21
Figura N° 12: Las esterasas son -enzimas que suelen tener, estereospecificidad 21
Figura N° 12: maltasa, que escinde la maltosa en dos moléculas de glucosa 23
Figura N° 13: conversión en glucósidos de la
6-metilglucosa o de la 2-desoxiglucosa
Figura N° 14: Enzima convierte en ácido úrico
tanto la xantina como la hipoxantina
Figura N° 15: Formula de la trietilenotetramina
Figura N° 16: Relación entre la velocidad de una
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reacción enzimática y la temperatura 35
Figura N° 17: Representación esquemática de una reacción enzimática 36
Figura N° 18: Relación entre el pH y Ja velocidad de
una reacción enzimática 38
Figura N° 19: Velocidad de reacción en función de la
concentración de enzima. 39
Figura N° 20: Velocidad de la hidrólisis de la sacarosa por
acción de la invertasa a diversas concentraciones de sustrato 39
Figura N° 21: Curvas teóricas de velocidades de reacción
basadas en la ecuación de Michaelis.
Figura 22: Tubo de Thunberg
Figura 23: Oxidación del gliceraldehído
Figura N° 24: Reducción del ácido succínico a márico
Figura N° 25: Oxidación de citocromo e
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Figura N° 26: Pérdidas de oxigeno en el jugo de manzanas
(a= jugo con pulpa natural; b =jugo filtrado; e=
después de la activación enzimática)
Figura N° 27: Oxidación de difenoles
Figura N" 28: Dispositivo esquemático para medir potenciales redox
Figura N° 29: Ciclo de respiración climatérica de las frutas
después de recolectadas.
Figura N° 30: Aparato para medir el ciclo climatérico
Figura N° 31: Absorción de oxigeno por diferentes jugos
Figura N° 32: Descarboxilación de la tirosina
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RESUMEN.
Durante la fabricación de alimentos, su almacenamiento, etc. muchos de los alimentos
desarrollan una coloración que en ciertos casos mejora sus propiedades sensoriales,
mientras que en otros las deteriora; la complejidad química de los alimentos hace que se
propicien diversas transformaciones que son las que provocan estos cambios. Existe un
grupo de mecanismos muy importantes llamados de oscurecimiento, encafecimiento o
pardeamiento, que sintetizan compuestos de colores que van desde un ligero amarillo
hasta el café oscuro; estos han sido clasificados en forma general como reacciones de
pardeamiento enzimático y no enzimático.
En las reacciones de tipo enzimático se encuentran aquellas que son catalizadas por
enzimas presentes en algunos alimentos; en las del tipo no enzimático se incluyen la
caramelización y la reacción de Maillard. Existen diversos factores como la
temperatura, pH, etc. que afectan el comportamiento de estas reacciones así como
también existen mecanismos que se emplean para controlar dichas reacciones en
aquellos alimentos donde no sean deseados.
El pardeamiento enzimático es una reacción de oxidación en la que interviene como
substrato el oxígeno molecular, catalizada por un tipo de enzimas que se puede
encontrar en prácticamente todos los seres vivos, desde las bacterias al hombre.
El enzima responsable del pardeamiento enzimático recibe el nombre de
polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa. eneralmente, el pardeamiento no enzimático es
el resultado de reacciones originadas por las condensaciones entre compuestos
carbonilos y aminados; o por la degradación de compuestos con dobles enlaces
conjugados a grupos carbonilo.
Estas reacciones conducen a la formación de polímeros oscuros que en algunos casos
pueden ser deseables (aromas cárnicos sintéticos), pero que en la mayoría de casos
conllevan alteraciones organolépticas y pérdidas del valor nutritivo de los alimentos
afectados.
La velocidad de oscurecimiento no enzimático tiene un máximo a valores de w= 0,60 -
0,70
Por eso es importante el estudio de estas reacciones como se detallan en el contenido del
presente trabajo.
I.INTRODUCCIÓN
El "pardeamiento enzimático", es aquella transformación enzimatica en sus primeras
etapas, de compuestos fenólicos en polímeros coloreados, frecuentemente de color
pardo o negro; es decir, es el pardeamiento oxidativo catalizado enzimáticamente.
EJ rápido obscurecimiento de muchas frutas y verduras como manzanas, plátanos, papas
y berenjenas, es un problema al que se enfrenta con frecuencia el tecnólogo de
alimentos. A diferencia de los varios tipos de pardeamiento no enzimático mencionados,
este tipo de coloración es muy rápida, requiere el contacto del tejido con el oxígeno, se
reconoce como catalizado por enzimas, y ocurre solamente en tejidos vegetales. El
nombre que recibe este fenómeno es de "pardeamiento enzimático". Con frecuencia, se
considera al pardeamiento enzimático como un proceso de deterioro perjudicial que
debe de prevenirse en la medida de lo posible, por ejemplo en la producción de puré de
plátano, papas fritas y compota de manzanas. Por otra parte, el pardeamiento enzimático
es esencial en el desarrollo del color y del sabor adecuado, en el té y el cacao. Este
fenómeno se relaciona también con la síntesis "in vivo" de pigmentos obscuros de
melanina en la piel y el cabello.
El reconocimiento de la naturaleza enzimática de este tipo de pardeamiento en ciertos
frutos debería de atribuirse probablemente a Lindet, ya en 1895. Sin embargo, fue
Onslow quien demostró, en 1920, que el pardeamiento enzimático de los tejidos
vegetales se debe a la presencia de derivados del o-dihidroxifenol, como el catecol, el
ácido protocatéico y el ácido caféico, así como de esteres de ácido hidroxigálico con el
ácido caféico, como el ácido lorogénico, que se encuentra muy difundido en muchos
frutos, y especialmente en las papas y batatas.
11. REVISIÓN DE LITERATURA.
2.1ENZIMA
2.2 Definición
Los enzimas o fermentos constituyen otro de los tipos más importantes de proteínas
conjugadas. Ahora es el momento adecuado para entrar en el estudio detallado de la
constitución y modo de acción de estos catalizadores biológicos.
Berzelius propuso en 1836 el término de «catalizadoreS}} para "sustancias capaces de
poner en marcha afinidades latentes, a una temperatura determinada en virtud sólo de su
presencia". Atribuyó estos fenómenos a un misterioso «poder catalítico». La creencia en
este poder misterioso persistió durante mucho tiempo, aun después de haberse
establecido con toda claridad muchas actividades enzimáticas. En 1926, Willstaetter
pronunció una conferencia ante la Sociedad Química alemana en que resumía sus
investigaciones sobre el aislamiento de enzimas puros, y mencionó su trabajo con la
peroxidasa, enzima que constaba de una proteína y una mitad no proteica que contenía
hierro. El enzima seguía siendo activo cuando su concentración se diluía hasta un punto
en que no podía demostrarse en el sustrato la presencia de proteína o hierro. Este hecho,
hizo creer a Willstaetter en la existencia de una nueva fuerza natural que los enzimas
creaban de algún modo.
Durante el mismo año 1926, Sumner aisló y cristalizó la ureasa de las habas, un enzima
que escinde la urea a C02 y NH3• y Northrop y sus colaboradores cristalizaron los
enzimas proteo líticos pepsina, tripsina y quimotripsina. Fueron muchos los hombres de
ciencia que no creyeron que estos cristales fuesen enzimas, o que los enzimas formasen
parte de estos cristales, y fue preciso que transcurrieran otros 20 años para que
Northrop, Stan]ey y Sumner recibieran el Premio Nobel por sus brillantes éxitos.
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Muchas reacciones biológicas pueden, desde luego, tener lugar in vitro como las
reacciones químicas ordinarias a temperaturas o concentraciones de ácidos o álcalis
relativamente elevadas.
Como ya se ha dicho, las proteínas pueden ser hidrolizadas a sus aminoácidos
constituyentes mediante varias horas de ebullición en ácidos o álcalis; el almidón puede
convertirse en glucosa, etc. Estas reacciones se producen in vivo a la temperatura
corporal merced a la participación activa de los enzimas.
En 1897, los Buchner observaron por primera vez que la actividad enzimática no estaba
limitada a las células vivas: trituraron con arena en un mortero células de levadura y
prensaron el «jugo de levadura» que, tras ser filtrado para eliminar los restos celulares,
seguía poseyendo capacidad de fermentar el azúcar para dar alcohol y dióxido de
carbono. Esto fue un gran descubrimiento en su tiempo, por que separó por primera vez
fenómenos biológicos del concepto de algún misterioso "poder vital".
Los enzimas se defmen hoy como catalizadores coloidales orgánicos generalmente
solubles en agua, formados (hasta ahora) dentro de células vivas de vegetales o
animales, pero capaces de actuar también en el exterior de las células y sin conexión
alguna con ellas. Se conocen hoy muchos cientos de actividades enzimáticas aunque
solo se han cristalizado unos 75 enzimas. Todos ellos sin excepción contienen proteínas,
como se demuestra mediante su análisis elemental. La ureasa por ejemplo, tiene la
siguiente composición: C, 51.6%; H, 7,1 %; N 16%, S 12%.
2.3 Clasificación
No hay unanimidad en la clasificación de muchas enzimas y la mayoría de los textos
especializados, clasifican a las enzimas en dos grandes grupos:
a) Enzimas hídrolíticas, las hidrolasas
3
b) los demás, desmolasas.
2.3.1 HidroJasas
2.3.1.1 Esterasas. Todos los enzimas que producen la hidrólisis y síntesis de los esteres
de acuerdo con la siguiente fórmula general:
R'COOR' + H20 -----')- RCOOH + R'OH ~
Estos enzimas son también capaces de hidrolizar los esteres de los alcoholes
polihídricos, como los glicéridos de los ácidos grasos. He aquí algunos ejemplos:
1) Lipasas, que se hallan en el páncreas; hidrolizan las grasas y aceites de los reinos
animal y vegetal.
2) Clorofilasa, escinde el fitol de la clorofila.
3) Fosfatasas, escinden el ácido fosfórico y suJrurico, respectivamente, de Jos esteres
4) Sulfatasas, escinden el ácido fosfórico y sulrurico, respectivamente, de los esteres
5) Peptinesterasas.
2.3.1.2 Carbobidrasas. Todos Jos enzimas que ocasionan la degradación y síntesis de
carbohidratos:
2.3.1.2.1 Poliasas, catalizan las reacciones de los polisacáridos, tales como a y (3-
amilasas, a-amiloglucosidasa, enzima Q, etc.
Los enzimas pectolíticos PG (poligalacturonasa) y polimetilgalacturonasa pertenecen a
esta categoría.
2.3.1.2.2 Clicosidasas o hcxosidasas, enzimas que participan en la hidrólisis de los
disacáridos o de los glicósidos, por ejemplo, separan la aglucona del azúcar; entre los
ejemplos se encuentran la a y (3-glucosidasas, maltosa, invertasa, lactosa, a-
4
galacturonasa, etc.
2.3.1.3 Enzimas proteoJíticos o proteasas. Todos Jos enzimas que participan en Ja
síntesis e hidrólisis de proteínas:
2.3.1.3.1 Proteinasas, capaces de romper el enlace péptido (-CO-NH-), separando
péptidos o aminoácidos individuales, como la pepsina, tripsina, quimotripsina, papaína,
bromelina, ficina, etc.
2.3.1.3.2 Peptidasas (carboxipeptidasa y aminopeptidasas), capaces de degradar los
péptidos a aminoácidos.
2.3.1.3.3 Amidasas, enzimas que rompen el enlace C-N que no participa en el enlace
péptido, tales como ureasa y arginasa
2.3.2 Desmolasas.
2.3.2.1 Oxidorreductasas, enzimas que oxidan y reducen Jos sistemas biológicos; se
clasifican en dos subgrupos: oxidasas y deshidrogenasas.
2.3.2.2 Oxidasas, que se subdividen a su vez en:
a) Las que contienen Fe en su grupo prostético como eJ citocromo e o Ja
peroxidasa, que transfiere hidrógeno de un aceptor otro,
2H20+ABH20 2 +AH2
y la catalasa, que degrada el H202.
2H20 2 ~ 0 2 +2H20
b) Las que contienen Cu como principal componente, cual sucede en otras
oxidasas, como la fenolasa, tirosinasa, ascorbinasa.
2.3.2.3 Deshídrogenasas.
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a) Las que contienen disfosfopiridon-nucleótico (DPN, TPN).
b) las que contienen ribotlavonucJeótidos (FMN, FAD).
e) Fosforilasas, varios enzimas que toman parte en los procesos de fosforilización y
defosforilización y algunas veces en la degradación de moléculas más grandes y en la
unión de grupos fosfato. A esta clase pertenece también la hexoquinasa, que actúa
colaborando con el importante sistema adenílico, ATP.
d) Isomerasas, el complejo zimasa; contienen numerosos enzimas que toman
diversas reacciones de isomerización, mutación, etc.
e) Carboxilasas, que separan C02 de diversos productos, como la ácido piruvico-
carboxilasa, cuyo coenzima es la tiamina fosforilada
t) Enzimas coagulantes, como la renina.
2.3.3 El grupo prostético
Según su composición, los enzimas pueden dividirse en general en tres grupos:
1) Enzimas en la composición de los cuales sólo intervienen proteínas. A la
proteina sola cabe achacar aquí la acción catalítica ejercida sobre una reacción
bioquímica determinada y de la especificidad del enzima por el sustrato. De este tipo
son por ejemplo, la amilasa, las proteínasas y muchos otros.
2) Enzimas que además de proteína poseen una mitad no proteica, llamada
coenzima o grupo prostético. En tales enzimas el grupo prostético es el centro de la
actividad química y la proteína responsable de la especificidad. En numerosos casos el
mismo grupo prostético puede combinarse con varias proteínas para formar diversos
enzimas. Así sucede con diversas deshidrogenasas que contienen diversas proteínas y
pueden tener el mismo grupo prostético, FMN (flavin-mononucleotido). y ejercen la
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misma actividad deshidrogenante aunque sobre distintos sustratos. En este tipo de
enzimas suele ser posible separar por diálisis el grupo prostético de la proteína sin
destruir el enzima, que recupera su actividad cuando se recombinan la proteína y el
grupo prostético.
