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ACTUALIZACIN EN NUTRICIN VOL 14 - N 4 - DICIEMBRE 2013 ACTUALIZACIONES MONOGRFICAS

Lisozima: Actividad antibacteriana y alergenicidad

Lysozyme: Antibacterial Activity and Allergenicity

Wilman Carrillo

Instituto de Investigacin en Ciencias de la Alimentacin (CIAL-CSIC-UAM) Madrid- Espaa.

Resumen Desde que la lisozima fue descubierta por Alexander Fleming en 1922, muchos son los trabajos que se han lleva-do a cabo para describir las distintas actividades biolgicas de esta protena como son su actividad antibacteria-na, antiviral, antinflamatoria, analgsica, antitumoral y antioxidante. Su actividad antibacteriana frente a bacte-rias Gram-positivas es la actividad ms ampliamente estudiada. Muchas investigaciones se han realizado paraampliar el espectro antibacteriano y poder atacar bacterias Gram-negativas. Se han llevado a cabo modificacio-nes trmicas, qumicas, enzimticas, mutaciones genticas y efectos sinrgicos con otros compuestos, y se con-sigui exitosamente ampliar el espectro antibacteriano, proponiendo en todos los casos que dicha actividad esindependiente de su actividad enzimtica natural. En este trabajo destacamos todas las propiedades estructura-les de la lisozima y sus principales actividades biolgicas y las investigaciones que se han llevado a cabo parapotenciar dichas actividades.

Palabras claves: Lisozima, Actividad muramidasa, Actividad antibacteriana y Pptidos antibacterianos.

Lysozyme: Antibacterial Activityand Allergenicity

SUMMARY

Since lysozyme was discovered by Alexander Fleming in1922, many papers have been published on the differentbiological activities of this protein, such as its antibacterial,antiviral, anti-inflammatory, analgesic, antitumor andantioxidant properties. Its antibacterial activity againstGram-positive bacteria is the most widely studied. Muchresearch has been done to widen the antibacterial spectrumand to attack the Gram-negative bacteria. Thermal, chemicaland enzymatic modifications, as well as genetic muta-tions and synergistic effects, with other compounds havebeen made. The antibacterial spectrum was successfullywidened in all cases, suggesting that this activity isindependent of its natural enzymatic activity. In thispaper we describe the structural properties of lysozymeand its main biological activities, and also the researchthat has been carried out to maximize these activities.

Key words: lysozyme, muramidase activity, antibacterialactivity, antibacterial peptides

Lisozima: Atividade antibacteriana ealergenicidade

RESUMO

Desde que a lisozima foi descoberta por AlexandreFleming em 1922, muitos so os trabalhos que foramrealizados para descrever as diferentes atividades biolgicasdesta protena, como so sua atividade bacteriana, antiviral,anti-inflamatria, analgsica, antitumoral e antioxidante.Sua atividade antibacteriana frente a bactrias Gram-positivas a atividade mais amplamente estudada.Muitas pesquisas foram realizadas para ampliar o espectroantibacteriano e poder atacar bactrias Gram-negativas.Foram realizadas modificaes trmicas, qumicas,enzimticas, mutaes genticas e efeitos sinrgicos comoutros compostos, e obteve-se com sucesso ampliar oespectro antibacteriano, propondo em todos os casosque tal atividade independente da sua atividade enzimticanatural.Neste trabalho destacamos todas as propriedades estruturaisda lisozima e suas principais atividades biolgicas e aspesquisas que foram realizadas para potenciar tais atividades.Palavras-chaves: Lisozima, Atividade muramidase,Atividade antibacteriana e Pptidos antibacterianos.

English Portugus

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LISOZIMA: ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y ALERGENICIDAD

