UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA

CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

LICENCIATURA EN BIOLOGlA EXPERIMENTAL

JUAN DANIEL DIAZ VALENCIA

MATRICULA: 91236112

TELEFONO: 756 O1 83

TRIMESTRE LECTIVO:

PROYECTO: "ANALISIS DE LA EWRESION DE ARN MENSAJERO DE CITOCINAS EN CELULAS HUMANAS DE SANGRE PERIFERICA".

CENTRO MEDICO NACIONAL SIGLO X X I EOSPITAL DE ESPECIALIDADES "DR BERNARDO SEPULVEDA"

UNIDAD DE INVESTIGACION MEDICA EN INMUNOQUIMICA INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL

ASESOR EXTERNO: D UA SOLIS INVESTIGA

UNIDAD DE INVESTIGACION lhkPk'A EN INMUNOQUIMICA

ANDO SERRANO MPO COMPLETO

DEPTO. DE CIENCIAS DE LA SALUD

INICIO: 4 DE ABRIL DE 1997

TERMINACION: 4 DE OCTUBRE DE 1997

HORAS A LA SEMANA: 20

CLAVE:

ANALISIS DE LA EXPRESION DEL ARN MENSAJERO DE CITOCINAS EN

CELULAS HUMANAS DE SANGRE PERIFERICA

INTRODUCCION

La sepsis y el choque séptico son síndromes clínicos que pueden ser

desencadenados por bacterias gram-negativas, bacterias gram-positivas y hongos

(I). La sepsis se caracteriza como una respuesta sistémica a la infección

manifestada por taquicardia, taquipnea, cambios en la temperatura (fiebre o

hipotermia), leucopenia o leucocitosis. Por otro lado, el choque séptico se define

como una sepsis severa acompañada de hipotensión. Sin embargo los pacientes

con sepsis pueden tener uno o varios signos y síntomas de sepsis, pero no hay

ningún parámetro fisiológico o de laboratorio que pueda identificar universalmente

este síndrome (2, 4-6, 19, 52, 53). AI inicio del 2000 se realizó una conferencia

consenso (4) donde son definidos cada uno de los síndromes relacionados a la

sepsis, así como la sepsis misma. Se describe como un Síndrome de Respuesta

lnflamatoria Sistémica (SRIS) causada por Infección, con criterios diagnósticos

tales como: signos clínicos de infección, fiebre o hipotermia, taquipnea,

taquicardia, hipoxemia, oliguria, frecuencia respiratoria mayor de 20/min y con

una cuenta leucocitaria mayor de 12 O00 cels/ml (4). De 10s pacientes con

diagnóstico clínico de sepsis un 40-65% tienen hemocultivo positivo y solamente

a un 65 a 85% se les aísla un microorganismo de la sangre, en dicho caso 50%

de 10s gérmenes son gram-negativos, 40% gram-positivos y 5% son hongos. De

tal manera que no es necesario que se presente bacteremia, pues las toxinas

pueden causar la misma sintomatología descrita anteriormente ( 5, 21, 30, 31).

FISIOPATOLOGIA.

La respuesta inflamatoria del huésped a la infección contribuye en forma

importante al desarrollo del choque séptico. Los productos tóxicos bacterianos

presentes en la circulación activan las defensas sistémicas del huésped,

incluyendo tanto factores del plasma como la cascada del complemento (55) y los

componentes de la coagulación; así como neutrófilos, monocitos, macrófagos o

células endoteliales. Las células activadas producen mediadores potencialmente

tóxicos para el huésped: citocinas tales como el factor de necrosis tumoral (TNF),

inteleucina 1 (IL-I ), cininas, derivados del ácido araquidónico, factor activador de

plaquetas y óxido nítrico ( 20, 32-34, 44). Todos estos mediadores aumentan la

respuesta inflamatoria hasta perpetuarla y la ausencia de un equilibrio entre los

componentes inflamatorios y antiinflamatorios del huésped puede generar

choque, falla orgánica múltiple y muerte (1-4, 40).

