La Fotosíntesis Comencemos por definir a la fotosíntesis como "síntesis

(formación) con la ayuda de la luz". En realidad cuando

hablamos de fotosíntesis nos estamos refiriendo al proceso

que llevan a cabo las plantas y otros microorganismos y que

consiste, en términos generales, en la formación de materia

orgánica mediante la luz. Como la materia orgánica contiene

fundamentalmente carbono, hidrógeno y oxígeno, la

fotosíntesis se refiere mayoritariamente a la incorporación

de estos elementos, que proceden del CO2 y el agua, en

materia orgánica. No debemos olvidar que la fotosíntesis

también se refiere a la reducción de compuestos inorgánicos

diferentes del CO2 como son el nitrato y el sulfato y su

incorporación, en aminoácidos.

Interacción de la luz con los organismos vivos.

Los organismos fotosintéticos sólo aprovechan una parte muy

pequeña de la energía que llega a la superficie terrestre,

del orden del 0,1 %, es decir, un fotón de cada 1000 que

caen sobre la superficie de la Tierra.

A pesar de que sólo una parte muy pequeña de la energía es

la que se absorbe por la planta, es tal el volumen de

materia orgánica que se produce en toda la Tierra mediante

la fotosíntesis que, si fuera caña de azúcar lo que se

formara, se produciría al año una pila de más de unos 3 km

de altura y de 10 km de lado. Aproximadamente la mitad de

la biomasa vegetal que se produce por fotosíntesis lo hace

en el ecosistema terrestre, mientras que la otra mitad lo

hacen los océanos.

En términos energéticos, la producción anual de biomasa es

sólo un orden de magnitud menor a las reservas de biomasa

en forma de bosques, y combustibles fósiles demostradas,

tales como el carbón, gas natural y petróleo, aunque

posiblemente exista otro orden de magnitud mayor de

reservas probables.

Desde otro punto de vista podemos decir que la energía

fijada por el reino vegetal es equivalente a unas diez

veces el consumo industrial, a nivel mundial y unas 200

veces superior a los requerimientos energéticos de la

humanidad en forma de alimentos. Debe tenerse en cuenta, no

obstante, que aunque el consumo individual de energía en

forma de alimentos por un hombre es del orden de 100 W, el

consumo de una bombilla eléctrica, el hombre del mundo

occidental necesita mucha más energía para satisfacer su

alto nivel de vida y confort, que es del orden de 10 kW.

Podemos, por tanto, considerar que la vida en nuestro

planeta se mantiene porque nos llega una energía de origen

nuclear. De manera que, a pesar de la mala fama que la

energía nuclear tiene en nuestra sociedad, nosotros

dependemos y debemos nuestra existencia a ella. Bien es

verdad que tenemos la salvaguarda de que tenemos a la

central nuclear a una buena distancia de nosotros, unos 150

millones de Km de distancia y, además, en un territorio

donde nadie ha protestado.

Historia del conocimiento de la fotosíntesis

Uno de los primeros pensamientos recogidos acerca de la

función de hojas en las plantas se debe a Aristóteles que

dijo que éstas tienen como misión dar sombra y proteger a

las partes tiernas y débiles de la planta, como son los

brotes. Esa era una observación sagaz pero errónea aunque

compresible por nosotros si pensamos fue elaborada en un

caluroso día de verano en Grecia. No podía imaginar

Aristóteles que las hojas eran una activa factoría en la

que se produce un activo intercambio de gases y fabricación

de material para la planta.

Si nos referimos a la historia de la fotosíntesis podemos

decir que empieza poco después de que se descubriera la

composición del aire. En 1648, es decir, cuando en España

andábamos luchando con los turcos, aproximadamente cuando

vivía el tatarabuelo de nuestro tatarabuelo. En esa época

el holandés van Helmont cultivó una planta en un recipiente

y comprobó que la tierra perdía mucho menos peso que lo que

se incorporaba en la planta que, en caso de ser un árbol,

era muy grande. Pensó que el aumento de peso se debía al

agua que había que añadirle a la tierra durante todo el

crecimiento de la planta y dedujo, por lo tanto, que la

masa de la planta procedía solamente del agua.

Fue casi un siglo más tarde cuando el clérigo inglés

Stephan Hales reconoció que una parte del aire contribuía a

alimentar a la planta diciendo que el Creador había puesto

al aire para que respiraran los animales así como también

las plantas. Se rompía así con la tesis de Aristóteles que

proponía que las plantas se alimentaban exclusivamente del

humus que contiene la tierra. En realidad los tres tenían

razón porque la planta asimila agua, humus y una parte del

aire. Hales también intuyó que la luz tenía un papel

importante en el proceso, aunque no llegó a probarlo.

Fue el pastor inglés inconformista y simpatizante con la

Revolución francesa Priestley, al que por este motivo, le

saquearon su casa emigrando a Pensilvania, quien demostrará

que en el aire había un elemento, que llamaría aire

deflogisticado y posteriormente Lavoisier oxígeno.

Priestley pudo demostrar que una planta restauraba el aire

empobrecido por arder una vela en él. De esta manera se

pudo explicar racionalmente por qué el aire de nuestro

planeta se mantiene puro a pesar de que los hombres y

animales lo consuman constantemente mediante la combustión

y no se haga irrespirable. De acuerdo con sus observaciones

ya dijo que ello hace que cualquier planta, por minúscula y

olvidada que se encuentre en un rincón de nuestro planeta

contribuye a limpiar y purificar nuestra atmósfera.

Un médico de la corte de la emperatriz de Austria María

Teresa, el holandés Jan Higenhousz, impresionado por los

descubrimientos de Priestley, al que había oído en una

conferencia que se dio en Londres, alquiló en la primera

ocasión que tuvo, que fue unos seis años después, una

casita en Londres para hacer experimentos sobre el efecto

de la luz en la acción limpiadora del aire que llevan a

cabo las plantas. En un libro publicado en 1796 y titulado

“Experimentos con vegetales, descubrimiento del poder

purificador del aire en la luz y de su envenenamiento en la

oscuridad”. Se decía que las plantas, a través de las hojas

y tallos verdes, purifican el aire tanto más cuanto más

expuestas están a la luz y que en la oscuridad se

desprenden gases muy nocivos.

Por ese mismo tiempo el pastor suizo Jean Senebier publicó

en Ginebra un tratado sobre la influencia de la luz solar

para modificar los seres de tres reinos, sobre todo del

vegetal. Hizo esencialmente la misma observación que

Hignehousz, pero añadió que la actividad de restauración

del aire por las plantas dependía de la presencia de "aire

fijado" que es como se denominaba entonces al dióxido de

carbono.

Quedaba por descubrir el otro reactivo implicado en la

fotosíntesis, que había sido descrito cualitativamente por

van Helmont, pero no medido: el agua. Nicolas de Saussure,

también de Ginebra, midió cuidadosamente el peso de la

planta y descubrió que el peso de ésta, junto con el del

oxígeno desprendido, pesaban mucho más que el "aire fijado"

por la planta y que la diferencia era el agua que se añadía

a la tierra. Propuso la siguiente ecuación:

luz

aire fijado + agua -- aire vital + materia orgánica

planta verde

En esta ecuación el aire fijado y la materia orgánica se

deben a Senebier

la inclusión del agua a Saussure

La implicación de luz y la planta verde, que se refiere, en

realidad, a los cloroplastos, a Ingenhousz

y el aire vital, el oxígeno, a Priestley.

Queda un nombre que añadir al nacimiento de la fotosíntesis

y es el del médico alemán Julius Robert Mayer que propuso

que la energía luminosa se transforma en energía química.

Las plantas no sólo son creadoras de materia orgánica sino

que son también los almacenadores de la energía que pasa a

ser energía química. Se podría entonces escribir la

ecuación

CO2 + H2O + luz -- O2 + materia orgánica + energía química

Él llamó a la energía "poder" y a la energía química

"diferencia química", pero ahora se puede considerar como

correcto el planteamiento de la fotosíntesis.

Estos son los padres de la fotosíntesis porque ellos

plantearon todos los elementos que intervienen en dicho

proceso. Son un ejemplo de interacción entre los pueblos,

puesto que hay un holandés, un francés, un inglés, un suizo

y un alemán. No se puede decir, sin embargo, que hubiera

armonía entre ellos, ya que el carácter y la situación

social de alguno de ellos, como Hingenhousz, un médico

imperial, era muy diferente de la de un discreto pastor

protestante provinciano y paleto, como Senebier. Ha pasado

mucho tiempo y la situación, aunque sigue igual, algo ha

mejorado.

Una vez que se demostró que el dióxido de carbono asimilado

por las plantas se transformaba en almidón y que ello

ocurría en los cuerpos cloróficos o cloroplastos, ya estaba

formulada la fotosíntesis en sus términos actuales, de

acuerdo con la ecuación:

CO2 + H2O ----- (CH2O)n + O2

No obstante, se creyó erróneamente que el oxígeno que se

desprendía procedía del CO2 y no del agua, como ocurre

realmente. De hecho Otto Warburg, uno de los mayores

científicos en el estudio de la bioenergética de todos los

tiempos defendió esta tesis hasta su muerte, que fue en

1970. Debido a su gran prestigio científico y a su notable

arrogancia sus opiniones equivocadas, como consecuencia, en

gran medida a la ignorancia que profesó respecto del

trabajo de otros, hizo que se retrasara considerablemente

el avance de este campo científico.

Warburg había introducido el alga unicelular Chlorella en

los estudios de Fisiología Vegetal debido a que es muy

fácil de cultivar y a que se pueden producir grandes

cantidades de material fotosintético en relativamente poco

tiempo. A Warburg se deben, además, las técnicas

manométricas para la medida de procesos fisiológicos. El

aparato de Warburg ha estado presente en todos los

laboratorios de bioquímica hasta hace unos 10 o 15 años. En

ellos se medían los cambios de volumen de los gases que se

generaban en reacciones de respiración o de fotosíntesis ya

que en dichos aparatos se podían iluminar las vasijas. Hoy

día las medidas de oxígeno se hacen polarográficamente

mediante un sencillo aparato que se llama el electrodo de

oxígeno y que no necesita la limpieza de las vasijas y su

cuidadoso calibrado, que exigía mucho tiempo de

manipulación.

Warburg midió el rendimiento cuántico de la fotosíntesis en

Chlorella y dijo que la reducción de 1 mol de CO2 requería

4 quanta de luz. Es decir, que la rotura de 2 moléculas de

agua y la liberación de 4 electrones del H que eran

recuperados como poder reductor, requerían 4 fotones.

Teniendo en cuenta la energía de los quanta a 680 nm y la

energía química que se aprovechaba en el CO2 reducido

resultaba un rendimiento del 70 %. Eso significaría que la

fotosíntesis era un proceso que tiene lugar con un

rendimiento mucho mayor que las mayoría de las máquinas

conocidas así como de otros procesos biológicos. Eso

levantó mucha polémica y muchos se lanzaron a comprobar sus

datos, pero él los ignoró. Proponía que en un mundo

perfecto la fotosíntesis debe ser perfecta y que podría

llegar a un rendimiento cuántico de 3, es decir, cercano al

100 %. Ignoró a su vez a los demás científicos que, usando

las técnicas manométricas que él había desarrollado,

obtenían rendimientos menores. Hoy día se acepta que el

rendimiento cuántico de la fotosíntesis es de 8 fotones por

mol de CO2 fijado estando el rendimiento próximo al 30 %.

Ello se debe, como se verá más adelante, a que por cada

electrón, o átomo de hidrógeno que se promueve son

necesarios dos fotones de luz.