WILMAN CARRILLO

La lisozimaLa lisozima, tambin conocida como muramidasa (N-acetil muramidaglicano hidrolasa, E. C. 3. 2.1. 17), fuedescubierta en 1922 por Alexander Fleming. Es la pri-mera protena de la que se dispuso de su secuenciapor cristalografa de rayos-X, adems la primera enzi-ma de la que se determin su mecanismo enzimticogracias a David Phillis en 1966 (Jolls y Jolls, 1984).Desde su descubrimiento esta protena ha jugado unpapel muy importante en los modelos enzimticos, yen muchos aspectos de la biologa moderna, incluyen-do la qumica de protenas, cristalografa, resonanciamagntica nuclear (NMR), inmunologa y plegamientode protenas (Chantal y col., 2007).La lisozima se encuentra en muchos organismos comovirus, insectos, anfibios, reptiles, aves y mamferos, pro-ducindose en multitud de tejidos y fluidos, incluyen-do huevos de aves, leche humana, lgrimas, saliva y esadems secretada por leucocitos polimorfonucleares(Niyonsaba y Ogawa, 2005).En los humanos, la lisozima juega un rol muy impor-tante en la defensa frente a las infecciones. En las lgri-mas se encuentra en cantidades comprendidas entre3.000 y 5.000 g/mL y protege frente a bacterias yvirus (Lesnierowski y col., 2007). En la saliva protegefrente una gran variedad de microorganismos comobacterias, virus y hongos de diferentes especies deCandida (Tenovuo, 2002; Samaranayake y col., 2008).Adems de la actividad antibacteriana, se han descritomuchas otras actividades biolgicas de la lisozima: porejemplo la actividad antiviral. La lisozima administradapor va oral y cutnea previene enfermedades de lapiel, como herpes simple y la varicela, debido a su acti-vidad antiinflamatoria (Sava, 1996). Se ha descrito queposee actividad frente al virus del VIH tipo 1 en ensa-yos in vitro (Lee-Huang y col., 1999), proponindosecomo mecanismo de accin, que la actividad antiviralpuede estar asociada con su carga positiva y las inter-acciones con la superficie del virus cargadas negativa-mente (Losso y col., 2000).Se han descrito otras actividades a la lisozima de huevocomo actividad antioxidante (Liu y col., 2006), actividadantiheparnica (Mega y col., 1994), actividad antifngica,capacidad fusognica con fosfolpidos y potenciacin delefecto de antibiticos (Ibrahim y col., 2001).Tambin se ha descrito en la bibliografa que la lisozi-ma humana acta como agente inmunomodulante,jugando un papel muy importante en el mecanismode defensa natural (Koslov y col., 2000; Cho y col.,2005). La funcin del sistema inmune es reconocer ycontrolar los microorganismos, basndose en la habili-dad de presentar y reconocer productos conservadosdel metabolismo microbiano que son nicos de losmicroorganismos y no se producen en clulas eucari-ticas. Como ejemplo de estas molculas asociadas a

patgenos encontramos al lipopolisacarido (LPS) debacterias Gram-negativas, secuencias de ADN no meti-ladas y peptidoglicano de bacterias Gram-positivas ynegativas. Varias sustancias antimicrobianas y enzimashidrolticas estn distribuidas dentro de los grnuloscitoplasmticos de neutrfilos y son eficientes en ladefensa frente a bacterias. Estudios recientes handemostrado que la lisozima es uno de los principalescomponentes de los grnulos primarios y secundariosde los neutrfilos y el principal producto secretado porlos macrfagos, por ello puede actuar en la activacinde estas clulas frente a los procesos de inflamacinpor la presencia de bacterias (Ganz y col., 2003; Cho ycol., 2005).Organismos internacionales como la FAO/WHO ymuchos pases como Alemania, Austria, Australia,Blgica, Dinamarca, Espaa, Finlandia, Francia, Italia,Japn y Reino Unido tienen reconocida a la lisozima declara de huevo como una protena no txica y por elloes utilizada para fines alimentarios, farmacolgicos yteraputicos, se estima que ms de 100 toneladas delisozima son usados anualmente para estos propsitos(Mine y col, 2004). La FDA (Administracin de drogas yalimentos en Estados unidos) considera a la lisozimacomo GRAS (generalmente reconocido como seguro)para el uso en la industria quesera.La lisozima de huevo est catalogada como aditivo deuso alimentario con el cdigo (E-1105). Vegetales fres-cos, pescado, carne, frutas, langostinos y otros alimen-tos han sido preservados por contacto de la superficiedel alimento con la lisozima. Esta protena tambin esusada para conservar otros alimentos como pepinillosKimuchi, sushi y fideos chinos. Entre sus usos encon-tramos la proteccin en los quesos frente a bacteriasdainas como el Clostridium tyrobutyricum que provo-ca la hinchazn de los quesos. Varias patentes garanti-zan que la lisozima a bajas concentraciones controla elcrecimiento de microorganismos en quesos durantems de 24 meses. Recientemente se han creado plsti-cos que contienen la lisozima adherida fuertemente aun biopolmero, estos biofilms son utilizados comoconservantes por contacto del alimento con los biopo-lmeros (Mine y col., 2004).La lisozima tambin est adquieriendo gran importan-cia en la elaboracin del vino. El dixido de sulfuro escomnmente usado como conservante en enologa.Acta como un antioxidante para proteger de la oxida-cin a los compuestos fenlicos. Adems el SO2 inhibelas oxidasas endgenas y previene la fermentacinindeseable como fermentacin actica y malolctica.Se quiere reducir el uso de SO2 por su efecto txico enla salud humana. Por ello se han establecido unos lmi-tes para aadirlo en la fabricacin de los vinos. Se hanrealizado muchos estudios para desarrollar protocolosenolgicos con aditivos alternativos que sustituyen al

