Lineamientos chagas oct_2012

Enfermedad de Chagas Página 1 de 48

Versión No.01 InDRE - RNLSP OCTUBRE 2012

LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE ENFERMEDAD DE CHAGAS

InDRE – RNLSP 2012



INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS

SECRETARIA DE SALUD

SALOMÓN CHERTORIVSKI WOLDENBERG

SECRETARIO DE SALUD

DR. PABLO KURI MORALES

SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD

DR. JESÚS FELIPE GONZÁLEZ ROLDÁN

DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA


DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ

DIRECTOR GENERAL ADJUNTO

DRA. MA. DEL CARMEN GUZMÁN BRACHO

DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA

QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS

DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO

LIC. JESÚS OMAR CASTILLO HERNÁNDEZ

SUBDIRECTOR DE OPERACIÓN

QBP. IRMA HERNÁNDEZ MONROY

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA

M EN C IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA

QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIA

QC. ISRAEL PARRA ORTEGA

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA

DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA

M EN C JUDITH ESTÉVEZ RAMÍREZ

JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS

DR. ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ

JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y

VALIDACIÓN DE PRUEBAS

BIOL. SERGIO PASTEN SANCHEZ

JEFE DEL LABORATORIO DE CHAGAS

COORDINADOR DE LA RED DE DIAGNOSTICO DE CHAGAS




ÍNDICE

INTRODUCCION ................................................................................................................ 4

ANTECEDENTES ............................................................................................................... 5

RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE ENFERMEDAD DE CHAGAS ............................................................................................................................. 7

MARCO LEGAL DEL LABORATORIO .............................................................................. 7

OBJETIVOS ........................................................................................................................ 8

Objetivo General ............................................................................................................................ 8

Objetivos Específicos .................................................................................................................... 8

ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE CHAGAS .............. 8

FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE ENFERMEDAD DE CHAGAS . 10

Funciones del laboratorio a nivel federal.................................................................................. 10

Funciones de los laboratorios estatales. (LESP) ..................................................................... 11

Funciones de los laboratorios a nivel local .............................................................................. 12

DEFINICIONES OPERATIVAS......................................................................................... 12

Caso Sospechoso ........................................................................................................................ 12

Caso Probable .............................................................................................................................. 12

Caso Confirmado ......................................................................................................................... 13

Caso Descartado .......................................................................................................................... 13

TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS .................................................................... 14

ALGORITMO DE DIAGNÓSTICO DE LA TRIPANOSOMIASIS AMERICANA ............... 16

ESTÁNDARES DE CALIDAD .......................................................................................... 39

CAPTURA DE DATOS Y RESULTADSOS ...................................................................... 40

PROGRAMA DE EVALUACION EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED) SEROCHAGAS .......................................................................................................................................... 40

CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO ............................................ 42

BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO .............................................................................. 43

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ................................................................................ 44

BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................ 45

Anexo I: CARACTERISTICAS DE EQUIPOS COMERCIALES ...................................... 47

Anexo II: PREPARACION DE REACTIVOS .................................................................... 48




INTRODUCCION

La enfermedad de Chagas es autoctona del continente americano. Es

causada por el protozoario hemoflagelado Trypanosoma cruzi , y se

transmite a humanos principalmente por triatominos hematófagos o por

transfusión sanguínea. Se ha estimado que de 16 a 18 mil lones de

individuos estaban infectados con T. cruzi a principios de los 1990s (WHO,

1991) sin embargo, gracias al éxito de las intervenciones para el control

vectorial y el tamizaje en donadores de sangre las cifras han disminuido

(Schmunis, 1999). Se estima, que 120 millones de individuos continúan en

riesgo de adquirir la infección.

En México, los tr iatominos fueron reportados por primera vez en 1928

(Hoffman, 1928) y el primer caso humano fue descrito 12 años más tarde

(Mazzott i, 1940). La transmisión vectorial de T. cruzi se lleva a cabo en dos

ecosistemás. Uno relacionado con tr iatominos selváticos y mamíferos

silvestres (ciclo selvático), el otro asociado a la vivienda humana con la

participación del vector que habita la vivienda o en el peridomici l io en

directa relación con animales domésticos y el hombre (ciclo doméstico)

(Pinto-Dias, 1992).

El control y prevención de la enfermedad depende del conocimiento

existente sobre su magnitud, trascendencia, vulnerabil idad. En México el

Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiologica (SINAVE) es un programa de

acción conformado por un conjunto de estrate gias y acciones que permiten

identif icar y detectar los daños y riesgos para la salud, su importancia

radica en la capacidad de generar información útil para la orientación del

Programa de Enfermedades Transmitidas por Vector.

El presente documento establece los l ineamientos de operación para la

vigilancia basada en el laboratorio de la enfermedad de Chagas, incluyendo

las funciones por niveles; la toma, manejo y envío de muestras; la

metodología para el análisis de muestras (métodos convencionales y no

Enfermedad de Chagas




convencionales);la evaluación del desempeño así como los estándares de

cal idad.

ANTECEDENTES

Los antecedentes del Laboratorio de Enfermedad de Chagas se remontan a la creación

en 1939 del Instituto de Salubridad y Enfermedades Tropicales (ISET) y los trabajos del

Dr. L. Mazzotti que fueron continuados por el Dr. A. Dávalos quien durante años confirmo

casos de Chagas agudos detectados por microscopistas del Centro Nacional de la

Erradicación del Paludismo (CNEP). El Laboratorio de Tripanosomátidos se crea en 1983

como parte del Departamento de Parasitología y en ese año, se inician estudios

epidemiológicos sobre esta tripanosomiasis. En 1985 el laboratorio estaba participando en

las encuestas epidemiológicas en zonas rurales de varias entidades federativas y otros

estudios de seroprevalencia en bancos de sangre. En los 80’s también se promueve la

creación de ceparios para Leishmania spp como Trypanosoma cruzi. En apoyo al

diagnóstico de esta infección, se desarrollan técnicas serológicas, utilizando

preparaciones antigénicas propias y las técnicas de inmunofluorescencia indirecta, tanto

para Leishmaniosis como para Tripanosomiasis Americana, fueron establecidas como

metodologías de referencia. En 1989 se lleva al cabo la transferencia de tecnología del

Instituto Nacional de Parasitología “Dr. Mario Fatala Chabén”, Laboratorio de Referencia

de la OPS/OMS a este laboratorio. En los años de 1987 a 1990, el laboratorio participó en

la Encuesta Nacional Seroepidemiológica, que evidenció la distribución geográfica de la

enfermedad y su prevalencia. En 1994 el Laboratorio de Tripanosomatidos fue dividido en

el Laboratorio de Enfermedad de Chagas y el Laboratorio de Leishmaniosis y es así como

se encuentran en la actualidad. Durante estos años, también se impulsa el tamizaje de

hemodonadores; se crea la Red Nacional de Laboratorios de Enfermedad de Chagas

(RNLECh) que opera con el binomio Hemaglutinación Indirecta-Inmunofluorescencia

Indirecta (HAI-IFI). En 1998 surge la necesidad de resolver la discordancia entre ambas

pruebas y se implementa el Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, por

sus siglas en inglés).

A inicios de este siglo, se cuenta con la suficiencia diagnóstica y se implementa el

algoritmo de referencia para diagnostico, referencia y control de calidad. Además, se

implementa un protocolo para la verificación de parámetros operativos de diagnóstico




serológico utilizando los estuches comerciales disponibles en México, con esta

información se apoya a los LESP enla correcta selección de reactivos. La técnica de

Inmunoelectrotransferencia (Western Blot) se implementa en el año 2002 como apoyo al

algoritmo de diagnóstico y referencia, en casos particulares. Tres años después, surge la

necesidad de evaluar el desempeño de los integrantes de la Red Nacional de

Laboratorios de Salud Pública y en 2005 la participación en el Boletín Caminando a la

Excelencia, como herramienta para identificar áreas de oportunidad en el desempeño de

los Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP). En 2008, se elaboran paneles de

eficiencia siguiendo lineamientos estandarizados y se implementa el programa de

evaluación externa del desempeño (PEED SEROCHAGAS) con dos ejercicios anuales.

De 2008 a la fecha, se ha fortalecido el algoritmo de diagnóstico, con el uso de equipos

comerciales de alto desempeño.




RED NACIONAL DE LABORATORIOS PARA LA VIGILANCIA DE ENFERMEDAD DE CHAGAS

Fig. 1. Conformación de la red para el diagnóstico de Chagas en México.

En color rojo se presentan los estados que realizan una prueba, amarillo dos pruebas y verde al menos tres

pruebas. En negro se indica los estados que no realizan el diagnóstico o están en proceso de

implementación.

MARCO LEGAL DEL LABORATORIO

1) Ley General de Salud.

2) Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2010 para la vigilancia epidemiológica.

3) Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA2-2010 para la Vigilancia Epidemiología,

Prevención y Control de Enfermedades Transmitidas por Vector.