También se debe a Warburg el empleo de ciertos colorantes,

como las quinonas, que eran utilizados como aceptores de

electrones en reacciones de óxido-reducción y que han

facilitado la medida de tales reacciones debido al cambio

de color que sufre dichos compuestos al cambiar de estado

redox.

Reacciones básicas de la Fotosíntesis.

La fotosíntesis puede formularse, en sus términos actuales

como la reacción mediante la cual el dióxido de carbono es

asimilado por las plantas transformándolo en almidón y

desprendiendo oxígeno molecular. Dicha reacción tiene lugar

en las plantas en los orgánulos cuerpos cloróficos o

cloroplastos, de acuerdo con la ecuación:

CO2 + H2O ----- (CH2O)n + O2

Dicha reacción implica que se asimila el anhídrido

carbónico, que procede del aire, además de agua y, todo

ello en presencia de la luz, que es un elemento

indispensable para la fotosíntesis.

Otros organismos llevan a cabo el proceso de la

fotosíntesis, aunque no esté formulada exactamente como se

ha escrito más arriba. Algunos organismos procariotas, como

son las bacterias fotosintéticas, no utilizan el agua como

donador de electrones y, por tanto, no desprenden oxígeno.

Otros procariotas, como son las cianobacterias, llevan a

cabo una fotosíntesis análoga a la de las plantas, es decir

oxigénica.

Se puede dividir la fotosíntesis en dos tipos de procesos:

los que implican el aprovechamiento de la luz y su

transformación en energía química, lo que se denomina la

fase luminosa de la fotosíntesis, y aquella mediante la

cual el anhídrido carbónico se fija mediante el consumo de

ATP y NADPH, un proceso típicamente bioquímico, y que se

denomina fase oscura, no porque requiera la oscuridad, sino

porque no se necesita la luz.

No cabe duda que la medida del proceso completo de la

fotosíntesis resulta complejo ya que son muchos los

requisitos exigidos. Por ello resulta esencial, para el

estudio de dicho proceso, disponer de un ensayo más

sencillo. Un ensayo que permita medir la fase luminosa

independientemente de la oscura.

Un paso transcendental en el desarrollo de la fotosíntesis

fue la formulación que hizo van Niel en 1929 que

consideraba que se trataba de un proceso redox en el que se

produce la reducción de CO2 y la oxidación de H2O. Esta

propuesta permite escribir la ecuación de la fotosíntesis

en los términos reales, tal como se acepta hoy día, es

decir, que consiste en la reducción del CO2, en realidad

también del nitrato y nitrito, además del sulfato, mediante

donadores de hidrógeno o de electrones:

CO2 + 2 H2O + h• ------ [CH2O] + O2 + H2O

Hay diferencias, como veremos, en lo que se refiere a la

naturaleza de los donadores de electrones, pues, si bien en

las plantas y cianobacterias se utiliza el agua, en las

bacterias fotosintéticas se utilizan otros compuestos tales

como el SH2 o un compuesto orgánico:

CO2 + 2 H2S + h• ----- [CH2O]n + 2 S + H2O

o bien:

CO2 + 2 H2A + h• ----- [CH2O]n + 2 A + H2O

Hasta este momento, y son sólo unos cincuenta años atrás,

para estudiar la fotosíntesis había que usar células

enteras. Si se intentaba fraccionarlas, se perdía su

capacidad para realizar reacciones fotoquímicas. La

elección era sencilla: o células enteras con actividad

fotosintética o fracciones muertas. Esto cambió en los años

entre 1937 y 39 cuando Robin Hill recogió una antigua

observación de que las hojas secas y hechas polvo

desprendían oxígeno al exponerlas a la luz. Este efecto

duraba poco y podía ser prolongado si se añadía a las hojas

sales de hierro tales como el oxalato férrico. En realidad

lo que estaba ocurriendo es que la sal de hierro se estaba

reduciendo en la luz y se desprendía oxígeno. En lugar del

oxalato de hierro se empezaron a usar las quinonas que

había descrito Warburg o, el mejor de todos y que desde

entonces se usa en todos los estudios de fotosíntesis como

el reactivo de Hill por excelencia, el ferricianuro, un

compuesto con un potencial redox muy oxidante, estable,

barato muy soluble y con propiedades cinéticas muy

apropiadas para reaccionar con los centros fotosintéticos.

Esta observación es semejante a la que efectuaron los

hermanos Buchner cuando rompieron las células de levaduras

y observaron que el extracto producía la fermentación de la

glucosa que se consumía en el proceso al mismo tiempo que

se desprendía CO2.

Mediante la reacción de Hill se podían separar los

distintos procesos de la fotosíntesis, al mismo tiempo que

se podía iniciar una búsqueda del material más adecuado

para llevar a cabo el estudio de dichas reacciones. Se

consiguió aislar los cloroplastos del resto de la célula y

demostrar que éstos siguen produciendo la reacción de Hill.

Se escogió la espinaca porque era fácilmente asequible y

porque presenta muchas ventajas adicionales, como es que se

rompen con facilidad así como que no liberan fenoles y

polifenoles que inactivan a los enzimas que se obtienen al

romper las células. En este caso se podían estudiar las

reacciones luminosas aisladas de las otras reacciones

enzimáticas acopladas a ellas. También se podía evaluar y

cuantificar el proceso puesto que se podían llevar a cabo

estudios cinéticos. En realidad lo que se produce es, ni

más ni menos, que la foto-oxidación del agua. Más adelante

se comprobó que también se podía sustituir el donador de

electrones, que en el caso de los cloroplatos es el agua,

por otros reactivos químicos, tales como el DCPIP y el

ascorbato. Se puede así medir flujo de electrones desde el

ascorbato hasta el ferricianuro. Por otra parte, esta

reacción permitió resolver el problema de si lo que se

rompe para dar oxígeno era el CO2 o el agua. Claramente se

comprueba que, en ausencia de CO2, hay todavía

desprendimiento de oxígeno y que, por lo tanto, procede del

agua.

Se propone un esquema para la fotosíntesis como un proceso

que tiene lugar a través de reacciones fotoquímicas que

llevan consigo procesos de óxido-reducción, junto con otros

procesos enzimáticos mediante los cuales se produce la

reducción del anhídrido carbónico y la oxidación del agua.

Es un paso adelante aunque, como veremos dentro de muy

poco, está equivocado.

Un experimento muy indicativo de lo que ocurre en la

fotosíntesis y que fue realizado y analizado con detalle

proporcionando mucha información es el espectro de acción

de la fotosíntesis. Es sabido que la fotosíntesis requiere

luz, pero, ¿de qué longitud de onda? es decir, ¿cuál es la

actividad fotosintética de una preparación iluminada con

una luz monocromática de una determinada longitud de onda?

Emerson describió que al iluminar las preparaciones con luz

del orden de 680 nm para arriba se producía una bajada en

la actividad de la fotosíntesis. Esa bajada se compensaba

al iluminar simultáneamente con luz de baja longitud de

onda y de alta longitud de onda. El efecto era superior a

la suma de las actividades a las dos longitudes de onda.

Ello llevó directamente a proponer que en la fotosíntesis

participan dos fotosistemas que se excitan a dos longitudes

de onda diferentes y que actúan en paralelo.

Por entonces se describió la espectroscopia diferencial

como una técnica muy poderosa. La razón es que en

fotosíntesis se trabaja con un material coloreado que

cambia su espectro al actuar, es decir, al iluminarlo. Por

ello, si se dispone de una técnica que permita observar los

cambios a una determinada longitud de onda mientras que se

activa al iluminarlo con otra luz diferente y más intensa,

se pueden analizar los componentes de la reacción. En

realidad se esperaba detectar cambios en las clorofilas,

cosa que no ocurrió, pero permitió descubrir los

citocromos, componentes fundamentales de los tejidos

fotosintéticos.

En la época de los años 60 Hill y Bendall propusieron el

expresivo esquema en Z de la fotosíntesis que tanto éxito

ha tenido y en el que se aceptaba la existencia de dos

fotosistemas además de que justifica la energética para la

formación de ATP como consecuencia de la liberación de

energía en reacciones de transferencia de electrones entre

los componentes de una cadena de transporte. De los dos

citocromos presentes en las células de plantas el b6 podía

ser utilizado en su forma oxidada como aceptor de

electrones de lo que ahora llamamos el fotosistema II en la

luz; mientras tanto, el citocromo f, en su forma reducida

podía ser utilizado como donador de electrones por el que

hoy se conoce como fotosistema I. El esquema en Z es, pues

la consecuencia de unir las dos reacciones correspondientes

a los dos fotosistemas.

No obstante, en estas primeras etapas del estudio de la

reacción de Hill parecía que los cloroplastos eran

incapaces de llevar a cabo la fotosíntesis real. Parecía

que sólo podían reducir compuestos relativamente oxidantes,

en concreto de potencial mayor de 0,00 V. No obstante se

comprobó después que, si la reacción se lleva a cabo con

cuidado para que se eviten reacciones en la dirección

opuesta, se pueden reducir compuestos muy reductores. En

concreto se puede reducir el NADP+ cuyo potencial es - 0,34

V. En este caso deben estar presentes algunos componentes

adicionales de la preparación de cloroplastos, tales como

una proteína de hierro que se denomina ferredoxina así como

una flavoproteína denominada ferredoxina-NADP+ reductasa y

que en un primer momento se llamó TNPN reductasa.

Curiosamente estos hechos fueron descubiertos por Vishniac

y Ochoa en 1951 en Nueva York y luego por Anthony San

Pietro en la John Hopkins y Daniel Arnon en Berkeley. Se

acepta por fin, que la fotosíntesis consiste en la

reducción del NADP+ a NADPH.

En muchas células en las que se lleva a cabo síntesis de

compuestos de carbono, como es el caso de las células

fotosintéticas, se sabía que eran necesarias tanto el NADPH

como el ATP, un compuesto bien conocido como moneda

energética. Ya hemos visto que se puede producir NADPH como

consecuencia del transporte de electrones en la

fotosíntesis, pero ¿qué ocurre con el ATP? Otros

investigadores habían indicado que los cloroplastos no

producen ATP quedando dicha función restringida a las

mitocondrias. Sin embargo los tejidos fotosintéticamente

más activos tenían pocas mitocondrias y debían producir

mucho ATP para llevar a cabo su acción sintetizadora. Para

investigarlo Daniel Arnon decide trabajar con cloroplastos

aislados por el procedimiento que todavía se usa y

comprueba que se produce incorporación de CO2 y que los

productos formados son los productos conocidos de la

fotosíntesis. Esto quiere decir que los cloroplastos llevan

también a cabo las reacciones enzimáticas que consumen ATP

y conducen a fijar el CO2. Entonces le añadieron a

preparaciones de cloroplastos los precursores del ATP, el

ADP y P y, en la luz y en presencia de CO2 tuvieron

síntesis de carbohidratos. Se probó que había síntesis de

ATP en lo que se llamó fosforilación fotosintética o

fotofosforilación. En este proceso no había síntesis de

NADPH. Más adelante se probó que también podía haber

síntesis de NADPH y de ATP en el mismo proceso, en cuyo

caso debía haber ferredoxina y el enzima que entonces se

llamó TPN reductasa, en lo que se llamó fotofosforilación

no cíclica para distinguirla de la anterior que se denominó

fotofosforilación cíclica.

Quedaba por debatir, no obstante, que el rendimiento de la

reacción en las condiciones de laboratorio era siempre una

fracción pequeña respecto de la que tiene lugar en las

células de Chlorella intactas y responder a la pregunta de

si estaba faltando algo en este sistema.

Más tarde Calvin utilizó el isótopo radiactivo del carbono,

el 14C para marcar el CO2 y poder así establecer la ruta de

incorporación de este compuesto en material orgánico,

aunque más tarde se comprobó que hay plantas, las C4, que

siguen otra ruta. No obstante, la diferencia radica sólo en

las primeras fases porque, en realidad las plantas C4 luego

se comportan como las C3, como se sabe bien.