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sulfito en las mencionadas funciones. Mundialmentese busca la fabricacin de vinos libres de sulfitos. Apartir de los aos 1990 el uso de la lisozima de clara dehuevo ha sido propuesto para el control de la fermen-tacin malolctica en la elaboracin de los vinos, por-que promueve la estabilizacin microbiana y previeneel aumento de las concentraciones de cido actico yaminas bigenas. Se ha demostrado que la lisozima pre-viene el crecimiento de Oenococcus oeni y bacterias lc-ticas alterantes. De acuerdo a la legislacin de la comu-nidad europea EC Nr 2066 se permite agregar 500 mg/Lpara vinos tintos y 250 mg/L para los blancos (Sonni ycol., 2009; Weber y col., 2009). Aunque en la industriadel vino se utiliza para controlar el crecimiento de bac-terias lcticas (Oenococcus, Lactobacillus y Pediococcus),tiene poca accin sobre las bacterias Gram-negativas(bacterias acticas) y levaduras por lo que no puedereemplazar totalmente al anhdrido sulfuroso (Delfini ycol., 2004; Tirelli y De Noni, 2007).

Estructura de la lisozima de clara de huevoLa lisozima se clasifica en seis tipos: lisozima de gallina(tipo-C) entre ellas se encuentran lisozima de estma-go y lisozima de unin a calcio, lisozima de ganso(tipo-G), lisozima de plantas, lisozima bacteriana, liso-zima del fago T4 y lisozima de invertebrados (tipo-I).Cuatro de estas lisozimas: tipo-C, tipo-I, tipo-G y lisozi-ma T4 tienen la estructura tridimensional muy pareci-da (Thammasirirak y col., 2010).De todas las lisozimas existentes, la lisozima de huevode gallina ha sido la ms estudiada, por encontrarse enalta concentracin (1-3 g/L de clara de huevo), su fcilmanejo y la posibilidad de purificacin por cristaliza-cin en NaCl al 5% a pH 9,5. La lisozima de huevo esuna protena que puede representar cerca del 3,4% delas protenas de la clara de huevo. Su masa moleculares 14.307 Da y est compuesta por una secuencia de129 residuos de aminocidos. Es una protena muycatinica, con un elevado punto isoelctrico (pI= 10,7),con 19 aminocidos en su secuencia cargados positi-vamente. Posee cuatro puentes disulfuro que le con-fieren una alta estabilidad, en ellos se encuentran lasocho cistenas presentes en la molcula (You y col.,2010).Se han desarrollado muchos mtodos de aislamientopara la lisozima de clara de huevo de gallina desdecromatografa de intercambio catinico o ultrafiltra-cin hasta llegar a mtodos como cromatografa deintercambio inico con columnas y membranas micro-porosas (Chiu y col., 2007; Jiang y col., 2001).La caracterstica ms llamativa de la molcula de lalisozima es una hendidura prominente, el sitio de fija-cin del sustrato, que atraviesa una cara de la molcu-la. El sitio cataltico de la lisozima se encuentra dividoen seis zonas: A, B, C, D, E y F que a su vez se unen a seis

azcares. En el sitio cataltico se encuentran dos ami-nocidos que son necesarios para que ocurra la catli-sis que son (Glu 35 y Asp 52) siendo estos los gruposfuncionales en el centro de reaccin de la lisozima quetienen propiedades catalticas requeridas, estos resi-duos son invariables en la familia de la lisozima. Pormedio de la mutacin dirigida se comprob la impor-tancia de estos aminocidos, cuando se cambia Glu 35por Gln se genera una enzima sin actividad catalticadetectable, por consiguiente Glu 35 debe ser esencialpara la actividad enzimtica; por otro lado cuando secambi Asp 52 por Asn se obtiene una enzima que notiene ms del 5% de su actividad cataltica, por consi-guiente se dedujo que Asp 52 es importante para laactividad enzimtica de la lisozima (Callewaert yMichellies, 2010; Ibrahim y col., 1998).La estructura de la lisozima se compone de dosdominios o lbulos, el dominio con los residuos (1-40 y 90-129) y el dominio (41-89), unidos por unalarga -hlice donde se encuentra el sitio activo. Laregin alfa se compone de cinco segmentos helicoida-les que son: hlice A (4-15), hlice B (24-36), hlice C(88-99), hlice D (108-115) y hlice 310 (120-125). Laregin beta laminar con tres cadenas: lmina- (41-60), hlice central 310 (79-84) y un largo bucle (61-78)(Mine y col., 2004). En la regin alfa tiene dos puentesdisulfuro (Cys 6-Cys 127 y Cys 30Cys 115), en eldominio beta posee otro (Cys 64-Cys 80) y el cuartopuente (Cys 76-Cys 94) se encuentra entre los dosdominios (Figura 1). Estos cuatro puentes disulfuroconfieren a la lisozima una elevada estabilidad trmica(Matsumura y col., 1989). Como es de esperar, la mayo-ra de las cadenas laterales no polares estn en el inte-rior de la molcula, fuera del contacto con el solventeacuoso. Adems es una protena estable en solucionescidas (Lesnierowski y col., 2007).