3) El tercer tipo de enzimas consta también de dos mitades, la proteína y el
coenzima, pero son prácticamente inseparables a menos que en el proceso se pierda por
completo la actividad enzimática. Tal es el caso, por ejemplo, de las metaloproteínas,
enzimas que contienen Fe, Cu, Co, etc. En estos dos últimos-grupos se acepta la
siguiente nomenclatura:
HoJoenzima
(el enzima entero)
Apoenzima + Coenzima
la mitad proteica (el grupo prostético)
El coenzima puede ser termostable; la mitad proteica (apoenzima) es, naturalmente,
muy termolábil.
Estudiaremos unos cuantos ejemplos de grupos prostéticos y su modo de acción:
2.3.3.1 Deshidrogenasas
Al examinar la introducción del nitrógeno en los aminoácidos mencionamos al ácido
glutámico-deshidrogenasa que contiene DPN-difosfopiridín-nucleótido como grupo
prostético. El mismo enzima fue estudiado en el esquema fermentativo de Embden
Meyerhof. Esta sustancia se denomina también Coenzima 1 o cozimasa. En honor de los
investigadores que aislaron su grupo prostético, también se llama a este enzima «nuevo
enzima amarillo de Warburg y Christiam>.
Las fórmulas del DPN o NAD contienen nicotinarnida, adenina, dos moléculas de
ribosa y dos moléculas de ácido fosfórico. La misma combinación con tres moléculas de
ácido fosfórico constituye otro grupo prostético, TPN, trifosfopiridín-nucleótido o
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coenzíma 11.
Figura N° 1: Fórmula estructural de TPN
La tercera molécula del ácido fosfórico del TPN está unida a la ribosa de la adenina.
La nicotidamina es el factor PP -factor preventivo de la pelagra-. Conviene hacer notar
que muchas de las vitaminas, en especial las del grupo B, representan el papel de grupos
prostéticos en diversos enzimas.
Warburg y Christian hallaron, antes de descubrir el «nuevo enzima amarillo}), otro
enzima de las levaduras, el «viejo enzima amarillo»; se trata de un enzima, una
deshidrogenasa también, que contiene FMN, flavinmononucleótido, como grupo
prostético. El FMN es una 6, 7-Dimetilisoaloxacina-ribitílfosforilada; desprovista de
ácido fosfórico es la vitamina B2 (riboflavina).
6,7 -dim.:tilisoaloxacina
_¿m: cn.-0-1~- · 1 U OH
r•bitnl (HCOU)s O
1 CH• 1
H cocN:cN--.c;o . a , 1 .H,.C - N 'N__..N·H
Figura N° 2: fórmula del flavinmononucleótido (FMN)
En este grupo prostético puede combinarse con diferentes apoenzimas y crear así
diversas deshidrogenasas, que actúan de transportadores de hidrógeno. Pueden transferir
el hidrógeno al citocromo e, que a su vez lo transfiere al oxígeno molecular. El grupo
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prostético es fácilmente dializado y separado del apoenzima. El enzima pierde entonces
su actividad. Basta, sin embargo, con mezclarlos para que el enzima recupere toda su
potencia.
El papel desempeñado por el FMN en la deshidrogenación puede deducirse de las
siguientes fórmulas:
FMN- (t'lt7.Íma oxidado}
Existen ocho de estos enzimas amarillos, aunque sólo dos contienen riboflavina sola.
Los demás contienen rivoflabina, y otros grupos, por ejemplo adenina, como el F AD
( flavinadenindinucleótido ):
ftdenina milad
Figura N° 3: flavinadenindinucleótido (FAD
2.3.3.2 El enlace proteína-coenzíma
Se sabe muy poco aún acerca de cómo el grupo prostético queda ligado a la proteína.
Teorell, un premio Nobel suizo (1955) fue el primero en conseguir separar por diálisis
(utilizando una solución ácida) el apoenzima incoloro del coenzima amarillo, FMN, del
«viejo» enzima de Warburg.
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Otros estudios de este enzima indican que el grupo prostético debe hallarse unido a
ciertos puntos de apoenzima mediante enlaces de hidrógeno, según se representa
esquemáticamente a continuación, en la figura N° 4:
FMN apooruim:~
Figura N° 4: Grupo Prostético con enlace de Hidrogeno
A este respecto es necesario examinar con algún detalle más el ATP.
Al estudiar la fosforilización de los azúcares, se hizo mención a la importancia del
adenosintrifosfato (ATP), que representa un papel vital como transportador de energía
en todos los sistemas biológicos. Se mencionó entonces el ATP como un grupo
prostético del enzima hexoquinasa. Existen, sin embargo, numerosas reacciones
bioquímicas en las que participa el ATP y en las que, con certeza absoluta, no es un
coenzima en el sentido estricto de la palabra. El ATP participa en la fosforilización y
fermentación de los azúcares, en la fotosíntesis y en el ciclo respiratorio; y junto con
otro enzima (CoA) en la síntesis de los lípidos y de los aminoácidos. Algunas de estas
reacciones son reacciones enzimáticas acopladas, en las que la conversión de A TP en
ADP y fosfato está unida a otra reacción, como la síntesis de esteres tiol de la coenzima
A:
Acetato+ CoA+ ATP ~ acetil-CoA + ADP + H3P04
Otro ejemplo de reacciones acopladas lo constituye el ciclo respiratorio, donde los
transportadores de electrones (DPN o TPN) se reoxidan a través de las flavo-proteínas
JO
por el oxígeno molecular, transfiriéndose la energía resultante al A TP por
fosforilización del ADP.
Como puede verse, el ATI' desempeña un papel importante en las reacciones
bioquímicas y probablemente lo hace así en "cooperación" con distintos enzimas o
formando cada ves un grupo prostético con otro apoenzima.
Existen, sin embargo, numerosos enzimas en que la unión entre e1 apoenzima y el grupo
prostético es aparentemente mucho más enérgica; para separarlos se necesita llevar a la
proteína al borde de la desnaturalización. Así sucede siempre que el grupo prostético
contiene metales pesados, como por ejemplo en las metaloporfirinas que constituyen el
grupo prostético de los citocromos, la peroxidasa, la catalasa, etc.
Aquí no es sólo el grupo prostético quien se halla ligado a la proteína sino también el
metal mismo. Véase la fórmula de la forma reducida del citocromo e:
Figura N> 5: Presentación esquemática de la unión de la mitad
porfirina a la proteína en el Citocromo e
A este grupo pertenecen al parecer numerosos enzimas; en algunos casos, los metales se
hallan de algún modo unidos a la proteína aún sin poseer una mitad porfirina. Así le
sucede al Cu de numerosas polifenolasas y de la ascorbinasa y al Mg de diversas
peptidasas y fosfatasas.
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Esto nos lleva de la mano finalmente a la posibilidad de entender el importante papel
que presentan en la agricultura los llamados elementos «indicio» tales como Ma, Cu,
Co, Zn, Mg, B. Todos ellos son, al parecer, necesarios para que los vegetales edifiquen
los enzimas precisos para su normal desarrollo y metabolismo.
El termino "coenzima" que los primeros investigadores dieron a la mitad no proteica de
un enzima fue sustituido luego por el nombre de "grupo prostático". En algunos sitios se
distingue entre estos dos términos, reservándose la palabra "coenzima" para los
:fragmentos orgánicos que no se aislan normalmente con el apoenzima, y grupo
prostético al unido firmemente a la proteína, como una metaloporfirina; el término
«activador» se refiere a los metales u otros agentes catalizadores. El denominador
común de todas estas sustancias es su peso molecular relativamente bajo y su, también
relativa, estabilidad.
2.3.3.3 Descarboxilasas
Se recordará que el esquema de Embden-Meyerhof para la fermentación se hizo
referencia al enzima piruvatocarboxilasa, capaz de desprender del ácido pirúvico una
molécula de C02, y dar acetaldehído. Esta reacción de descarboxilación es llevada a
cabo por un enzima que tiene como grupo prostético tiamina fosforilada y necesita Mg.
El mecanismo de acción química de este cofactor es aún desconocido. Se han
encontrado, además, numerosas carboxilasas, cada una de las cuales posee un grupo
prostético totalmente distinto. Al estudiar el ciclo respiratorio se mencionan tres
carboxilasas distintas que degradan sucesivamente el ácido pirúvico: la
piruvatocarboxilasa, oxalasuccinatocarboxilasa y a-cetoglutaratocarboxilasa, cada una
de las cuales posee distinta constitución; la primera y tercera de estas descarboxilasas
contiene coenzima A.
12
Se conocen muchos otros ejemplos de reacciones de descarboxilación: una larga serie
de aminoacidodescarboxilasa, algUna de las cuales son muy específicas y requieren
piridoxalfosfato como coenzima. Con el nombre de «degradación de Strecker» se
conoce una descarboxilación química de naturaleza similar que tiene lugar durante el
pardeamiento de los alimentos.
Algunas de estas reacciones van acompañadas de oxidación; las 11amadas
«descarbooxilaciones oxidativas», que tienen lugar en presencia de aceptores de
hidrógeno, entre las que se encuentran, por ejemplo, la ya mencionada descarboxilación
del ácido a-cetoglutárico, acoplada a la deshidrogenación para formar ácido succínico.
Finalmente, en el esquema de Calvin para la síntesis de hidratos de carbono durante la
fotosíntesis, la ribulosadisfosfato se combina con el C02, para dar dos moléculas de
PGA (ácido fosfoglicérico) que es, desde luego, activado de nuevo por un enzima
carboxilante, una carboxidismutasa.
2.4 Enzimas que catalizan reacciones de transferencia
Aunque no se haya hecho mención específica ciertas hidrolasas poseen la capacidad de
participar en numerosas reacciones de transferencia que desempeñan, al parecer, papeles
biosintéticos primordiales en la biosíntesis.
En los carbohidratos tienen lugar transferencias similares. Enzimas de este tipo:
transglicosidasas catalizan en ellos la transferencia de grupos fructofuranosilo, no sólo
al agua (como ocurre con la invertasa que hidroliza la sacarosa), sino también a diversos
alcoholes y azúcares, formando así glicósidos nuevos. Otro enzima; el enzima Q,
transfiere el enlace glicosídico 1 :4 a un nuevo enlace 1 :6, constituyendo así la
ramificación de la molécula de amilopectina.
La importancia de estos enzimas hidrolíticos en la catálisis de reacciones moleculares,
13
en las que un sustrato no reacciona con el agua, sino con una amina o alcohol, no ha
sido apreciada hasta una época muy reciente. Estos fenómenos han sido objeto de un
interés particular en los experimentos realizados con objeto de prolongar la cadena
péptida. Enzimas de este tipo, las llamadas transamidasas, pueden transferir el grupo
amino terminal de un péptido al extremo de un péptido nuevo:
alanil-fmilalaninamida
_ _.. -alanil-renilalanínamida
Figura N° 6: reacción de polimerización
Este tipo de reacción de polimerización, en el que no tiene lugar cambio alguno de
energía libre (son reacciones puramente hidrolíticas, reversibles en la mayor parte de los
casos), ha sido demostrada con otras amidas dipéptidos que pueden servir de sustrato al
enzima catepsina C; con la amida glicil-tirosina se ha logrado edificar un octopéptido
mediante esta reacción de transamidación.
Aunque precisan muy poca energía, estas reacciones aún son endergónicas.
Cuando las proteínas se sintetizan in vivo, Jos péptidos que entran en Ja reacción deben
conseguir la energía necesaria para edificar sus-enlaces péptidos (CO-NH) de algún
sitio.
Finalmente, remitimos al lector a Ja descripción de una posible biosíntesis de la
molécula de clorofila y la importancia del Fe en la misma. El hierro se intercambia allí
con Mg, muy probablemente a través de la acción de enzimas de este tipo.
Los enzimas intracelulares o constitutivos actúan dentro de las células vivas, en tanto
que los extracelulares o inducidos se hallan adsorbidos a las superficie de las células y
14
tejidos, o son capaces de pasar a través de la membrana plasmática de la célula, para
llevar a cabo la catálisis en el exterior de la misma. Normalmente los enzimas (que son
moléculas protéicas de gran tamaño) son incapaces de pasar a través de la pared celular.
Así sucede con los microorganismos que actúan sobre un sustrato determinado; el
sustrato penetra a través de la membrana plasmática del organismo, en tanto que los
productos finales de la reacción son vertidos al exterior, como ocurre en la fermentación
alcohólica.
Se dan, sin embargo, numerosos casos de actividad extracelular, aunque aún no se
conoce el mecanismo por el cual esta actividad tiene lugar; la única explicación posible
de este fenómeno es que la membrana plasmática no sea totalmente continua y que los
enzimas hallen su camino al exterior a través de tales aberturas.
Los enzimas oxidativos, tanto los que contienen Cu -las fenolasas- como los que
contienen porfrrinas férricas - peroxidasa, cata/asa, etc
2.4.1 Especificidad de los enzimas
La mayor parte de los enzimas, con excepción de unos pocos, actúan en solución
acuosa. Las moléculas se hallan en el agua en un movimiento térmico constante;
hablando en términos generales, sólo pueden reaccionar cuando chocan de un modo
adecuado. Si no existen enzimas, estas colisiones sólo pueden producir una reacción
química en un caso de cada billón; las probabilidades de que la reacción tenga lugar son
mucho más numerosas en presencia de enzimas. Se atribuye esto a la capacidad del
enzima de formar un complejo o compuesto de adición con el sustrato adecuado, al
menos durante un tiempo breve. Como quiera que la mera presencia de un enzima no es
capaz de acelerar el movimiento de las moléculas en solución y no puede, por
consiguiente, aumentar la frecuencia de colisión, hay que suponer que los enzimas, al
15
combinarse con las moléculas de sustrato, producen un cambio en la arquitectura
molecular de éste, que incrementa su reactividad. Se ha demostrado, por ejemplo, que
en algunos casos que esta reactividad es consecuencia de la separación de algunos
electrones de la molécula de sustrato que la convierten en iones o radicales libres
provistos de una carga determinada.
La formación de un complejo enzima-sustrato se ha confirmado recientemente por
métodos espectrofotométricos en la degradación del peróxido de hidrógeno por la
catalasa. Cuando a una solución de catalasa se le añade H20 2; el espectro ultravioleta
original queda transformado en un espectro característico del complejo formado; una
vez que todo el H20 2 ha sido agotado, el espectro vuelve a su característica normal.