Marco analítico existente en la RNLSP para el Diagnostico Serológico de Chagas




OBJETIVOS

Objetivo General Generar información básica para apoyar las actividades del programa de Enfermedades

Transmitidas por Vector (ETV) y promover la creación de sinergias de actuación para

realizar el diagnóstico de la tripanosomiasis americana.

Objetivos Específicos Generar información oportuna y valida mediante la utilización de algoritmos de

diagnóstico validados.

Generar servicios de diagnóstico confiables mediante la participación en el programa

de evaluación externa del desempeño.

Incrementar el desempeño técnico de los recursos humanos de la RNLSP mediante la

capacitación continua y específica a las necesidades particulares.

Demostrar nuestra competencia técnica, fomentando la cultura de calidad y mejora

continua de nuestros procesos.

ORGANIZACIÓN DE LA RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE CHAGAS La red está constituida por tres niveles: federal, estatal y local: El nivel federal está

representado por el Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE). El

nivel estatal está constituido por los Laboratorios Estatales o Regionales de Salud Pública

(LESP) que cuentan con las técnicas serológicas para el diagnóstico de la enfermedad. El

nivel local está integrado por los laboratorios ubicados en centros de salud, en hospitales

y en cabeceras jurisdiccionales. En cada estado puede haber tantos laboratorios locales

como sean necesarios para resolver las necesidades de diagnóstico en apoyo a la

vigilancia epidemiológica y a las actividades de salud pública. Los laboratorios de nivel

local apoyan el diagnóstico de enfermedades de importancia epidemiológica y se integran

en redes específicas de diagnóstico. La coordinación de la RNLSP la ejerce InDRE que

interacciona con los LESP, quienes a su vez, son los enlaces funcionales entre los

laboratorios del nivel local y el de nivel nacional. Los laboratorios de apoyo al Sistema

Nacional de Vigilancia Epidemiológica (SINAVE) se deben coordinar con los de la RNLSP,

en el nivel correspondiente.




Fig 2. Flujo de trabajo de la Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública

Fuente: Congreso AMIMC. Dra. Celia M. Alpuche Aranda Mayo, 2008




FUNCIONES DE LOS INTEGRANTES DE LA RED DE ENFERMEDAD DE CHAGAS

Funciones del laboratorio a nivel federal

EL laboratorio de Chagas en el InDRE es el Laboratorio de Referencia Nacional para los

laboratorios del SINAVE y es el órgano normativo para el diagnóstico de la enfermedad de

Chagas. Sus funciones son:

Efectuar el diagnóstico serológico y parasitológico de la Enfermedad de Chagas.

Consolidar los algoritmos de referencia y criterios de interpretación de resultados.

Realizar las pruebas de control de calidad en el diagnóstico parasitológico y

serológico, apoyado a nivel estatal, por los LESP. El control de calidad se realizará

con el total de las muestras biológicas positivas y el 10% de las negativas1

Transferir tecnología estandarizada a los laboratorios integrantes de la Red, Técnica

de Inmunofluorescencia indirecta (IFI).

Ofrecer biológicos como, antígeno IFI y sueros control.

Verificar las características operativas de estuches comerciales como apoyo a la

RNLSP en la selección de reactivos.

Preparar y enviar paneles de eficiencia (PEED SEROCHAGAS) a los LESP

participantes.

Capacitar en servicio para la formación de recursos humanos en la prestación de un

servicio eficiente.

Implementar y adecuar nuevas técnicas de diagnóstico en apoyo al algoritmo de

referencia.

Desarrollar investigación aplicada en apoyo a la vigilancia epidemiológica.

Generar información de orden nacional, integrando y siendo el rector de la Red

Nacional de Laboratorios de Salud Pública, en materia de diagnóstico, investigación y

desarrollo tecnológico para la vigilancia epidemiológica para la toma de decisiones en

el control de la enfermedad que incidan en la formulación y orientación del programa

nacional de salud.

1 NOM-032-SSA2-2010, Control de calidad del diagnóstico, numeral 7.3.2.5..




Funciones de los laboratorios estatales. (LESP) Participar en las actividades de vigilancia epidemiológica mediante la realización de

las pruebas de diagnóstico serológico con estuches comerciales verificados o

metodología estandarizada previamente, en el InDRE, de la cual ha recibido

capacitación el personal de los LESP.

Proporcionar a otras Instituciones de salud los formatos y lineamientos establecidos

en InDRE para la toma y envío de muestras al LESP, que garanticen la calidad y

cantidad de muestra que ingresa a la RNLSP.

Referir muestras al InDRE para la realización de pruebas generales, especializadas y

de referencia, así como para control de calidad.

Referir al InDRE en volumen suficiente, el 100% de muestras positivas, el 10% de

muestras negativas para control de calidad y conformación del Banco de Sueros.

Brindar supervisión y asesoría al personal delos laboratorios a nivel local.

Promover la utilización adecuada de las pruebas de diagnóstico y la interpretación de

los resultados por medio de la capacitación realizada en cursos-taller, impartidos por

personal del InDRE con el compromiso que la capacitación sea dinámica y de

acuerdo a las tendencias y necesidades de la RNLSP.

Desarrollar, promover y apoyar acciones de capacitación e investigación para el

mejoramiento integral de la RNLSP en el ámbito estatal.

Asegurar la estabilidad y confiabilidad del diagnóstico, mediante la implementación

de un programa de control de calidad y la participación en el PEED SEROCHAGAS a

través de los Paneles de Eficiencia, para evaluación de desempeño, dos veces por

año.

Capacitar a los integrantes de la Red estatal de laboratorios para el diagnóstico de la

Enfermedad de Chagas

Elaborar y llevar a cabo los programas operativos y de control de calidad en los

laboratorios locales para el diagnóstico de la Enfermedad de Chagas.

Participar en la elaboración y actualización de los manuales técnicos referentes a

diagnóstico y temas especializados (bioseguridad, manejo de residuos peligrosos

biológico-infecciosos, etc.) para uso en el ámbito estatal y local.

Generar evidencia de la enfermedad de Chagas al notificar al órgano normativo

estatal correspondiente los casos agudos, indeterminados y crónicos confirmados.




Funciones de los laboratorios a nivel local

Realizar alguna de las pruebas convencionales (HAI, ELISA e IFI) para el diagnóstico

de la enfermedad de Chagas que requieren únicamente equipo básico de laboratorio.

Referir muestras al LESP de su entidad para control de calidad y para la realización

de las pruebas generales y especializadas o de referencia que no realicen en el

laboratorio local.

Notificar al órgano normativo jurisdiccional correspondiente los casos de enfermedad

de Chagas confirmados: agudos, indeterminados y crónicos.

Recibir capacitación y asesoría del nivel estatal.

Aplicar las recomendaciones del nivel estatal.

Cumplir con el programa de control de calidad que establece el nivel estatal.

DEFINICIONES OPERATIVAS2

Caso Sospechoso Toda persona que refiera antecedentes de residencia o visita a zona endémica de

Tripanosomiasis Americana y que presente alguna o varias de las siguientes

características: que haya recibido sangre de donador seropositivo o componentes

sanguíneos; con antecedente de trasplante de órganos; que sea hijo de madre

seropositiva a T. cruzi o que presente algún síntoma inespecífico de la enfermedad. El

caso sospechoso de Tripanosomiasis es totalmente inespecífico, por lo que su utilización

debe abocarse para estudios de brotes y situaciones especiales.

Caso Probable Persona que resida o provenga de zona endémica y que presente uno o varios de los

siguientes signos o síntomas:

Caso probable agudo: Chagoma de inoculación, fiebre intermitente prolongada,

Signo de Romaña, cardiopatía y/o seropositividad a inmunoglobulina IgM en una de

las siguientes pruebas: HAI, IFI o ELISA.

2 Fuente: Lineamientos para la vigilancia epidemiológica de las Enfermedades Transmitidas por Vector. Grupo Técnico

Interinstitucional del Comité Nacional para la Vigilancia Epidemiológica (CONAVE). Marzo 2012.




Caso probable congénito: Hijo de madre seropositiva, prematurez, fiebre,

hepatoesplenomegalia y/o linfadenopatias.

Caso probable post-transfusional: Cuadro compatible con Tripanosomiasis aguda,

antecedentes de haber recibido sangre 3 meses antes de presentar la sintomatología

y/o antecedentes de no haber realizado pruebas de tamizaje en el donador.

Caso probable indeterminado: Que presente serología positiva a una de las

siguientes pruebas: HAI, IFI o ELISA.

Caso probable crónico: Cardiopatía dilatada, megaesófago, megacolon y/o serología

positiva a una de las siguientes pruebas: HAI, IFI o ELISA.