Funciones biolgicas de la lisozimaLa lisozima es de la clase de enzimas que destruye lasparedes celulares de ciertas bacterias Gram-positivaspor ruptura del enlace (1-4) entre el cido N-acetil-murmico (NAM) y N-acetilglucosamina del peptido-glicano (NAG) [Figura 2], debilitando as la paredcelular.El resultado es la penetracin de agua en la clulaque se hincha y acaba por estallar, un fenmenodenominado lisis [Figura 3].

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Figura 1Estructura de la lisozima de huevo. A) Estructura tridimensional donde se observa la hendidura de fijacin del sustrato y B) Representacin MOLSCRIPT de la lisozima nativa con el dominio- con las -hlices A-D y C terminal 310 hlice en color prpura, el dominio contiene tres lminas entrecruzadas y un largo loop de color verde. Las hlices estn representadas como cilindros. Los tomos de los cuatro puentes disulfuro, cistenas en azul y azufre en rojo. Los dos puentes disulfuro del dominio son:(Cys6Cys127 y Cys30Cys115). Los otros puentes disulfuro son Cys64Cys80, localizado en el dominio-, y Cys76Cys94, se encuentra entre los dos dominios (Figura tomada de Van den Berg y col., 1999).

A) B)

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La lisozima es casi inactiva frente a microorganismosGram-negativos por la dificultad de acceder al pepti-doglicano que se encuentra protegido por la membra-na externa. Esta propiedad de hidrolizar el peptidogli-cano se conoce como actividad neuraminidasa omuramidasa [Figura 4 (Ibrahim y col., 2002)]. Tambines importante destacar que en las bacterias Gram-positivas el peptidoglicano representa alrededor del90 % de la pared celular, mientras que en las Gram-negativas apenas abarca el 10 %. La desnaturalizacin por calor da lugar a una estructu-ra dimrica que conserva dos puentes disulfuro quesiguen reteniendo su actividad ltica frente a las pare-des bacterianas. Esta forma dimrica tambin llega aformarse durante el almacenamiento de los huevos(Back, 1984). Estas formas oligomricas de la lisozimade huevo han sido descritas en diferentes trabajos.Estos dmeros se obtuvieron mediante diferentesmtodos desde desnaturalizacin trmica en diferen-tes soluciones, tratamiento con agentes reductores,agentes de unin qumica, ultrafiltracin, calenta-miento con vaco, radiacin, etc., (Ibrahim, 1996 a, b;Lesnierowski y col., 2004). En algunos de los trabajosse le atribuyen actividades biolgicas a estas formasdimricas de la lisozima, como por ejemplo actividadantibacteriana frente a bacterias Gram-negativas ypositivas, virus y hongos. Nika Health Products Inc(Patente N US00546649A) ha desarrollado un sistemade preparacin de un producto puro de dmero de

lisozima para usarlo en tratamientos virales y antibac-terianos. Se sabe que el dmero de la lisozima simula lasntesis de algunas interleucinas y de los interferonesalfa y gamma. Adems tambin modula la generacinde TNF alfa (factor de necrosis tumoral), previniendolos efectos negativos por cantidades excesivas. Eldmero de la lisozima induce la actividad de clulasfagocticas y tambin previene la produccin de radi-cales libres. Se ha sugerido que la lisozima en las clu-las del sistema inmunolgico se encuentra en formadimrica, parece ser que esta estructura es menos txi-ca que el monmero, y adems ejerce un efecto inmu-nomodulador. El dmero de la lisozima es utilizado enveterinaria y medicina (Malinowski, 2001). Durante la lactacin, la lisozima protege a los bebsfrente a infecciones respiratorias y gastrointestinales.La exposicin a las bacterias en los neonatos ocurre enel tracto gastrointestinal, la mucosa intestinal no con-tiene normalmente fagocitos o clulas inmunolgica-mente maduras, por ello tiene que existir un sistemade defensa del organismo. En el momento del desarro-llo del sistema inmune, la leche materna aporta al neo-nato entre 0,3-0,5 g/L de lisozima proporcionando deesta manera una importante defensa frente a losmicroorganismos. Es sabido que la lisozima de la lechehumana juega un papel importante en el sistemainmune de los recin nacidos. Rosenthal y Lieberman(1931) fueron los primeros en describir la importanciade la lisozima en la flora intestinal de los recin nacidos