Entramos ahora en un período, que se podría situar

alrededor del 70, que se puede denominar como el del

conocimiento a nivel molecular de la fotosíntesis. Se va

desvelando la naturaleza de los componentes de los aparatos

fotosintéticos. Se han aislado los componentes de los

cloroplastos y de las bacterias fotosintéticas y se han

manipulado las preparaciones de membranas fotosintéticas

para hacerlas cada vez más simples, con menos componentes,

de manera que den respuestas más concretas a preguntas de

cómo funcionan. Se podría considerar que es la época de la

espectroscopia rápida. Se quieren conocer los mecanismos de

las reacciones luminosas. Es decir, los sucesos que ocurren

una vez que el pigmento que lleva a cabo el proceso

fotoquímico es excitado por la luz. Eso significa conocer

la naturaleza de lo que se llamó el aceptor primario de

electrones. Es decir, cuando se excita la clorofila para

dar su electrón a quién se lo da de los muchos componentes

que hay en las membranas con las que se trabaja. De aquí la

importancia de la composición de la muestra. Se emplean

detergentes que actúan selectivamente sobre las membranas

eliminando unos componentes u otros y afectando a la

función de la membrana. Pero se quiere saber cuál es el

aceptor primario de electrones de cada uno de los

fotosistemas que hay en los cloroplastos y las

cianobacterias. Para ello se desarrollan métodos que

exciten a la clorofila de manera muy rápida e intensa,

aparatos de láser, así como sistemas que permitan medir la

transferencia de electrones que ha tenido lugar. Para ello

se utilizan técnicas espectrofotométricas, que miden

cambios de color de pigmentos o proteínas coloreadas que

hay en las membranas, o bien de EPR, que permiten medir

aparición de especies paramagnéticas mediante una reacción

redox que afecta a un componente de la membrana

fotosintética. En otros apartados veremos la aplicación de

ambas técnicas al estudio de la fotosíntesis. En cualquier

caso, ello llevó consigo el descubrimiento de los

diferentes componentes que intervienen en la fotosíntesis,

tales como los pigmentos P680 y P700, el P430 así como de

los citocromos y centros sulfoférricos que participan en

estas reacciones. Se planteaba, no obstante, un problema

que hizo que se llegara a ralentizar el desarrollo en este

campo debido a que siempre quedaba la duda de si el cambio

que se observaba después de la iluminación de la muestra

correspondía a la reducción del aceptor primario o de otro

compuesto de la cadena que se encontraba después, es decir,

que el instrumento no era suficientemente rápido para

captar el primero de los componentes de la cadena. Ello

llevó a desarrollar técnicas más y más rápidas. Del

milisegundo se pasó al microsegundo, de ahí al picosegundo

y ahora estoamos en el fentosegundo y ello a base de

resolver problemas cada vez más complejos. Todos eso cambió

de aspecto cuando en 1983 Deisenhoffer, Huber y Michel

cristalizaron la molécula del centro fotosintético de

Rhodopseudomonas viridis una bacteria púrpura cuyo centro

es semejante al PS II de plantas y determinaron su

estructura. EN los años siguientes se ha ido determinado la

estructura de los centros de reacción PS I y PS II a

niveles de resolución suficiente para poder identificar a

todos y cada uno de los pigmentos que intervienen en el

proceso de fotosíntesis.

La información obtenida a partir de las estructuras de los

complejos ha servido para confirmar los datos obtenidos a

partir de las técnicas espectroscópicas y que se refieren a

la organización de los centros fotosintéticos así como de

los pigmentos que intervienen. Es de desatacar que

prácticamente todas la información conocida anteriormente

se ha visto confirmada por los datos de estructura.

No es el final del camino. No se sabe cómo se lleva a cabo

la fotosíntesis, sino que ahora se pueden interpretar los

resultados sobre una base real, de acuerdo a la naturaleza

de los compuestos presentes en las estructuras de los

centros fotosintéticos. BIBLIOGRAFIA Dinamics of the history of photsynthesis research. H. Hzisige and B. Ke Photos. Res. 38, 185-209 (1993) Fotosíntesis: sol, agua, tierra y aire M.A. de la Rosa, M.G. Guerreo y M. Losada Mundo Científico nº vol 13 138 744 (1993) Fotobioquímica M. A. de la Rosa, M. Hervás, A. Serrano y M. Losada Editorial Síntesis, Madrid 1990 Discurso de investidura como Doctor Honoris Causa por la Universidad de Sevilla

D.I. Arnon 1992 Photosynthesis E. Rabinobitz and Govindjee John Wiley, New York, 1969 The vital force F.M. Harold W.H. Freeman, New York, 1986

Composición y organización de las membranas

fotosintéticas

Entre los organismos que llevan a cabo fotosíntesis están

las bacterias fotosintéticas, los organismos fotosintéticos

más primitivos que tienen un aparato fotosintético más

simple y que, como característica interesante, utilizan

otros materiales diferentes al agua como donadores de

electrones.

La fotosíntesis se realiza mediante proteínas y otros

componentes que se encuentran en las membranas. Dichas

membranas se denominan tilacoides y se extienden hacia el

interior de las células procariotas donde se hace la

fotosíntesis. Las células fotosintéticas eucariotas han

adquirido un orgánulo especializado para esta función: el

cloroplasto que, en realidad, es una cianobacteria

englobada dentro de la propia célula habiéndose logrado una

simbiosis muy provechosa para ambos entes vivos. De ese

origen habla el hecho de que los cloroplastos mantienen

todavía una dotación génica en forma de DNA que han

mantenido, reducido en parte, a través de todos los

millones de años que ha durado dicha simbiosis. Parte de la

dotación génica del cloroplasto se ha ido perdiendo a lo

largo de los años, por lo que muchas de las proteínas de

los cloroplastos deben incorporarse desde la propia célula

porque han sido sintetizadas con la información génica del

núcleo. Los cloroplastos, que son orgánulos de gran tamaño

(unas 5 µm de diámetro), poseen una membrana externa

fácilmente permeable a los diferentes solutos que

intervienen en la fotosíntesis, un espacio intermembrana y

una membrana interna mucho más selectiva que la externa que

se extiende hacia el interior del cloroplasto formando una

compleja red de membrana que se denominan tilacoides. La

función principal de las membranas de la envoltura del

cloroplasto es controlar el flujo de metabolitos, lípidos y

proteínas dentro y fuera del CP. Además, en ellas están

localizados los sistemas responsables de la síntesis,

procesamiento y ensamblaje de los lípidos, pigmentos y

proteínas de la membrana. La membrana interna sirve de

barrera al paso de moléculas grandes tales como las

proteínas del citoplasma al espacio entre membranas.

Los tilacoides pueden formar unos saquitos, unos espacios

cerrados que se apilan dando lugar a lo que se denominan

los grana. El espacio del interior de los tilacoides es el

lumen. Los tilacoides que no están formando esas

estructuras sino que están uniendo unos grana con otros son

lo que se denomina lamelas. Por último, el espacio de la

célula o el cloroplasto que está relleno por una solución

acuosa en donde se encuentran los enzimas que realizan la

fase oscura de la fotosíntesis se llama estroma y es el

equivalente de la matriz mitocondrial. Los principales

componentes del estroma son:

- muchas (300) copias de DNA, ribosomas 70S, mRNA y

otros elementos necesarios para la síntesis de

proteínas;

- enzimas implicadas en la reducción del carbono y

nitrógeno

- enzimas implicadas en la síntesis de los lípidos,

porfirinas, terpenoides, quinonas y compuestos

aromáticos.

- gránulos de almidón

En organismos más simples la fotosíntesis tiene lugar en

estructuras membranosas que no forman orgánulos cerrados,

sino que están integrados en la propia célula. Tal es el

caso de las cianobacterias en donde las membranas del

tilacoide están repartidas en la célula.

En el caso de bacterias fotosintéticas la fotosíntesis lo

lleva a cabo la membrana que rodea a la célula. Las

membranas de las bacterias fotosintéticas se pueden romper

mediante sonicación liberando el contenido interior y

volviéndose a cerrar formándose lo que se conoce como

cromatóforos que son elementos muy útiles para el estudio

de la fotosíntesis.

Constituyentes de las membranas del tilacoide

Como todas las membranas celulares están compuestas por

lípidos proteínas y pigmentos. Los lípidos de la membrana

fotosíntesis difieren mucho de los del resto de la planta

apoyando el origen procariótico de estos orgánulos.

Los lípidos son de varias clases, aunque hay muy pocos

fosfolípidos (5-10 % de fosfatidil-colina y fosfatidil-

glicerol), la mayoría son mono y di-glactosil-diacil

gliceroles sin carga (80 % repartidos en una 50 % de MGDG y

25 % de DGDG) y el resto son los sulfolípidos

sulfoquinovosil-diacil gliceroles (5 %) y diglicil-trimetil

homoserina DGTS. Las cadenas laterales de los lípidos

contienen ácidos grasos muy insaturados como el linoleíco.

Las proteínas de la membrana son casi en su totalidad los

componentes de los centros de reacción fotosintéticos y los

componentes de las cadenas de transporte fotosintético. Hay

cinco complejos proteicos que atraviesan la membrana del

tilacoide y que intervienen en la fotosíntesis. Hay tres

complejos que contienen clorofila: el PS I (que tiene

asociado un complejo antena que capta la luz, el LHC I), el

PS II, que lleva también asociadas algunas moléculas de

clorofila en lo que se conoce como la antena interna y el

complejo LHC II, que está separado del PS II, aunque

funciona generalmente acoplado con él. Los otros dos

complejos no llevan clorofila y son el complejo citocromo

b6f y la ATP sintasa.

Hay un estudio interesante referente al papel de un lípido

en una membrana en fotosíntesis. El funcionamiento

eficiente del LHC II requiere la formación de trímeros y

ello depende de la presencia de un fosfatidil-glicerol que

contiene un ácido graso de 16 átomos de carbono con una

insaturación en la posición 11. La disminución en el

contenido de este ácido graso provoca la disociación de los

trímeros y la menor capacidad de captar luz. Esta facultad

la explotan algunas plantas de arroz que se aclimatan al

frío disminuyendo la síntesis de este ácido graso y

evitando así el daño producido por la luz en estas

condiciones de bajo rendimiento fotosintético.

Los pigmentos fotosintéticos: absorción de la luz

En las membranas es donde se realiza la fotosíntesis. Por

ello es necesario que existan en ese espacio pigmentos que

recojan la luz, la primera fase para que se pueda llevar a

cabo su transformación en energía química. Un pigmento es

cualquier sustancia capaz de absorber luz visible. El hecho

de que las plantas utilicen la luz visible se debe no a que

es la que tiene una mayor cantidad de energía, que

corresponde la UV, sino que es aquella de la que mayor

cantidad cae sobre la superficie de la Tierra. Es decir,

aquella que produce una gran intensidad aunque de poca

energía. Por otra parte, el hecho de que se utilice una

energía de poca intensidad produce un menor daño en las

estructuras biológicas que lo soportan. La luz activa en

la fotosíntesis es la comprendida entre longitudes de onda

entre 400 y 700 nm.

Hay dos tipos de pigmentos en cuanto a su función, no a su

composición: antena y centros de reacción que se refiere a

que sean los encargados simplemente de captar la luz o los

responsables de llevar a cabo la reacción fotoquímica.