El complejo enzima-sustrato formado entre la catalasa y el H20 2 dura. 1/85000
segundos. Combinaciones enzima-sustrato de este tipo sólo se dan en casos muy
específicos: cada enzima se combina con un sustrato, o a lo más con un grupo de ellos;
de ahí el término especificidad de los enzimas, su propiedad más importante.
Con el objeto de entender el fenómeno de la especificidad; se propuso hace tiempo la
analogía de «la llave y la cerradura». Para abrir una puerta, la «llave» el "sustrato" debe
encajar en la «cerradura» (el enzima); de lo contrario no tiene lugar la reacción. A
veces, la «llave» que se introduce en la cerradura no sólo no abre la puerta sino que
además se atasca y no es posible sacarla. Lo mismo sucede con el enzima. La
succinicodeshidrogenasa, por ejemplo, cataliza la transformación del ácido succínico en
fumárico.
. COOH COOU: 1 1 CH1 -•It CH
r - n C!-!~ <ln""t·~""""' CH
1 1 COOH COOH
16
Figura N° 7: Canalización y transformación del ácido succínico en fumárico.
Este enzima es muy especifico y no deshidrogena ninguna otra sustancia. Sin embargo,
si se añade al sustrato ácido malónico, éste compite con el succínico en virtud de la
estrecha semejanza de sus estructuras (COOH--CHr-COOH), combinándose con el
enzima impidiéndole cumplir con su misión. El ácido malónico, además, tampoco se
deshidrogena; es aquí «la llave» que no encaja bien (por alguna razón) en la cerradura
(succinícodeshidrogenasa) e impide al mismo tiempo la apertura de la puerta (la
auténtica reacción).
Las sustancias que reaccionan de un modo semejante a como Jo hace en este caso el
ácido malónico se denominan antimetabolitos, sustancias que no son ellas mismas
atacadas por los enzimas, pero que son capaces de formar un complejo con ellas y
competir con el sustrato. Los antimetabolitos fueron descubiertos por vez primera por
Woods en 1940, trabajando con microorganismos. Un ejemplo de ellos lo constituye el
ácido p-arninobenzóico, necesario para el crecimiento de ciertas bacterias: con
seguridad que esta sustancia representa el papel de grupo prostético de algún enzima
vital para su metabolismo.
NH'" o so.·NH
Oltido p.amiunbt:-m:oito 1' -amill(>l~nilsulfonamida
Se ha observado, sin embargo, que la p-aminofenilstifonamida evita el desarro1lo de
estas bacterias al desempeftar el papel de un antimetabolito, es decir, combinándose con
el enzima exactamente igual que él e impidiéndole así ejercer su actividad.
Tan importante descubrimiento permitió a la industria farmacéutica desarrollar un
importante número de las 1Jamadas sulfamidas, siendo utilizadas en medicina. Todas
17
ellas son antimetabolitos que interfieren el desarrollo y multiplicación posterior de los
microorganismos patógenos.
La acción de algunos conservadores químicos de los alimentos, o antibióticos puede
explicarse de modo semejante.
Tal vez el más convincente de los experimentos que explican el concepto de «llave y
cerradura» es el efectuado por Barron y sus colaboradores al estudiar la oxidación
enzimática del ácido acético como parte del metabolismo de los lípidos.
AL probar la misma reacción enzimática con sustancias semejantes al ácido acético:
monofluoracetato y monocloracetato, observaron que este último no intervenía en la
reacción, en tanto que el primero actuaba como un antimetabolito. La única diferencia
entre estas dos sustancias estriba en que el átomo de carbono está sustituido en una de
ellas por F y en la otra por Cl.; es muy interesante observar las diferencias en la longitud
de estos enlaces:
A. =0.32 Á f H-C en 2cido acético= 1.(19 A
, F·C ~n el monofluoracetatu = lA 1 Á }
' A =0.35 ;\
CI-C rn el monocl~roacetalo = l.í6 A
La diferencia es aproximadamente igual en ambos casos, suficiente para convertir a las
otras dos sustancias en sustratos inadecuados para el enzima que oxida específicamente
el ácido acético.
En la figura 8, aparece un esquema muy simplificado que intenta aclarar la idea del
concepto de «llave y cerradura»:
18
Figura N° 8: Representación esquemática del complejo enzima-sustrato.
El enzima está aquí representado como una mancha negra; en tanto que el ácido acético
(a la izquierda) generalmente se adapta al enzima específico, el monocloroacetato (a la
derecha) no se adapta a él y no es activado; el monofluoracetato (en el centro) se ajusta
demasiado y obra como un antimetabolito.
Finalmente, debemos mencionar la propuesta ''teoría de la poliafinidad" de la acción
enzimática, ilustrada por el siguiente esquema:
~ H\i-----r~----cOOH
1 ~~:;:,~~-C=O ---
Figura N° 9: Esquema que ilustra la hipótesis de la "poliafinidad".
Esta teoría indica que, para que proceda la reacción enzimática, debe haber una
orientación específica mutua del grupo de la cadena lateral del resto aminoácido
terminal del sustrato (en el caso de una proteína) y uno de los grupos del coenzima, y
que debe haber, al menos, tres puntos de interacción específica entre el enzima y el
sustrato. Según esta hipótesis, el centro activo de un enzima puede tener carácter
asimétrico. Esta teoría permite entender más fácilmente acción competitiva de los
antimetabolitos: estos inhibidores pueden tener grupos comunes con el sustrato y, en tal
caso, estos grupos pueden combinarse con uno o más de los tres puntos esenciales del
centro activo de los enzimas, de modo que impidan la llegada de los grupos
19
correspondientes del sustrato. La teoría de la poliafinidad ha conseguido explicar la
estereoespecificidad de los enzimas proteolíticos.
2.4.1.1 Hay varios .tipos de especificidad enzimática:
2.4.1.1.1 Este.rvospecificidad. Un buen número de las sustancias orgánicas que
participan en los procesos metabólicos de interés en bioquímica son sustancias
óptimamente activas; sólo una de las dos configuraciones estereoquímicas posibles se
halla en la naturaleza. Los hidratos de carbono, por ejemplo, son generalmente isómeros
D mientras que los aminoácidos suelen hallarse en forma L Conviene observar que los
enzimas conocidos sólo actúan sobre una de estas configuraciones ópticas y no sobre su
enantiomorfo. Esta observación está de acuerdo con la filosofía de «la llave y la -
cerradura:».
Ejemplo: La arginasa, un enzima hidrolítico, cataliza la degradación de la L-arginina, un
aminoácido, al que escinde en urea y L-ornitina, pero no ataca a la D-arginina
!o.'lt NH1 ........... e 1 NH+HsO 1
(CHvs 1 CH · (NH1) · COOH L-mginina
NUI. NH, '-./ co
+. NH~
1 . (CH1)~ 1 CH • {NH,}t".OOH L-{)ulilina
Figura N° 10: degradación de la L-arginina
Otro ejemplo: El enzima ácido láctico-deshidrogenasa, que se ha aislado del músculo y
contiene como grupo prostético DPN, cataliza la conversión de ácido láctico L-(+) a
ácido pirúvico, pero no es capaz de atacar la forma D
20
NO SALEA DOMICILIO
-·---CH$ 1.
HOCH
' booH ácido láctiro L( +)
CH• 1 c~o
1 COOH
2<'ido pir(wiro
Figura N° 11: Conversión de ácido láctico L-( +) a ácido pirúvico
Obsérvese que el mismo enzima actúa sobre el ácido pirúvico, que es ópticamente
inactivo, lo convertirá sólo en la forma L; su enantiomorfo no aparecerá nunca con este
enzima. Existe sin embargo otra deshidrogenasa específica que se encuentra en
microorganismos tales como Bacillus delbrückii capaz de formar sólo ácido láctico D.
Este enzima se utiliza en la producción industrial del ácido láctico.
Un tercer ejemplo de estereospecíficidad es el que se refiere al isomerismo cis-trans. La
succínicodeshidrogenasa antes citada oxida el ácido succínico a ácido fumárico que
ofrece una configuración trans y nunca a ácido maléico, que es la forma cis de la misma
molécula
CH.COOH 1 CH1COOH
ácido sutcíniro
dts~tmmt dtl ácido ~lko
CH.·COOH
1 HOOC·CH
ácido fum:itíro (tf(lnS)
CH·COOH 8 CH·COOH
ácido maleiro . ( i-is)
Figura N° 12: Las esterazas son enzimas que suelen tener, estereospecificidad.
2.4.1.1.2 Otros tipos de especiftcidad. Los otros tipos conocidos dependen del grado de
especificidad. El mejor ejemplo para explicar este concepto es el de las hidrolasas. Su
acción general puede representarse mediante el siguiente esquema:
hidro lasa
Donde A-B representa una molécula del sustrato edificada con dos partes A y By el
21
.. __. ..
enlace entre ellas. De acuerdo con esto existen tres tipos de especificidad:
I) Cuando sólo el tipo de unión importa al enzima y no lo que A y B sean:
especificidad escasa.
2) Cuando lo que importa al enzima es el enlace y uno de los componentes de la
molécula: especificidad de grupo, y
3) Cuando ambas mitades y el enlace que las une son precisas para la actuación del
enzima: especificidad absoluta.
Como ejemplo de especificidad escasa puede tomarse el de las lipasas: prácticamente
todas ellas pueden romper el enlace establecido entre el ácido y el alcohol mientras se
trate de un enlace éster; con la misma facilidad romperán un etilbutilato que un
triglicérido.
Algunas glucosidasas actúan sólo sobre un enlace glicosídico, y algunas peptidasas
sobre un enlace péptido. Se mencionaron, sin embargo, las necesidades específicas de
las carboxipeptidasas al hablar de los enzimas proteolíticos; la carboxipeptidasa ofrece
como requisito estructural la necesidad de que exista un grupo a-carboxilo libre
adyacente al enlace péptido que va a ser hidrolizado:
Rt 1
RCO-NH·CH•COOH t
Este enzima no hidroliza el enlace péptido de un péptido de este tipo:
Para el que se requiere una peptidasa diferente, aminopeptidasa. La aminopeptidasa
22
necesita, por tanto, ]a presencia de un grupo a.-amino adyacente al enlace peptido
sensible.
Tanto la carboxipeptidasa como la aminopeptidasa pueden servir de ejemplo de la
especificidad del segundo tipo: especificidad de grupo. Es el tipo más común entre los
enzimas.
Otro ejemplo de especificidad de grupo es e] de] enzima digestivo generalmente
denominado maltasa, que escinde la maltosa en dos moléculas de glucosa. De hecho, la
maltosa obtenida del tracto gastrointestinal de los-mamíferos hidroliza, sin embargo,
otros glucósidos además de la maltosa. El requisito principal para la acción de la
maltosa es la presencia O-glucosa y de un enlace glucosídico en posición a.; la
naturaleza de la aglucona R carece de importancia.
OCH10Ii
0-R HO +
OH H--OH
Figura N° 12: maltasa, que escinde la maltosa en dos moléculas de glucosa
Este enzima no actuaría si la aglucona R fuera 13-glucosídica, o si la glucosa hubiera
experimentado un cambio mínimo, tal como su conversión en glucósidos de la 6-
metilglucosa o de la 2-desoxiglucosa
cn,p-CH1
HG--~ OH
glueósido de la 6-.mdil¡¡lurosa
~~~ H~-R
H
glurosldo de la 2-d~...,:<i¡:lu~-ósa
Figura N° 13: conversión en glucósidos de la 6-metilglucosa o de la 2-desoxiglucosa
23
Este enzima no debiera, por tanto, llamarse maltosa, puesto que no es específico de la
maltosa. Debiera denominarse 13-glucosidasa, porque pertenece al grupo de los enzimas
con especificidad de grupo; este tipo de especificidad se presenta también en enzimas
tales como la 13-glucosidasa o la a-galactosidasa, en las que ofrece gran importancia la
mitad azúcar y el tipo de enlace glicosídico.
Especificidad absoluta. Se da en Jos enzimas que necesitan que las tres partes del
sustrato sobre el que actúan cumpla ciertos requisitos: las mitades A y D y el enlace
entre ellas.
Un ejemplo de este tipo de especificidad absoluta es el de la maltasa verdadera de la
cebada en germinación, la maltasa de la malta. Este enzima ataca sólo a la maltosa y no
actúa sobre ningún otro glucósido; el nombre de maltasa es, por tanto, perfectamente
adecuado para ella.
También son de una especificidad absoluta la argínasa y la succinicodehidrogenasa,
mencionadas antes, en relación a la estereospecificidad. La arginasa es específica para
la arginina y no escinde la urea de compuestos tales como 8-N-metilarginina o a
N:metilarginina, en los que uno de los grupos amino ha sido sustituido por un radical
metilo. De modo semejante, la succinicodeshidrogenasa es específica para el ácido
succínico y no para el ácido málico.
Antes de terminar la cuestión de la especificidad enzimatica conviene mencionar un
ejemplo más de un caso excepcional. En 1902, Schardinger descubrió en la leche un
enzima capaz de catalizar la oxidación de numerosos aldehídos a sus correspondientes
ácidos. Este enzima, que sólo posee especificidad de grupo, ha sido denominado desde
entonces enzima de Schardinger. Veinte años más tarde, en 1822 Morgan halló otro
24
enzima en la leche de naturaleza no específica capaz de convertir en ácido úrico tanto la
xantina como la hipoxantina:
.J:":!intina
o n m<)l)-~)<:H
I"N.,:!-.r<•
hifll)xanlina
..rrmrino oxióanr
o HN~NH\CO W!...NJ-NHI
H ácido IITieo
Figura N° 14: Enzima convierte en ácido úrico tanto la xantina como la hipoxantina:
Este enzima xantinooxidasa; no utiliza corno sustrato ninguna purina distinta de las dos
mencionadas. Parece, por tanto, que este enzima posee una especificidad casi absoluta.
El enzima de Schardinger y la xantinooxidasa son un solo enzima; es decir, este es el
caso de un enzima que tiene especificidad absoluta frente a un tipo de reacción y
especificidad de grupo frente a otro.
En resumen, se ve uno forzado a suponer que no todos los enzimas pueden ser
estrictamente clasificados en los tres grupos de especificidad antes mencionados y que
deben existir algunos tipos intermedios.