En el establecimiento de la sepsis intervienen muchos factores, por lo que es

difícil hallar un mediador o mediadores responsables directos del padecimiento,

por lo tanto sería importante encontrar un mediador central que permitiera el

desarrollo de tratamientos más efectivos. Con respecto a lo anterior, los hallazgos

más recientes nos llevan a pensar que la acción de citocinas tales como IL-lp, IL-

6, IL-8, IL-12, IFNy y en especial el factor de necrosis tumoral a (TNFa) ( 23, 29,

38, 39, 43, 48) juegan un papel central en la fisiopatología de la sepsis y la

generación del síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS) (7).

2

En 1997, Bone ( 8-12) describe una nueva hipótesis en la patogénia del SRIS. En

ella describe 5 estadios:

Estadio I .- Ante una infección, lesión traumática (incluyendo lesiones

quirúrgicas), lesión por quemadura, pancreatitis, se presenta una respuesta local

pro y anti inflamatoria fisiológica, con el fin de limitar la lesión.

Estadio 2.- Si la lesión original es severa, aparece una reacción

proinflamatoria sistémica. Los mediadores proinflamatorios, en especial las

citocinas reclutan neutrófilos, linfocitos T, linfocitos B y macrófagos en el sitio de

la lesión, esta cascada estimula a su vez una respuesta antiinflamatoria sistémica

que rápidamente regula la respuesta proinflamatoria, con pocos o ningún signos y

síntomas.

Estadio 3.- Hay pérdida de la regulación de la respuesta proinflamatoria

sistémica, estableciéndose el SRIS o síndrome de respuesta inflamatoria

sistémica, que está constituido por la disfunción progresiva del endotelio,

generando un aumento de la permeabilidad microvascular con agregación de

plaquetas que bloquean la microcirculación, esto produce una mala distribución

del flujo sanguíneo con posible isquémia, esto a su vez puede causar lesión por

reperfusión. Como consecuencia de lo anterior hay inducción de proteínas de

choque térmico, activación del sistema de coagulación e inhibición de 10s

3

mecanismos fisiológicos de la anticoagulación, profunda vasodilatación,

transudación y mala distribución del flujo sanguíneo que pueden conducir al

choque. Finalmente, puede haber falla orgánica con coagulación vascular

generalizada que puede conducir a la muerte si la homeostasis no se restablece.

Estadio 4.- Muchos pacientes con respuesta proinflamatoria SistémiCa

masiva que no mueren en el estadio previo pueden ser capaces de controlar esta

fase con una respuesta antiinflamatoria, sin embargo, está puede ser tan excesiva

como la proinflamatoria, conduciendo finalmente a una inmunosupresión. Los

pacientes que nunca han tenido una respuesta inflamatoria masiva, también

pueden presentar una respuesta antiinflamatoria excesiva desarrollando

inmunosupresión, algunos autores han denominado a la inmunosupresión

"parálisis inmune" o "ventana de inmunodeficiencia" (42). Bone denomina a esta

fase SRAC o Síndrome de Respuesta Antiinflamatoria Compensatoria. En este

síndrome existe mayor susceptibilidad a infecciones y anérgia (8), aumento en el

número de monocitos con una reducción persistente en los antígenos HLA- DR y

HLA-DQ (14, 23-28, 37, 54), disminución en la capacidad de formación de

especies reactivas del oxígeno y citocinas proinflamatorias. La IL-10 ( 25, 36, 45,

50, 51) y el factor de crecimiento transformante-p (TGF-p) inhiben la proliferación

de linfocitos T- antígeno-específicos, así como también suprimen la expresión en

superficie de moléculas de histocompatibilidad clase II en monocitos.