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y lactantes. Estos autores observaron que el tractointestinal del recin nacido libre de bacterias en elmomento del nacimiento, era invadido, en un cortoperiodo de tiempo, por los microorganismos delmedio ambiente. Esta flora inicial desaparece al terce-ro o cuarto da en los lactantes alimentados en formanatural y es reemplazada por una flora en la cual pre-domina el Lactobacillus bifidus. En los nios alimenta-dos en forma artificial no sucede lo mismo, desarro-llndose una flora microbiana intestinal muy variada ysin predominio de ninguna especie determinada.Estos investigadores adems encontraron lisozimaslo en las deposiciones de los nios alimentadosnaturalmente, concluyendo que esta enzima seencuentra en mayor cantidad en la leche humana queen la leche de vaca (frmulas infantiles) y que atravie-sa el tracto intestinal, sin ser destruida por el jugo gs-trico ni por las secreciones intestinales.En los recin nacidos el pH gstrico es mayor que el delos adultos y se encuentra en valores de pH 4,0. Al sermenos cido el pH, la accin de la pepsina se ve redu-cida, lo que puede favorecer el paso a la circulacin deprotenas intactas. La barrera intestinal constituye unmecanismo de defensa al inducir el fenmeno de tole-rancia oral. En este proceso se encuentran implicadasclulas presentadoras de antgenos y clulas T regula-doras. La barrera de la mucosa gastrointestinal, queincluye mecanismos fsicos e inmunolgicos, procesay modifica las protenas de la dieta, de forma que slo

un 2% se convierte al final en antgenos potenciales(Figura 5).

Capacidad antignica de la lisozimaLos huevos de gallina se incluyen como uno de losgrandes ocho alimentos ms alergnicos, siendo elovomucoide (OM) y la ovoalbmina (OVA) los ejem-plos ms tpicos de protenas de huevo con potencialalergnico. Sin embargo, aunque no se haya estudiadoen profundidad, la lisozima (Gal d4, 14 KDa, 3,5%) estambin uno de los principales alrgenos de clara dehuevo y se han descrito reacciones clnicas a la lisozi-ma y con frecuencia se han encontrado anticuerposIgE anti-lisozima en los pacientes alrgicos de huevocomo marcadores de sensibilizacin.En la industria alimentaria se utilizan muchas prote-nas como aditivos o conservantes ya sea por sus pro-piedades funcionales como capacidad espumante opor sus propiedades biolgicas como la capacidadantibacteriana. Muchos derivados del huevo son utili-zados para estos fines, entre estos derivados seencuentra la lisozima de clara de huevo de gallina, lacual est catalogada y aceptada como aditivo de usoalimentario en muchos pases por su comprobadaactividad antibacteriana frente a bacterias Gram-posi-tivas. Por ejemplo en la Unin Europea, est permitidosu uso en la fabricacin de quesos (Directiva EuropeaN 95/2/EC), en la que se establece que se puede utili-zar entre 50 y 350 mg de lisozima por kg de queso. La

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adicin de estos conservantes en los alimentos puedeconducir a reacciones alrgicas especialmente en per-sonas ya sensibilizadas. Incluso cantidades compren-didas entre 1 y 2 mg de lisozima de huevo pueden pro-ducir reacciones en personas muy sensibles. Estos alr-genos ocultos son un problema comn en la seguri-dad alimentaria que se conoce desde hace muchosaos y que adems puede estar contribuyendo a laprevalencia de las alergias alimentarias (Weber y col.,2007; 2009).La prevalencia de las alergias al huevo se estima quepuede llegar a ser entre 1.6-3.2 % en los pases des-arrollados y es la segunda causa de alergias alimenta-rias en nios en Estados Unidos (Mine y col., 2008).Estudios epidemiolgicos recientes sugieren que elmayor nivel de higiene en las poblaciones urbanas delos pases desarrollados puede jugar un papel impor-tante en el desarrollo de las alergias (Renz y col., 2006). La lisozima de clara de huevo tiene un 60% de homo-loga con la lisozima de leche humana y comparten laresistencia a las enzimas proteolticas. El proceso de ladigestin juega un papel importante en la sensibiliza-cin alrgica. Saber qu le sucede a los alrgenos ali-mentarios en el tracto gastrointestinal (fragmentacin,absorcin, biodisponibilidad y conjugacin con otrasprotenas) es importante para el conocimiento delmecanismo que subyace en las alergias. Un grannmero de alrgenos alimentarios son estables encondiciones que simulan la digestin gastrointestinalin vivo. Entre estas protenas hay ciertas caractersticascomunes, se asume que tienden a ser protenas mayo-ritarias en los alimentos, resistentes a la digestin yestables a los tratamientos de procesado, sobre todo altratamiento trmico (Taylor y Lehrer, 1996). Con esteobjeto, se han desarrollado diferentes modelos dedigestin in vitro estticos y dinmicos. Los modelosestticos (modelos bioqumicos), no simulan las condi-ciones fsicas de una digestin in vivo, mientras que losmodelos dinmicos se caracterizan porque tratan desimular las condiciones fsicas que ocurren in vivo(como hidratacin, mezclado, etctera). Estos modelosusan alimentos complejos y tienen en cuenta los efec-tos de la matriz del alimento en la cintica de la libera-cin del alrgeno. Un modelo dinmico descrito en laliteratura es el modelo intestinal descrito por Morenoy col. (2005). Este modelo analiza cmo afecta laestructura del alimento en la liberacin de alrgenosen el tracto gastrointestinal, su estabilidad y su degra-dacin en el lumen intestinal. Tambin es importantetener en cuenta las interacciones de las protenas conotros componentes. Las asociaciones lpido-protenapodra ejercer un efecto protector frente a la digestin,puesto que absorcin de la protena en la interfaseaceite/agua origina cambios en la conformacin quehacen que algunos enlaces susceptibles no sean acce-

sibles al ataque enzimtico. Por ejemplo Mandalari ycol (2009) encontraron que el surfactante biolgicofosfatidilcolina (secretado por el estmago y tambinpresentes en las sales biliares) interfiere con ladegradacin del alrgeno -lactoglobulina. Ademshay que tener en cuenta que un 30% de los lpidos dela yema de huevo son fosfolpidos, de los cuales un80% es fosfatidilcolina (Thomas y col., 2007).