Caso Confirmado

Es la persona con signos o síntomas de la enfermedad en quien se demuestre la

presencia del parásito mediante alguna de las siguientes pruebas: estudios

parasitoscópicos (gota gruesa, frotis, hemoconcentración de muestras sanguíneas, cultivo

en medios NNN) o serología positiva en la misma muestra de suero a por lo menos dos

de las siguientes pruebas: IFI, HAI o ELISA, o cualquier técnica avalada por la instancia

competente.

Caso Descartado

Es la persona en la que no se encuentra evidencia de T. cruzi por los procedimientos

descritos.




TOMA, MANEJO Y ENVÍO DE MUESTRAS

Para la correcta identificación de cada muestra es imprescindible que cada una de ellas

este rotulada en forma completa con los siguientes datos:

a) Apellido y nombre

b) Fecha de extracción de la muestra

c) Demás datos necesarios según caso.

1. La muestra de suero, sangre o laminilla (ver Tabla 1A y 1B) debe acompañarse del

formato REMU-F-12, del resumen de historia clínica y de la solicitud del estudio.

2. La falta de alguno de estos documentos o inconsistencia en la identificación precisa

de la muestra será causa de rechazo. Se notificará al usuario, la muestra quedará en

resguardo en él laboratorio y contará con un periodo de ocho días para enviar la

documentación completa o corrección, de no ocurrir la muestra es desechada.

3. La muestra no deberá estar hemolizada, contaminada, lipémica o contener alguna

sustancia interferente. Si sucede, la muestra será rechazada de manera definitiva y

se notificará al usuario o responsable del envío vía fax.

4. El diagnóstico serológico de la tripanosomiasis americana seguirá el algoritmo Los

resultados serán emitidos para diagnóstico en 10 días, para referencia y control de

calidad 15 días después de recibida la muestra.

5. En casos especiales, si la muestra no cumple con los criterios de calidad biológica

pero el usuario considera que la muestra es de alto valor deberá notificarlo al

Laboratorio de Enfermedad de Chagas por escrito en la solicitud o formato y aceptar

que el resultado debe ser interpretado con cautela, quedando el laboratorio del InDRE

libre de toda responsabilidad legal.

ENVÍO Y RECEPCIÓN DE MUESTRAS El envío de muestras debe realizarse a la brevedad posible después de la obtención de la

muestra y en no más de siete días hábiles. El tubo con la muestra de suero se empaqueta

bien en un recipiente con doble cubierta y en un contenedor que cierre herméticamente y

se envía de inmediato; se debe proteger de la luz solar y del calor excesivo con un

refrigerante (4-8 °C), que no debe de estar en contacto directo con la muestra. En el caso

de las dependencias de la Secretaría de Salud la muestra se envía al Laboratorio Estatal




de Salud Pública correspondiente. Para otras instituciones el envío se realizará de

acuerdo con los procedimientos que se determine en el nivel estatal o federal.

InDRE: Instructivo para la toma y envío de muestras biológicas para diagnóstico y control

de calidad: http://www.cenavece.salud.gob.mx/indre/interior/intd_manuales.html

Toma y recepción de muestras InDRE: http://www.cenavece.salud.gob.mx/indre/interior/tomayrecepcion.html

Tabla 1. Toma y manejo de muestras clínicas

A. Técnicas parasitoscopicas

Tipo de muestra

Método Medio/contenedor/forma

de envío Tiempo Técnica

Sangre capilar Por punción digital

Extendido sobre vidrios porta objetos si es posible coloreado con Giemsa, muestra de sangre en laminilla a TA.

Durante la fase aguda de la enfermedad.

Frotis, Gota gruesa

Sangre total

Por venopunción en tubos con heparina/EDTA

2 mL, enviar con refrigerantes de 4 a 8 °C


Frotis, Gota gruesa

Sangre total

Por venopunción en tubos con heparina/EDTA

2 mL, enviar con refrigerantes de 4 a 8 °C.


Microhematocrito fluorescente

Sangre total

Por venopunción en tubos con heparina

3-5 mL, enviar con refrigerantes de 4 a 8 °C.


Hemocultivo

Sangre total

Por venopunción en tubos con heparina

2 mL, enviar con refrigerantes de 4 a 8 °C.


Inoculación en ratón

http://www.cenavece.salud.gob.mx/indre/interior/tomayrecepcion.html




B. Técnicas inmunoserológicas

Tipo de muestra

Método Medio/contenedor/forma de envío

Tiempo Técnica

Suero

Por venopunción en tubos sin anticoagulantes

1 mL, enviar con refrigerantes de 4 a 8 °C

Durante la fase aguda tardía y crónica de la enfermedad

ELISA Ag Totales ELISA Ag Recombinantes IFI Parasito Integro WB

ALGORITMO DE DIAGNÓSTICO DE LA TRIPANOSOMIASIS AMERICANA

El diagnóstico etiológico de la enfermedad de Chagas se basa en la evaluación clínica,

epidemiología y pruebas de laboratorio. Para el diagnóstico de laboratorio, los exámenes

adecuados dependen de la etapa clínica del paciente. En la etapa aguda los estudios se

centran en la búsqueda y reconocimiento del Trypanosoma cruzi en sangre (metodología:

parasitológica directa), porque en las etapas iníciales de la enfermedad se encuentran

parasitemias importantes y a medida que transcurre la infección van disminuyendo hasta

hacerse mínimas y aleatorias. En las etapas crónicas (inaparente o indeterminada y

sintomática) las parasitemias son transitorias y por ello el diagnóstico se realiza

fundamentalmente mediante el hallazgo de anticuerpos circulantes contra el T. cruzi.

1. INMUNODIAGNÓSTICO

El inmunodiagnóstico se basa en la detección de anticuerpos específicos contra el

Trypanosoma cruzi sin embargo, se debe tener bien entendido que lo que se busca no es

el parásito y por tanto sus resultados nunca proporcionarán certeza diagnóstica y deben

evaluarse en términos de probabilidad. Para que la probabilidad se acerque a la certeza,

es importante seleccionar adecuadamente el método a emplear, el momento de la toma

de muestra y la interpretación apropiada de los resultados.

El diagnóstico de laboratorio se realiza en una muestra de sangre o suero del paciente, el

tipo de muestra se determina en base a la fase de la enfermedad y la técnica a realizar.

Se debe obtener una muestra de sangre completa por venopunción [(aproximadamente 5




mililitros (mL)] en un tubo con o sin anticoagulante. Para inmunodiagnóstico se utiliza

suero, en fase crónica, para técnicas de cultivo o inoculación en modelo animal es sangre

completa o laminillas con extendido y gota gruesa para técnicas parasitoscópicas, será

enviado al LESP para el ensayo. La muestra de suero debe mantenerse siempre en

refrigeración (2-8 °C) desde la toma hasta la llegada al LESP. La muestra deberá venir

acompañada con el Formato envío debidamente completado, sin datos alterados o sobre

escritos y en caso de considerarlo conveniente, por favor indique la gravedad del

paciente; las muestras que no cumplan con los requisitos establecidos, serán rechazadas.

De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-032-SSA-2010, para la vigilancia

epidemiológica, prevención y control de enfermedades transmitidas por vector, el

diagnóstico de la Enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana se basa en el

cuadro clínico del paciente, asociado a las fases aguda y crónica del padecimiento;

antecedentes de residencia en áreas endémicas de la enfermedad, transfusional, madre

chagásica y/o trasplante de órganos. “Se confirma el diagnóstico en fase aguda, al

demostrar la presencia del Trypanosoma cruzi o serología positiva en la sangre, por

estudio directo o por la técnica de concentración de Strout, cultivo o xenodiagnóstico,

serología positiva (HAI, IFI, ELISA y Aglutinación de Partículas) en fase aguda tardía. En

fase indeterminada, se confirma por serología positiva y en fase crónica por serología

positiva o el xenodiagnóstico y el cultivo en sangre en medios bifásicos al dar resultados

positivos” de acuerdo a lo que especifica la NOM-032-SSA-2010.

La confirmación del diagnóstico por laboratorio se establece por la demostración del

parásito o bien por al menos dos pruebas serológicas de diferente formato, positivas. Los

servicios de salud instalados en áreas endémicas, donde la población está en riesgo de

contraer la parasitosis, deben tener conocimiento, para establecer el diagnóstico clínico,

parasitológico y serológico. Los criterios de laboratorio para la clasificación de casos son

de acuerdo a la siguiente tabla.




Tabla 2. El diagnóstico de la enfermedad de Chagas se realiza por criterios clínico,

epidemiológicos y principalmente con ayuda de métodos parasitológicos o serológicos.

Parásitos cualquier método Serología

Dos Pruebas Sintomatología

Criterio Diagnóstico de

Caso

+ + + Agudo

+ - + Agudo

- + + Agudo

+ + - Indeterminado

- + - Indeterminado

- + + Crónico

- - + No caso

El inmunodiagnóstico de la infección por Trypanosoma cruzi involucra una mezcla de

anticuerpos dirigidos contra un gran número de antígenos parasitarios, con diferente

concentración, afinidad y antelación de aparición. Puede haber expresión de diferentes

mosaicos antigénicos entre las distintas cepas y reactividad cruzada con microorganismos

relacionados que comparten zonas geográficas. Los distintos métodos y estuches de

reactivos pueden comportarse de manera diferente frente a una misma muestra y la

evaluación de desempeño de diferentes lotes no son siempre consistentes con estudios

previos.