A medida que mejoran los métodos de aislamiento y purificación, muchos de los
enzimas que hoy son probablemente mezclas serán finalmente trasladados del grupo de
escasa especificidad a los de especificidad de grupo y especificidad absoluta.
2.4.2 Enzimas no proteicos
Binkley llamó recientemente la atención sobre el curioso comportamiento de algunas
aminopeptidasas al ser escindidas en unidades protéicas más pequeñas.
Comenzó con una aminopeptidasa que originalmente se comportaba al análisis
electroforético corno una proteína homogénea. La sometió a crornatografia de
25
intercambio de iones y obtuvo 15 fragmentos más pequeños, de un peso molecular
próximo a 6000. Cada uno de esos fragmentos conservaba la actividad enzimática de la
aminopeptidasa original, a pesar de hallarse muy lejos de ser verdaderas proteínas; cada
fracción contenía un mononucleótido, una glucosamina y un péptido pequeño
compuesto de dos o tres aminoácidos (ácido glutámico, ácido aspártico y leucina). Sólo
uno de estos fragmentos contenía un péptido relativamente más complejo formado de
alanina, histidina, leucina, ácido glutámico, ácido aspártico, lisina y arginina. Los
Aminoácidos de estos péptidos estaban ligados a la glucosamina y ésta a la uridina y al
guanosindifosfato, las unidades péptido-nucleótido estaban transversalmente unidas por
moléculas de ácido fosfórico, como en el ácido ribonucleico.
Esta observación es de importancia fundamental en bioquímica porque muestra una vía
para la síntesis de estos enzimas con pequeñas porciones protéicas.
Recientemente se han intentado sintetizar, moléculas orgánicas que semejen la
configuración estructural y espacial de un grupo prostético o del cofactor de un enzima.
El primer modelo de un catalizador de este tipo fue preparado por Wang: una
trietilenotetramina unida a una molécula, de Fe y utilizada para catalizar la
descomposición de H20 2• Esta sustancia no es tan eficaz como la catalasa, pero
demuestra que es posible crear artificialmente enzimas, o, al menos, sustitutos de los
catalizadores biológicos íntimamente relacionados con ellos:
lrictifcnnt('lr•mina
Figura N° 15: Fórmula de la trietilenotetramina
26
2.4.3 lnactivación de los enzimas por el calor
Los enzimas pueden desnaturalizarse fácilmente, al igual que el resto de las proteínas,
por algunas de las vías antes mencionadas, entre ellas el calor. Los enzimas son, por
tanto, muy termolábiles y si se las calienta a temperaturas de 70° a 80° C durante dos a
cinco minutos, la actividad de la mayoría de ellos queda destruida.
La industria de los alimentos usa con frecuencia la inactivación de los enzimas por el
calor. En la mayor parte de los casos, la conservación de los alimentos precisa de la
supresión de cualquier actividad enzimática: no sólo deben destruirse por completo
todos los microorganismos, sino que ha de detenerse también la actividad de los
enzimas fuera de la célula viva. Si la actividad enzimática persiste, puede por ejemplo
producirse un cambio en el color verde de la clorofila, o de los carotenoides, o el
pardeamiento de alimentos, puede alterarse el sabor de los carbohidratos, o enranciarse
la grasa, se pueden producir alteraciones del aroma, o del valor nutritivo de las proteínas
o de las vitaminas, finalmente, la presencia de enzimas peptolíticos modifica totalmente
la textura de los alimentos.
El método más conveniente para inactivar los enzimas en la conservación de los
alimentos es el calentamiento: pasteurización o esterilización. Por desgracia la
inactivación de los enzimas por el calor exige con frecuencia un tiempo superior al
necesario para una completa esterilización de los microorganismos. En ciertos casos, en
la leche por ejemplo, la fosfatasa constituye un índice de si la leche ha sido o no
adecuadamente pasteurizada; el enzima se inactiva totalmente al elevar la temperatura
lo bastante como para la destrucción de los gérmenes patógenos existentes, del tipo del
B. tuberculosis. La prueba de la fosfatasa consiste en hacer que el enzima actúe sobre
fosfato de fenoftaleína o P-nitrofenilfosfato, sustancias ambas incoloras; si el enzima es
todavía activo, hidroliza estos compuestos y da productos coloreados.
27
Desde el punto de vista industrial es importante también conocer la adecuada
distribución del enzima en un producto alimenticio dado: si está homogéneamente
distribuido en todo el producto (como la fosfatasa en la leche), disuelto en él (como las
lipasas en las grasas y aceites) o si está adsorbido sobre partículas sólidas (como los
enzimas pectolíticos o fenolasas que se encuentran adsorbidos en la pulpa de diversos
jugos de frutas).
En la tecnología de los alimentos, se dan casos de regeneración de algunos enzimas
previamente inactivados que recuperan al cabo de algún tiempo su actividad. Esta
regeneración enzimática se produce a veces con la fosfatasa de la leche y los enzimas
pectolíticos de los jugos cítricos. La introducción reciente de un nuevo método de
esterilización: «tapa contra tapa», en el que se calienta el alimento durante un tiempo
breve a 125° e (en vez del tratamiento a 115° e durante períodos más largos que se
utiliza en los esterilizadores rotatorios), ha permitido observar con frecuencia la
regeneración de la actividad de la peroxidasa al cabo de 24 horas, pese a no haber
podido demostrarse su presencia inmediatamente después del tratamiento.
En la industria de los alimentos se supone que cuanto más corto sea el tiempo de
tratamiento mayor son las posibilidades de regeneración de la actividad enzimática.
Este fenómeno de la regeneración de la actividad enzimática no puede explicarse bien
todavía. Sólo puede suponerse que las proteínas de estos enzimas, estiradas o
desenrolladas durante la desnaturalización, adquieren por sí mismas al cabo de algún
tiempo una reestructuración parcial mediante enlaces de hidrógeno o uniones disulfuro
y se restablece así su actividad.
2.4.4 Usos de los enzimas en la industria de los alimentos
Mencionamos antes que los enzimas se inactivan en los productos alimenticios, por el
28
calor u otros métodos, con objeto de impedir los cambios indeseables que produce la
persistencia de la actividad enzimática.
A veces, sin embargo, conviene producir algunas alteraciones deseables; estudiaremos
ahora cómo pueden aprovecharse los enzimas para ciertos tratamientos en las industrias
de los alimentos. Hemos mencionado algunos de estos métodos enzimáticos; parece
apropiado, sin embargo, resumir todos los procesos de este tipo bajo el presente
subtitulo. No mencionaremos, a pesar de todo, los procesos de fermentación, en los que
la actividad enzimatica interviene.
Algunas industrias alimentarias, como la cervecera, la de fabricación de quesos, la de
jarabes de maíz, etc., utilizan mucho los enzimas, al igual que la de tenderización de la
carne y los de elaboración de vinos y jugos de frutas.
Los enzimas industriales se obtienen de tres grandes fuentes: vegetales, animales y
macroorganismos:
2.4.4.1 La diástasa de la malta, la pupaína, la bromelina y la ficina proceden de los
vegetales. La diástasa de la malta se obtiene del trigo o la cebada en germinación. La
papaína es producida por la Carica papaya, un árbol que produce una fruta semejante al
melón; se extrae habitualmente del látex de la fruta verde. La bromelina se encuentra en
la piña y suele ser un subproducto de esta industria.
La ficina se obtiene del látex de las plantas tropicales del género Fícus y contienen tema
enzimático proteo lítico muy activo.
2) Los enzimas industrialmente preparados a partir de fuentes animales son los
enzimas pancreáticos, la pepsina, la catalasa y la renina El páncreas es particularmente
abundante en numerosos enzimas importantes, utilizados para preparar hidrolizados
proteicos, y en los productos de lechería para evitar el aroma oxidado. La mejor fuente
29
de enzimas es la constituida por diversas glándulas animales; su empleo es, sin
embargo, dificil y costoso, porque se recogen en pequeñas cantidades de los mataderos
y porque precisa la conservación rápida de los tejidos animales mediante desecación o
congelación.
3) La más prometedora de las fuentes de producción de enzimas industriales es la
fuente microbiana. Muchos enzimas de este tipo se preparan hoy en escala: la invertasa
del Sacharomyces cerevisiae; también se obtienen amilasas y proteinasas de diversas
fuentes bacterianas como el Bacilus subtilis o el hongo Aspergillus oryzae; la
amiloglucosidasa, pectinasas, gluxosaoxidasa y catalasa se obtienen industrialmente a
partir del Aspergillus niger.
Seleccionando el microorganismo que da cantidades óptimas del enzima deseado, se
aplica a la producción industrial del enzima la técnica microbiológica actuaL
2.5 Cinética Enzimática
2.5.1 Termodinámica
Todas las reacciones biológicas están, en contra de lo que un día se creyó, sometidas a
las leyes básicas de la termodinámica y conviene que veamos ahora cómo se aplican
éstas a las reacciones enzimáticas.
La primera ley de la termodinámica establece que la suma de todas las energías de un
sistema cerrado permanece constante:
óE=Q- W
es decir, L\E, e} incremento de la energía 'interna de un sistema, es igual a Q, la cantidad
de calor suministrada al mismo, menos W, la cantidad de energía empleada por el
sistema en efectuar un trabajo en su entorno.
30
En la termodinámica química ofrecen un interés particular los cambios de energía a
presión constante. En estas condiciones, el trabajo efectuado por el sistema es PAV, es
decir, el producto de la presión constante P, por el incremento de volumen. Cuando el
sistema absorbe calor del entorno: Q = AE + PAV. Este cambio en la energía calórica, a
presión constante, se denomina cambio de entalpía, y se indica con el ·símbolo AH. Si
una reacción produce calor, AH es negativo y la reacción se denomina exotérmica; si el
sistema absorbe calor, Ahí es positivo y la reacción se llama endotérmica.
El cambio total de calor que acompaña las reacciones químicas puede medirse en un
calorímetro. No toda la energía comprendida en AH se halla disponible
Para la ejecución de trabajo real, como mover máquinas o romper enlaces químicos.
Aquella parte del cambio de energía que puede utilizarse para realizar trabajos se
denomina energía libre y se designa con el símbolo AF.
En una máquina calórica reversible, por ejemplo, en el que .AH represente la energía
total que le es suministrada a la temperatura T h que disminuye a un valor T 2 a lo largo
del proceso, el trabajo real efectuado (AF) es, invariablemente, menor que la energía
suministrada (AH):
T 1 --- T~ AHT¡ .d_-HTs '"H ___ ( LJH __ ) T ..dF=AU - =-------·-=LJ - T' • T 1 T, T1. :1
Es decir, el cambio en la energía libre (o trabajo realizado por la máquina misma) sólo
puede igualar a la cantidad de energía suministrada a la máquina cuando T 2 es igual a
cero; o lo que es lo mismo, cuando la temperatura del escape o condensador es cero
absoluto. Como esto es imposible, o irreal, el cambio en energía libre es siempre menor
que el cambio en entalpía (F < H). La fracción (AH 1 T 1), a la que generalmente se
asigna el símbolo AS, es el incremento en la entropía y representa la medida de la
31
energía no explotada en trabajo real por la máquina calórica reversible. En general, se
cumple, por tanto, la siguiente ecuación:
~F = Llli- T(~S)
El objetivo primordial es siempre el conocimiento del valor de ~F; pero asi como es
posible medir directamente ~H por medio de un calorimetro, resulta, en cambio
imposible hacer lo mismo con la entropía. Es evidente que:
Cuando ~F =O, el sistema se halla en equilibrio;
Cuando M > O, el sistema roba calor al contorno, y la reacción no tiene lugar a menos
que al sistema se le suministre energía procedente del exterior (es una reacción
endotérmica), y ~H es un valor positivo
Cuando ~F < O, el sistema cede energía libre, y la reacción puede proceder por si sola
(es una reacción exotérmica), y ~Hes un valor negativo.
Pondremos ahora unos cuantos ejemplos de reacciones bioquímicas. Al oxidarse la
glucosa a H20 y C02 el sistema cede calor al entorno, la reacción es exotérmica y los
valores de ~F y ~H son negativos:
El incremento de la entalpía Llli es -673 Kcal
El valor de T ~S es pues + 13 Kcal
Recordemos la fotosíntesis como un ejemplo de reacción endotérmica; en este caso, el
C02 y el agua reaccionan para formar hidratos de carbono de gran energía potencial.
La energía química ~F, precisa para sintetizar un mol de glucosa a partir de C02 y
agua, es de unas 690 kcal y le es suministrada al sistema por la energía radiante, de la
32
luz visible.
2.5.2 Energía de activación
Un enzima no pone en marcha una reacción por su mera presencia. Está claro que las
reacciones enzimáticas sólo pueden tener lugar si son termodinámicamente posibles, es
decir, si van acompañadas de una pérdida de energía libre, como sucede en todos los
procesos metabólicos, a menos que el entorno le ceda energía, lo que sólo puede suceder
en los procesos anabólicos. Si la reacción procede o no, es otra cuestión, y depende de
que se cumplan ciertas condiciones. La primera y la más importante de estas
condiciones es la de que las moléculas que entran en la reacción se hallen en forma
activada. La relación existente entre velocidad de reacción, energía de activación y
temperatura venía dada por la ecuación de arrhenius
K=Ae-Ea/KT
Jo que significa que e] más Jigero cambio en Ja energía de activación, o en ]a .
temperatura, influirá notablemente en la velocidad de la reacción.
La característica fundamental de los enzimas, como catalizadores biológicos, es su
capacidad de reducir considerablemente la energía de activación. No existe aún una
explicación adecuada de este hecho; la tabla 1 pone de manifiesto, sin embargo, las
diferencias entre la energía de activación de diversas reacciones cuando tienen lugar en
ausencia y en presencia de enzimas.
Dcgrndación dt: II20: . . . . • • • . . • . • • . Cn~llllffw • IIidró!isis de la s:u:arosa • • . . . . • . . . . P·l·~urln:ndnsa Jlidrólisis de la c111...o;cina . . . . • . • . . . • • Tripsinn Hidrólisis de un Ji pido (butirato de etilo} LiJm~a
\
Sin ~ldllliuJw E,. prn.,-ri• • ~ .do om u._ ~" ttttt-..