4

Estadio 5.- El estadio final se denomina "disonancia inmunológica" y puede tomar

varias formas, una de ellas puede oscilar entre períodos de severa inflamación y

severa inmunosupresión, durante esta etapa se puede presentar una infección

secundaria que inducira a otra respuesta proinflamatoria seguida por otra

antiinflamatoria, la presencia de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias a un

mismo tiempo en el huésped de esta manera, continuar perpetuándose este

problema hasta la muerte. Mantener este balance entre reacciones pro- y anti-

inflamatorias es crucial para regular y limitar el alcance de SIRIS y SRAC y

consolidar finalmente la homeóstasis

Un antecedente importante en el cual un tratamiento específico ha dado buenos

resultados, es el caso del tratamiento que se hizo con interferon gamma en

pacientes en los cuales se pudo reconocer la fase precisa en la que se

encuentran pues en forma indirecta y a través de la disminución de la expresión

de moléculas de clase II se reconoció que estaban en SRAC ( 24, 46).

5

OBJETIVO GENERAL

Describir el patrón de citocinas presentes en células humanas de sangre

periférica entre individuos normales y pacientes con sepsis y analizar su relación

con el estadio de la respuesta inflamatoria a la infección en cada paciente.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Establecer criterios de selección de pacientes en choque séptico y personas

normales.

Detección por Reacción en Cadena de la Polimerasa-Transcripción Inversa (RT-

PCR) de los ARNm de citocinas presentes en células humanas de sangre

periférica.

Detección y cuantificación de citocinas en suero de individuos normales y

pacientes en choque séptico, por ensayos enzimáticos inmunoabsorbentes

(ELSA).

Caracterizar el perfil de citocinas presente en cada sujeto de estudio para

determinar patron pro-inflamatorio o anti-inflamatorio.

Análisis de los perfiles de citocinas a nivel de expresión genética y proteína en

suero y su relación con la condición de los pacientes.

6

METODOLOGIA

Criterios para la Inclusión de Pacientesterios de Inclusión

1. Pacientes con los diagnósticos de sepsis, sepsis grave y choque séptico

(16, 22, 35, 49), admitidos en la Unidad de Cuidados Intensivos del HE

CMN SIGLLO XXI, de acuerdo a la siguiente tabla:

Definiciones operacionales de los síndromes relacionados a la sepsis ( 2, 3)

TERMINO CRITERIOS DIAGNOSTICOS DEFlNlClON

INFECCION CULTIVO POSITIVO FENOMENO MICROBIAN0

CARACTERIZADO POR UNA

RESPUESTA INFLAMATORIA

SECUNDARIA A LA INVACION DE

MICROORGANISMOS EN SITIOS

NORMALMENTE ESTERILES

BACTEREMIA HEMOCULTIVO POSITIVO PRESENCIA DE MICROORGANISMOS

EN HEMOCULTIVOS

SINDROME DE 2 o mas de los siguientes: RESPUESTA INFLAMATORIA

RESPUESTAINFLAMATORIA

-FC > 90 LATIDOSlrnin. INFECCION, PANCREATITIS, ISQUEMIA SlSTEMlCA

-TEMPERATURA C 36 C ; > 38 SlSTEMlCA CAUSADA POR:

O TRAUMA MULTIPLE -FR > 20/min

-LEUCOCITOS > 12000, < 4000/1

SEPSIS Cultivo positivo RESPUESTA INFLAMATORIA

SlSTEMlCA CAUSADA POR UNA

INFECCION

SEPSIS GRAVE ACIDOSIS LACTICA, OLIGURIA, SEPSIS ASOCIADA CON DISFUNCION

ORGANICA, ANORMALIDADES DE LA PERFUSION TISULAR O HIPOTENSION

CONFUSION MENTAL E HIPOTENSION

CHOQUE SEPTIC0

RESPUESTA A LA ADMlNlSTRAClON

ESTADO ANTERIOR MAS UNA MALA

VASOPRESORES

DE LlQUlDOS Y AGENTES

SINDROME DE FALLA ORGANICA ESTADO ANTERIOR CON EL

MULTIPLE COMPROMISO DE 2 O MAS ORGANOS

VITALES, COMO RESULTADO DEL

CHOQUE SEPTIC0

7

1. Edad de 16 a 65 años.

2. Inicio del padecimiento (sepsis) máximo de 24 hrs.

3. Inicio de la terapia antimicrobiana menor a 24 hrs.

4. Inicio del padecimiento (sepsis) máximo de 24 hrs.

5. Inicio de la terapia antimicrobiana menor a 24 hrs.

Criterios de NO Inclusión.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

Pacientes que no cumplan los criterios anteriores.