La especificidad del inmunodiagnóstico para la tripanosomiasis americana es buena sin

embargo, la sensibilidad es mayor hacia la fase crónica sintomática. Los antígenos en los

estuches comerciales o reactivos de elaboración casera son obtenidos a partir de

diferentes cepas y fases del parásito, van desde el parásito íntegro, extractos crudos,

extractos parcialmente purificados, antígenos recombinantes de fase aguda o crónica,

péptidos sintéticos, hasta antígenos quiméricos. Los estuches de diagnóstico son muy

variables en su composición antigénica y ninguno de ellos alcanzan por sí solo el 100%

de certeza diagnóstica (WHO, 2010), es por esto que, los grupos de expertos

internacionales de Tropical Disease Research (TDR) / Word Health Organization (WHO)

(TDR-WHO) recomiendan para tamiz, una técnica altamente sensible y para diagnóstico

al menos dos pruebas en paralelo, de diferente formato. Con este diseño, el diagnóstico,

puede alcanzar un rango de sensibilidad del 98-99.5%. Es decir, para obtener resultados




más seguros y concluyentes, se debe realizar más de una técnica diagnóstica. Sin

embargo, una limitante es la presencia de resultados indeterminados (resultados

discrepantes), la frecuencia de estos obedece a las características del desempeño de las

pruebas utilizadas. La selección de las pruebas de diagnóstico depende de: a) la relación

costo/beneficio, b) al tipo de antígenos y conjugado utilizados, ya que algunas

metodologías utilizan conjugados polivalentes (Anti IgM, IgG e IgA) con el paradigma de

incrementar su aplicabilidad al espectro de la enfermedad, sin embargo, puede haber un

incremento de la tasa de falsos positivos. La experiencia en Sudamérica y México señala

que el mejor par de técnicas utilizadas en paralelo es, un ELISA confeccionado con

antígenos crudos, más otro ELISA con antígenos recombinantes. Las técnicas de biología

molecular han mostrado una variabilidad importante y a la fecha sólo son de utilidad en

casos particulares. Se debe tener en cuenta que los valores predictivos, positivos o

negativos, varían en función de la prevalencia regional de la infección.

El 64% de los laboratorios de la RNLSP utiliza antígenos recombinantes (Formato: ELISA

50%, Aglutinación de partículas de gelatina (APG) 37.5% y prueba en mancha 12.5%), el

96% antígenos crudos (Formato: ELISA 68% y HAI 78.6) y el 7.0 % parasito integro

(Formato: IFI). El equipo requerido para realizar éstas técnicas depende del formato

seleccionado, en general se requiere de un lector de ELISA para placas completas con un

filtro de 450 nm y otro de referencia entre 600-650 nm, un lavador para placas completas,

un microscopio de fluorescencia, una incubadora, baño María (28-37°C) y micropipetas

multicanales y sencillas con volúmenes variables, además de todo el material requerido

especificado en el inserto del producto comercial, pero no incluido en los estuches de

diagnóstico.

Los procedimientos se deben realizar siguiendo las indicaciones del inserto que se

encuentra dentro del estuche de diagnostico para dar cumplimiento con la validación de

cada serie de muestras y sesión de trabajo. Cabe señalar que en el inmunodiagnóstico de

la enfermedad de Chagas, no existe ni una técnica, ni un suero de referencia nacional o

internacional.

El algoritmo de referencia del InDRE para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas, se

deriva de la modelación como árbol de decisión, en donde las muestras ingresadas tienen

una probabilidad a priori de ser reactivas o no, y depende del servicio solicitado es decir,

en una muestra referida para control de calidad se espera mayor certeza diagnóstica, ya




que la probabilidad a priori de ser reactiva es mayor que en una muestra que es referida

para diagnostico o referencia y es bajo esa condición que se desarrollo el algoritmo. Para

lo cual fue necesario considerar los métodos a utilizar, el orden de realización

(paralelo/serie), el momento de la toma de muestra y la interpretación apropiada de los

resultados.

Los métodos actualmente validados son: ELISA, Hemaglutinación indirecta (HAI) e

Inmunofluorescencia (IFI). No existen actualmente otras pruebas validadas para

diagnóstico de infección chagásica. Los parámetros para determinar la confiabilidad de un

método son: Sensibilidad (S), Especificidad (E) y Valor predictivo (VP). Estos últimos

dependen de la prevalencia de la infección.

Los laboratorios de la RNLSP deben tener disponibles al menos dos pruebas de formato

diferente. Estas pruebas son seleccionadas de acuerdo a la complejidad del laboratorio,

su infraestructura y la formación profesional de su personal operativo.

La ejecución de dos pruebas inmunoserológicas no garantiza un resultado definitivo, ya

que se pueden presentar algunas situaciones que es necesario conocer y resolver. El

valor umbral, valor crítico o valor de corte, es el punto C en la escala de medición

(densidad óptica ó razón S/Co; en donde S es la densidad óptica de la muestra estudiada

y Co es el valor de corte) que clasifica la muestra como positiva o negativa, este valor da

un sentido simple y práctico para interpretar el resultado: el valor Yi etiqueta al individuo

como libre de la enfermedad si Yi < C ó con la enfermedad si Yi > C. Sin embargo, esta

regla de decisión presenta una región de incertidumbre o zona gris, en la que los valores

no determinan si es positivo o no y se reportan como no concluyente (resultado

indeterminado). La zona de incertidumbre se determina en absorbancia como C ± 10%, y

de 0.9 a 1.1 para la razón S/Co. Estos valores están descritos en el inserto del equipo de

diagnóstico utilizado. Un ejemplo de situaciones especiales sería:

Tabla 3 Algoritmo de dos pruebas, interpretación en paralelo, resultados esperados y su interpretación.

METODO RESULTADO

ELISA + - + -

IFI + - - +

Interpretación: Reactivo No Reactivo Discordante Discordante




a. Situación: caso discordante: Decisión en el laboratorio:

Repetir la prueba con la misma muestra.

Referir a referencia, LESP o InDRE.

Solicitar una nueva muestra, en aproximadamente mes y medio. Decisión del médico

No considerar como infectado.

Explicar al paciente que las pruebas de laboratorio tienen limitaciones y hay que valorar con base a la clínica y la epidemiologia.

b. Situación: caso no concluyente (indeterminado, zona gris):

Los valores de densidad óptica se sitúan muy cerca del punto de corte (±10%), el resultado no debe considerares positivo o negativo, se debe reportar como indeterminado.

Decisión en el laboratorio:

Repetir la prueba con la misma muestra.

Referir a referencia, LESP o InDRE.

Solicitar nueva muestra, en aproximadamente tres semanas. Decisión del médico:

No considerar como positivo o negativo.

Explicar al paciente que las pruebas de laboratorio tienen limitaciones analíticas.




Figura 3. Algoritmo Inmunodiagnóstico

2. DIAGNÓSTICO PARASITOLOGICO

El Laboratorio juega un papel determinante en el diagnóstico de la Enfermedad de

Chagas sin embargo, este diagnóstico debe ser integral y por ello también, se deben

evaluar los datos clínicos, y epidemiológicos de la infección. Existen tres aspectos

fundamentales deben ser considerados al realizar un análisis: ¿Cuándo realizarlo?, ¿Qué

tipo de análisis se debe realizar? y ¿Cuáles son los objetivos del análisis?

La demostración de la presencia del parásito, T. cruzi, es el diagnóstico indiscutible de

infección chagásica pero solo se recomienda practicarlo, en la etapa aguda de la

enfermedad es decir, entre los 7 a 15 días de manifestaciones clínicas ya que en las

etapas indeterminada y crónica de la enfermedad la sensibilidad puede ser menor al 50%.

Como en otras enfermedades infecciosas, se presenta un periodo de ventana que es

imprescindible conocer para evitar la utilización de métodos de diagnóstico en momentos

inadecuados y obtener resultados falsos positivos. Al término del periodo de ventana

comienza la fase aguda en donde las pruebas diagnósticas parasitológicas pueden




alcanzar una sensibilidad superior al 95%. Conforme progresa la infección (después del

día 15), la sensibilidad de las pruebas diagnósticas decae hasta el 50%. Los métodos de

elección para la detección del parásito durante la fase aguda son aquellos que requieren

procesos de al menos 3 horas. El xenodiagnóstico, el hemocultivo y la utilización de

animales de experimentación solo se recomiendan para confirmar la presencia del

parásito en las fases indeterminada y crónica. En la siguiente tabla se presentan ventajas

y desventaja de las diferentes técnicas de diagnóstico:

Tabla 4. Ventajas y desventajas de las técnicas de diagnóstico, parasitológico de la Enfermedad de Chagas

Técnica Ventajas Desventajas

Frotis, Gota gruesa

1. Resultado temprano 2. Certeza diagnóstica 3. Sencillez operativa 4. Bajo costo

Sensibilidad cercana al 60% en el período agudo y 10% en el período crónico.