Actividad antibacterianaLos microorganismos evolucionan con humanos y ani-males y, en general, muchas de las relaciones que segeneran son mutuamente beneficiosas. En los casosdonde hay competicin, por ejemplo enfermedades,tanto microorganismos como humanos tienen laoportunidad de desarrollar estrategias de defensa. Lasbacterias continuamente desarrollan resistencia a losagentes antimicrobianos, convirtindose en un pro-blema alarmante. Esta situacin es considerada comouno de los mayores problemas de salud pblica a nivelmundial. Se estima que entre el 50%-60% de las infec-ciones nosocomiales que ocurren cada ao en losEstados Unidos son causadas por cepas bacterianasresistentes a los antibiticos, por lo que constituye unade las mayores preocupaciones en los cuidados mdi-cos. Esta alta infectividad con cepas resistentes incre-menta la morbilidad, mortalidad y costes mdicos(Pellegrini y col., 2003 b).Por otro lado la industria alimentaria tambin se veafectada, por la contaminacin de alimentos. Estehecho genera prdidas millonarias anualmente. Porello la industria alimentaria busca agentes antimicro-bianos eficaces. En la actualidad, existe mucho interspor los agentes antimicrobianos de origen natural,debido a que por lo general presentan baja toxicidad,amplio espectro microbiano y su obtencin es econ-mica. Por ejemplo, desde hace dcadas en la industriaalimentaria se utilizan como conservantes la nisinauna bacteriocina y la lisozima de huevo (Pellegrini ycol., 2003 b).Durante las ltimas dcadas, el descubrimiento denuevos antimicrobianos se ha basado en el screeningde productos naturales y qumicos sintticos. Muchosde los antimicrobianos descubiertos han sido utiliza-dos como drogas (antibiticos) o como conservantesen alimentos. Los factores ms importantes que se tie-nen en cuenta para considerar la seleccin de unagente antimicrobiano incluyen: (1) el espectro anti-microbiano y las propiedades fisicoqumicas del com-puesto; (2) la seguridad del compuesto que se preten-de usar; y (3) el tipo de microorganismo al que seataca. Considerando todos estos factores muchasveces se necesita ms de un agente antimicrobiano.Para ello se pueden combinar compuestos que porefecto sinrgico potencien su actividad. Por tanto,

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cualquier hecho que permita potenciar la especifici-dad de un agente antimicrobiano seguro que logreactuar sobre un amplio espectro de bacterias, puedeconsiderarse como una importante contribucin a labiotecnologa moderna, en la lucha contra la resisten-cia de los microorganismos (Ibrahim y col., 2002).Los pptidos antimicrobianos representan un antiguosistema de defensa en un gran rango de organismoscomo son: mamferos, aves, anfibios, crustceos,peces, insectos, plantas y microbios (Bacher, 2003;Tomma y col., 2003). Algunos pptidos antibacterianosson producidos habitualmente por el organismomientras que otros son sintetizados como respuesta aun ataque microbiano (Gallo y col., 2002). La rpidadisponibilidad de estos pptidos es importante para elsistema inmune innato, ya que su alta efectividad lespone en primera lnea de defensa en el organismo. Lospptidos antimicrobianos son capaces de matar a ungran rango de clulas y microbios incluidas las bacte-rias, hongos, protozoos, virus, clulas tumorales y algu-nos parsitos (Vizioli y Salzet, 2002 a y b).Muchas de estas molculas exhiben mecanismos deaccin altamente complejos y distintos. Estos pptidostienen mayor afinidad por los microorganismos quepor las clulas de mamferos, siendo as sustancias queno son txicas para los tejidos. Se ha descrito que lospptidos antimicrobianos logran distinguir entre lostejidos infectados por patgenos acumulndose enesos sitios. Dentro de las caractersticas que compar-ten estas molculas se encuentran la conservacin dela estructura y la carga. Se ha visto que los pptidosantimicrobianos a pH fisiolgico son anfipticos y concarga neta catinica. Se considera que los pptidosantimicrobianos comparten ciertos parmetrosestructurales como son la conformacin, carga, hidro-fobicidad, momento hidrofbico, anfipaticidad yngulo polar. Todas estas caractersticas permitenseleccionar posibles pptidos con actividad antibacte-riana (Epand y Vogel, 1999; Yeaman y Yount, 2003).Los pptidos antimicrobianos pueden generarsedurante la digestin de las protenas alimentarias en eltracto gastrointestinal. En la actualidad se conocenms de 750 pptidos con actividad antibacteriana enmamferos, anfibios, artrpodos y plantas (Reddy ycol., 2004). Se ha descrito la actividad antibacterianade protenas alimentarias y sus respectivos hidroliza-dos. Dentro de los alimentos que poseen protenascon esta actividad se encuentran la leche y el huevo.Recientemente ha crecido mucho el inters de las pro-tenas alimentarias porque se han encontrado ppti-dos dentro de sus secuencias primarias que puedenejercer actividad antibacteriana, convirtindose asestas protenas en un sustrato potencial para aumen-tar las defensas del organismo o utilizarlas en la indus-tria alimentaria como posibles conservantes.