Hll!flll :w llf)l}
:!O IWI 1:1:mo
S lii!U 11 5!10 12 01!0 4 2011
En todos estos ejemplos, las energías de activación requeridas en presencia de los
33
enzimas son muy inferiores a las precisadas en su ausencia o cuando la reacción es
activada sólo por el ion hidrógeno, y no es difícil calcular que un descenso de 20000 a
10000 cal/mol puede corresponder a multiplicar por 500.000 la velocidad de la reacción,
dado el carácter exponencial de la relación entre la velocidad de la reacción y la energía
de activación.
2.5.3 Influencia de la temperatura
El segundo factor que influye considerablemente en la velocidad de la reacción, como
queda indicado en la ecuación de Arrhenius es la temperatura. Aunque la característica
general de temperaturas adecuadas para las reacciones enzimáticas sea muy pequeña,
cambios mínimos de temperatura ejercen una influencia muy considerable. La
temperatura óptima para la mayor parte de las reacciones enzimáticas (con muy pocas
excepciones) se halla entre 30 oc y 40 °C. Al elevar la temperatura, aumenta la
velocidad de la reacción, y en la mayor parte de los enzimas un incremento de 1 oo C
duplica con frecuencia la velocidad.
Así, por ejemplo, para la invertasa (¡3-fructoxidasa) la constancia de la velocidad K
entre O y 20 oc será
El punto de desnaturalización de los enzimas se halla también muy cerca de la
temperatura óptima de la reacción enzimática, por lo que las curvas obtenidas al
representar la velocidad de la reacción en función de la temperatura suelen tener en
muchos enzimas la forma de la figura 16.
34
' : e:l ·-o
¡¡ <> .. e • ~ 'e • 'O g -¡:,
-Punto d-e de•nau.rtlltuocl6n
> IL-;T::eMP::. 0:·===.,___.__
Figura N° 16: Relación entre la velocidad de una reacción enzimática y la temperatura.
A temperaturas entre 50 y 90° e se inactivan la mayor parte de los enzimas.
De otro Jado, a temperaturas bajas Ja actividad enzimática transcurre muy Jentamente,
aunque no se detiene; la industria de los alimentos congelados debe recordar esto:
numerosos alimentos congelados experimentan un considerable deterioro tras
prolongados almacenamientos. Algunas reacciones enzimáticas siguen funcionando aún
a temperaturas del orden de -18° e (0° F).
2.5.4 El complejo enzima-sustrato
La necesidad de una energía de activación menor para comenzar una reacción suele
adscribirse al hecho de que el enzima forma primero un complejo con el sustrato,
«rompiéndose» o «deformándose» la molécula entera con lo que la reacción puede
transcurrir con mayor rapidez y más facilidad. Michaelis y Menten fueron los primeros
que trataron de explicar este fenómeno. Según ellos, el complejo enzima-sustrato es un
compuesto muy lábil en virtud de su complicada estructura específica. En el caso de los
enzimas hidrolíticos, suponen que el sustrato se combina con el enzima durante un
tiempo muy corto y queda tan debilitado por la gran molécula del enzima, que se
encuentra a una concentración de ion hidrógeno más baja que en ausencia del enzima.
El concepto de complejo enzima-sustrato fue de gran utilidad para el estudio de la
35
enzimología, aunque durante mucho tiempo no fue sino una hipótesis de trabajo. Puede
representarse esquemáticamente como en la figura 17
Complejo 1
Á E etedo Hmsf Enzl~'-._/
Figura No 17: Representación esquemática de una reacción enzimática.
Recientemente, sin embargo, se han observado hechos que indican la presencia real de
estos complejos. Chance descubrió en 1943, estudiando la descomposición del peróxido
de hidrógeno, que la peroxidasa del rábano silvestre forma por adición de H20 un
complejo de color verde con máximos de absorción a 41 O y 624 m ¡.t. Los máximos
cambian a 418, 527 y 555 m¡.t. durante la reacción, recuperando su espectro original sólo
al término de la reacción.
2.5.5 Número de recambio (Turnover number)
Si el viejo concepto de que un catalizador no participa en la reacción no tiene validez,
¿cómo puede explicarse el hecho de que basten cantidades mínimas de un enzima para
que la reacción prosiga? Este hecho se atribuye a la enorme velocidad a que se
restablezca la actividad enzimática.
La invertasa, por ejemplo, puede hidrolizar cantidades de sacarosa por segundo 1 O veces
superiores a su propio peso, y la amilasa produce 40 veces su peso de maltosa a partir
del almidón. Habida cuenta de la enorme diferencia entre los pesos moleculares del
enzima y sus sustratos, se comprende fácilmente que algunos enzimas tengan un
recambio ("tumover") que se halla entre 100 y 3 000 000 por minuto.
El número de recambio de un enzima se define como el número de moléculas de
sustrato que pueden ser catalizadas durante un minuto por cada molécula de enzima.
36
La tabla N° 2, da una idea de este valor en unos cuantos enzimas.
~02 Urea !"acarosa Difosfato de sosa Acido pirúviw . Transferencia de bidrógdao
2.5.6 Velocidad de las reacciones enzimáticas
s x to~> 4,6 X !OS
4 x to• 7 X 11)3 S X 101
5 X 101
La velocidad de las reacciones está controlada por otros factores, importantes, tales
como el pH del sustrato y la concentración de sustrato y enzima.
Influencia del pH. La catálisis enzimática tiene lugar dentro de límites bastante
estrechos del pH. Cada reacción enzimática tiene en general un pH óptimo; si un mismo
enzima actúa sobre diferentes sustratos, puede tener distintos óptimos en cada caso. La
carbohidrasa, por ejemplo, requiere diferentes pH óptimos para los distintos azúcares
sobre los que actúa, mientras que la pepsina tiene sólo unos límites de pH óptimos muy
pequeños, comprendidos entre 1 ,5 y 2,5 dependiendo de las proteínas sobre las que
actúa. Casi todas las curvas en las que se representa la velocidad de la reacción
enzimática ('V') en función del pH ofrecen características semejantes a las de la figura
18.
Esta gráfica general se parece mucho a la que representa el grado de ionización de un
anfolito simple, como la glicina, a diversos valores de pH. Debe recordarse que las
sustancias anfóteras, como los aminoácidos de las proteínas experimentan ciertos
cambios mínimos y máximos de sus propiedades (solubilidad, presión osmótica,
conductibilidad, viscosidad, ·etc.) en sus correspondientes puntos isoeléctricos. Se
admite que estos cambios son consecuencia de los diferentes estados iónicos de los
37
citados anfolitos: Las proteínas son zwiterion, por lo que pueden adoptar distintas
configuraciones iónicas. Es de suponer que un enzima que es, desde luego, una proteína,
pueda presentar también distintas configuraciones iónicas, y que sólo una de estas
formas sea capaz de ejercer actividades catalíticas. Es posible que a un pH óptimo dado
la configuración en cuestión sea más abundante y le permita por ello actuar como un
enzima.
1 1'
Figura N° 18: Relación entre el pH y la velocidad de una reacción enzimática.
Concentración de enzima. Si los demás se hallan en condiciones óptimas, la velocidad
de la reacción enzimática depende de la concentración de enzima. La velocidad de la
reacción es directamente proporcional a la concentración de enzima, según se indica en
la figura 19, que representa la inversión de la sacarosa
... ., 1.1 ., :;
1 mi de prepeteclón cnum6tir;:e
Figura No 19: Velocidad de reacción en función de la concentración de enzima.
por acción de la invertasa; como quiera que la reacción tiene lugar en ausencia del
enzima, es evidente que la curva debe pasar a través del punto O, es decir, del punto de
38
intersección de las dos coordenadas.
2.5. 7 Concentración de susll'ato. La velocidad de una reacción aumenta normalmente
con la concentración de sustrato, aunque sólo hasta un punto determinado. De ahí en
adelante la velocidad de la reacción apenas varía con la concentración de sustrato, y
finalmente la gráfica sigue un curso horizontal; es decir, la velocidad se hace constante.
Al aumentar la concentración de enzima manteniendo las mismas concentraciones de
sustrato se obtiene una gráfica con valores más elevados, pero de igual forma. En la
figura 20 se representan los resultados de un experimento efectuado con invertasa que
actúa sobre sacarosa (al aumentar la concentración de enzima, la hipérbola obtenida
circunscribe la lograda con concentraciones de sustrato inferior).
Figura N° 20: Velocidad de la hidrólisis de la sacarosa por acción de la invertasa a
diversas concentraciones de sustrato.
Este es uno de los experimentos que Michaelis usó para explicar su teoría y
fundamentar la hipótesis de la existencia de un complejo enzima-sustrato. Antes
proseguir con el estudio de las velocidades de las reacciones enzimáticas, debe
recordarse que trataremos de concentraciones molares, y no de concentraciones simples,
expresadas en % de peso. Es preciso tener esto en cuenta, porque los enzimas son
proteínas de peso molecular muy alto en comparación con la mayor parte de los
sustratos.
39
De acuerdo con la ley de las masas, la velocidad de una reacción química es
proporcional al producto de las concentraciones de los reaccionantes. En presencia de
un solo reaccionante la velocidad de la reacción (v) es proporcional a la concentración
de sustrato (S).
Esta es una reacción monomolecular o reacción de primer orden. Muchas reacciones
hidrolíticas son reacciones monomoleculares y sus velocidades son, por tanto,
proporcionales al sustrato que experimenta la hidrólisis. Durante la hidrólisis de la
sacarosa, por ejemplo, por iones Ir reacciona una molécula de agua con cada molécula
de sacarosa a hidrolizar; la concentración de agua en comparación con la sacarosa es,
sin embargo, tan grande, que cualquier cambio considerable en la concentración de esta
última no producirá efecto apreciable en la concentración de agua. La velocidad de esta
reacción puede medirse, por tanto, mediante la concentración de sacarosa:
va [S]
Es decir, Ja velocidad de esta reacción (v) es directamente proporcional a la
concentración del sustrato, sacarosa (S). Sustituyendo el concepto de «proporcional»
por la constante de velocidad (K)
V0 =K [S]
Cuando la reacción ha estado en marcha durante algún tiempo (t), la concentración de
sustrato disminuye algo, pasa a ser [S-x], y la velocidad de la reacción será entonces:
dx v =-= K[s-xJ
dt
Lo que quiere decir que en un momento determinado la velocidad de la reacción es
igual a la constante de velocidad multiplicada por la concentración de sustrato en ese
preciso instante. Integrando la ecuación anterior se obtiene:
40
2.303 [s] K= ( )log10 -r -]
t2 -t1 Ls -x
o
Lo que quiere decir que la constante de velocidad es igual a la inversa del tiempo (en
segundos, minutos u horas) multiplicado por el logaritmo natural de la concentración
inicial del sustrato y dividido por su concentración fmal en el tiempo (t) no es dificil
calcular, por tanto, la constante de velocidad a partir de las concentraciones al principio
y al final de la reacción. (S) y (S-x) son las concentraciones de sustrato en los momentos
t1 y t2 Si los valores de K a dos intervalos de tiempo distintos son iguales o muy
parecidos, la reacción se considera de primer orden.
En la figura 20, las gráficas que representan la velocidad de hidrólisis de la sacarosa
indican al principio una reacción monomolecular, es decir, que las velocidades iniciales
de reacción son directamente proporcionales a las concentraciones de sustrato. Al cabo
del tiempo, sin embargo, las curvas se aproximan asintóticamente a un límite, en el que
las velocidades de la reacción son constantes, cualquiera que sea la concentración de
sustrato.
Este fenómeno se debe, al perecer, a la presencia del enzima. Al hidrolizar la sacarosa
con invertasa, podría suponerse, de acuerdo con la teoría del complejo enzima-sustrato,
que a concentraciones de sustrato bajas (en este caso hasta alrededor de 4 % de
sacarosa) no todas las moléculas de enzima participarían en la formación del complejo.
Finalmente, sin embargo, cuando las concentraciones de sacarosa son altas (10-20 %)
todas las moléculas de enzima se hallan ocupadas en la reacción y se encuentran
formando constantemente complejos con el sustrato a partir de este momento la adición
41
de más sacarosa no modificará la reacción porque todas las moléculas de enzima se
hallan funcionando al límite de su capacidad de recambio. Cuando la velocidad de la
reacción no depende ya de la concentración del sustrato, la reacción se considera de
orden cero. Empleando los mismos símbolos que antes, la ecuación diferencial para una
Reacción de orden cero es:
dx 1" d K ~X -=K, que a mtegrar a =-dt ~t
2.5. 7 La ecuación de Michaelis
Consideremos ahora el principio, ya estudiado, del complejo enzima-sustrato a la luz de
la ley de las masas. El enzima a una concentración (E) forma con el sustrato (S) un
complejo temporal de concentración [ES]:
[EJ + [SJ ~ [ES]
La constante de equilibrio será:
K_ [Eis] - [ES]
En virtud de la formación de complejo ha de restarse la cantidad ligada tanto de la
concentración del enzima como la del sustrato. La ecuación anterior se transformará por
tanto en esta:
K_ ([E]-[Es])([s]-[EsD - [Es]
La concentración del complejo es tan pequeña, en comparación con la cantidad de
sustrato, que puede ignorarse en lo que al sustrato se refiere. Esta ecuación puede por
tanto, simplificarse así:
42
K_ UE]- [EsD[s] - [Es]
La última forma de esta ecuación para la constante de equilibrio de las reacciones
enzimáticas se llama ecuación de Michaelis y la constante km se la denomina en
bioquímica constante de Michaelís.
Véase en Ja figura 21, gráficas teóricas basadas en Ja ecuación de MichaeJis; obsérvese
que se parecen mucho a las curvas obtenidas en los experimentos (figura 20) esta
ecuación da una curva hiperbólica rectangular, con las características siguientes:
a) EJ Jimüe deJa velocidad de reacción es un valor asintótico, al que se aproxima Ja
velocidad al aumentar la concentración de sustrato.
b) En la constante de Michaelis, Km corresponde a la concentración de sustrato a
que la velocidad de la reacción es igual a la mitad de la velocidad máxima.
e) En exceso de sustrato, las velocidades límite son directamente proporcionales a
la concentración de enzima (según se discutió antes), como puede deducirse de las
diferencias entre las curvas a y b:
Figura N° 21 : Curvas teóricas de velocidades de reacción basadas en la ecuación de
Michaelis.