Microhematocrito fluorescente

1. Elevada sensibilidad 2. Certeza diagnóstica 3. Facilidad en la obtención

de la muestra 4. Bajo costo

Sensibilidad de 90% a 100% en el período agudo, no valorada en crónico.

Hemocultivo


de la muestra 8. Bajo costo

9. Sensibilidad de 90% a 100% en el período agudo, en crónico 20-50%.

10. Requiere experiencia del operador. Contaminaciones por hongos o bacterias.

Inoculación en ratón


de la muestra 14. Se incrementa costo

15. Sensibilidad de 90% a 100% en el período agudo, en crónico 20-50%.

16. Requiere experiencia del operador.

17. Infraestructura compleja como por ejemplo un bioterio, gabinetes de bioseguridad, etc..




Los métodos parasitológicos convencionales permiten detectar al parásito, y

consecuentemente efectuar el diagnóstico de certeza, prácticamente en el 95% de los

casos durante el período agudo.

Figura 4. Algoritmo diagnóstico parasitológico fase aguda

1. Frotis sanguíneo (CLAVE: 1D2612002: Identificación morfológica del agente en

muestras de sangre)

Esta técnica se utiliza también para detectar otros protozoarios hemáticos. En el caso de

T. cruzi se observan los tripomastigotes como estructuras alargadas en forma de "S" o "C"

entre los eritrocitos. Los frotes deben de ser lo suficientemente delgados para poder leer

un texto a través de la extensión. Los portaobjetos deben estar limpios y desgrasados.

a. Material y equipo




Alcohol metílico grado reactivo

Colorante de Giemsa

Lancetas

Microscopio

Portaobjetos

Solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2

Torundas de algodón humedecidas en alcohol etílico al 70%.

Torundas de algodón secas

b. Procedimiento

1. Realizar la punción digital.

2. Desechar la primera gota de sangre y limpiar con una torunda de algodón seca.

3. Obtener una segunda gota de sangre y colocarla sobre la mitad de una de las caras

de un portaobjetos desengrasado.




4. Colocar frente a la gota un portaobjetos auxiliar en un ángulo de 45°, sujetarla por

sus bordes mayores.

5. Proceder a extender la muestra con un movimiento uniforme hacia el extremo libre

del portaobjeto, hasta terminar el extendido.

6. Dejar la preparación sobre una superficie horizontal hasta que se seque (protegerla

de polvo, moscas y otros insectos).

7. Identificar el extendido escribiendo con lápiz sobre la sangre el nombre, edad y sexo

del paciente. El frote siempre se deberá fijar con alcohol metílico antes de enviar.




8. Para fijar el extendido, introducir la parte correspondiente al frote en un recipiente de

boca ancha conteniendo alcohol metílico sin diluir, escurrir el alcohol excedente, sin

que se moje la gota gruesa.

9. Colocar el portaobjeto sobre una superficie horizontal hasta que seque.

10. Teñir con Giemsa como se indica en el procedimiento de tinción de la gota gruesa.

Puntos críticos

Realizar el extendido de manera uniforme. Evitar que se moje la gota gruesa con el

alcohol metílico. Usar portaobjetos limpios y desengrasados.

2. Gota gruesa (CLAVE: 1D2612002: Identificación morfológica del agente en

muestras de sangre)

Es un método de concentración para buscar parásitos sanguíneos y tiene mayor

sensibilidad que el examen directo y el frote. Es indispensable hemolizar la muestra

sanguínea para que los eritrocitos acumulados no impidan la observación de los

parásitos.

a. Reactivos, material y equipo

Lancetas estériles desechables

Microscopio

Portaobjetos

Torundas de algodón con alcohol etílico al 70 %

b. Procedimiento

1. Obtener otra gota de sangre de la misma punción de donde se obtuvo la anterior, para

el frote sanguíneo (punto anterior).




2. Obtener la muestra del dedo apretándolo suavemente por sus bordes laterales hacia

su extremo.

3. Sobre la misma cara del portaobjetos donde se hizo el extendido sólo que en la parte

media libre, colocar otra gota de sangre más grande que la anterior.

4. Con el ángulo de un portaobjeto auxiliar y con movimientos circulares se extiende la

gota en un cuadro de más o menos 2 cm por lado.

5. Dejar la preparación sobre una superficie horizontal hasta que se seque, abanicar con

la mano para obtener un secado más rápido (protegerla del polvo, moscas y otros

insectos).

Punto crítico

La gota gruesa no se debe poner en contacto con alcohol metílico por lo que se debe

cuidar de no introducir la porción del portaobjetos con la gota gruesa en el alcohol, ni dejar

que escurra el fijador sobre de ella.

Tinción

Preparar la solución de trabajo del colorante Giemsa con solución amortiguadora de

fosfatos realizando una dilución 1:10 de la solución madre.

1. Cubrir las láminas con la solución de trabajo y dejar teñir durante 30 minutos.

2. Transcurrido el tiempo de tinción lavar el frote con agua de la llave.

3. Colocar sobre una superficie horizontal hasta que se seque.

Punto crítico

El tiempo de tinción debe de estandarizarse cada vez que se prepara colorante.

Lectura

1. Enfocar primero la gota gruesa, utilizando los objetivos de menor a mayor aumento.

2. Cubrir con aceite de inmersión ambas muestra teñidas, hasta conseguir una imagen

nítida con el objetivo de inmersión.

3. Emplear filtro azul.




4. Buscar sistemáticamente la presencia del parásito en todo el portaobjeto hasta

asegurarse de dar un resultado final correcto.

5. Observar todos los campos microscópicos de ambas muestras antes de emitir un

resultado negativo.

3. Microhematocrito fluorescente (QBC)* (CLAVE: 1D2612001: Identificación rápida

en sangre (microhematocrito fluorescente)

El sistema de microhematocrito fluorescente (QBC) es un método de diagnóstico

cualitativo de alta sensibilidad para detectar rápidamente la presencia de parásitos

hemáticos como plasmodios, tripanosomas y microfilarias en sangre capilar o venosa,

centrifugada. La capa de leucocitos y plaquetas que se forma en los tubos capilares con

sangre, al ser centrifugados, se expande en una capa delgada alrededor del flotador

cilíndrico de alta precisión introducido en el tubo capilar, formando tres estratos celulares.

El sistema utiliza anaranjado de acridina para teñir las nucleoproteínas celulares, y la

fluorescencia de los componentes incrementa su visibilidad. Se observan en la parte

superior (hacia el plasma) las plaquetas anaranjado-amarillentas, en la capa media los

linfocitos y monocitos de tono verde y en la capa inferior se localizan los granulocitos

amarillos y debajo de los granulocitos, se encuentra el paquete de glóbulos rojos.

Los tripomastigotes sanguíneos del T. cruzi se ubican en la inter fase de plaquetas y

plasma, se observan teñidos de color verde tenue en su citoplasma, pero de un tono

verde fuerte el núcleo y el cinetoplasto.

a. Equipo

Equipo de Microhematocrito fluorescente (QBC) de Becton Dickinson

b. Procedimiento

1. Llenar el tubo capilar por el extremo más cercano a las dos líneas azules, con sangre

capilar o venosa, hasta las marcas azules.

2. Girar el tubo entre los dedos índice y pulgar para mezclar con el anticoagulante.

3. Inclinar el tubo hacia el extremo libre y girar para mezclar con el naranja de acridina.




4. Colocar el tapón en el extremo más alejado a las líneas azules.

5. Introducir el flotador con las pinzas.

6. Identificar el tubo con su clave correspondiente, colocando la etiqueta entre las líneas

blancas.

7. Centrifugar durante 5 minutos a 14000 rpm.

8. Colocar los tubos en una gradilla con el tapón hacia abajo.

9. Se pueden conservar hasta tres días a temperaturas de entre 16°C a 37 °C.

10. Colocar el capilar en el porta tubo y este a su vez en la platina del microscopio.

11. Agregar una o dos gotas de aceite de inmersión sobre el tubo capilar.

12. Enfocar la capa de leucocitos con el objetivo especial.

13. Buscar las formas parasitarias en la interface correspondiente.

Puntos críticos

La lectura debe ser inmediatamente después de la centrifugación, de lo contrario se

puede producir lisis del tripomastigote.




Figura 5. Algoritmo diagnóstico parasitológico fase crónica.




4. Hemocultivo [CLAVE: 1D2612004: Aislamiento a partir de muestras de sangre

(cultivo)]

Es un método de diagnóstico parasitológico que permite la reproducción del parásito. La

sensibilidad en los casos agudos es cercana al 100%, pero en las fases indeterminada y

crónica puede disminuir hasta el 50%.