Dichos pigmentos son fundamentalmente las clorofilas, de

las cuales hay dos especies que difieren en la naturaleza

de los sustituyentes del anillo de la porfirina, la a y la

b. La clorofila, como pigmento de las plantas es la

sustancia más importante del mundo. Gracias a ella se

produce la entrada de los alimentos en la cadena de

alimentación de todos los animales, incluyendo al hombre.

Los pigmentos absorben la luz y se excitan. Luego pueden

perder esa energía de tres maneras: calor, emisión de

fluorescencia y fotoquímica.

Existen también carotenos que tienen un espectro de

absorción complementario al de las clorofilas. En las

cianobacterias y algas rojas existen también otros

pigmentos accesorios que están constituidos por una serie

de pirroles lineales, son la ficobilinas, que poseen un

color azulado-violeta. Las ficobilinas se unen

covalentemente a proteínas que se denominan

ficobiliproteínas, muy abundantes y llamativas por su

intenso color durante la preparación de proteínas de

cianobacterias. El conjunto de pigmentos que incluye a las

clorofilas, los carotenos y las ficobilinas da lugar a un

espectro de absorción que es prácticamente el mismo del

espectro solar que se recibe sobre la superficie de la

tierra.

Centros de reacción fotosintéticos

Los centros de reacción de la membranas púrpura son las

mejor conocidas y, de hecho son los complejos de membranas

biológicos mejor caracterizados. H. Michel en 1982 obtuvo

los primeros cristales tridimensionales de los CR de la

bacteria púrpura no sulfurosa Rhodopseudomonas viridis, lo

que permitió determinar la estructura de este complejo, que

fue el primero en ser resuelto a escala atómica. y que les

valió a Deisenhofer, Michel y Huber el premio Nóbel de

Química el año 1988.

La estructura está compuesta por cuatro polipéptidos y

catorce (14) cofactores. Las proteínas son la L, M, H y C.

Los cofactores son: 4 citocromos c, cuatro

bacterioclorofilas b, 2 feofitinas, 1 hierro no hemínico,

un carotenoide y dos quinonas.

Los cuatro hemos están covalentemente unidos a la subunidad

C, todos los demás están unidos no covalentemente a las

subunidades L y M.

La subunidad C es un lipoproteína que está anclada a la

membrana por un diacil-glicerol que está covalentemente

unido a una cisteína del extremo amino terminal. El

complejo tiene 11 hélices transmembrana, 5 en la L, 5 en la

M y una en la H. Una gran parte de las Subunidades L y M

están asociadas por una simetría binaria con un eje

perpendicular al plano de la membrana.

Años más tarde se determinó la estructura del CR de

Rhodobacter spheroides. Las dos estructuras son muy

semejantes excepto que la Subunidad C está ausente en

spheroides. No se tienen cristales de Rhodobacter

capsulatus, de la que se tiene mucha información genética y

bioquímica. Lo mismo ocurre con el PS II de plantas o

cianobacterias. No obstante, utilizando la información

obtenida de las bacterias se puede extrapolar al caso del

PS II y se pueden construir modelos sobre los que trabajar

acerca de los mecanismos.

Función de los pigmentos

Los pigmentos forman dos ramas, cada una con 2

bacterioclorofilas, una bacteriofeofitina y una quinona.

Cada una de la ramas va de lado a lado de la membrana

comenzando por el 'par especial' que son dos moléculas de

clorofila que están formando un par y que se encuentran en

el lado del periplasma (la parte externa de la célula). A

continuación está la bacterioclofila accesoria, una

bacteriofeofitina y una quinona. Solamente la rama asociada

a la Subunidad L se utiliza para el transporte de

electrones. En esta rama se encuentra la quinona QA,

mientras que la QB está en la rama inactiva. Entre las dos

quinonas se encuentra un hierro no hemínico.

La luz es absorbida por los pigmentos de la LH antena o

bien por el propio par especial. En el primer caso se

transfiere la energía al par especial (D) en donde hay una

molécula DL asociada a la Subunidad L y la otra DM asociada

a la Subunidad M. Ambas están relacionadas por un eje de

simetría. La excitación de las moléculas D se traduce en la

transferencia de un electrón a la clorofila accesoria B.

Este fenómeno es lo que se conoce como separación de carga

y está estabilizada por la rápida transferencia del

electrón a la feofitina ΦA que se encuentra en la rama activa. El siguiente paso es la transferencia de un

electrón perpendicular al plano de la membrana al aceptor

primario de electrones, la quinona QA, que está unida a la

Subunidad M. A continuación se produce la transferencia de

un electrón paralelo al plano de la membrana hasta la

quinona QB, que está en la Subunidad L.

Mientras que QA sólo puede aceptar un electrón, QB puede

acomodar dos que, después de captar dos protones da lugar a

un quinol que migra para ser reoxidado por otro complejo de

membrana que será estudiado en otro momento y que es el

citocromo bc1, lo que lleva consigo la liberación de

protones en el espacio periplásmico. La creación del

gradiente de membrana es lo que permite la síntesis de ATP

por la ATPasa integrada en la membrana. Los electrones que

han llegado al complejo cit bc1 vuelven al CR a través de

un citocromo pequeño y muy móvil que es el cit c2, que

interacciona con la Subunidad C y que permite que se vuelva

a reducir el par especial que había sido oxidado en el

proceso fotoquímico. El papel del carotenoide presente en este CR es proteger al

CR de la fotooxidación mediante el quenching del estado de

triplete del donador primario de electrones, el par

especial. Su proximidad a BB sugiere que la transferencia

de energía desde el estado triplete del donador de

electrones tiene lugar vía BB.

El sitio QB está profundamente embebido en el complejo del

centro de reacción. A pesar de ello deben llegar dos

protones cuando se reduce para dar un quinol, por lo que le

deben llegar los protones desde el citoplasma a través de

la proteína. Es probable que implique residuos ionizables

así como moléculas de agua. Los protones se moverían a lo

largo de una cadena de donadores de protones y aceptores

conectados por puentes de hidrógeno. De hecho, en las

estructuras descritas se pueden observar cadenas de

moléculas de agua que se encuentran a distancias de puentes

de hidrógeno unas de otras.

Las preparaciones de PS II.

El aislamiento de membranas de PS II que fueran capaces de

desprender oxígeno fue el inicio de una corriente de

trabajos que han ayudado a aclarar su estructura y el

mecanismo. Las actividades del PS II debían estudiarse

hasta entonces con preparaciones muy inestables de

tilacoides con una relación señal/ruido muy baja. Estas

preparaciones están limpias de PS I y casi libres de

complejo citb6/f. Mas adelante, la manipulación de las preparaciones de PS II

condujo al aislamiento de complejos de submembrana capaces

de desprender oxígeno, que se denominan PS II cores o

centros de reacción. El aislamiento de nuevas

preparaciones de PS II, así como de PS I u otras

subfracciones da lugar, en muchos casos a que se avance un

paso más en el conocimiento del mecanismo de la

fotosíntesis. En otras palabras, podemos decir que la

fotosíntesis está muy ligada a la descripción de nuevos

métodos de aislamiento de preparaciones más limpias y aún

capaces de llevar a cabo las funciones de la fotosíntesis.

En todos los casos se trata de aislar un conjunto de

proteínas y cofactores que sean capaces de llevar a cabo

una función, pero que, al mismo tiempo, estén libres de

otras moléculas de proteína y pigmentos que no son

necesarios para esa unción. Para ello se emplean diferentes

estrategias en las que se utilizan técnicas cromatográficas

y tratamientos con detergentes, que producen la separación

de los proteínas y pigmentos accesorios y la obtención de

una preparación más activa en una determinada función.

La estructura del PS II La estructura del PS II se presenta en estos momentos de

manera muy detallada debido en gran medida, al gran

esfuerzo que se ha realizado en los últimos años para poder

desvelar la estructura cristalina de este importante y

complejo sistema. La última estructura disponible de un PS

II corresponde a la publicada en Science en Marzo de 2004

(Science 303, 1831-1838 (2004) por un grupo de japoneses

junto con Jim Barber, del King College en Londres, que han

resuleto el centro PS II de la cianobacteria

Thermosynechococcus elongatus, a 3,5 Å de resolución en

donde se ha dado información detallada de la estructura del

OEC así como del posible mecanismo de funcionamiento de

dicho centro. Como hemos mencionado más arriba, el PS II

tiene una gran similitud con el centro de reacción

fotosintético de bacterias, aunque en las bacterias no hay

desprendimiento de oxígeno y, por tanto, no existe el

centro que lleva a cabo dicha función en el PS II.

El PS II que se observa en los cristales contiene un dímero

en el que los dos monómeros son casi idénticos. El monómero

contiene 19 proteínas, que se nombran como D1 D2,

codificadas por los genes psbA y psbD. Son similares a las

proteínas L y M del centro de reacción de bacterias. Las

dos proteínas son muy similares y parecen un heterodímero

con una simetría dimérica. Ambas proteínas tienen cinco (5)

hélices transmembrana. En ellas es donde están localizados

los cofactores donde se lleva a cabo la reacción

fotoquímica. Se han comparado las secuencias de muchas de

estas proteínas y se encuentran muchos puntos en común. El

80-85 % de la secuencia es homóloga entre unas proteínas y

otras. En ambas D1 y D2 hay el máximo de conservación en

las regiones correspondientes a las hélices D y las CD. A

estas proteínas se unen varios cofactores, tales como las

clorofilas del P680, el aceptor primario, la feofitina, un

hierro no hemínico y las QA y QB así como los radicales

TyrZ+ y TyrD+. Se considera que son importantes porque

proporcionan los sitios para que se lleve a cabo la

fotoquímica del PS II al coordinar dichos aminoácidos los

cofactores que intervienen en esas reacciones. Por ejemplo,

las His que ligan los Mg del P680, así como los que ligan

al Fe. También el W254 en D2 y F255 en D1 que se propone

que interaccionan con QA y QB están conservados en todas

las especies. Otro residuo conservado es la Tyr 161 de D1

que da el radical al reducir el P680+

Las proteínas CD47 y CP43, también llamadas CAa-1 y CPa-2

son proteínas integrales de la membrana del PS II. Están

codificadas por los genes psbB y psbC. Tienen varias

moléculas de clorofila y se pueden considerar como

intermediarios en la transferencia de energía entre las

proteínas que captan la luz (LHC en las plantas, los

ficobilisomas en cianobacterias y algas rojas y el centro

de reacción fotosintético. También hay mucha conservación

en las secuencias de las proteínas entre especies

distintas. Se deduce que hay seis (6) hélices transmembrana

y un gran bucle que queda fuera de ella. Este bucle pudiera

estar implicado en la unión al centro de evolución de

oxígeno porque al introducir algunos cambios en los bucles

se observa un drástica disminución de la capacidad de

desprender oxígeno de estas preparaciones. La estructura

de la CP 47 y la CP 43 son muy similares.

El citocromo b-559

El cit b0-559 es uno de los componentes del PS II más

enigmáticos. Es un centro redox al que no se le conoce un

papel funcional. Se propone que sirve para darle la

estructura correcta al centro de reacción ya que cuando se

elimina el gen no se obtiene actividad ni se puede aislar

el PS II. Además, la cantidad de las proteínas D1 y D2 es

muy pequeña. Lo mismo ocurre si se eliminan los residuos de

His a los que se une el Fe. Hay dos subunidades que

conforman al cit b y esto es poco frecuente para un

citocromo. Presenta dos potenciales redox, el potencial

alto es de + 370 mV, lo que es raro porque los citocromos

tienen potenciales entre 0 y 100 mV. El potencial bajo es

de 60-80 mV. La forma de bajo potencial está a veces

asociada a formas dañadas durante la preparación. Se

propone también que pueda tener un papel en la

fotoprotección del PS II.

Mecanismo de transferencia de electrones en el PS II.