43
Las curvas de Michaelis no sólo predicen la velocidad de las reacciones enzimáticas en
función de las concentraciones de sustrato, sino que dan además una idea aproximada de
la especificidad de los enzimas que intervienen. Si las curvas a y b de la figura 21
representan dos enzimas distintos de escasa especificidad, que actúan sobre el mismo
sustrato, es evidente que el enzima a tiene mayor afinidad por el sustrato que el enzima
b, y que sería necesario usar mucho más enzima b para obtener el mismo Km que en a,
que aparentemente es un enzima más específico.
2.5.8 Oxidación biológica - empardeamiento enzímático
2.59 Tipos de oxidación
En general, se conocen tres tipos de oxidación:
2.5.10 Combinación directa del oxígeno molecular con otro átomo
Por ejemplo, la combustión del carbón en el aire con producción de dióxido de carbono:
Este mismo tipo de oxidación se da, en condiciones aeróbicas, en ciertas reacciones
enzimáticas en las que el enzima transfiere directamente el hidrógeno, obtenido del
sustrato, al oxígeno molecular. -Ejemplo de este tipo de enzimas es la deshidrogenasa.
"aeróbica" o enzima de Schardinger (xantin-oxidasa). Se trata de una metaloproteína
que contiene hierro, molibdeno y F AD como grupo prostético. El enzima de
Schardinger cataliza la oxidación directa de muchos aldehídos a sus ácidos
correspondientes, como también la de la xantina e hipoxantina a ácido úrico.
2.5.11 Oxidación anaeróbica o desbidrogenación.
Se conocen muchas sustancias que, en ausencia absoluta de oxígeno, actúan como
aceptores de hidrógeno. Una de ellas, el azul de metileno, acepta el hidrógeno pasando a
su forma leuco, incolora. Trumberc elaboró un método, empleando un recipiente
especial para llevar a cabo la reacción (tubo de Thunberg), en el que puede demostrarse
44
y medirse la oxidación anaeróbica (figura 22). El sustrato, junto con el azul de metileno
(MB) debidamente tamponizado, se coloca en el tubo, mientras que el enzima se sitúa
en una rama lateral que forma parte del tapón que es hueco. Después de cerrado se
practica el vacío en el tubo y el enzima se vierte entonces sobre el sustrato, con el que se
combina.
Si e) enzima cataliza Ja oxidación, el azul de metileno se decolora a MBH2•
Por ejemplo:
Cf~·CH,Oli + MB
. ~tono! azul de metiteno
~t&ldehido forma li!uco. reducida
La velocidad de la reacción puede medirse con un cronómetro de laboratorio, si se
conocen las concentraciones del sustrato y del enzima.
=~~ - --=-· t•~6n -.v•tr•to Mt1
Tubo de Thtm~
Figura 22: Tubo de Thunberg
No es siempre fácil explicarse cómo tales reacciones se llevan a cabo en ausencia de
oxígeno. ¿Cómo puede, por ejemplo, el gliceraldehído obtener oxígeno en condiciones
anaeróbicas para oxidarse a ácido glicérico? Tales reacciones de oxidación se explican
por la presencia de pequeñas cantidades de un hidrato del sustrato, en este caso hidrato
aldehído:
45
CttO 1 CH·Oll +n.o 1 . en.o u
· ·• t.lk~aldehlc!o
HO...._,.,OH· CH
1 --+ CH·OH+MB
. 1 CH10H
hidraln afdehitln
COOH 1
CH-OH +MBI~ 1 CfioOH .
acido gliccril"<'
Figura 23: Oxidación del gliceraldehído
Todas estas reacciones son posibles en condiciones anaeróbicas por la hidratación del
sustrato, pero requieren también un aceptar de hidrógeno como el MB, antes citado. Sin
embargo, en la mayor parte de las reacciones bioquímicas, son los enzimas
deshidrogenas los que actúan como aceptares de hidrógeno. Las llamadas
deshidrogenasas anaeróbicas, tales como el DPN o TPN, son aceptares de hidrógeno y
se reducen con facilidad a DPNH2 o TPNH2•
El ácido succínico a márico en el ciclo de Krebs:
CH1·COOJ-l · CH·COOH 1 +DPN CR1 ·COOH
át.-:ÚQ succini('O
1 +DPl'm,_ i DOC•HC •• J
:kíd'l fttnt~ak-o •··
Figura N> 24: Reducción del ácido succínico a márico
Una reacción semejante es la oxidación del ácido láctico a ácido pirúvico en el
metabolismo del glucógeno en el cuerpo humano:
CR,·CHOH·COOH + DPN ácido l:iwro
__ .. -- CH,CO·COoH + OP.N'U• ácido pin'h•ii:u
Sin embargo, la pequeña cantidad de enzima debe poseer un gran «tumover» o
recambio y el DPNH2 no puede reaccionar directamente con el oxígeno molecular, por
lo que antes, de que esto ocurra deben producirse otras reacciones. En primer lugar, las
deshidrogenas anaerobias reducidas cambian su hidrógeno por otros enzimas, sobre
todo flavoproteínas (FB), como las que contienen FMN o F AD:
46
En estos intercambios, el DPNH2 y el TPNH2 constituyen los sustratos de las
flavoproteínas (FP). En esta fase, en vez de transferencia de hidrógeno hay transferencia
de electrones, como puede verse.
2.5.12 Transferencia de electrones
Al reaccionar el zinc metálico con el sulfato de cobre, por ejemplo, se dice que el átomo
de zinc se ha «oxidado» al perder dos electrones y la forma cúprica se reduce aceptando
dos electrones:
zn + cu• .. so~•- __.. z.n•+so,~ + eu or: Zn- 'le-:- ___.. Zn•~ álld Cu ... + 2~- ---.. Cu
Una situación semejante acaece en la última fase de la oxidación biológica. El
citoeromo e reduetasa constituye un ejemplo de los enzimas transportadores de
electrones. El peso molecular del eitoeromo e es sólo de 13 000, comprende
aproximadamente de 50 a 100 aminoácidos y es, por lo tanto, una proteína pequeña a la
que es difícil clasificar como enzima. Su grupo prostético es una metaloporfina que
contiene hierro. La acción del citocromo e puede representarse así:
dtonumo e Fel+
Ahora podemos explicamos la última fase de las reacciones de oxidación anaeróbica
antes descritas: El FMNH2, que obtiene su hidrógeno del DPNH2, transfiere sus
electrones al citocromo e, que, a su vez, es oxidado por el oxígeno molecular para
formar una molécula de agua. Esta oxidación del citocromo e la cataliza otro enzima, el
eitoeromo-reduetosa. En la figura 25, en el que se utiliza el sistema representativo de
Baldwin , nos muestra los cambios que se producen:
47
Figura 25: Oxidación de citocromo e
2.5.13 Propiedades de los enzimas oxidantes
Los extractos de fenolasas. se obtienen corrientemente macerando el tejido vegetal, por
ejemplo mondaduras de patata, con acetona al 50 % en agua a O oc y almacenándolas a
continuación a temperatura muy baja (de 60 a 75 °C bajo 0). La purificación de estos
enzimas se suele llevar a cabo por precipitación fraccionada en soluciones de sulfato
amónico. Para determinar que sustratos son atacadas por una fenolasa dada pueden
utilizarse dos métodos: o bien el sustrato se oxida primero y los productos de esta
oxidación se separan después cromatográficamente o, por el contrario, se prepara
primero un Cromatograma del sustrato que después se trata pulverizándolo con la
suspensión del enzima.
Las fenolasas ni siquiera son estables a temperaturas relativamente bajas. La
peroxidadsa, por otra parte, es uno de los enzimas más estables y su inactivación
requiere mucho tiempo. La tabla 3 da unos pocos ejemplos de las temperaturas de
actividad y óptimas de estos enzimas.
48
TABLAN°3
Enzima Temperatura de Temperatura
actividad (°C) óptima (°C)
Fenolasa de manzanas 5-65 40,0
Oxidasa de olivas 5-40 31,0
o,. .. ,.., ~rl<ts:a de uvas 0-40 36 3
Peroxidasa de guaba 5-50 50,0
M.A. Joslyn y. J. D. PoNNTING, Enzyme-catalyzed oxidantive browning of fruit
products, Advances in Food Research, 3 (1951) l.
A temperaturas de 85-95° C, todas las fenolasas se inactivan en poco tiempo, mientras
que la inactivación de la peroxidasa requiere hasta 5 minutos. Cuando, para inactivar
estos enzimas en la elaboración de productos de las frutas, se utiliza el escaldado, se
pretende siempre conseguir la inactivación completa de los enzimas sin alterar ni el
aroma ni la textura del producto final; cada fruta en particular exige un tratamiento
especial; por ejemplo, un escaldado insuficiente de los cortes de frutas que se intentan
congelar determinará la decoloración de sus capas, o porciones más internas, que
contienen todavía enzimas activos.
A parte de por el calor también se pueden inactivar estos enzimas por la acción de los
iones de metales pesados, por halógenos, sulfitos, cianuros, ultrasonidos y ondas de la
radio de alta frecuencia. En la industria de los alimentos, los que encuentran más
aplicación práctica son las sales de los halógenos y los sulfitos. Con sólo 1 *10-2 M de
FNa se inactivará toda la peroxidasa de las uvas, y una concentración de 0.1 N de ClNa
reducirá la actividad de la enzima en un 78 %. A esto se debe el que se utilicen
salmueras de cloruro sódico para sumergir las patatas cortadas inmediatamente antes de
someterlas a la deshidratación.
49
El dióxido de azufre, en forma gaseosa o como sulfito, se utiliza mucho en los cortes de
frutas y de ciertas hortalizas para prevenir su empardeamiento.
Inmediatamente de cortadas y antes de deshidratadas o congelarlas. Debe recordarse sin
embargo, que sólo el S02 libre y no su forma ligada es capaz de evitar el
empardeamiento.
Aparte de eJJo, eJ pH deJ tejido vegetal desempeña un papel importante en Jos
fenómenos de empardeamiento, lo mismo que en todas las reacciones enzimáticas: la
disminución del pH natural disminuye, a menudo apreciablemente, la velocidad del
empardeamiento. En las manzanas, por ejemplo, el pH óptimo para empardeamiento
enzimático es de 4, mientras que a pH de 3, 7 la velocidad de empardeamiento
disminuye mucho y a pH de 2.5 casi desaparece. En las ciruelas el pH óptimo es 7; a pH
3.0, la actividad fenolasa es únicamente del 12 %, y a 2.5, cesa por completo. La
influencia del pH, al reducir la velocidad de empardeamiento, se utiliza mucho en la
industria de los alimentos con frutas como los albaricoques o melocotones después del
escaldado alcalino, se sumergen inmediatamente en una solución de ácido cítrico para
reducir su pH a 4. Los ácidos minerales son, por supuesto mucho más efectivos, por lo
que a menudo se emplea el ácido fosfórico puro. JOSL YN y HOHL propusieron el
empleo de una solución al 0,5 % de ácido cítrico y ácido ascórbico al 0,03 % para
prevenir el empardeamiento en trozos de frutas que van a ser congeladas. En este caso,
el ácido ascórbico actúa también como antioxidante.
La causa por la que la presencia de fono/asas in situ no origina el empardeamiento se
explicó, durante algún tiempo, diciendo que el cromógeno (el sustrato fenólico) y el
enzima se encontraban en células distintas de la fruta y su interacción no comenzaba
hasta que, al romperse aquéllas, ambos se ponían en contacto. Sin embargo, esta
suposición no puede mantenerse, como demostró por primera vez, Szent-Gyórcyi.
50
Todas estas reacciones bioquímicas, tal y corno ocurren en las células, son reversibles y
la oxidación y reducción de los cromógenos ocurren a la vez. Sin embargo, cuando se
altera la organización celular, la reacción se verifica rápidamente en una dirección. Este
sistema oxidativo exige tres componentes: cromógeno, fenolasa y oxígeno. Según el
investigador citado, la pulpa de patata absorbe 15 veces más oxígeno, para la oxidación
de sus cromógenos, de la que necesita para una normal respiración.
No estará de más, en relación con esta capacidad de absorber oxígeno de las frutas
trituradas, el mencionar los resultados muy interesantes de algunos experimentos que
indican con claridad la localización de los enzimas oxidantes. Contrariamente a lo que
ocurre con enzimas como la fosfatasa de la leche, que están disueltos en el sustrato, las
fenolasas están en su mayor parte absorbidas en los tejidos sólidos y cuando éstos se
filtran para dar los jugos, la velocidad de oxidación, disminuye en medida considerable.
La figura 26 señala los resultados de experimentos llevados a cabo con jugo de
manzana al que se adicionaba oxígeno cada 2 horas. El jugo natural («a»), que contiene
una cantidad normal de pulpa, pierde todo su oxígeno en aproximadamente 2 horas y
continúa perdiéndolo incluso cuando se le adiciona de nuevo. Por el contrario, el jugo
filtrado por EK, ("b"), pierde su oxígeno absorbido muy lentamente, mientras que el
jugo pasteurizado con la pulpa («e») no sufre oxidación alguna debido a la inactivación
del enzima.
Estos experimentos indican que las fenolasas se absorben principalmente en la pulpa.
51
Figura N° 26: Pérdidas de oxígeno en el jugo de manzanas (a= jugo con pulpa natural;
b =jugo filtrado; e= después de la activación enzimática).
2.5.14 Sustratos fenólicos y pigmentos
Existen numerosos sustratos naturales del pardeamiento enzimático: mono, di o
polifenoles . Su reactividad es más o menos elevada según su estructura (por ejemplo,
los metadifenoles son malos sustratos) y también según el origen de las enzimas que
catalizan su oxidación. Además, una gran parte de estos sustratos se clasifican entre los
principales constituyentes fenólicos de los vegetales:
OH
ÓOH
1
~
• El pirocatecol y sus derivados. Conviene recordar que el guayaco! u o-
metoxifenol, no es substrácto de estos pardeamientos.
• La 4-dihidroxifenilalanina (DOPA)
52
HO
NH 2 1
CH2- CH - COOH
tomada a partir de la tirosina (caso de la patata) y susceptible de oxidarse a
dopaquinona.