Caldo infusión cerebro corazón estéril

Centrífuga clínica

Gradillas para tubos de ensaye

Heparina

Incubadora (28ºC)

Jeringas estériles desechables de 20 mL con aguja

Microscopio

Pipetas Pasteur

Portaobjetos y cubreobjetos

Tubos de ensayo con medio de Warren

b. Procedimiento

1. Utilizar medio de cultivo de Warren en condiciones de esterilidad.

2. Extraer 10-20 mL de sangre por punción venosa en un tubo con heparina.

3. Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos.

4. Separar el plasma en otro tubo y por separado tomar el paquete de leucocitos.

5. Mezclar el paquete de leucocitos con 10 mL de caldo infusión cerebro corazón.

6. Sembrar 2.0 mL de la suspensión celular anterior en medio de cultivo de Warren en

cinco tubos diferentes.

7. Cerrar perfectamente los tubos sembrados e identificar con claridad cada uno de

ellos.

8. Agitar suavemente cada tubo inclinándolo 90 º (no provocar burbujas).

9. Incubar los tubos sembrados a 28°C durante 8 días.




10. Para la revisión de los cultivos, extraer con ayuda de una pipeta Pasteur estéril una

gota del medio de cultivo que se coloca entre portaobjetos y cubreobjetos para

observar al microscopio con objetivo de 40x.

11. Revisar al microscopio cada tubo de cultivo y hacer resiembra por duplicado, se

continúa cultivando y se revisan los tubos cada 15 días por un periodo de 3 meses.

12. Descartar los tubos que continúen negativos después de este tiempo. Esterilizar y

lavar.

Interpretación

Se da como positivo el hemocultivo cuando se detectan las formas móviles características

del flagelado en su fase de epimastigote en las preparaciones de los medios de cultivo

sembrados.

Puntos críticos

Evitar la dispersión del paquete leucoplaquetario después de la centrifugación. No retirar

en su totalidad el plasma, dejar de 2 a 3 mm del plasma, por arriba del paquete.

Preparación del Medio de Warren.

Materiales

Agar nutritivo al 2.8%, estéril.

Caldo de infusión cerebro corazón (BHI) según instrucciones del fabricante,

Sangre desfibrinada de conejo, estéril.

Suero fetal de ternera (SFT), descomplementado.

Gentamicina 200X.

Preparación

5. Esterilizar los medios de cultivo, agar nutritivo y BHI, a 15 Lb de presión durante 15

minutos en autoclave.

6. Mantenga la temperatura del agar nutritivo a 45 °C y agregue sangre de conejo, 5%

v/v.




7. Envasar 3.0 mL de medio en tubos de ensaye para cultivo con tapón de rosca de

16x150, estériles.

8. Colocar los tubos a una inclinación de 10° hasta que se solidifique el agar.

9. Hacer pruebas de esterilidad a 28°C por 24 horas.

10. Complementar el caldo de infusión cerebro corazón, al 1%, con suero fetal de ternera

al momento de hacer la siembra del medio de cultivo. Adicionar gentamicina a una

concentración final de 5 µg/mL de BHI.

5. Modelo experimental (CLAVE: 1D2612005: Aislamiento a partir de muestras de

sangre [inoculación en ratón)]

Los animales más utilizados son los ratones Balb/c jóvenes (seis semanas de vida). Antes

de inocular a los ratones es importante estar seguros que no están infectados con

Trypanosoma lewisi, por tinción en sangre del ratón y observación al microscopio Se

recomienda utilizar un lote de seis ratones por paciente.


Colorantes de Giemsa

Jeringa desechable estéril de 5mL con aguja

Microscopio

Portaobjetos y cubreobjetos

Solución salina isotónica

Tijeras

Tubo o frasco estéril con heparina

Torundas de algodón con alcohol yodado

Jeringas de insulina




b. Procedimiento

1. Obtener una muestra de sangre del paciente por punción venosa previa asepsia del

área de la toma de muestra, con alcohol yodado. No retirar el capuchón de protección

de la aguja hasta el momento de realizar la punción.

2. Cerca de un mechero o lámpara de alcohol depositar la sangre en un tubo o frasco

estéril que contenga anticoagulante (heparina, es el producto de elección).

3. Inocular a los animales inmediatamente después de tomar la muestra, con 0.2 mL a 0.3

mL de sangre por vía intraperitoneal a cada animal. Si la muestra no se puede procesar

de inmediato, conservar la muestra de sangre en refrigeración hasta su procesamiento.

El tiempo de almacenaje puede ser hasta de 48 horas.

4. Mantener los animales inoculados con agua y alimento a libre demanda en

condiciones de bioterio, es decir temperatura y humedad controladas entre otras.

5. Ocho días después de la inoculación, practicar un corte en la porción distal de la cola

del ratón.

6. Realizar un examen directo, que consiste en la observación al microscopio entre porta

y cubre buscando al parásito por el movimiento de este y en otro portaobjetos hacer

un frotis y gota gruesa.

7. A los 15 días después de la inoculación practicar un nuevo corte en la porción distal

de la cola del mismo ratón.

8. Realizar un examen directo de la sangre y en otro portaobjetos hacer un frotis y gota

gruesa.

Nota:

Si se muere el ratón extraer en condiciones estériles la sangre por punción cardiaca para

inocular otro ratón; obtener corazón, diafragma, intestino, esófago e hígado, lavarlos con

solución salina estéril. Tomar improntas, seccionar y hacer cultivo de cada órgano en

medio de Warren.

Puntos críticos

Asegurarse de inocular en cavidad peritoneal. Saber manejar animales de laboratorio.




INFECCION CONGÉNITA O CONNATAL. El diagnostico de infección congénita se realiza por métodos parasitológicos a partir del

nacimiento y durante los primeros meses de vida, y por métodos inmunoserológicos, a

partir de los 9-12 meses (Consenso de Cochabamba).

La observación del parásito confirma el diagnóstico, mientras que la detección de

anticuerpos es enmascarada por los anticuerpos maternos. En estos casos, aplicar el

algoritmo de diagnóstico parasitológico de fase aguda, en el nivel hospitalario. Se

recomienda el uso de microhematrocrito o micro Strout. Es necesario recurrir a las curvas

serológicas, que presentan la cinética de los niveles de IgG sérica. Existen dos

comportamientos de las curvas serológicas, a) si el niño nace infectado, mantendrá o

incrementará los niveles de anticuerpos durante el primer año de vida, b) si la positividad

se deba a la presencia de anticuerpos maternos el catabolismo elimina la IgG materna y

los títulos de anticuerpos caerán hasta la negatividad entre los 6 y 12 meses de vida. Las

muestras enviadas al InDRE para este fin, deben ser claramente identificadas.




Figura 6. Cinética de anticuerpos de la clase IgG en hijo infectado de madre chagásica

desde el nacimiento y por trimestre durante el primer año de vida.

Tabla 5. Posibles escenarios epidemiológicos durante el primer año de vida del hijo de

madre chagásica

Grupo Parasitología Serología Interpretación

diagnóstica RN * 1er año RN 3-6 m 9-12 m

1 + --------- + + + Infección congénita

2 - + + + +

Infección de origen no confirmado*

(Vectorial, transfusional, digestiva)

3 - - + + + Infección de origen no confirmado*

4 - - + ± - Ausencia de infección

* El diagnóstico parasitológico se puede realizarse en el momento del nacimiento, o durante el primer año de vida. Para confirmar infección congénita debe detectarse el parásito y descartar cualquier otra posible vía de infección.

Es importante considerar que la experiencia sudamericana recomienda, que cualquiera

haya sido la vía de infección, el tratamiento es efectivo mientras más temprano se

administre; en nuestra experiencia, se recomienda administrarlo antes de los tres años de

vida, por lo cual resulta importante realizar el diagnóstico lo más precozmente posible.

1

10

100

1000

0 3 6 9 12

TITU

LO D

E A

c

TIEMPO (meses)

Cinética de IgG

Hijo Madre




SEGUIMIENTO DE TRATAMIENTO

El tratamiento etiológico en la enfermedad de Chagas está dirigido a eliminar el parásito

del organismo del hospedero y evitar la aparición y/o progresión de lesiones. Las

indicaciones para el tratamiento etiológico en la enfermedad de Chagas, propuestas por la

OMS y el consenso de la comunidad científica son para: todos los casos agudos, inclusive

los congénitos; individuos en quimioprofilaxia (accidentes, trasplantes); episodios de

reactivación;crónicos de baja edad y crónicos recientes y formas clínicas iniciales (en

carácter experimental).