Ibrahim y colaboradores (1996) han propuesto que lalisozima desnaturalizada por calor expone regionesocultas en la forma nativa, como son dos grupos tiolesque le permiten aumentar la hidrofobicidad de lamolcula y como consecuencia tener una mayor afini-dad por las membranas bacterianas desestabilizndo-las y provocando la lisis. Adems, este aumento de lahidrofobicidad de la lisozima desnaturalizada por calorpermite ampliar su espectro bacteriano frente a losmicroorganismos Gram-negativos, destacando queeste mecanismo es independiente de su actividadneuraminidasa natural. Este hecho ha creado contro-versia durante dos dcadas porque diferentes gruposhan intentado reproducirlo, algunos sin mucho xito(Ibrahim y col., 1996 a y b; Masschalk y col., 2002).Una prueba evidente de este nuevo mecanismo anti-bacteriano se ha logrado con la construccin de unmutante de lisozima de huevo catalticamente inacti-vo mediante la sustitucin de un residuo de cidoasprtico del centro activo por una serina. El mutanteresulta activo frente a bacterias Gram-negativas, y fuetan bactericida como la lisozima enzimticamenteactiva frente a Staphylococcus aureus y Bacillus subtilis,sugiriendo de este modo que la actividad antibacteria-na frente a las bacterias Gram-positivas es indepen-diente de la actividad enzimtica (Ibrahim y col.,2001a).La lisozima de huevo cuando es modificada por distin-tos mtodos logra ampliar su espectro antibacterianofrente a ciertas bacterias Gram-negativas, adems depotenciar su actividad frente a los Gram-positivos.Entre los mtodos utilizados para modificar la lisozimase encuentran tratamientos de tipo fsico como la apli-cacin de altas presiones (Masschalk y col., 2001;2002), la ultrafiltracin (Lesnierowski y col., 2009), ladesnaturalizacin por calor (Ibrahim y col., 1996 a y b),la radiacin gamma (Schmidt y col., 2007) y una seriede modificaciones qumicas como son la unin depolisacridos, combinacin con cidos grasos (Ibrahimy col., 1993), la combinacin con cido etilendiamino-tetractico (EDTA) (Bolder, 1997) y la reduccin depuentes disulfuro con DL-ditiotreitol (DTT) (Touch ycol., 2004).Por otro lado, la lisozima recombinante con un ppti-do hidrofbico en el extremo C-terminal de la molcu-la incrementa su actividad frente a Escherichia coli(Ibrahim y col., 1992; Kato y col., 1998). Tambin se handesarrollado mtodos que buscan potenciar el espec-tro antibacteriano de la lisozima de huevo mediante lacombinacin de tratamientos trmicos y qumicos(Cegielska-Radziejewska y col., 2009).La lisozima sin actividad enzimtica posee propieda-des bactericidas, por lo que se han publicado variostrabajos enfocados en la bsqueda de pptidos anti-microbianos derivados de esta protena de huevo.

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Entre ellos, Pelligrini y col. (1997) han identificado unpentadecapptido derivado de la lisozima de huevocon actividad antibacteriana, pero sin actividad neura-minidasa, producto de la hidrlisis con clostripana. Elpptido identificado corresponde al fragmento f(98-112) IVSDGDGMNAWVAWR, el cual present activi-dad frente a bacterias Gram-positivas y negativas. Sinembargo dicha actividad fue bastante menor que laactividad de la lisozima nativa. Con el objetivo deconocer posibles mecanismos de accin independien-tes de la actividad ltica natural de la lisozima de clarade huevo se han llevado a cabo modificaciones en lasecuencia del fragmento f(98-112) mencionado ante-riormente. La sustitucin de una Asn en la posicin106 por una Arg aument la actividad bactericida delpptido considerablemente. Adems los autoresencontraron que en la lisozima humana y de babuinosla Arg aparece de manera natural en la posicin 106.Posteriormente en otro trabajo del mismo grupo(Ibrahim y col., 2001b) se sintetiz el dominio de ladoble hlice que corresponde al fragmento f(87-114)en el caso de la lisozima de huevo llamado Helix-Loop-Helix, y f(87-115) para la lisozima humana. Estedominio se encuentra en el sitio activo de la protena(Figura 6).Adems se sintetizaron diferentes regiones del domi-nio de la doble hlice de la lisozima, como el fragmen-to f(87-100) llamado Helix 1, el fragmento correspon-