Las reacciones del PS II están promovidas por la luz y

consisten en una serie de reacciones que llevan los

electrones desde el agua hasta una molécula de quinona que

abandona el PS II para contactar con el siguiente complejo

en la cadena que es el complejo citocromo b6/f.

Cuando se ilumina, se libera un electrón del P680, que es

una molécula del par especial que se encuentra en el lado

del lumen de la membrana. Dicho electrón salta en muy corto

espacio de tiempo (2-20 ps) hasta la feofitina, a través de

una molécula de clorofila. La feofitina sería, pues, el

aceptor primario de electrones del PS II. A continuación el

electrón pasa a una molécula de quinona que se encuentra

firmemente unida a la membrana, la QA (aprox. 400 ps). Por

último, la quinona QA cede el electrón a QB (aprox. 100 µs)

pasando a través de un átomo de hierro que está colocado

entre las dos proteínas D1 y D2 con las cuales está unido

mediante cuatro His, mientras que la quinta valencia es un

grupo de bicarbonato en el caso de PS II, mientras que en

el centro de bacterias era un resto de Glu. La llegada del

segundo electrón a la QB dispara la captación de dos

protones, su salida del sitio donde se encuentra unida y su

reposición por una quinona procedente del pool de la

membrana.

La salida de un electrón desde el P680 genera un radical

catiónico, el p680+ que debe ser devuelto a su situación

original y eso ocurre mediante la cesión de un electrón por

un grupo que no tiene características redox, como es la Tyr

161 de D1 a la que se ha denominado TyrZ. Ésta pasaría a su

vez a convertirse en un radical TyrZ·. El radical tiene un

potencial redox muy oxidante, que se ha estimado del orden

de 1,3-1.4 V, lo que hace posible que sea capaz de extraer

un electrón del oxígeno del agua. Simplemente, la reacción

fotoquímica ha generado un compuesto que es más oxidante

que el oxígeno para que se realice la reacción de rotura de

la molécula de agua. Contrasta este hecho con lo que se ha

encontrado en bacterias, ya que en este organismo dicho

radical el para especial genera un radical de tan sólo 0,4

V que se reduce con un citocromo c.

La estructura del OEC

Hace unos dos o tres millones de años se produjo a través

de la evolución un centro de reacción fotosintético que

desprendía oxígeno al extraerlo del agua. De esta manera

los organismos capaces de llevar a cabo esta reacción

disponían de una fuente inagotable de electrones y protones

activados biológicamente. Como consecuencia de esta

reacción de rotura de la molécula de agua el oxígeno se fue

acumulando en la atmósfera y pudieron aparecer los

organismos que respiran. Los primeros experimentos que

abrieron una puerta en la investigación acerca del

mecanismo de la rotura de la molécula de agua fueron

realizados por Joliot en 1969 utilizando flashes de corta

duración para iluminar cloroplastos de espinaca o células

de Clorella que estaban adaptadas a la oscuridad. El

resultado fue una prueba evidente de que el oxigeno se

emite de una manera que evidencia un cierto ritmo. De

hecho, el máximo de oxígeno desprendido aparece después del

tercer flash, y a partir del máximo se produce a los cuatro

flashes y así hasta que se rompe el ritmo y se alcanza un

estado estacionario. La interpretación que se hace de este

experimento es que el complejo pasa por cuatro estados

siendo cada uno propiciado por un fotón. Así pasarían desde

el estado S0 hasta el S4, cada uno después de absorber un

fotón.

Otro experimento que permitió un avance se produjo al

observar la señal de EPR correspondiente al Mn en las

preparaciones de OEC, lo que asociaba este metal a dicha

reacción. Se ha utilizado la técnica de EXAF (Extended X-

ray absorption fine structure) en donde la modulación de la

absorción de rayos X se puede interpretar como densidad

electrónica alrededor de un átomo. Con estas técnicas se

proponen una serie de estructuras, de entre las cuales hay

una denominada dímero de dímeros que es la que tiene más

adeptos. En este modelo hay 4 Mn unidos por dos puentes

dioxo en donde hay otros carboxilatos que unen los Mn. Hay

una His de la proteína que interviene uniendo el cluster.

También está posicionada muy cerca la Tyr 161 que es la que

se convierte en el radical TyrZ+. Se observan las moléculas

de agua unidas a los Mn que reaccionarán en el proceso

fotoquímico.

La estructura del PS II desvelada en Marzo de 2004 muestra

las densidades electrónicas que permiten identificar no

sólo los residuos de la proteína implicados, sino también

la naturaleza y posición de los metales que intervienen.

Indican que hay cuatro metales en un dominio mayor que

podría ser un tetrahedro, mientras que hay un quinto metal

en una región extendida que se encuentra cercana. Mediante

el examen de los mapas diferenciales de rayos X anómalos,

que indican mucha diferencia entre el Ca y el Mn se propone

que uno de los vértices del cubo está ocupado por un Ca,

mientras que el cuarto Mn está en la región extendida

cercana. Los restantes vértices del cubo Mn3CaO4 están

ocupados por grupos oxo que conectan con los Mn.

Los datos de cristalografía de rayos X indican que el Mn

localizado en la región extendida une una molécula de agua

que sería la que sufre la oxidación. El enlace 0=0 se

formaría mediante un ataque nucleofílico desde una segunda

molécula de agua que está ligada al átomo de Ca del cubo

que puede actuar como un ácido débil del Lewis.

La cadena de agua al sitio QB.

El sitio QB está profundamente embebido en el complejo del

centro de reacción. Como debe protonarse durante el ciclo

catalítico para dar una hidroquinona, debe captar dos

protones y lo hace del lado del estroma, en este caso el

citoplasma, por lo que se encuentra con una gran porción de

la proteína que está en el camino. Por ese motivo se piensa

que la protonación se lleva a cabo a través de residuos

protonables de la proteína así como con moléculas de agua.

Los protones podrían así desplazarse a través de una cadena

de elementos que actúan como aceptores y donadores de

puentes de hidrógeno. En las estructuras cristalinas

disponibles se pueden observar verdaderas cadenas de

moléculas de agua alineadas a lo largo de un canal que une

el medio externo con el centro donde se encuentra en QB.

Cada una de las moléculas de agua se encuentra a una

distancia que está más o menos a la distancia de los

puentes de hidrógeno. De esta manera llegarían los protones

a la QB desde el citoplasnma y luego los perdería en el

lumen, con lo que se establecería un flujo de protones

desde el citoplasma o estroma al lumen, con la consiguiente

bajada del pH en este espacio.

EL PS I

El PS I, o centro de reacción fotosintética I, es un

complejo multienzimático asociado a membrana que se puede

denominar, de acuerdo con la nomenclatura de la IUPAC como

una Plastocianina-ferredoxina oxidorreductasa en el sentido

de que lleva a cabo una reacción de transferencia de un

electrón desde la plastocianina, cuyo potencial es de E'o =

+380 mV, hasta la ferredoxina, cuyo potencial es de E'o = -

420 mV. Eso significa que debe vencer una gran barrera

termodinámica que es para lo que se utiliza la energía de la

radiación luminosa. Este proceso es muy eficiente puesto que

se puede decir que prácticamente el 43 % de la energía de

del fotón rojo, de acuerdo con la luz absorbida, se

transforma en energía química.

En los últimos años se ha avanzado mucho en el conocimiento

de la estructura y función del PS I así como de otros

componentes de la fotosíntesis. Se conoce la estructura de

la plastocianina así como de la del citocromo c6 que la

sustituye en aquellos organismos que se cultivan en ausencia

de Cu y en presencia de Fe. Se conoce la estructura de la

ferredoxina y flavodoxina, así como de la FNR de Anabaena y

de otras cianobacterias. Es más, recientemente, en el año

2001 se ha publicado la estructura, a una resolución de 2,5

Å, del PSI de una cianobacteria. Por otra parte en los

últimos años se ha avanzado mucho en el conocimiento de la

estructura y la función de muchos de los componentes del PS

I, al mismo tiempo que se han clonado y se han llevado a

cabo experimentos de mutagénesis en algunos de ellos, con lo

que se empieza a comprender cómo interaccionan entre ellos y

cómo participan en el transporte de electrones.

Respecto a la nomenclatura de los genes que codifican las

proteínas del PS I es necesario aclarar que se ha

estandarizado su nomenclatura, que consiste en utilizar las

letras en cursiva psa y luego una letra que va desde la A a

la M con mayúsculas. Las proteínas se nombran siguiendo el

mismo sistema, pero con letra normal y la primera en

mayúscula PsaA hasta la PsaM, pero también se nombran como

PsIA.

Arquitectura del centro PS I

La organización de las diferentes subunidades del complejo

así como de sus cofactores, ha sido determinada por

cristalografía de rayos X a una resolución de 2,5 A.

El centro de PS I de cianobacterias aparece como un trímero

de peso molecular 3 x 356.000. Esta forma está presente

también in vivo. Cada monómero contiene 11 subunidades de

proteínas diferentes que coordinan más de 100 cofactores.

Las subunidades PsaA (en azul en la Figura) y el PsaB (en

rojo en la Figura) comparten muchas similitudes en la

secuencia de proteínas así como en su estructura. Contienen

11 hélices transmembrana cada una.

En la estructura por rayos X correspondiente al PS I de la

cianobacteria Synechococcuss elongatus, se observan dos

dominios diferentes, el llamado dominio de conexión, que no

sobresale ni por enzima ni por debajo de la membrana, y que

sirve, aparentemente, para unir los monómeros en trímeros.

El dominio mayor es el catalítico, que tiene salientes de

unos 35 Å hacia el estroma o de unos 15 hacia el lumen y que

contiene los componentes de la reacción fotoquímica de

separación de cargas. Se supone también en este caso que la

parte que sobresale hacia el estroma corresponde a los

polipéptidos hidrofílicos, PsaC, D y E, que son las partes

por las que interacciona el PS I con la Ferredoxina (ver

Figura). También hay una cavidad en el lado del lumen que

podría corresponder al sitio de unión de la plastocianina o

el citocromo c6. Se observan tres regiones ricas en densidad

electrónica, que podrían corresponder al centro sulfoférrico

Fx, que forma parte del núcleo del PS I, y que sería el más

interno, mientras que los otros dos, los FA y FB, son parte

de la subunidad PsaC.

Hay un eje de simetría que comprende 22 de las hélices

transmembrana, 8 hélices de superficie, los cofactores del

sistema de transporte de electrones (excepto (FA y FB) y un

par de moléculas de clorofila de la antena de conexión. Este

eje comprende a las subunidades PsaA y PsaB y pasa por el

centro de hierro FX. 11 de las hélices transmembrana y 4 de

la superficie son de las subunidades PsaA y PsaB. Todas

tienen su pareja. No se puede saber cuál es de A y cuál es

de B. En la Figura aparece la subunidad PsaF (en amarillo),

una subunidad importante en plantas porque es el sitio de

unión de la plastocianina. En cianobacterias no tiene esa

función porque la interacción con el PS I es diferente.

Con respecto a los cofactores del PS I se puede decir que se

han identificado más de 100 moléculas de clorofila que

forman parte del PS I. A pesar de que se está lejos de

conocer la función de todas ellas las que juegan un papel

catalítico están localizadas. Así, hay un par de clorofilas

cerca del eje de rotación, próximas a la depresión del lado

del lumen, lo que indica que puede recibir electrones de la

plastocianina o del citocromo c6. Serían dos planos de

porfirina separados por unos 3,6 Å y que están

perpendiculares a la membrana. En la Figura se indica su

localización así como los residuos que las rodean. Hay otras

dos moléculas de clorofila próximas, semejantes en posición

a otras que se han encontrado en la estructura del centro de

reacción de las membranas púrpura por Deisenhoffer, Michel y

Huber, que harían de puente de los electrones en su camino

hacia el aceptor primario de electrones que se supone que es

una molécula de clorofila que se encuentra como un monómero

y relativamente cerca de las clorofilas accesorias. Forman

dos ramas por las que podrían pasar los electrones hacia el

aceptor de electrones. No obstante, aún no se ha resuelto

cuál es el papel de cada una de las ramas en este proceso de

transferencia de electrones. Por analogía con las clorofilas

del centro de reacción de bacterias se propone que estos

pigmentos accesorios participan en la reacción de

transferencia de electrones.