Aunque la eficacia del tratamiento etiológico contra la infección por T. cruzi ha sido

demostrada, las herramientas para su evaluación son todavía de implementación e

interpretación complejas. Un tema importante que aun presenta controversias es la

definición de cura de pacientes que recibieron tratamiento etiológico. Hasta ahora, el

criterio universalmente aceptado es el obtenido por la conversión negativa de la serología

convencional. Sin embargo, las técnicas serológicas disponibles fueron diseñadas para el

diagnostico y no para evaluar la eficacia del tratamiento, ya que presentan diferentes

respuestas según el antígeno o mezcla de antígenos empleados, y el diseño de prueba

serológica a usar. El seguimiento serológico es prolongado y los resultados obtenidos son

en gran parte controversiales. Como criterios de evaluación del tratamiento (criterios de

cura), se investigan los cambios en la serología, la parasitemia y la evolución clínica;

mientras los primeros se pueden observar en meses, la evaluación clínica requiere años

de control. Otro inconveniente es en aquellos pacientes en quienes la enfermedad ha

evolucionado por lo menos 20 años y la evidencia de seroconversión sólo puedo

observarse muchos años más tarde. Hecho que ha desalentado a diversos grupos de

investigadores. En la actualidad, se recomienda utilizar la técnica de Reacción en Cadena

de la Polimerasa (PCR) para evaluar la eficacia pos-tratamientosin embargo, esta prueba

tiene un alto costo, requiere un laboratorio con alta tecnología y personal calificado, pero

sobretodo se requieren más estudios para su correcta aplicación.

Las muestras remitidas al InDRE para seguimiento de tratamiento deben estar bien

etiquetadas de acuerdo a criterios de aceptación y rechazo de muestras InDRE, las

muestras de seguimiento deben ser enviadas con justificación referencia, el volumen

mínimo de la muestra debe ser de al menos 1.0 mL.




ESTÁNDARES DE CALIDAD

El tiempo máximo para el reporte de resultados hasta finalizar con el algoritmo depende

del tipo de análisis solicitado. Para serología, el estándar de diagnóstico es de 10 días

hábiles, para control de calidad y referencia es de 15 días hábiles. Para diagnóstico

parasitoscópico: Frotis/Gota gruesa / hematocrito fluorescente tres horas caso agudo.

Hemocultivo e inoculación en ratón 90 días hábiles.

CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Y RECHAZO

1. La muestra de sangre total para el aislamiento, frotis, gota gruesa o microhematocrito

fluorescente, en volumen apropiado, deberá acompañarse del formato F-REM-01, del

resumen de historia clínica y de la solicitud del estudio. Para laminillas (Frotis o gota

gruesa) el requisito es el mismo.

2. La falta de alguno de estos documentos causa rechazo, la muestra quedará en

resguardo. Se notificará al usuario y contará con un periodo de siete días para enviar

la documentación complementaria, de no ocurrir se rechazará definitivamente y se

notificará al usuario o responsable del envío vía fax.

3. La muestra no deberá estar contaminada o contener alguna sustancia interferente. Si

sucede, la muestra será rechazada de manera definitiva y se notificará al usuario o

responsable del envío vía fax.

4. La laminilla (frotis o gota gruesa) deberá venir rotulada y no deberá estar rota, si

sucede, será rechazada y se notificará al usuario o responsable del envío vía fax.

5. El diagnóstico parasitológico de la tripanosomiasis americana seguirá el algoritmo.

Para el aislamiento los resultados serán emitidos 90 días después de recibida la

muestra, para hematocrito fluorescente, frotis y gota gruesa los resultados serán

emitidos tres horas después de recibida la muestra.

6. En casos especiales, si la muestra no cumple con los criterios de calidad biológica

pero el usuario considera que la muestra es de alto valor deberá notificarlo al

Laboratorio de Enfermedad de Chagas por escrito en la solicitud o formato y aceptar

que el resultado debe ser interpretado con cautela, quedando el laboratorio del InDRE

libre de toda responsabilidad legal.




CAPTURA DE DATOS Y RESULTADSOS

La captura de los datos en la plataforma Info-Lab InDRE se realizará de acuerdo a la

capacitación recibida por el departamento de recepción de muestras.

PROGRAMA DE EVALUACION EXTERNA DEL DESEMPEÑO (PEED) SEROCHAGAS

El Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) genera información de

orden nacional, integrando y siendo rector de la Red Nacional de Laboratorios de Salud

Pública, en materia de diagnóstico, investigación y desarrollo tecnológico para la vigilancia

epidemiológica, para la toma de decisiones en el control de enfermedades y la

formulación y orientación de los programas nacionales de salud.

En este sentido en el Instituto, uno de nuestros compromisos es que el InDRE y la RNLSP

generen información confiable y oportuna para la toma de decisiones en apoyo de la

vigilancia epidemiológica y los Programas Nacionales de Salud, en apego a la normativa

vigente y las buenas prácticas de laboratorio.

En el 2001, el diagnóstico serológico de la enfermedad de Chagas fue incorporado al

marco analítico básico de los Laboratorios Estatales de Salud Pública, quienes en agosto

de 2008 ratificaron la importancia de fortalecer su aplicación en todo el país. Dos meses

después, en octubre de 2008, se inició el Programa de Evaluación Externa del

Desempeño del Diagnóstico Serológico de la Enfermedad de Chagas para los laboratorios

de apoyo a la salud pública en México, con la participación de los LESP que incluyeron

la(s) prueba(s) en el marco analítico estatal registrado en el InDRE y/o participaron en las

actividades de control de calidad del InDRE así como de laboratorios universitarios y de

centros de investigación que realizan el diagnóstico serológico o desarrollan nuevos

antígenos para el mismo fin. Con esta base, el Programa de evaluación externa del

desempeño (PEED) para serología de Chagas se suma al esfuerzo institucional de

evaluar el desempeño de los laboratorios de la RNLSP y contribuir al mejoramiento del

serodiagnóstico de este padecimiento.

ENVÍO DE PANELES DE EFICIENCIA

El laboratorio de Chagas del InDRE es el organizador de PEED_SEROCHAGAS y se

encarga de:




Producir el panel de sueros con respaldo documentado de las características de

reactividad de cada muestra,

Embalar el panel en condiciones óptimas para el envío a los laboratorios participantes,

incluyendo instrucciones detalladas para el manejo del mismo.

Elaborar los reportes de resultados y enviarlos a los participantes.

Mantener la confidencialidad de los laboratorios participantes mediante una clave

única.

Se envía un panel de sueros obtenidos de plasma por procedimientos estandarizados,

utilizados por expertos colaboradores de la OMS.. Contiene muestras con positividad para

el marcador de enfermedad de Chagas y negativas para todos los marcadores virales

utilizados en el tamizaje en banco de sangre.

Se trata de un panel de 12 sueros, caracterizados con todas las pruebas de algoritmo

diagnóstico del InDRE (HAI, IFI, ELISA, WB) y los estuches comerciales disponibles

actualmente en el mercado nacional.

El envío de un primer panel será la segunda semana de marzo del año en curso, y el

segundo envío será en segunda semana de septiembre del año en curso.

CAPTURA DE DATOS Y RESULTADOS

Los resultados deberán ser registrados en el formato CHAG-F-21, el cual se encuentra en

la hoja electrónica del InDRE, en la sección correspondiente al Departamento de

Parasitología (http://www.cenavece.salud.gob.mx/indre/interior/dpto_parasitologia.html).

Se recomienda descargarlo en formato de Excel, no guardarlo como imagen, para facilitar

su llenado y leer cuidadosamente el instructivo de llenado que se encuentra en el mismo

archivo. Una vez completado el formato en Excel deberá ser enviado vía electrónica a

[email protected] y [email protected], en la fecha y hora

acordadas.

El formato impreso y firmado en original, deberá ser enviado por oficio a la Dirección

General Adjunta del InDRE con atención al Director General:

http://www.cenavece.salud.gob.mx/indre/interior/dpto_parasitologia.html

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]




INFORME DE RESULTADOS PEED SEROCHAGAS A RNLSP

Los resultados serán expresados en resultados concordantes, resultados falsos positivos

y falsos negativos los cuales se presentarán en cuadros y gráficos, con las cifras globales

e individuales.

Se realizará un informe preliminar con los resultados de concordancia por participante

será enviado a cada participante cuatro semanas después de la entrega de resultados a

InDRE. El objetivo de este informe preliminar es recibir comentarios y aclaraciones por

parte de los laboratorios participantes de la RNLESP

El informe final detallado se envía cuatro semanas después el envío del informe

preliminar.

CRITERIOS PARA LA LIBERACIÓN DEL DIAGNÓSTICO Adquiere la liberación diagnóstica el LESP si cumple:

1. Tener establecido un algoritmo de diagnóstico (par serológico), con un diseño en

paralelo, con pruebas de alto desempeño, una debe utilizar antígenos totales como

fuente de antígeno y la otra antígenos recombinantes.

2. Participar en el PEED SEROCHAGAS por tres ciclos seguidos con una calificación ≥

95%.

