La Investigación en la Sección Departamental de Bioquímica y Biología

Molecular

La Investigación en la Sección Departamental de Bioquímica y Biología Molecular

• Grupo de BIOQUIMICA TISULAR

• Grupo de HEPATOLOGIA EXPERIMENTAL

• Grupo de ESTRÉS OXIDATIVO

• Grupo de PATOLOGÍA AUTOINMUNE

• Grupo de ENZIMOLOGÍA Y BIOQUÍMICA METABÓLICA

• Grupo de CITOMETRÍA Y CITÓMICA

La Investigación en la Sección Departamental de Bioquímica y Biología Molecular

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La Investigación en la Sección Departamental de Bioquímica y Biología Molecular

Citometría en Investigación Clínica

José-Enrique O’Connor Grupo de Investigación en Citometría y Citómica

Universidad de Valencia Centro de Investigación Príncipe Felipe

Método analítico por el que se mide la emisión de múltiples

fluorescencias y la dispersión de luz de células o partículas

microscópicas, alineadas mediante una corriente líquida laminar,

cuando son presentadas de una en una y a gran velocidad frente a una

fuente de iluminación de longitud de onda adecuada

CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO

Método analítico que mide la emisión simultánea de múltiples fluorescencias y dispersión de luz

CITOMETRIA DE FLUJO

Alineadas de forma secuencial por un flujo laminar y presentadas de una en una a gran velocidad en un punto óptimo de iluminación

Células o partículas biológicas individuales en suspensión

CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO

• Proteínas extracelulares • Secuencias de ADN o ARN libres • Complejos inmunes circulantes

CONCEPTO DE CITOMETRIA DE FLUJO

• Viriones individuales • Liposomas • Cromosomas aislados • Orgánulos aislados • Núcleos aislados

• Bacterias • Hongos unicelulares • Células humanas y animales • Protoplastos vegetales

• Hibridomas y fusiones celulares • Esferoides • Cuerpos embrioides • Larvas y embriones • Organismos pluricelulares

Air-cooled Argon Ion Laser

Beam Shaping Lenses

High Sensitivity Quartz Flow Cell

Forward Scatter Detector

Side Scatter Detector

525BP FL1 (FITC)

575BP FL2 (RD1)

620BP FL3 (ECD) 675BP FL4 (PC5)

488DL 488BK

550DL 600DL

645DL

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

FLUOROFORO

FLUOROCROMO

PROPIEDAD BIOLOGICA

FLUOROCROMO

`PROPIEDAD BIOLOGICA

633, 635 nm He-Ne

Allophycocyanin

785 nm

660 nm

Alexa Fluor 750

Alexa Fluor 750

Alexa Fluor 750

785 nm

785 nm

FLUORESCENCIA Y MARCADORES FLUORESCENTES

FLUOROCROMOS EN TANDEM: ALOFICOCIANINA +ALEXA DYES

Parámetros Citoplasmáticos

Parámetros Nucleares

Parámetros de Superficie

Parámetros Extracelulares

Moléculas de superficie

Enzimas

Enzimas

Enzimas

Proteinas

Proteinas

Pared celular

Proteinas secretadas

Parámetros analizables por Citometría de Flujo

Moléculas de superficie

RESUMEN DE LAS APLICACIONES CLINICAS GENERALES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Y SUS METODOLOGIAS

1. INMUNOFENOTIPAJE DE SUPERFICIE

2. DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES

3. ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS

4. ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: OBJETIVO

Determinar la presencia y cuantificar la expresión de proteínas (antígenos) o de regiones de las mismas (epitopos) en la superficie de las células de la sangre, tejidos linfoides, líquidos biológicos o cultivos celulares, usando combinaciones adecuadas de anticuerpos fluorescentes.

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE: INFORMACION CLINICA

Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y técnicas de análisis permiten identificar subpoblaciones específicas de células y determinar:

• Linaje celular

• Grado de maduración

• Grado de activación

• Clonalidad de cadenas ligeras de inmunoglobulinas y del receptor TCR

• Expresión de proteínas de fusión en translocaciones cromosómicas

DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES : OBJETIVO

Determinar la presencia y cuantificar la expresión de proteínas (antígenos) o de regiones de las mismas (epitopos) en la cara interna de la membrana plasmática, citoplasma, vesículas o núcleo de las células de sangre, tejidos linfoides, líquidos biológicos o cultivos celulares, utilizando combinaciones de anticuerpos fluorescentes.

DETECCION DE ANTIGENOS INTRACELULARES : INFORMACION CLINICA

Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y técnicas de análisis permiten identificar:

• Linaje celular

• Grado de maduración

• Grado de activación

• Expresión de enzimas intracelulares

• Activación de enzimas intracelulares

• Expresión de proteínas reguladoras del ciclo celular

• Expresión de antígenos relacionados con la apoptosis

• Expresión de proteínas de fusión en translocaciones cromosómicas.

ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS : OBJETIVO

Determinar la presencia y cuantificar los niveles de ácidos nucleicos (ADN y ARN) en células enteras, células permeabilizadas o suspensiones de núcleos aislados a partir de sangre periférica, tejidos linfoides, líquidos biológicos, biopsias y otras muestras de tejidos sólidos y cultivos celulares, utilizando fluorocromos que se unen a los ácidos nucleicos.

ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS : INFORMACION CLINICA

Las técnicas de análisis basadas en el uso de fluorocromos específicos de ácidos nucleicos en células permeabilizadas permiten:

• Determinar la ploidía celular

• Detectar la presencia de células en proliferación

• Calcular la distribución en las fases del ciclo celular

• Identificar células nucleadas en sangre (leucocitos, eritroblastos)

• Estimar el grado de maduración de precursores de eritrocitos y plaquetas

• Identificar y cuantificar células vivas, apoptóticas y necróticas

ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES : OBJETIVO

Analizar, de forma cualitativa o cuantitativa, fenómenos dinámicos o transitorios de la Bioquímica intracelular, cuya alteración sea causa, consecuencia o esté relacionada con situaciones fisiopatológicas de relevancia clínica.

+ADP

ANALISIS DE PARAMETROS FUNCIONALES : METODOLOGIA

Se realiza usando fluorocromos, sustratos fluorogénicos específicos o partículas fluorescentes cuyas propiedades varían en función de: • Entorno celular: pH, iones, moléculas oxidantes, reductoras • Actividad de enzimas intracelulares específicos: oxidasas, peptidasas • Transporte a través de membrana plasmática o de orgánulos • Acumulación selectiva en compartimentos intracelulares

El proceso de preparación de la muestra debe respetar la viabilidad y competencia funcional. En muchas aplicaciones en Inmuno-Hematología, el análisis funcional se puede realizar en muestras de sangre entera, con un grado de manipulación mínima. En estudios de activación, se puede requerir una etapa de estimulación celular controlada.

The Evolution of Cytometry: From Cytometry to Cytomics

Cytology Cytometry Cytomics

• Increasing technical complexity and information • Demanding better instrument performance and data management • Exploring new biological parameters and new fields of application

Cytomic Technology: Single-cell Analysis

Hydrodynamic Flow Cytometry

Laser Scanning Cytometry

Automated Bioimage Analysis

Image-in-flow Cytometry

Mass-Spectrometry Flow Cytometry

Acoustic Flow Cytometry

High-Troughput Flow Cytometry

Confocal Microscopy

Inreasing the rate of samples: High-Troughput Cytometry

The HTFC™ Screening System performs high-throughput, multiplexed, single-cell

analysis on cells or particles in suspension:

• Reads a 96-well plate in 3 minutes, or a 384-well plate in 12 minutes

• Samples from 1 microliter or 1 ml

• No sample goes to waste

• With 4 fluorescent channels and 2 light scatter measurements

Clinical Medicine & Clinical Flow Cytometry

• Diagnostic • Prognostic • Therapy assesment

• Molecular Pathology • Predictive Medicine • Target identification • Individualized therapy

Translational Medicine & Translational Cytomics

Phase I

Phase II

Phase III

• Needs • Safety • Efficacy

Cytomics

Chemical Risk Assesment

Toxicity

Drug Discovery

• Acute/Sustained • On/Off target • Environmental • Cytotoxicity • Genotoxicity • Mutagenicity • Reproductive

Cytomics in Drug Discovery and Preclinical Studies

Cytomics Predicts Chronic Toxicity: The Relevance of Hepatotoxicity

• While acute toxicity of a substance or drug candidate is usually detected in vitro, anticipating long-term toxicity is complicated.

• For the prediction of drug-induced chronic

hepatotoxicity, we have validated two novel cytomic assays of steatosis and cholestasis, the major causes of drug-candidate withdrawal.

Steatosis is approached by an assay consisting of 24-hour exposure of HepG2 cells to fatty acids in the presence of test compounds.

Cytomics Predicts Chronic Toxicity: The Relevance of Steatosis

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

CONTROL0,0

50,1 0,3 0,4 0,6 0,8

Tetracyclin treatment(mM)

% live cellsBODIPYRh123

CONTROL CELLS

0.5 mM FATTY ACIDS

Cytomics Predicts Chronic Toxicity: The Relevance of Steatosis

Steatosis is approached by an assay consisting of 24-hour exposure of HepG2 cells to fatty acids in the presence of test compounds.

Cytomics Predicts Chronic Toxicity: The Relevance of Steatosis

CONCENTRATION (µM)

1 10 100 1000 10000

TMRM

(% o

f con

trol)

0

50

100

150

200

250

300FLD VPA DOX AMD TET CIT

CONCENTRATION (µM)

1 10 100 1000 10000

BOD

IPY

ACC

UM

ULA

TIO

N(%

of c

ontro

l)

0

100

150

200

250

CONCENTRATION (µM)

1 10 100 1000 10000

VIA

BILI

TY (%

of c

ontro

l)

0

25

50

75

100

FLDVPA DOX AMD TET CIT

CONCENTRATION (µM)

1 10 100 1000 10000

RO

S (%

of c

ontro

l)

0

50

100

150

200

250

300

Cytomics Predicts Chronic Toxicity: The Relevance of Steatosis

Cholestasis is predicted from the interference on bile acid uptake by isolated rat hepatocytes, with a kinetic assay of bile-acid fluorescent derivatives.

COOH

OH

OHHN

N

O

N

NO2

Cytomics Predicts Chronic Toxicity: The Relevance of Cholestasis

Control rat hepatocytes

Cytomics Predicts Chronic Toxicity: The Relevance of Cholestasis

Test compound JJ4 (Johnson&Johnson)

Cytomics Predicts Chronic Toxicity: The Relevance of Cholestasis

More info: jose.e.oconnor@uv.es

Contents in: http://www.uv.es/~oconnor/JIFM-2014