Portadores de enfermedades que comprometan la inmunidad

(inmunodeficiencias primarias y adquiridas).

Pacientes portadores de insuficiencia renal crónica.

Pacientes bajo tratamiento con factores estimulantes de colonias o

cualquier otra citocina.

Pacientes bajo tratamiento con inmunomoduladores.

Pacientes bajo tratamiento con glucocorticoides o inmunosupresores

. Criterios de eliminación.

1. Pacientes que tengan una coinfección por gérmenes gram-positivos,

negativos u hongos.

2. Pacientes en los que no se logre aislar el germen causal.

3. Pacientes en los que no se complete el estudio.

8

Toma de Muestras

Se extrajeron 5 ml de sangre periférica por punción directa con vacutainer en

tubos que contienen EDTA como anticoagulante. Para el aislamiento de células

mononucleares se mezclaron volúmenes iguales de sangre con solución salina

estéril 0.9%, adicionar 3 ml de Ficoll- Paque (Pharmacia Biotech) en el fondo de

un tubo de polipropileno de 15 ml y formo un gradiente agregando 1 O ml de la

mezcla sangre-solución salina, se centrifugo a 2000 rpm (revoluciones por

minuto) (Sorvall RT6000D) 20 min. a temperatura ambiente. Se recupero la

interfase con pipeta Pasteur estéril, esta interfase contenia las células

mononucleares. Se lavaron las células mononucleares con 5 ml de solución salina

al 0.9% y centrifugo a 1500 rpm, 10 min. t.a.; se elimino el sobrenadante y

resuspendio el paquete celular en 5 ml. de solución salina, se repitio el lavado y

desecho el sobrenadante. Se resuspendio el paquete celular en 3 ml de solución

salina. Se realizo el conteo celular en cámara de Neubauer (American Optical

Scientific Instrument Division), el número obtenido se incorporo en la siguiente

fórmula:

#Células Totales/4= R*100000= X células/ml

Este nuevo número se multiplico por 3 para obtener el número de células del

volumen total. Se centrifugo a 1500 rpm, 5 min, se desecho el sobrenadante.

Para iniciar el análisis, se aislo el mRNA total, para lo cual se utilizo el método de

aislamiento de ARN en un solo paso desarrollado por Chomczynski y Sacchi ( 18).

9

Aislamiento de ARN

Se centrifugo a 1500 rpm por 5 min, desecho el sobrenadante y agrego TRIZOL

(Gibco-BRL/Life Technologies), 1000 pI por 5x106 células, se disolvio la pastilla

por pipeteo e incubo por 10 min a T.A.; transcurrido el tiempo, se agrego

cloroformo CHCl3 (Merck), 200 pl por 1000 pI de TRIZOL, se agito 30” en vortex,

enseguida, se incubo 3 min. a T.A. y se centrifugo a 14000 rpm por 15 min

(Eppendorf Centrifuge 5415C). A continuación se recupero la fase acuosa

(contiene el ARN) y se agrego Isopropanol (Merck), 500pl por 1OOOpl de TRIZOL,

se agito 30” en vortex, enseguida se incubo 10 min t.a. y centrifugar a 14000 rpm

por 15 min. Transcurrido el tiempo, se desecho el sobrernadante y se agrego

etanol al 70% (Mallinckrodt), 1000 pI por 1000 pl de TRIZOL, se centrifugo 5 min

a 14000 rpm, posteriormente se retiro el sobrenadante y se colocaron los tubos

en un concentrador (HETO VAJ VR-1/120/240) por 20 min para secar el ARN y

se almaceno a -70°C hasta el día que se realizo el RT-PCR.