El heterodímero PsaA/PsaB

Las proteínas PsaA y PsaB son las mayores del PS I. De

hecho, se expanden de un lado a otro de la membrana y

contienen un alto número de centros redox así como de

pigmentos. Se conocen las secuencias de diferentes genes de

dichas proteínas, tanto de plantas como de cianobacterias.

Llama la atención el hecho de que son de un gran tamaño:

unos 740 y 734 Aa en Synechococcus, la A y B, lo que

significa tamaños del orden de 81 kDa. Entre las dos

proteínas existe un 45 % de identidad. Otro hecho destacable

es que la homología entre las proteínas A de eucariotas y

cianobacterias es del 95 % y lo mismo ocurre con la PsaB que

también es idéntica en un 95 % entre diferentes especies.

Eso significa que juegan una función análoga y muy

especializada, lo que deja muy poco margen de variabilidad.

Presentan también una gran semejanza en su estructura

terciaria y cuaternaria.

Ambas proteínas son transmembrana, como se había determinado

anteriormente con anticuerpos específicos que permiten

determinar si un proteína está expuesta al espacio luminal o

estromal o a ambos, como sería este caso.

Se detectan también dos cisteínas en cada una de las

proteínas, lo que significa que el centro Fe/S, que se

denomina Fx, el único en el heterodímero, está soportado por

ambas cadenas polipeptídicas, un hecho que resulta bastante

insólito.

Como consecuencia de la transferencia de la energía captada

por las moléculas de clorofila de las antenas, y mediante el

mecanismo de transferencia de energía de Foster ya descrito,

la energía llega a un pigmento donde queda atrapada al

encontrarse en un nivel energético ligeramente inferior.

Este pigmento de propiedades diferentes, es un dímero de

clorofila a que cambia su espectro alrededor de 698-700 al

oxidarse, se pierde absorbancia a esta longitud de onda.

Debido a ello se le denomina P700 y al excitarse puede

perder un electrón quedando como una especie cargada P700+.

La pregunta ahora sería ¿a qué le da su electrón el P700?

cuál es el aceptor primario de electrones en el PS I, ese

compuesto que fue buscado con tanta insistencia durante la

década de los 70, como se ha citado ya varias veces.

Hay acuerdo general acerca de que el aceptor es el llamado

Ao, que consiste en una molécula de clorofila aislada y

separada unos 12 A del par de clorofilas del centro de

reacción. Este proceso tiene lugar en tiempos muy cortos,

del orden de 3 ps. De nuevo tiene lugar un proceso muy

rápido como es la reoxidación del Ao-. Al transferirle su

electrón al siguiente componente de la cadena, una molécula

de filoquinona (vitamina K1), que se denomina A1. También

este proceso transcurre en unos 30 ps. Este pigmento absorbe

a 430 nm por lo que antes de identificarlo se le llamó P430

y se propuso como aceptor primario de electrones del PS I.

Ahora se denomina A1 y en su forma reducida sería A1-. En

este punto se podría preguntar uno por qué no se produce la

reacción inversa, es decir reoxidación del P700+ con el

electrón de A1. Dicha reacción no se observa a menos que se

cumpla alguna de las dos siguientes condiciones

artificiales: o bien que se haya extraído el centro Fx, o

bien que se hayan reducido previamente los centros Fx, FA y

FB. Parece lógico, por tanto, que el siguiente componente

de la cadena sea el centro Fe/S denominado Fx, que se

encuentra a sólo 12 Å de distancia del A1. Una razón que

apoya la propuesta de que el centro Fx participa en la

cadena de transporte de electrones es que si se cambia

mediante mutagéseis dirigida una de las cisteínas que

mantienen la agrupación Fe/S por Ser, se forma un centro que

contiene sólo 3Fe/4S, que se puede reducir con ditionito

aunque la transferencia hasta los centros FA y FB se ve

alterada en parte.

El PsaF

La secuencia de diferentes genes que codifican a este

polipéptido indica que tiene una secuencia correspondiente

a un péptido señal que justificaría la localización que se

le adscribe en el lado del lumen, a donde tiene que ser

transportado una vez que se sintetiza en el estroma del

cloroplasto. También se observa una región con una alta

concentración de cargas positivas. Por otra parte, los

estudios de hidropatía indican que hay una región con fuerte

contenido en aminoácidos hidrofóbicos que indicaría que

existe una hélice que atraviesa la membrana que serviría

para anclar la proteína al heterodímero PsaA/PsaB. Esa

hélice se cree que es la i de la estructura cristalina (en

amarillo en la Figura).

Respecto a la función del PsaF en el PS I se acepta como

probado que sirve para fijar al donador de electrones la

plastocianina o el citocromo c6 para que puedan ceder

electrones al P700+. En cualquier caso esto plantea una

interesante pregunta, que también se da en otros puntos del

PS I, y es que si la PC y el Cit c6 juegan el mismo papel

uniéndose a la misma cadena PsaF, cómo es que lo hacen

teniendo unas estructuras tan diferentes. Apoyan esta

propuesta experimentos cinéticos y el hecho de que se ha

unido covalentemente la PC a la PsaF en plantas superiores,

lo mismo que más recientemente, se ha hecho entre el cit c6

y la PsaF de cianobacterias. De todas formas existen

algunos puntos de controversia acerca de esta propuesta que

habrá que aclarar antes de que se dé por definitivamente

establecido el papel de la psaF en el Ps I.

La proteína PsaC

Tiene 81 aminoácidos en la mayoría de los organismos de los

que se conoce la secuencia. Entre ellas hay una muy alta

analogía de secuencia existiendo pequeñas variaciones entre

las plantas monocotiledóneas, las dicotiledóneas y las

cianobacterias. La eliminación del gen da lugar a un

fenotipo que es letal en cultivos fotoautotróficos,

indicando que es un gen esencial para el aprovechamiento de

la luz.

La proteína es ligeramente acídica con un pI de 5,5 y

contiene 9 Cys ocho de las cuales se encuentran en dos

agrupaciones del tipo CxxCxxCxxxCP, que son típicas de

proteínas que tienen grupos sulfoférricos del tipo 4Fe/4S.

La secuencia de la PsaC es muy similar a la de otras

ferredoxinas o trozos de ellas. Tal es el caso de la de

Azotobacter y otras bacterias y sulfobacterias. En aquellos

casos en que se conoce la secuencia se comprueba que ésta

es muy similar en todas ellas. Una característica

estructural de estas proteínas es que muestran dos dominios

simétricos que tienen una estructura semejante y contienen

cada uno a un centro Fe/S. En cada uno de los agrupamientos

de cuatro Cys las tres primeras están uniendo átomos de Fe

mientras que el tercero lo hace con el Fe del otro centro.

Debido a este hecho los dos dominios no se muestran como

independientes sino que cooperan entre sí para dar lugar a

un eje binario.

Esencialmente se puede decir que esta estructura es la

mínima requerida para englobar a los dos centros

sulfoférricos dado el pequeño tamaño de la proteína. En

cualquier caso es de destacar el hecho de que, incluso en

secuencias que fueran más largas, por tener inserciones en

algunas regiones, no se afectaría la disposición de los

centros Fe/S debido al hecho de que la cuarta Cys, que

enlaza al segundo centro, está situada necesariamente

próxima al primer centro por estar en una agrupación de

secuencia concreta.

Con respecto a la función del PsaC está claro que tiene dos

centros redox que participan en el transporte de electrones

entre el Fx del PS I y la ferredoxina o la flavodoxina. Se

podría considerar que su función es conseguir que los

electrones salgan del núcleo hidrofóbico del centro de

reacción y pasen a la región del estroma, que es

hidrofílica. Ello se demuestra cuando se interrumpe la

fotorreducción del NADP+ al eliminar del PS I las

subunidades PsaC, PsaD y PsaE. El transporte de electrones

se restablecía al añadir las proteínas PsaC y PsaD al

núcleo PS I-Fx. Ello indica, a su vez, que el Fx no puede

dar electrones a la ferredoxina. Por otra parte en la

proteína de plantas se destruye el FB mediante tratamiento

con HgCl2 y en ese caso no hay fotoreducción de NADP+.

Se propone que la secuencia de transferencia de electrones

es Fx ---> FA ----> FB. La localización del FA más cercano

al Fx indica que ésta es la secuencia, aunque los

potenciales redox indicaría la dirección opuesta. Para

probar el orden de intervención sería necesario alterar el

potencial de uno de los centros y ver qué pasa con el

transporte de electrones. Cuando se ha hecho la mutación

C14D se obtiene una proteína con un centro FB de potencial

-90, mientras que el del FA se mantiene en -520 mV. Por

otro lado al hacer la mutación C51D el potencial del FA

pasa a ser -98 mV mientras que el del centro FB es de -580

mV. Ello indica, en primer lugar, que lo que determina el

potencial del centro redox es la secuencia de la proteína y

concretamente en el entorno del centro redox. En segundo

lugar que el cambio en uno de los centros no afecta al

otro, lo mismo que no está determinado por el hecho de que

al titular el segundo centro, el FB, ya se ha reducido el

FA, que estará como FA-.

Desgraciadamente no se han estudiado las proteínas con

centros 3Fe/4S en experimentos de reconstitución del núcleo

del PS I. El ideal sería ver si en aquellos sistemas en

donde tenemos un sumidero en el centro FA o bien en el

centro FB por haberles cambiado su potencial haciéndolo más

positivo se detiene el transporte de electrones cuando está

el otro centro reducido, en cuyo caso se concluiría que el

centro alterado está después del otro centro que se reduce.

Si no está reducido el centro intacto querrá decir que el

centro alterado está antes del otro.

Este tipo de experimentos también se están intentando

llevar a cabo utilizando centros en donde se integra un

metal diferente al hierro, en cuyo caso se obtienen centros

con potenciales diferentes.

PsaD

La secuencia del gen del PsaD muestra que corresponde a una

proteína de unos 135-150 aminoácidos entre los cuales hay

un enorme cantidad de Lys y Arg. La secuencia se encuentra

bastante conservada entre las cianobacterias (del orden del

65 %) mientras que lo está algo menos con relación a

plantas superiores (55 %). El punto isoeléctrico es muy

alto, del orden de 9-9,5 aunque hay algunas que lo tienen

más bajo. Los perfiles de hidropatía y experimentos de

extracción indican que la PsaD está fuera de la membrana

del tilacoide y es muy soluble. La mayor abundancia de

residuos básicos en el extremo carboxilo hace pensar que

esa porción de la proteína es la que establece el contacto

con la ferredoxina (o flavodoxina) que son negativas. Al

mismo tiempo se piensa que estará próxima a la PsaC

formando una especie de capuchón.

La función de la PsaD se ha adelantado al hablar de su

estructura. Se propone que es el sitio de unión de la

ferredoxina (o flavodoxina) al PS I. Esta propuesta, que se

hacía sobre la base de la abundancia de cargas positivas en

la proteína, se apoya en el hecho de que la ferredoxina se

une covalentemente a la PsaD cuando se incuban con EDC. Se

apoya también en el hecho de que cuando se utilizan

mutantes PsaD- no tiene lugar la fotoreducción del NADP+ y

se recuperaba dicha capacidad al añadir PsaD pura.