• La 3, 4-dihidrofeniletilamina o dopamina, que es el sustrato principal del
pardeamiento de los plátanos.
• Los ácidos de anillo aromático, tales como el ácido gálico
OH
/'1 HO'OOH ~
COOH
Forman taninos hidrolizables (ver a continuación), al igual que el ácido clorogénico y
del ácido cinámico y cumárico. El ácido clorogénico está presente en las manzanas,
peras, patatas, etc. También participa en la formación de los pigmentos negro-azulados
que pueden aparecer en las patatas durante la cocción, por reacción con trazas de hierro.
53
OH
ácido clorogénico COOH
---+-OH CH=CH-CO-· O
----------.......---_...... ácido cafeico H,Q OH
----------ácido qu (nico
Esta coloración puede evitarse por descenso del pH (debajo de 4, lo que no es
aconsejable, pues a esta acidez la cocción origina la transformación del almidón con
dextrina) y sobre todo por adición de agentes complejantes del hierro, tales como los
fosfatos y -si está permitido su empleo- ácido etilen-diamino-tetra-acético (EDTA).
• Los jlavonoides , cuya estructura general es
7
6
5 4
entre los cuales se encuentran principalmente:
a) Los antocianidoles, rojos, violetas o azules, según su estructura, por el cianidol
azul:
54
Generalmente este compuesto se encuentra bajo la forma de antocianósidos, es decir
unido a uno o varios glúcidos. Estos pigmentos vegetales son muy sensibles a las
variaciones de pH: así pasan de azul a rojo, según baje el pH e inversamente. Su
colorado se puede modificar cuando el grupo glucídico se separa por hidrólisis, o por
reacción con diversos metales (por ejemplo el color parduzco con el estaño, en los
envases de conservas).
b) Los leucoantocianidoles, incoloros, por ejemplo elleucocianidol:
HO OH
OH OH leucocianidol
Por calentamiento en medio ácido, sufren una oxidación con pérdida de agua y se
transforman en el correspondiente antocianidol; su coloración vira al rosa o rojo
(habichuelas, ciertas variedades de manzanas, peras, coles.). A veces, los compuestos
incoloros de este tipo se presentan al estado de polímeros y entonces constituyen una de
las dos categorías de taninos.
HO
OH
55
e) Losflavonoles, como por ejemplo el quercetol, caracterizado por la presencia de
un grupo carbonilo en posición 4 y de un grupo hidroxilo en posición 3, que, por lo
general se encuentra unido a un glúcido en posición 7.
d) Las jlavanonas, como por ejemplo el naringenol, del cual el diolósido (con
glucosa y ramnosa) naringina es el responsable del sabor amargo de ciertas toronjas,
todo antes de la maduración. En las naranjas, se encuentra un compuesto de estructura
similar, la hesperidina (7,5,3'-metoxi-4'-tlavanona).
H
OH O
• Los taninos no son solamente sustratos de pardeamientos enzimáticos, sino que
también contribuyen a la textura (incrustación de las paredes celulares) y al sabor
(astringencia) de los tejidos vegetales. Se distinguen dos grupos de taninos: los taninos
hidrosolubles (o pirogálicos), que resultan de la esterificación de cinco funciones
alcohólicas de glucosa por diversos ácidos polifenólicos (gálico, digálico, elágico y
lutéico) y los taninos condensados (o catequicos), cuya composición química está muy
próxima la de los antocianidoles. Los taninos poseen la propiedad de reaccionar con las
proteínas y de esta forma pueden inactivar enzimas. La turbidez de las cervezas es una
reacción entre polifenoles oxidados (procedentes de taninos) y proteínas. El
ennegrecimiento que se observa a veces en los purés de castañas ("marrons"), procede
56
de la formación de compuestos pigmentados entre los taninos pirogálicos y trazas de
hierro.
• Las ligninas son polímeros de fenoles que contribuyen a la rigidez de algunos
tejidos vegetales.
Los pigmentos que se forman por pardeamiento enzimático se designan bajo el término
general de melaninas. Su color final es pardo o negro, pero existen una variedad de
colores intermedios: rosa, rojo, azulado. Su formación, sin la intervención de enzimas,
es a partir de las quinonas que resultaron de la reacción enzimática
Las quinonas reaccionan con el agua y dan trihidroxibencenos; estos reaccionan,
posteriormente, con otras quinonas para formar hidroxiquinonas, que en realidad, son la
base de una condensación oxidativa (donde todavía se consume oxígeno), que conduce
a polímeros del tipo:
Las quinonas también pueden reaccionar con los grupos SH y NH2 de las proteínas,
aminoácidos y aminas:
57
D HO
e igualmente con diversos poJifenoles que no son susceptibles de oxidarse directamente
por las enzimas de pardeamiento enzimático.
2.6 Enzimas y mecanismos de las reacciones
La hidroxiladón de monofenoles y la oxidación de difenoles son dos acciones
enzimáticas distintas y separables; sin embargo, parece que una misma enzima puede
catalizar, frecuentemente, ambas reacciones. Enzimas de origen diferente también
presentan relaciones de actividad hidroxilante, actividad oxidante diferentes lo que se
atribuye a la existencia de isoenzimas y al hecho de que su contenido en Cu + y Cu ++
varía de una a otra. La nomenclatura relativa a estas enzimas no es muy precisa: se
habla de monofenolasa o de cresolasa, refiriéndose a la primera etapa enzimática y de
polifenol oxidasa, de polifenolasa o de catecolasa, con relación a la segunda etapa. El
nombre sistemático para las enzimas responsables de la acción oxidante es 0-difenol
oxígeno oxidoreductasa. Es el oxígeno molecular el que actúa como aceptor de
hidrógeno.
En Jos tejidos de algunos mamíferos, se encuentra una tirosinasa, de especificidad
limitada, que motivaría la formación de DOPA y de dopaquinona, a partir de la tirosina.
Las polifenol oxidasas del plátano, melocotón, té, tabaco, catalizan específicamente la
oxidación de difenoles; las de la manzana, pera, patata y champiñones también poseen
58
una actividad hidroxilante. Los polifenol oxidasas son metaloenzimas conteniendo un
0,2 % de cobre, elemento que se puede separar por diálisis mediante el EDTA. La
polifenol oxidasa del té, con un peso molecular de 144.000, posee 7 moles de cobre por
mol; su pH óptimo es 5,5.
No se conoce perfectamente el mecanismo de la oxidación de difenoles. Se propuso la
siguiente ecuación estequiométrica:
cu++ppo +H. )):.1 ~. _ 2 ,, . ......::: 1
H
+ -
Cuyo resultado fmal es:
HO~ + '¡202
HO~
cu;.PPO
Cu;+.PPO
-
Figura N° 27: Oxidación de difenoles
oo~· + ' /)· ~ o
+ o--
+ aH• (1)
(2}
La cinética de la reacción se estudió midiendo la absorbancia de las quinonas. La
reacción se inhibe por un exceso de producto final (quinona).
Se puede incluir la hidroxilación de un monofenol, para un balance más completo
(trabajos de H.S. Masón):
59
(3)
{4}
Por su parte, el difenol cataliza la hidroxilación del monofenol, según la anterior
ecuación (4), porque su transformación en quinona (ecuación (1) origina la formación
de polifenol oxidasa con ion cuproso.
Aunque las polifenol oxidasas sólo están presentes en los tejidos vegetales en bajas
concentraciones (por ejemplo 40 mg/kg en los champiñones) frecuentemente es el
contenido en sustrato y no la enzima el que limita la velocidad de pardeamiento.
Generalmente, el pH óptimo para la actividad de la polifenol oxidasa, así como el pH
óptimo para el pardeamiento enzimático se sitúan entre 5 y 7 y, más concretamente,
entre 6 y 6,5. A pH más bajos su actividad decrece rápidamente y puede medirse por la
absorbancia de las quinonas, por consumo de oxígeno, por oxidación indirecta de
ciertos compuestos e incluso por la absorbancia, por ejemplo, a 470 nm, de los
pigmentos finales polimerizados.
Asimismo, la acción de la polifenol oxidasa puede conducir, debido a la formación de
quinonas, a la oxidación no enzimática de compuestos cuyo potencial redox es inferior
al de las quinonas (oxidaciones acopladas):
0):). ~ • RH ~ z o
HOÚ~ - lh
HO • R
Así pueden oxidarse (con absorción de oxígeno) el ácido ascórbico, la nicotinamida
adenina di-nucleótido reducida (NADH2), el glutation reducido, la cisteína, los
antocianidoles y reducir las quinonas a difenoles.
60
2.6.1 Potencial Redox
De cuanto antecede se deduce que estos diversos enzimas poseen tendencias diferentes
relativas para actuar como agentes reductores u oxidantes: cuanto mayor es la tendencia
de un agente reductor a perder su hidrógeno, tanto más potente es, es decir, mayor
presión de hidrógeno ejerce. La presión de hidrógeno puede medirse cuantitativamente
por un método que se basa en el hecho de que se sabe que ciertas sustancias imparten su
hidrógeno al oro o platino metálicos. Ejemplo de tales sustancias es una solución en la
que existen iones ferrosos y férricos. El Fe2+ tiende a liberar electrones y convertirse,
por lo tanto, en Fe3+, mientras que éste admite electrones y cambia, por consiguiente, a
La hidroquinona, que se oxida fácilmente a quinona, constituye otro sistema de
oxidación-reducción:
OH' o · oa·
--··-E. Baldwin, Dynamic Aspects ofBiochemístry, 3a ed. Cambridge Univ. Press, 1957.
El potencial de tales sistemas puede medirse si un electrodo de platino se sumerge en tal
sistema y la presión de hidrógeno se compara con un sistema patrón de oxidación-
reducción de potencial conocido. Uno de estos últimos sistemas puede prepararse
haciendo burbujear hidrógeno, a la presión de una atmósfera, en agua destilada; parte de
sus átomos se absorben en electrodo y se disocian en cantidades iguales de iones y \
61
electrones. En vez de este sistema de hidrógeno puede utilizarse un electrodo de vidrio.
EJ sistema patrón y eJ que contiene eJ de oxidación-reducción problema se unen por un
puente salino, generalmente un tubo que contiene CIK en agar-agar, que permite la
migración de los iones, pero evita la interacción entre los sistemas adyacentes. La
diferencia en las presiones de hidrógeno o de electrones entre la cubeta patrón y la del
sistema dado se mide con un potenciómetro, según se indica esquemáticamente en la
figura 28.
Potenclómetco
+-
Puc.--le de eger-Ctl< '
figura 28: Dispositivo esquemático para medir potenciales redox.
El potencial de óxido-reducción (0-R); a menudo llamado potencial redox, es, por lo
tanto, la diferencia de potencial (diferencia en la tensión de hidrógeno) entre el
electrodo de Pt y el electrodo de hidrógeno (o de vidrio). La unidad actualmente
aceptada (Dixson) se denomina rH, que es el logaritmo con signo negativo de la presión
de hidrógeno (PH):
rH =- IogwPH
La escala de rH va de O (rH = 0), cuando la presión de hidrógeno es una atmósfera, a
un valor de rH = 41, a una presión de oxígeno de 1 atmósfera.
62
Siempre que sea posible, las mediciones deben realizarse a un pH de 7; sin embargo, si
ello no es posible se verificarán a un pH dado, pero constante, y se haran las
correspondientes correcciones en el rH (adicionando 0,06 V al valor rH encontrado por
cada unidad de pH menor de 7, o sustrayendo 0,06 V por a unidad de pH mayor que 7).
Una mezcla de hidroquinona y quinona, por ejemplo, a proporciones iguales un pH de
7, tiene una tensión de hidrógeno de 1,10-23 y, por lo tanto rH = 23.
La tabla 4 da algunos ejemplos de valores aproximados de H.
TABT.A X
· .el d~ frutas . - ... · • · · · • · · • · · · · · · · :; · · · • ·: · · · • • · · • • · · · · • · · · wusione; de levadura (en ferm<:ntacton activn) ....•...•. • •.•
t•tbaoloo. ....•. • · · · · · · · • • • • ·: • · · • • · • ·- ... • • · • ·-· • · • • • • · · · · • • · .-..:utadén anneróbica (E. eolt) · • · · · • • • · · • · • • • '·: • • • • • • .. · · • •
, · " TPX ,f~sbidrogtr.asas • - · · ·- · · • • • · ·: · · • ·· · • · · · · · · ·. · · • • • · · .,.ÓW!eü1as {F:J.iX y fAD) . · • · · • · · · • · · · • · · · • • ·- •.•.••.••.•• -~ml!l' ·,························ ....................... .
2.6.2 Ciclo climatérico
rH
Z"l-t3 9
5-12 o 8 t-t :!:J
El estudio que antecede se ha referido sólo a las oxidaciones biológicas en la materia
viviente. Cuando las células vivas son disgregadas o cuando se han ido de su vegetal
madre, como ocurre cuando las frutas se recolectan, el problema es totalmente distinto.
En estas condiciones, la fruta continúa respirando (absorbe 0 2 y elimina C0:2.), en
algunos casos a una velocidad muy acelerada, pasando por los denominados ciclos
climatéricos, según se indica en la figura 29.
63
,, Má:dmO cfima('!!ri<:O
Figura N> 29: Ciclo de respiración climatérica de las frutas después de recolectadas.
Como se deduce de la misma, el aguacate (fruta tropical) cuando menos oxígeno
absorbe es durante los 2-3-días después de su recolección; sin embargo, muy pronto la
absorción de oxígeno aumenta considerablemente, alcanzando un máximo climatérico
después de, aproximadamente, 1 O días. En este momento la fruta alcanza su total
madurez y después se deteriora muy de prisa, salvo que se almacene en condiciones
especiales a temperatura baja y en una atmósfera de composición controlada. La
mayoría de las frutas, como peras, manzanas, plátanos y todas las frutas caedizas
alterables se comportan de forma similar al avogado o aguacate. Las frutas cítricas
constituyen una excepción a este comportamiento. Los factores que distinguen a las
frutas cítricas de las demás, respecto de la oxidación, los veremos inmediatamente.
La figua 30 muestra Ja disposición de un equipo sendJJo necesario para medir e] cicJo
climatérico de las frutas. El aire que penetra en el mismo, debidamente medido con un
manómetro, desecado y libre de dióxido de carbono, se pone en contacto con las frutas.