Cuantificación de ARN

Se resuspendio la muestra de ARN con 35 pI de agua estéril y calento a 60°C por

30 min. Posteriormente se cuantifico el ARN haciendo una dilución 1 :IO0 (5 pI de

ARN más 495pl de agua estéril). Se registro la D.O. de la dilución a 260nm y

280nm (Spectrophotometer Beckman DU640). El ARN restante se mantuvo en

hielo. Para cuantificar el ARN, se introdujo el valor de la D.O. a 260 nm en la

siguiente fórmula:

x 40 x I00 = X pg/ml(l m1/1000pl) = Ypg/pI

10

Para determinar el grado de pureza del ARN, se realizo el cociente

A260IA280 = 1.8-2.0

siendo los valores anteriores indicadores de ARN libre de proteínas

Para realizar la Reverso Transcripción (RT), se requirió de un mínimo de 1 pg de

ARN ( 13, 47). Se calentó el ARN 5 minutos a 70°C antes de agregarlo a la

mezcla de RT.

Transcripción Inversa

Los componentes para la mezcla de RT para cada tubo a utilizar son:

Desoxinucle6tidos Trifosfatados (Boehringer Mannheim)

MgC12 (Boehringer Mannheim)

Buffer RT (Boehringer Mannheim)

lnhibidor de RNAsas (Boehringer Mannheim)

Transcriptasa Reversa AMV (Boehringer Mannheim)

Hexanucleótidos (Boehringer Mannheim)

ARN

Agua estéril

10 mM 2Pl

25 mM 4Pl

5x 4Pl

Dilución 1 :40 1 PI

Dilución 1:lO de la IpM, 25 u/pl 2pl

Stock 1OX concentrado 2Pl

1Pg

llevar hasta 20pl

Se incubaron los tubos con mezcla de RT 60 min. a 42°C y posteriormente 3 min.

a 95°C.

11

Reacción en Cadena de la Polimerasa

Para realizar la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), se colocaron en

tubos eppendorf de 0.5 ml, los siguientes componentes de la mezcla de reacción

para PCR:

MgC12 25 mM (Boehringer Mannheim)

Buffer PCR 10 x (Boehringer Mannheim)

Taq DNA Pol 1 U/pI (Boehringer Mannheim)

Iniciador 3’ (NBU

ADNc 20 pI

Agua estkril 57pl

12

A continuación las secuencias de los iniciadores específicos para cada citocina

Iniciador

IL-IO (5') (3')

IL-12 (5') (3')

TNF-a( 5') (3')

1FN-y (5') (3')

p-actina(5')

Secuencia (5'+3')

AAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAA 350 ATAAGGTTTCTCAAGGGGCTGGGTCAG

TACTCCTTGTTGTCCCCTCTG GTGGCCATATGGGAACTGAAG

420

ATGAGCACTGAAAGCATGATC 702 TCACAGGGCAATGATCCCAAAGTAGACC

ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTT 493 GATGCTCTTCGACCTCGAAAC

GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 548 (3') CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC

JOURNAL OF IMMUNOLOGY 1993; 150: 39-47.

13

El ADN complementario se calentó durante 5 minutos a 70°C antes de

incorporarse a la mezcla de PCR. Los tubos se colocaron en el termociclador

(Techne, Progene FPROGOSY) programado para las siguientes condiciones:

DESNATURALIZACION 30” 94°C

ALINEAMIENTO 60” 58°C

EXTENSION 90” 72°C

40 CICLOS

I I Los productos de PCR se cargaron en geles de agarosa (Pronadisa, H0503196) a

2%, preparada con TBE 1X y 3 pl de bromuro de etídio (0.5 pg/mI), montados en

de electroforesis horizontal (CBS, MGU-IOOT) de 8 pozos en buffer TBE 1X y

utilizando marcadores de ADN de 50 pares de bases (pb) (1 pgIpI) (Gibco BRL).