Curiosamente dicho requerimiento es menos estricto si se

utiliza flavodoxina, lo que indica que esta proteína no

requiere a la subunidad PsaD para unirse al PS I. Una

segunda función de la PsaD consiste en orientar

adecuadamente a la subunidad PsaC para su unión al PS I.

Experimentos de eliminación del gen aportan poca

información adicional acerca de la función del PsaD. Dichos

mutantes son incapaces de crecer en la luz. Cuando se aísla

el PS I de estos mutantes les faltan algunas subunidades,

pero esto puede indicar que no las tengan in vivo o que la

hayan perdido al aislar el PS I. Experimentos más recientes

indican que están presentes las otras subunidades.

PsaE

La secuencia de aminoácidos deducida a partir de la

secuencia del gen de diferentes organismos muestra que la

PsaE es una proteína de 70-75 aminoácidos con una masa

molecular de 7-8 kDa y un alto grado de homología entre

ellas (unos 75 %). Se tiene una estructura de NMR para esta

proteína. Tiene un alto contenido en hoja β ya que contiene

cinco láminas β. Es interesante señalar que en la

estructura se observa que la parte superior no contiene

prácticamente aminoácidos cargados sino que son polares o

apolares, mientras que en la parte inferior existe un

elevado número de residuos cargados. Esta diferente

distribución de los aminoácidos según el tipo a que

pertenezcan podría deberse a su papel en la unión a PsaC,

al heterodímero PsaA/PsaB o a proteínas transportadoras de

electrones solubles.

Con respecto a la función de esta proteína existen varias

pruebas de que aumenta la velocidad de intercambio de

electrones entre la ferrredoxina (o la flavodoxina) y el PS

I. De nuevo son experimentos en los que se elimina el

componente PsaE de la preparación y se observan cinéticas

que suelen ser la mitad o la cuarta parte de la original.

La adición de la subunidad restaura parte de la actividad

perdida.

Sin embargo ésta no puede ser la principal función de la

subunidad ya que la ausencia del gen no causa un fenotipo

letal. La discrepancia entre los datos bioquímicos

(obtenidos con preparaciones de membranas) y los

fisiológicos (medidos con organismos enteros) sugiere que

no es necesaria una eficacia del 100 % en la reacción (en

este caso de transporte de electrones) para que un

organismo crezca mejor.

Una segunda función de la subunidad PsaE fue descubierta

después de que un mutante PsaE se observara que era más

sensible a la temperatura que la silvestre.

Todos estos datos nos han proporcionado una visión de la

estructura del PS I así como de su función en el transporte

de electrones en la fotosíntesis. Hemos visto que en este

momento se puede presentar una visión bastante coherente de

este centro, de sus componentes así como de la función de

cada uno de ellos. Se ha recorrido un largo camino y ya se

puede prácticamente tener un idea de cómo funciona. No se

esperan novedades en este campo. No obstante, son muchas

las lagunas que aún quedan por rellenar hasta que se pueda

tener un cuadro completo de cómo funciona la fotosíntesis.

El complejo citocromo b6/f

Las moléculas de quinona reducidas en el PS II deben

reoxidarse para generar los equivalentes de reducción al

mismo tiempo que se genera el ATP, los dos productos de la

fotosíntesis. Hemos visto en temas anteriores que los

electrones que se extraían del agua en las reacciones

dependientes del PS II debían llegar al PS I para terminar

en el NADPH. La conexión entre los dos se realiza a través

del complejo cit b6/f. Se puede decir, por tanto, que el

citocromo b6/f es una plastoquinona-plastocianina

oxidoreductasa ya que transfiere electrones desde la

plastoquinona hasta la plastocianina generando un gradiente

de protones que sirve para la síntesis de ATP. En algunas

algas la plastocianina se sustituye por citocromo tipo c,

el citocromo c6 cuya síntesis depende de la presencia de

hierro o cobre en el medio de cultivo.

Ocurre igual en el otro proceso en el que se produce

transformación de energía biológica, la respiración. En la

mitocondria hay otro complejo que se denomina el citocromo

b/c1 que transfiere electrones desde la ubiquinona hasta el

citocromo c. Vemos, por tanto, la similitud de ambos

sistemas, que está reflejada en una Figura. Complejos de

este tipo se han encontrado, de hecho, en todas las

mitocondrias y en muchas especies bacterianas. Se pensaba

que sólo estarían en la fotosintéticas, pero se han

encontrado en muchas más.

El complejo citocromo b6/f se requiere también para llevar

a cabo la fotofosforilación cíclica. En este caso se

transforma la energía captada por el PS I en un gradiente

transmembrana que puede servir para la síntesis de ATP.

La localización del complejo citocromo b6/f incluye la

membrana de los grana y los tilacoides estromales, a

diferencia de los PS I y PS II que están distribuidos de

manera irregular en estas membranas. De hecho encontramos

una mayor cantidad de complejo en la parte final de los

sacos de grana, justamente entre los PS I y PS II indicando

su función de comunicación entre ellos.

Se he resuelto la estructura del complejo citocromo b6/f de

la cianobacteria termófila Mastigocaldus laminosus a 3,0 Å

de resolución por el grupo de Bill Çramer, de Purdue

University Science, 302, 1009-1014 (2003). Se obtiene como

un dímero, tal como se observa en la Figura, en donde cada

monómero contiene cuatro subunidades proteicas grandes, que

son el citocromo b6, con dos grupos hemo, el hemo bn y el

hemo bp, cada uno coordinado a dos His; la Sid IV,

relacionada con el citocromo b6, la proteína Rieske, que

contiene un centro sulfoférrico del tipo [2Fe-2S]; y el

citocromo f, un citocromo del tipo c. Hay también otras

cuatro subunidades altamente hidrofóbicas, que son la PetG,

PetL, PetM y PetN, así como una molécula de clorofila a, un

β-caroteno y una plastoquinona, lo que da lugar a un

complejo de un peso molecular de 217 kD. Por otra parte,

anteriormente, se habían determinado las estructuras de una

forma trucada del citocromo f así como de la de la proteína

Rieske.

Cada monómero presenta 13 hélices transmembrana que son 4

del citocromo b6, tres de la subunidad IV, y una en cada

una de las proteínas citocromo f, proteína Rieske y las

subunidades PetG, -L, -M y –N. Los dominios extrínsecos del

citocromo f están situados en el lado “luminal” de la

membrana (lado p).

Los dos monómeros forman una cavidad que se encuentra vacía

en la interfase transmembrana y que está colocada en el

lado “estromal” de la membrana y que se propone que sirve

para el intercambio de quinonas en el complejo.

El citocromo b6

El citocromo b6 y la subunidad IV son homólogas a las

porciones N- y C- terminales del citocromo b del complejo

citocromo bc1, de la misma manera que lo es la parte

central que corresponde a la proteína Rieske. Sin embargo,

el citocromo f, que es un citocromo tipo c no es homóloga

al citocromo c1 del complejo bc1. Los dos hemos del

citocromo b6 tienen un potencial que resulta peculiar para

una proteína de este tipo, ya que se les han asignado los

valores de -50 y -150 mV para cada uno de ellos. No es

casualidad que en mitocondrias ocurra prácticamente lo

mismo donde los hemos del citocromo b tienen potenciales

muy próximos a éstos.

Una sorpresa que ha resultado al resolver la estructura de

este complejo consiste en que ha aparecido un nuevo grupo

hemo que se encuentra asociado al hemo bn del citocromo b6.

Dicho grupo hemo parece que no pertenece a ninguna familia

de hemos, por lo que se propuesto, por el momento, el

nombre de hemo x. El hemo x se encuentra unido

covalentemente a la proteína por una Cys del citocromo b6.

El Fe del hemo no está coordinado a un residuo de la

proteína sino a una molécula pequeña que se propone que es

de agua. Dicha molécula de agua está unida por puentes de

hidrógeno a un propionato del hemo bn así como a otro

residuo del citocromo b6. La sexta valencia está vacía. Los

planos casi perpendiculares de los hemos x y bn están en

contacto a través de la unión por el puente propionato-

agua, lo que implica que exista una transferencia de

electrones eficiente entre los dos grupos hemo. Sobre la

función del grupo hemo x se hablará más adelante.

El citocromo f

El citocromo f del complejo b6/f es un citocromo tipo c y,

por lo tanto, tiene el grupo hemo unido covalentemente a

dos cisteínas de la proteína, de acuerdo con el motivo

CXXCH en la porción amino terminal, que es común a los

citocromos f y c1. En los dos casos el extremo carboxilo

de la proteína está precedido por un trozo de unos 20

aminoácidos hidrofóbicos que se piensa que puedan ser el

sitio de anclaje a la membrana. Para conseguir cristales de

la proteína de membrana se ha aprovechado el hecho de que

en algunas especies la porción de la hélice hidrofóbica que

produce el anclaje del citocromo a la membrana se elimina

durante la purificación de la proteína siendo ésta soluble

en agua. Se da también le circunstancia muy favorable de

que este fragmento contiene el grupo hemo y éste mantiene

el mismo potencial redox que en la proteína intacta, por lo

que se puede asumir que la estructura es muy semejante a la

de la proteína nativa.

Dicha estructura es muy diferente de las de otros

citocromos en los que hay preferentemente hélices α, mientras que en el citocromo f hay mayoría de hojas β. La proteína está constituida por dos dominios de plegamiento

diferentes. Uno que se encuentra en la parte superior de la

molécula y que está constituido por los residuos 169 al

231, que está constituido casi exclusivamente por hojas β y otro, constituido por los residuos 1 al 168 y del 232 al

246, que es el más grande y donde se encuentra el hemo. En

este dominio hay mayoría de cargas positivas y es donde se

encuentra la Lys 187 que ha sido descrita que se une

covalentemente al Asp44 de la plastocianina, motivo por el

cual se propone que es uno de los residuos que

interacciona con la plastocianina. El grupo hemo se

encuentra en la región entre los dos dominios, aislado de

la fase acuosa por un escudo muy amplio formado por una

serie de aminoácidos hidrofóbicos y muchas Pro.

La principal característica del citocromo f es el sexto

ligando del Fe, lo que lo diferencia también del citocromo

c1 ya que en éste es una His, mientras que en el citocromo

f es el grupo α-amino de la Tyr en la primera posición. Se comprueba, al conocer esta estructura, que existe una gran

variedad en lo que se refiere al sexto ligando de los hemos

en los diferentes citocromos. En algunos de ellos, como es

el caso del citocromo b5, es otra His (como el quinto

ligando). Como se ha dicho antes en los citocromo c el

sexto es una Met. Por último, en una bacterioferritina el

quinto y sexto ligando son Met.

Parece que no hay relación entre el tipo de hemo y el

ligando. El extraño ligando que tiene esta proteína implica

otro hecho interesante y es que el centro redox de la

proteína no puede integrarse en ésta hasta que no se haya

eliminado el péptido señal para que se libere así el grupo

NH2 de la Tyr1 y esto no ocurre hasta que la proteína no es

translocada hasta el lumen. Si, como parece, el hemo es una

señal importante para que la proteína se pliegue y esto no

ocurre hasta que se le elimina el péptido señal, puede que

sea la forma de regular el plegamiento para que la proteína

esté desplegada antes de pasar la membrana. Se puede decir,

por tanto, que el citocromo c y el f representan otros dos

ejemplos de evolución convergente, de los que ya hay varios

en diferentes sistemas.

Una vez determinada la estructura de este citocromo y

conocido la naturaleza de los residuos que forman parte de

él se puede proponer la forma en la que se produce el

acoplamiento entre dicha proteína y la plastocianina, tal

como se propone en la Figura.