3. Tener concordancia (C) en el VCE ≥ 90%.

4. Participar en el Curso-Taller anual

5. Tener una calificación (C+PEED)/2 ≥ 95 %.

Mantiene su liberación diagnostica el LESP si cumple:

1. Todo lo anterior

2. Envío del 90% de muestras positivas de acuerdo a:

(No de muestras recibidas InDRE / No de muestras reportada en SIS) x 100

3. Envío del 10% de muestras negativas de acuerdo a:

(No de muestras recibidas InDRE / No de muestras reportada en SIS) x 100




Pierden su liberación diagnóstica el LESP si no cumple:

1. Alguno punto de lo señalado anteriormente.

2. Si el LESP requiere confirmar su desempeño técnico, debe solicitar un nuevo panel,

cuyo costo es de acuerdo al tabulador vigente. El panel deberá ser solicitado dentro de

los siguientes 10 días hábiles, después de haber recibido el informe final. Cabe

mencionar que la calificación obtenida en este panel no será tomada en cuenta para el

Boletín Caminando a la Excelencia.

3. Concordancias no aceptables (<95%) en el segundo panel, requerirán de capacitación

y de establecer nuevamente el envío de muestras para realizar diagnóstico en el

InDRE.

BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO El objetivo de banco es obtener material de control y referencia con una calidad adecuada

que permita calibrar reactivos diagnósticos de elaboración propia, evaluar el desempeño

de equipos de diagnóstico comerciales y ser utilizado en protocolos de investigación.

Características de la muestra

La muestra debe se de al menos 1.0 mL.

La muestra debe ser fresca, si no es así asegurarse que ha sido conservada adecuadamente, de preferencia congelada a –20 ºC.

No lipémica.

No hemolizada,

No contaminada.

Si cumple lo anterior es fraccionada, etiqueta y congela a –60 ºC hasta su uso.

El material ingresado al banco se registra en una bitácora de control y seguimiento.

Respaldo documental

En Archivo del Banco de Sueros debe existir la historia clínica o formato único de envió

de muestras al InDRE y registro de los resultados del LESP como del InDRE.




CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES




BIBLIOGRAFIA 1. Chagas Congénito: Estrategias de diagnóstico y Control. 2007. 2da. Edición.

Cochabamba – Bolivia 2. Fierz, W.2004. Basic Problems of Serological Laboratory Diagnosis in: Methods in

Molecular Medicine, vol. 94: Molecular Diagnosis of Infectious Diseases, 2/e Edited by: Decker, J and Reischl. U. Humana PressInc.,Totowa, NJ.

3. Guzmán Bracho C, Floriani Verdugo J, Pastén Sánchez S y col. 2000. Manual de

procedimientos para laboratorios de diagnóstico de enfermedad de Chagas o tripanosomosis americana. Secretaria de Salud. InDRE, México.

4. Guzmán Bracho C. 2001. Epidemiology of Chagas disease in Mexicoanupdate.

TRENDS in Parasitology. 17(8)372-376. 5. Luquetti AO, Rassi A 2002. Conferencia: Perspectiva del uso de la serología (Ag

naturales y otros) en la evaluación de la eficacia del tratamiento etiológico. Available from URL: http://www.fac.org.ar/fec/chagas2/llave/c003/luque.htm.

6. Luquetti AO. 2007. Diagnóstico de la enfermedad de Chagas: Diagnóstico serológico,

xenodiagnóstico, hemocultivo, reacción en cadena de la polimerasa y examen directo. En: Enfermedad de Chagas. Sociedad Colombiana de Cardiología y Cirugía Cardiovascular. 1ª Ed.Pág. 25-31.

7. Luquetti AO., Rassi A.2007. Tratamiento etiológico de la enfermedad de Chagas.

Experiencia en Brasil. En: Enfermedad de Chagas. Sociedad Colombiana de Cardiología y Cirugía Cardiovascular. 1ª Edición, Pág. 145-148.

8. NOM-032-SSA2-2010, para la vigilancia epidemiológica, prevención y control de

enfermedades transmitidas por vector. 9. PasténSanchéz S. 2003. Manual de Técnicas de Laboratorio. Laboratorio de

Enfermedad de Chagas. InDRE, México. 10. Secretaria de vigilânciaemsaúde do ministério da saúde:Consenso brasileiro

emdoença de chagas. 2005. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical Vol. 38 (Sup. III). 1-30.

11. WHO. 2000. Control of Chagas Disease: second report of the WHO expert committee.

Geneva. 12. WHO. 2003. Manual of basic techniques for a health laboratory. 2nd ed. Geneva. 13. WHO. 2005. Reporte del grupo de trabajo científico sobre la enfermedad de Chagas.

TDR/GTC/06. Geneva.

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14. WHO.2007. Consultation on International Biological Reference Preparations for Chagas Diagnostic Test. Switzerland.

15. WHO.2010. Anti-trypanosoma cruzi assays: operational characteristics. Diagnostics

and Laboratory Technology. Geneva. 16. WHO. 1991. Control of Chagas Disease. Report of a WHO Expert Committee. WHO

Tech. Rep. Ser. 811. 17. Schmunis G.A. 1999. Iniciativa del Cono Sur. Proceedings of the second International

Workshop on Population Genetics and Control of Triatominae. Tegucigalpa, Honduras. INDRE, México City. Pp.26-31.

18. Hoffman C. 1928. Nota acerca de un probable transmisor de la tripanosomiasis humana en el Estado de Veracruz. Rev Mex Biol 8,12-18

19. Mazzotti L. 1940. Dos casos humanos de enfermedad de Chagas en el estado de Oaxaca. Gac. Méd. Mex (Méx). 70, 417-420.

20. Pinto Dias JC. 1992. Epidemiology of Chagas' disease In: Chagas' disease (American Trypanosomiasis): Its impact on transfusion and clinical medicine. Wendel S, Brener Z, Camargo ME, Rassi A (editors). ISBT Brazil'92, Sao Paulo, Brazil. pp 49-80.




Anexo I: CARACTERISTICAS DE EQUIPOS COMERCIALES

EQUIPOS DISPONIBLES EN MEXICO

ESPECIFICACIONES TECNICAS

RENGLÓN o PARTIDA

No. CONCEPTO

DESCRIPCIÓN Y PRESENTACION DEL PRODUCTO

MARCA NUMERO

DE CATÁLOGO

UNIDAD DE MEDIDA

1

Ensayo inmunoenzimático (EIA) para la detección de anticuerpos IgG de Trypanosoma cruzi en suero humano. Chagascreen, ELISA

Bio-Rad, S.A. México

150101 Estuche para 96 pruebas

2 Método de aglutinación de particulas para la detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi. SERODIA Chagas, APG

Fujirebio Diagnostics, Inc.

227442 Estuche para 100 pruebas

3 Prueba de Hemaglutinación Indirecta para la detección de anticuerpos contra T.cruzi Chagatest HAI

Wiener Lab. 1293205 Estuche para 96 pruebas

4 Estuche para la determinación de anticuerpos anti Trypanosoma cruzi. Chagatest ELISA.


5 Estuche para la determinación de anticuerpos anti Trypanosoma cruzi. Chagatest ELISA recombinante V 3.0.


6 Ensayo inmunoenzimatico en mancha. ImmunoComb II Chagas Ab.

Orgenics 60481002 Estuche para 36 pruebas

7

Ensayo inmunoenzimático en fase sólida para la detección de anticuerpos séricos dirigidos contra el Trypanosoma cruzi. TEST ELISA PARA CHAGAS III

bIOSChile Estuche para 96 pruebas

8 Prueba de ELISA para la detección cualitativa de anticuerpos totales de Trypanosoma Cruzi en suero o plasma humano. Bioelisa CHAGAS

Biokit bioELISA 3000-1236 Estuche para 96 pruebas

9

Estuche de Diagnóstico. Prueba de Hemoaglutinación indirecta para la determinación de anticuerpos contra el T. cruzi en muestras de suero y plasma. Chagas HAI.

Accutrack ACHAI-96 Estuche para 96 pruebas

10

Estuche de diagnóstico. Prueba Microelisa para la determinación de anticuerpos contra T. cruzi, en muestras de suero y plasma. Chagas Microelisa Test System.

Accutrack ACHMT-96 Estuche para 96 pruebas

11 Prueba de hemaglutinación indirecta para la detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi. CHAGAS/HAI

Interbiol, México INB 105 Estuche para 96 pruebas

12 Estuche de diagnóstico. Prueba de ELISA Para la detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi. Enzyme-Chagas.

Interbiol, México INZ105 Estuche para 96 pruebas

13

Ensayo inmunoenzimático (EIA) para la detección de anticuerpos IgG de Trypanosoma cruzi en suero humano. Pathozyme Chagas, ELISA

Omega Diagnostics

OD147 Estuche para 96 pruebas




Anexo II: PREPARACION DE REACTIVOS

Otra

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Lineamientos chagas oct_2012

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