Las imágenes de los geles se visualizaron y almacenaron en el Analizador de

Imágenes con software analizador de imágenes (IS-I O00 Alpha-lnnotech).

2 2 7 5 2 6 14

Detección de Citocinas en Suero de Pacientes y Sujetos Normales

Se determinó por duplicado la concentración de las citocinas pro-inflamatorias en

Suero mediante el método de ensayo inmunoenzimático E L M ( 15, 23, 28,38, 39,

50, 51), basado en la técnica inmunométrica cuantitativa de sandwich, utilizando

equipos comerciales (R&D Systems) para las citocinas TNF-a, IFN-y, IL-12 e IL-

I O . (13, 14).Se prepararon los reactivos de ensayo y estándares de trabajo. Se

colocaron placas de microtitulación con suficientes pozos que permitieron las

cuantificación de todas las muestras problema y estándares que se requirieron.

Se agrego 50pL de estándar o muestra por pozo por duplicado. Se agrego 50pl

del reactivo de anticuerpo biotinilado a todos los pozos utilizados. Se agregaron

50pL del diluyente de muestra apropiado a los pozos que no se utilizaron. Se

cubrio con cinta adhesiva cada placa e incubaron por 2 horas a T.A. (20-25°C).

Se decantaron y lavaron vigorosamente cada placa con buffer de lavado 3 veces,

se retiraron los restos del buffer de lavado secando la placa en posición invertida

con una toalla de papel limpio. Se agregaron 100 pL de conjugado estreptavidina-

HRP prediluido. Se cubrió cada placa e incubo por 30 minutos a T.A. (20-25°C).

Posteriormente se decanto y lavo cada placa 3 veces como ya se menciono. Se

agregaron 1OOpL de solución sustrato TMB por pozo e incubo por 30 minutos a

T.A. La placa permaneció en oscuridad. Se agregaron 1OOpL de la solución de

paro por pozo y se determino la D.O. a 450nm de cada placa a los 30 minutos

utilizando un lector de placas para ELlSA (MRX 11, DINEX Technologies). La

concentración de citocinas en muestras de pacientes se determinó interpolando el

15

promedio de las absorbancias por cada muestra dentro de la curva estándar

generada para cada citocina.

16

ACTIVIDADES REALIZADAS

Las actividades que realice hasta la conclusión del proyecto incluyeron el

monitoreo en la UCI del HE CMN SIGLO XXI de los posibles sujetos que

pudieran ingresar al estudio. Puse en practica las medidas de ética y

bioseguridad requeridas para el manejo de muestras potencialmente infecto-

contagiosas; aprendí el aislamiento y cultivo de células mononucleares de sangre

periférica, así como de la extracción, manejo y cuantificación de ARN total.

Estandarice la técnica de RT-PCR y los parámetros para su realización rutinaria.

Me entrene en la elaboración de géles de agarosa y las prácticas correctas para

el manejo y eliminación del bromuro de etidio; así como en la realización de

electroforesis en gel de agarosa y el análisis de los productos de RT-PCR en un

analizador de imágenes, con el correspondiente manejo del software que permite

la visualización, análisis y almacenamiento de las imágenes de los geles. Por otra

parte aprendí el manejo de equipos comerciales para la detección de citocinas en

suero, as;, como también el manejo adecuado del lector de placas para ELEA y la

interpretación y análisis de los resultados generados por este último equipo.

Finalmente, hice la comparación del estado clínico del paciente con el perfil de

citocinas que presento cada día de estudio y lo comparé con el perfil de citocinas

de sujetos sanos; para la elaboración del reporte final realice una búsqueda

bibliográfica la cuál presente las principales evidencias de la participación de

citocinas en diferentes enfermedades y síndromes inflamatorias y autoínmunes,

en un intento de proponer la posible relación de las citocinas en el desarrollo de

la sepsis, choque séptico y síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS).