El potencial redox del citocromo f está en la zona

positiva, como es normal en los citocromos tipo c (E'o = +

0,37 V). De acuerdo con este valor el citocromo f se puede

reducir con ascorbato, lo mismo que la proteína Rieske, Por

el contrario, el citocromo b sólo puede reducirse con

ditionito, lo que indica un potencial de reducción mucho

más negativo.

La proteína Rieske.

Es una proteína sulfoférrica con un centro 2Fe-2S que tiene

un potencial inusualmente positivo por lo que puede

reducirse con ascorbato. De hecho el alto potencial de

estos grupos, que fueron ya descubiertos en mitocondrias,

se debe a que el hierro tiene coordinado el N de una His,

además del S. Su unión a la membrana se hace por la porción

C-terminal, aunque el centro metálico se queda fuera.

Mecanismo de transferencia de electrones y transporte de

protones del complejo citocromo b6/f

La función del complejo citocromo b6/f es hacer posible el

paso de los electrones desde el fotosistema PS II, donde se

produce la rotura de la molécula de agua, hasta el PS I,

donde se produce la reducción del NADPH. Así mismo, el

citocromo b6/f es el responsable de llevar a cabo el

aprovechamiento de la energía que se libera en dicho

proceso. Dicha energía se aprovecha para sintetizar una o

varias moléculas de ATP. Una vez que se conoce la

estructura del complejo así como muchos otros aspectos

relativos a la energética de los procesos biológicos es

obligado intentar proponer un mecanismo que explique cómo

se produce el proceso molecular de transformación de la

energía de la fotosíntesis.

Los cuatro centros del complejo funcionan en dos parejas,

dos de ellos de potencial alto y dos de potencial

relativamente bajo. La de potencial más próximo a la

quinona es la proteína Rieske (+ 300 mV) y es la que recibe

un electrón de la quinona, que después pasa al citocromo f

(+340 mV).

La hipótesis quimiosmótica de Michel propone que la energía

que se desprende en el proceso de transporte de electrones

en el cloroplasto, lo mismo que en la mitocondria, se

conserva mediante la formación de un gradiente de protones

consistente en la acumulación de éstos en un lado de la

membrana. Los protones se acumularían en un lado de la

membrana debido a que el paso de los electrones a través

del complejo citocromo b6/f provoca el paso de un cierto

número de protones, aún por determinar, de un lado al otro

de la membrana (del estroma, lado n al lumen, lado p). Hace

muchos años el propio P. Michel propuso un mecanismo que

explicaría cómo se produce transporte de protones al pasar

los electrones por el complejo. Dicho mecanismo se conoce

como el ciclo Q y sigue siendo válido, a pesar del paso de

los años y de que en este tiempo se han conocido muchos

detalles concernientes a los componentes de dicho complejo.

El ciclo que se resume en los siguientes términos: en el

citocromo b6/f hay dos sitios diferentes con afinidad para

las quinonas, cada uno con afinidad diferente por una

especie redox de la quinona. Así hay uno, que es el Qo por

oxidado o outside (también llamado Qp por positivo) que

está en un sitio de la membrana próximo al espacio intra-

tilacoidal. A él se une preferentemente la quinona

reducida. Hay otro denominado Qi que es por interior o

sitio de reducción de la quinona (también llamado Qn por

negativo), que está en la porción más externa de la

membrana.

De acuerdo con este modelo una quinona reducida se une al

Qo desde donde se transfiere un electrón a la proteína

Rieske para pasar a continuación al citocromo f y luego a

la plastocianina. Como consecuencia de esa reducción se

genera una semiquinona que es capaz de reducir al citocromo

bp y éste rápidamente reduce al citocromo bn que está

situado muy próximo y en el otro lado de la membrana (están

perpendiculares los planos a la membrana). El hemo bn

reducido es capaz ahora de reducir una molécula de quinona

hasta dar la semiquinona, lo que tiene lugar en el sitio

Qi. Ahora tiene lugar otro ciclo catalítico mediante el

cual llega de nuevo un electrón a través del hemo bp y el

hemo bn hasta la semiquinona que estaba en la posición Qi

quedando ahora reducida completamente y que se disocia ya

que este sitio tiene afinidad por la quinona oxidada.

Como consecuencia de los dos ciclos de oxidación de las

quinonas se produce el paso de dos electrones desde la

quinona hasta la plastocianina, al mismo tiempo que cuatro

protones pasan desde el estroma al interior del lumen. El

primer par lo hace al reducirse la quinona con los

electrones de proceden del PS II y que son liberados al

ceder la quinona los electrones al complejo bf siendo los

protones impulsados hacia el lumen. El otro par de protones

se transfiere al reducirse la quinona en el sitio Qi con

los electrones procedentes del citocromo bn.

La reacción es

QH2 + PCox + Q -- Q + PCrd + QH· + H+

QH2 + PCox + QH· -- Q + PCrd + QH2 + H+

QH2 + 2 PCox --- Q + 2 PCrd + 2 H+

Los protones que se utilizan para reducir una quinona en el

PS II proceden del lado del estroma, mientras que se

pierden por el lado del lumen. Por otro lado, los protones

que se utilizan para reducir quinona oxidada así como la

semiquinona, tal como se indica en las reacciones

detalladas más arriba, proceden también del lado del

estroma.

Regulación

Puesto que la transferencia de electrones desde la quinona

al complejo b6/f es lenta constituye en muchos casos el

paso limitante en la Fotosíntesis. Por eso puede ser un

sitio a propósito para establecer un mecanismo de

regulación pudiendo actuar como un sensor del estado redox

del cloroplasto o la célula fotosintética. El mecanismo

sería el siguiente: un nivel alto de quinona reducida

indica que el PS II está funcionando muy eficientemente y

que se está acumulando poder reductor. Entonces se activa

una quinasa que fosforila a una proteína del LHC II

asociado normalmente al PS II, lo que hace que pierda

afinidad por este fotosistema y lo gane por el PS I. De

esta manera la acumulación de poder reductor reduce el

número de antenas del PS II y aumenta el del PS I, con lo

que se produce un tirón de los electrones hacia el NADPH.

Plastocianina

La conexión entre el complejo citocromo b6/f y el PS I se

realiza a trabes de la proteína de pequeño tamaño conocida

como plastocianina. Es interesante señalar que, mientras

que las plantas sólo tienen plastocianina para esta

función, los organismos más antiguos, como son las

cianobacterias, tienen otra proteína que puede cumplir el

mismo papel: el citocromo c6. Eso sugiere algún tipo de

evolución convergente en la cual dos proteínas de

estructura muy diferente se han seleccionado para cumplir

la misma función. Es decir, que la proteína de hierro pudo

ser sustituida por otra de cobre de forma que los

organismos más evolucionados la han adoptado como la única

necesaria para la función que realizan.

La plastocianina es una proteína de cobre que tiene un

átomo metálico por un Mr de 10,5 kDa. Las proteínas de Cu

suelen ser de color azul y así es la plastocianina en el

estado oxidado siendo el máximo a 600 nm como corresponde a

una transición de transferencia de carga del tipo Cys(S)-

Cu. Hay otras proteínas de Cu con espectros similares,

tales como la azurina y la estelacianina.

La plastocianina de plantas y algas eucariotas está

codificada por el gen petE en el núcleo, por lo que una vez

sintetizada en el citoplasma debe transferirse al

cloroplasto, lo que implica ser transportada a través de

las membranas de dicho orgánulo. La secuencia de

aminoácidos de las plastocianinas conocidas muestran una

alta conservación de residuos, especialmente los implicados

en la unión del Cu que son dos His, una Cys y una Met así

como una Tyr. Los residuos básicos cambian mucho de una a

otra especie cambiando también el pI de la proteína que es

casi de 4 en plantas y algas verdes, es casi neutra (6) en

algunas cianobacterias y muy básica en otras tal como

Anabaena (9).

La estructura cristalina de algunas plastocianinas se han

determinado así como por RMN. En todos los casos es una

especie de cilindro con el Cu en la parte norte metido en

un bolsillo formado por residuos conservados e hidrofóbicos

que están próximos a la superficie pero no expuestos. Este

bolsillo hidrofóbico se ha propuesto, mediante experimentos

de mutagénesis dirigida, que es el sitio de interacción con

el PS I.

Se ha encontrado otro agrupamiento de residuos ácidos que

se encuentran en la región este de la proteína. Se propone

que este parche negativo es el sitio de interacción con el

citocromo f y también que en Anabaena y otros organismos

en los que la plastocianina tiene un pI básico estos

aminoácidos ácidos se han reemplazado por otros neutros.

Citocromo c6 (antes denominado c553) Tiene un Mr de 10 kDa y un potencial redox de + 350 mV.

Cumple la misma función que la plastocianina. Ambas tienen

tamaños y potencial redox que son similares en las dos

proteínas. Las estructuras de la proteína de varias

especies se ha determinado recientemente y presenta muchas

similitudes entre sí. Basándose en la comparación de las

estructuras de la plastocianina y citocromo c6 de

organismos diferentes se puede establecer una relación

evolutiva entre ellas que se han confirmado por datos de

cinética en los que en el caso de los organismos más

primitivos se produce la reacción por colisión simple,

mientras que los más evolucionados se hace mediante un

reconocimiento y posterior reorganización para que se

produzca la reacción.

Aspectos evolutivos de la fotosíntesis

Hace setenta años se realizaron los experimentos que

demostraban que en las plantas había dos centros de

reacción implicados en la fotosíntesis. Se denominaron PS I

y PS II. Más adelante se descubrió que había otros

organismos procariotas que realizaban la fotosíntesis. Se

denominaron bacterias púrpura y bacterias verdes y en ellas

se produce la transformación de la energía luminosa

mediante centros de reacción de otro tipo. Las diferencias

principales con las plantas y cianobacterias es que en

estas bacterias el proceso transcurre sin desprendimiento

de oxígeno; sólo tienen un centro de reacción; finalmente,

el pigmento principal de la fotosíntesis es la

bacterioclorofila, (BChlo). Durante los años 60 y 70 se

produjeron muchos avances en el conocimiento de la

fotosíntesis de las bacterias púrpura cuyas preparaciones

eran relativamente fáciles de obtener y se obtenían casi

libres de otros pigmentos diferentes de los que se

requieren para producir el proceso a estudiar. En estos

momentos se puede afirmar que los hechos más significativos

a destacar del estudio comparativo acerca de la

fotosíntesis que llevan a cabo los diferentes organismos

son los siguientes: 1) el centro de reacción PS II de las

plantas se parece en muchos aspectos al de las bacterias

púrpura. EN concreto las subunidades D1 y D2 son análogas a

las L y M de estas últimas; 2) el centro de reacción de las

bacterias verdes así como de las descubiertas

posteriormente de nominadas heliobacterias, es más simple y

homodimérico pareciéndose más al centro de reacción PS I de

las plantas y cianobacterias.

Hoy día se toda la comunidad científica acepta que los

cloroplastos de las plantas que realizan fotosíntesis

surgió del atrapamiento de una cianobacteria por parte de

una célula eucariota, lo que explica la gran similitud

entre el PSI de cianobacterias y de plantas. Las

subunidades PsaA, PsaB, la PsaC que tiene los centros

sulfoférricos, así como la PsaD fueron heredados por los

cloroplastos directamente de sus ancestros las

cianobacterias. Posteriormente a la existencia de una

simbiosis entre los cloroplastos y la célula eucariota se

le añadieron a éste otras subunidades que son específicas

del PS I. De hecho, las últimas adquisiciones son las PsaG,

PsaN y Psa H.

Las heliobacterias y bacterias verdes sulfurosas poseen,

por su parte, una versión “económica” del centro de

reacción fotosintético.