La cantidad de C02 absorbido por e] NaOH, en el frasco de medida, se determina
después.
64
Figura N° 30: Aparato para medir el ciclo climatérico.
2.6.3 Tejido vegetal disgregado
El estudio anterior se refería :a los fenómenos de oxidación en las células vivientes
íntegras. Allí las diferentes reacciones bioquímicas son reversibles y están reguladas por
las necesidades de la materia viva. Sin embargo, cuando los tejidos se disgregan o
cuando sufren algún cambio fisiológico, como en el estado posmadurativo o después de
congelados, las diferentes reacciones bioquímicas proceden bruscamente en una
dirección particular y a una velocidad acelerada. Por ejemplo, las sustancias tánicas de
una pera disminuirán normalmente en la fruta mientras se encuentran en el árbol, unas
semanas antes de la maduración. Sin embargo, si la misma fruta se tritura y convierte en
pulpa, el contenido en tanino disminuirá con gran rapidez y es muy posible que
desaparezca en pocas horas. De este fenómeno se aprovecha la industria para eliminar la
manifiesta astringencia de los jugos de frutas debida a los taninos.
Otro ejemplo muy significativo es la disminución del ácido málico en las manzanas
trituradas, que se debe a la liberación del enzima ácido málico-deshidrogenasa (esta
reacción constituye la última fase del ciclo respiratorio de Krebs).
En Ja tabla siguiente se expone Ja desaparición de] ácido máJico en el jugo de manzanas:
65
Tabla N° 5
Tiempo Acido Málico (g/1) Inmediatamente después del prensado 8,8 Jugo obtenido por presión 24h. después de desintegrada la fruta 5,1 Prensado después de 48 h. 3,7
Uno de los fenómenos mejor conocidos en la vida ordinaria es el rápido
empardeamiento de las frutas tales como manzanas, plátanos, aguacates o patatas,
cuando se mondan o cortan y se exponen al aire. Ello se debe a una oxidación
enzimatica que estudiaremos con detalle. Pero incluso antes de que esto ocurra, los
tejidos vegetales se combinan rápidamente con el oxígeno disuelto, según indica en el
siguiente experimento (figura. 31 ).
l ~¡- -<_1"~:~~· 6
5
3 4 5 la~mpo {h)
Figura N° 31: Absorción de oxígeno por diferentes jugos.
6
En este experimento, varios jugos de fruta se agitaron con oxígeno en un tiempo t = O
durante un minuto. El oxígeno restante en los jugos se midió polarográficamente a
varios intervalos de tiempo.
La curva de Ja figura 31 demuestra claramente que:
66
a) Todos los jugos experimentaron reacciones oxidativas después de su extracción.
b) Mientras en Jos jugos cítricos Ja desaparición de] oxigeno es Jenta, en e] jugo de
manzana, la mayor parte del oxígeno desaparece en la primera media hora.
e) Las frutas cítricas, que no se empardan al aire, se comportan en esto caso de una
forma muy similar a como lo hacen durante el ciclo climatérico antes citado; en ambos
casos, su velocidad de combinación con el oxígeno molecular es más lenta, mientras
que la velocidad de respiración y de oxidación en las manzanas y, en todas las frutas
sujetas a empardeamiento enzimático, son mucho más rápidas.
2.6.4 Función fisiológica de Jas poJifenoJ oxidaxas y de Jas reacciones de
pardeamiento enzimático
Aparentemente, ciertas frutas (agrios, piña) no contienen polifenol oxidasa y
relativamente pocos sustratos fenólicos. Otras contienen las enzimas, pero no los
sustratos (melocotón, variedad "Sunbeam"). Aún en las frutas y legumbres susceptibles
de pardeamiento, esta reacción prácticamente no aparece mientras los tejidos estén
sanos e intactos. Parece que las enzimas y los sustratos están localizados en
compartimentos tisulares o celulares distintos, separados por varias membranas. La
localización de estos constituyentes no es todavía bien conocida. En la manzana se puso
en evidencia una ·enzima soluble y otra ligada a cloroplastos; en el plátano parece que el
sustrato de pardeamiento de la piel está repartido de forma difusa en las sucesivas capas
del tejido.
Se considera que las polifenol oxidasas tienen como función originar la oxidación de
diversos sustratos:
67
l/20·x H2 0
difenol
quittona ac. ascórbico o NADPH
Esta acción puede ocurrir como final de la cadena metabólica respiratoria, de modo
análogo al de la citocromo oxidasa (que también contiene cobre). Resultaría así:
metabolito NADP A:r
gl. "d y uuenol Y. 1/20~. UCI i~~Hv . . .,
deshldrogcnasa ¿qumona potifenol oxidasa Á reductasa?
metabolito / '-..._ NADPIJ Á . Á ,/ \... qumona / "H.Q glucídico •
Por ejemplo, parece que en la patata, alrededor de un tercio de los fenómenos de oxi-
dación respiratoria se deben a la actividad de la polifenol oxidasa.
Además, las reacciones de pardeamiento enzimático representarían un papel de
protección contra microorganismos; en efecto, se considera que los polímeros
coloreados, que se forman rápidamente cuando un tejido vegetal se lesiona, lacera o
infecta, pueden constituir una defensa contra la penetración de microorganismos o
incluso, retardar su proliferación.
2.6.5 Empardeamiento enzimático
El conocimiento de la naturaleza enzimática de este tipo de empardeamiento en ciertas
frutas se debe posiblemente a Lindet, que lo observó en 1895. Sin embargo, fue Onslow
quién demostró, en 1920, que el oscurecimiento enzimático de Jos tejidos vegetales en
el aire se debía a la presencia de derivados del o-dihidroxifeno/, tales como el catecol,
68
ácido protocatecuico, ácido cafeico y a los esteres del ácido hidroxigálico con el ácido
cafeico, tales como, el ácido clorogénico, que está ampliamente distribuido en muchas
frutas y, sobre todo, en las patatas y boniatos.
Todas estas sustancias fenólicas y otras de estructura similar, .incluidos los taninos,
abundan en la naturaleza y posiblemente se forman por la degradación de las
antocianinas y flavonoides.
Onslow investigó sistemáticamente muchas frutas y hortalizas, a las que dividió en dos
grupos: las que contenían catecol y derivados, junto con enzimas que actuaban sobre los
mismos, a los que denominó oxigenasas, y las que carecían de estos enzimas y
derivados del catecol, que llamó vegetal-peroxidasa. Pertenecen al primer grupo las
siguientes frutas: manzanas, melocotones, albaricoques, plátanos, cerezas, peras, uvas,
fresas, higos, y de las hortalizas, las patatas y la remolacha roja.
El grupo de frutas peroxidasa comprende varias frutas cítricas; piña americana, melón,
fresas rojas y blancas y la mayoría de las frutas de este tipo.
Las investigaciones más recientes han demostrado que los enzimas peroxidasa y
catalasa se presentan siempre en ambos grupos, mientras que las oxigenasas no existen
en el segundo grupo. Esta división en dos grupos distintos no es del todo correcta,
porque si bien en el segundo grupo no existen ni enzimas, ni compuestos fenólicos, hay
casos en los que tan sólo falta uno de estos componentes; tal ocurre con la variedad de
melocotones «Sumbeam>, que se ha demostrado que es deficiente en sustancias
fenólicas, aun cuando posee los enzimas correspondientes.
A los enzimas productores del empardcamiento enzimático se Jes han dado diferentes.
69
nombres: el de oxigenasa ya no se utiliza y en su lugar se aplican los de fenolasa,
polifenolasa y polifenoloxidasa. Este grupo de enzimas se caracteriza por poseer Cu
como grupo prostético y comprende varias fenolasas.
a) Tirosinasa. Es una monofeloxidasa que cataliza la conversión del aminoácido
tirosina en o-quinona-fenilalanina. La tirosina se hidroxila primero para formar 3,4-
dihidroxifenilalanina (DOPA), que después se oxida:
CH1-CH·t.UUH
0 1 NH;
OH
Ct11 • CH:. COU!1
ao() *II. OH
(;HfCH·~OOH
oP ~11, DOPA o-quinona-tenilalanina
b) Catecolasa. Se trata de una polifenoloxidasa que cataliza la oxidación del
catecol y de otros compuestos fenólicos análogos:
o
()=o e) Laccasa. Es también una polifenoloxídasa que cataliza la oxidación de laccol,
una sustancia fenólica encontrada en el látex japonés, que al oxidarse se vuelve negra:
OH
OOH <;-zHu
lat:col
La Jaccasa actúa también sobre los porafenoles, pero no en los fenoles mono-
hidroxilados. Conviene recordar que, dado que las fenolasas no se han ni aislado ni
cristalizado, no puede asegurarse que algunas de ellas no sean mezclas de varias
fenolasas. Se sabe que el origen de las fenolasas depende o menudo de su mecanismo de
70
acción.
3 Asc.orbinaso. Es un enzima que contiene Cu y canaliza la oxidación del ácido
ascórbico (vitamina C) a ácido deshidroascórbico.
El segundo grupo de enzimas oxidantes, encontrados prácticamente en todos los
tejidos vegetales, peroxidasa, cata/asa y citocromo, se ha visto recientemente
que no intervienen en el empardeamiento enzimático. La peroxidasa oxida las
sustancias fenólicas únicamente en presencia de H20 2• Todos estos enzimas
contienen el mismo grupo prostético, ferroporfirina, con un apoenzima distinto.
El de la peroxidasa contiene los aminoácidos histidina, lisina, arginina y un
polisacárido.
Protcina
CH.1'l j(CH·Of3 -----CH-----.r.:·
N_ N
-~ .... - ........... Fe~
N~ ' ...... , .......... N
"'1:====· CH'· . . ,v,..
71
1
2.6.6 Mecanismo del empardeamiento enzimatico.
Es probable que ]a propiedad más sobresaliente de Jos grupos de enzimas oxidativos sea
el hecho de que lentifican y por último frenan por completo la actividad enzimática,
como si hubieran sido «envenenados» de alguna manera. Tal inhibición de los enzimas
por los productos resultantes de la reacción no constituye un hecho extraño en la
bioquímica. Lu VALLE y Goddard suponen un mecanismo que se basa en la creación
de un radical libre que forma un enzima peróxido inactivo; en el esquema siguiente, SH2
indica el sustrato, S el sustrato y el enzima:
(i) _SH, +E ~ E·SH1
(i} E·SH1 +Os ~ SR~·E·Oa
(J) SH.-E·Ot ~ S+ H"~ + HO,-·E tel triple rom¡me.Ho se de5rompnne en un -suhstr:~t.. m:idarln. un proa)r. j un radkal libt<'i
(el raílirnl libre :orma un nu!"\-n (.'Otnpue.'>:o ~·n ?1 '-'•m.lmln}
(,in emh:~tr,<>. el radirnl lí!m: puede i<>rtru:r uunhién peró:oridn ,¡na<::Ívol
Para aclarar el mecanismo del empardeamiento enzimático se han emitido diversas
teorías que explican los diferentes estadios de la oxidación, así como la formación de
melanoidinas, los complejos productos finales de color castaño. Ninguna de ellas
explica del todo los diferentes resultados obtenidos por un gran número de
investigadores, con la excepción de que un mecanismo tan complicado debe implicar
inicialmente la oxidación enzimática de los derivados del o-benceno y una oxidación
ulterior, no enzimática, seguida de ciertas transformaciones no oxidativas y de una
polimerización fmal; el oxígeno total absorbido durante el proceso de empardeamiento
oscila de 2,34 a 3,35 átomos de oxígeno por mol de catecol:
72
a) Hidroxilación inicial, como en el caso de la tirosina a DOPA:
·-- OH
OOH 1 '-~·
e) Oxidación a o-quinona, que en esta fuse sólo requiere un átomo de oxígeno:
CH ~·OH l'' 1 1~9)
e) Hidroxílación secundaria:
d) Posibles intercambios o redisposiciones intramoleculares:
OH .o OH o Q
-:'""JOH + ~ {)OH (Jo Óoa ~,; ,,, J - + or
OH ~ ,_ :'-..&
OH ' o
4 Formación final de color debida posiblemente a la polimerización en una de las
diferentes formas propuestas .
... ,.0 COOH :-,. H·o~~~
1 . 1 •
HO~;)J~ or or: 1
Al investigar la presencia de fenil-alquilaminas en algunos arbustos, Correale y Cotese
encontraron que el mecanismo de oxidación de la tirosina era completamente distinto
del que antes se creía. De acuerdo con estos investigadores, antes de que ocurra la
73
oxidación de la tiramina se descarboxila la tirosina.
AJ mismo resultado JJegó Griffiths con Jos plátanos. Por otra parte, BuckJey y Towers,
utilizando productos marcados con C14, identificaron como producto final de la
oxidación de la tirosina, una sustancia dihidroindólica. Estos hallazgos recientes,
pueden resumirse como sigue:
tirosina
-co.
o ·(ro
, .. ,.,. UN CH1
-...../" CHs
dt!hidrnindot
tiramimr
Figura N° 32: Descarboxilación de la tirosina
3-hidroxilir~mina (OOPA-amina)
74
Conclusiones
El pardeamiento enzimático se observa en los vegetales ricos en compuestos fonóiicos y
también durante la fonnación de melaninas; en los insectos (oscurecimiento de lo
cutícula) así como en los mamíferos (melanomas responsables de la pigmentación de la
piel).
El pardeamiento enzimático no ocurre en los alimentos de origen animal.
Por el contrario, plantea importantes problemas de coloraciones con algunas frutas y
legumbres, en particular cuando se alteran los tejidos de estos vegetales o se dañan por
golpes durante los procesos: pelado, corte, triturado para la preparación de jugos,
congelación, deshidratación.
Recordemos los casos de las manzanas, peras, albaricoque, melocotón, plátanos,
aguacate, así como las patatas y champiñones.
Sin embargo, la fonnación de este color oscuro no es siempre un inconveniente; así se
busca un ligero pardeamiento en la maduración de los dátiles, en la preparación de la
sidra, fermentación del té, secado de los granos fennerttados del cacao, así como durante
el secado del tabaco.
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Recomendaciones
Continuar con la investigación o aplicación de procedimientos nuevos para
impedir el Pardeamiento Enzimático, en los casos no deseados.
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