17

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS

Al final de este trabajo se puede observar que se cumplieron los objetivos

planteados y entre las metas alcanzadas estan el aprendizaje y manejo de

técnicas actuales y de gran poder de sensibilidad y precisión, que resultan

indispensables y de gran utilidad para abordar problemas relacionados a la

salud y la biomedicina. Dado el impacto que tiene la incidencia de muertes

asociadas a la sepsis, choque séptico y síndrome de respuesta inflamatoria

sistémica (SIRIS) ( 30, 39, 41, 42, 48), el uso de las técnicas abordadas en este

estudio, hizo posible la posible la detección y caracterización de mediadores

proinflamatorios que como se establecera en los resultados y discusión son

fundamentales en la fisiopatología de la sepsis y SRIS. Realización. Otra de las

metas alcanzadas fue el manejo e integración de información generada en los

experimentos y adquirida por medio de la lectura de artículos relacionados con el

problema abordado.

227526 18

RESULTADOS

El proyecto fue aprobado por el comité ético del hospital y se obtuvo el

consentimiento de los pacientes o su familiar responsable. Ingresaron al estudio

4 pacientes, 4 hombres (75%) y una mujer (25%). Las edades de los pacientes

masculinos fueron: 75 años paciente 1; 72 años paciente 3; 39 años paciente 4.

Femenino 65 años paciente 2. Y 4 controles (individuos sanos).

Promedio de edad de la población: 57.8 años. Extremos de edades: 38-75 años.

Controles sanos: Sujetos de 25 a 60 años de edad sin antecedentes patológicos,

sanos durante el mes previo al estudio. Se tomaron muestras por un período

mínimo de tres días.

Antecedentes Patológicos de los pacientes.

Dentro de los antecedentes patológicos personales, se encontró que al momento

de ingreso a la UCI 20% de la población presentó diabetes; 40% presentó algún

tipo de enfermedad pulmonar; 40% presentó pancreatitis; 40% algún tipo de

enfermedad pulmonar; 20% enfermedad hepática; 40% enfermedad renal y 40%

hipertensión arterial.

19

Concentracidn de citocinas en suero de pacientes 1 y 2.

Paciente 1

2501 n - E 200- % CI) a cn Q c 'ii 100- O ' 50-

150-

.c,

+ IL-1 O (pg/ml) + IL-12 (pglml) -+ IFN-y (pg/ml) + TN F-a (pg/ml)

O 1 I I I I I I I I

O 1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (días)

Paciente 2

2004

Y Q ,501

\

i

+" IL-10 (pg/ml) + IL-12 ( pg/ml) --t IFN-y (pg/ml) + TNF-a ( pg/ml)

O ! 1

O 1 2 3 4

Tiempo (días)

I I I

20

Concentración de citocinas en suero de pacientes 3 y 4.

Paciente 3

500-

E 400- 0 Q

v) Q r= O

'4

300-

'3 200-

100-

.cI

"t IL-I O (pglml) -M- IL-12 (pglml) -O- IFN-y (pglml) +I+ TN F-a ( pglml)

O 1 O 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Tiempo (días)

Paciente 4

2000-1 T" f 1750-

3 1500-

1250- a v) 2 1000- .- $ 750-

G 500- *

- IL-10 (pglml) - IL-12 (pglml) - IFN-y (pglml) -+I+ TNF-a ( pglml)

I I I I I I I 1

O 1 2 3 4 5 6 7 8

Tiempo (días)

21

EXPRESIóN DE GENES DE ClTOClNAS EN CELULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFERICA ESTIMULADAS CON LPS 10 ng/mI

I 2 3

600 Db

5

I00 Db

l . P.M. 100pb 2. IFN-y 493 pb 3. TNF-a 702 pb 4. IL-4 255 pb 5. p-actina 548 pb

22

Las células mononucleares de todos los pacientes expresaron p-actina (control

positivo) (548 pb), TNF-a (702 pb), IFN-.)I (493 pb), IL-12 (420 pb) e IL-IO (350

pb), al igual que las células estimuladas con ionomicina (control de activación); la

magnitud de la expresión de cada citocina varió considerablemente entre cada

paciente. Por otro lado, las células mononucleares de los controles sanos solo

expresaron p-actina (548 pb), sin detectar ninguna de las citocinas antes

mencionadas en muestras de individuos sanos).

23

CONCLUSIONES

Entre las células mononucleares de sagre periférica, una población de gran

importancia son los monocitos, estos intervienen en muchos procesos incluyendo

la inmunidad medida por células, presentación de antígenos, fagocitósis,

destrucción de microorganismos, producción de citocinas, etc. La expresión de

moléculas clase II del complejo principal de hístocompatibilidad con el péptido

procesado es necesario para que sea presentado al linfocito T; su expresión está

regulada en parte por IFN-y, TNF-a, IL-12 e IL-IO; de estos monocitos de sangre

periférica aproximadamente el 80% expresan HLA-DR.

Pacientes en SRlS cualquiera que sea la causa, pueden progresar hasta la falla

orgánica múltiple con coagulación intravascular diseminada y muerte; sin

embargo otros pacientes tienen una respuesta contraria al SRlS y responden con

síndrome de respuesta antiinflamatoria compensatoria (SRAC); durante esta fase

las citocinas anti-inflamatorias tipo IL-10 predominan por lo que inhiben

secundariamente la producción de TNF-a, IFN-y, etc. La producción deprimida de

IFNy conlleva a la disminución en la expresión de moléculas de clase II en

monocitos, lo que a su vez aumenta la susceptibilidad a infecciones secundarias

en este tipo de pacientes: La infección secundaria agregada en estas condiciones

puede en un principio contra restar el SRAC y tratar de llevar al paciente a la

homeostasis; sin embargo cuando los pacientes han permanecido con cambios

alternos de SRlS Y SRAC pueden perder todo control llegando a la disonancia

24

inmunológica diseminada o síndrome de respuesta de antagonistas mezclados

(SRAM) la cual esta constituida por una mezcla de SRlS y SRAC.

Aun cuando el número de pacientes que se estudiaron fueron muy pocos. Con los

resultados que se obtuvieron se puede señalar que en 3 de ellos hay una

tendencia a MARS pues no existe una correlación entre los criterios pro-

inflamatorios como el IFNy, IL-12 y TNF-a; y anti-inflamatorios como IL-IO ( 10-

12). Ya que en el paciente 4 se encontró que la única interleucina que esta

aumentada en relación con las otras tres fue el TNF-a. En el paciente 3 se

observo una elevación en los niveles de IL-IO por lo que probablemente en este

curso tenemos un Síndrome de respuesta antiinflamatoria compensatoria (SRAC).

El nivel de expresión de genes de citocinas puede depender del grado de

activación celular en cada paciente aunque en los pacientes 1, 2 y 4 no se pudo

correlacionar con el estado clínico y tipo de evolución del paciente. En cambio en

el paciente 3 como ya se dijo, existe una probable relación entre los niveles muy

elevados en la concentración de IL-IO y la susceptibilidad a reinfección que

presento el paciente y que es característico de un SRAC.

Dado que la presencia de citocinas aisladas no puede explicar completamente la

evolución y pronóstico de los pacientes estudiados, probablemente lo permita

explicar el conjunto de eventos moleculares que ocurren durante la sepsis,

choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica y síndrome de

respuesta antiinflamatoria compensatoria.

25

Los estudios más recientes indican que no solo la producción de citocinas pro-

inflamatorias es importante, sino también el balance entre los mediadores pro-

inflamatorios y anti-inflamatorios.

26

CRITERIOS DE EVALUACION

Se evaluaron los conocimientos adquiridos y el desempeño en el laboratorio

mediante la presentación de seminarios de avance en los cuales se presentaron

los resultados generados en base a los objetivos planteados, así como también

en la elaboración del reporte final y presentación del trabajo en la reunión anual

de investigación del IMSS.

27

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