diente a f(101-106) llamado Loop y el pptido f(107-114) llamado Helix 2 para la lisozima de clara dehuevo. Se determin la actividad antibacteriana deestos pptidos, frente a seis bacterias Gram-negativas(Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, Klebsiellaneumoniae, Pseudomona aeruginosa, Serratia marces-cens y Salmonella typhimurium) y seis bacterias Gram-positivas (Bacillus subtilis, Micrococcus luteus,Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,Staphylococcus lentus y Streptococcus zooepidemicus).Tambin se determin la actividad antifngica frenteal hongo (Candida albicans).En este estudio se encontr que el fragmento f(87-114) llamado Helix-Loop-Helix era activo frente a losGram-negativos ensayados a excepcin de las cepasde Escherichia coli y Salmonella typhimurium ademstampoco present actividad frente al hongo Candidaalbicans. El fragmento f(87-100) Helix 1, no presentninguna actividad frente a los seis Gram-negativosensayados, mientras que fue muy activo frente a losseis Gram-positivos, incluyendo adems al hongoCandida albicans. Por otro lado, el fragmento f(107-114) Helix 2 demostr una fuerte actividad frente atodas las cepas utilizadas a excepcin de Serratia mar-censcens, este fragmento tambin fue muy activofrente al hongo Candida albicans, y cabe destacar quelas actividades ms fuertes fueron las de este fragmen-to. Por ltimo el fragmento f(101-106) Loop, slo pre-

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sent actividad frente a Bacillus subtilis y a Candidaalbicans.Posteriormente, Pellegrini y col. (2003 a), sintetizaronotros pptidos derivados de la lisozima de huevo:f(106-112) RAWVAWR, f(106-112-NH2) RAWVAWR-NH2,f((D)106-112) (D) RAWVAWR, con D aminocidos,f(107-112) RWVWR, f(107-112-NH2) RWVWR-NH2,f(107-114) AWVAWRNR llamado Helix-2 y f(107-115)RAWVAWRNR Helix 2 de la lisozima humana.Examinaron la actividad antibacteriana frente a lospatgenos Staphylococcus aureus ATCC 25923;Listeria monocytogenes ATCC 19115; Escherichia coliO157: H7 EDL 933; Salmonella entereditis ILS 386/98(cepa salvaje); Salmonella typhimurium (cepa salvaje);Escherichia coli O157: H (cepa salvaje) y se determinque el pptido f(106-112) era muy activo frente aStaphylococcus aureus pero su actividad fue moderadafrente a las otras bacterias. La amidacin en el C-termi-nal de este pptido f(106-112-NH2) produce un fuerteaumento de su actividad antibacteriana frente a todaslas bacterias ensayadas. El fragmento f(107-112) fuealtamente bactericida frente a Salmonella typhimuriumpero ineficaz frente a Salmonella enteriditis, Escherichiacoli O157: H7 y Escherichia coli O157: H. Adems, fuemoderadamente activo frente a Staphylococcus aureusy Listeria monocytogenes. La amidacin en el C-termi-nal de este pptido f(107-112-NH2) produjo unaumento de la actividad frente a todas las cepas utili-zadas en el experimento. Fue particularmente muyactivo frente Staphylococcus aureus, Salmonella typhi-murium, Salmonella enteriditis y Listeria monocytoge-nes. El fragmento f(107-114) llamado Helix 2 de la liso-zima de huevo fue significativamente activo frente aSalmonella typhimurium, mostr una actividad mode-rada frente a Staphylococcus aureus y Listeria monocy-togenes, frente al resto de las cepas fue inactivo.Finalmente el fragmento f(107-115) llamado Helix 2de la lisozima humana fue altamente activo frente atodas las bacterias ensayadas.Teniendo en cuenta lo anterior se concluy que lospptidos formados durante la hidrlisis que se

encuentren en este dominio de la molcula puedentener una elevada actividad antimicrobiana. El pptidocorrespondiente al fragmento f(98-112) con la secuen-cia IVSDGDGMNAWVAWR descrito por Pellegrini ycolaboradores (1997) se encuentra en este dominio, ysu actividad antimicrobiana podra deberse a ello.Mine y colaboradores (2004) han descrito dos ppti-dos producto de la digestin de la lisozima con pepsi-na y tripsina. El pptido correspondiente al fragmentof(98-108) con la secuencia IVSDGDGMNAW, el cualinhibi el crecimiento de la bacteria Gram-negativaEscherichia coli K-12, y que se encuentra en el centrodel Helix-Loop-Helix de la molcula de la lisozima, yel otro pptido fue el fragmento f(15-25) con lasecuencia HGLDNYR con actividad antibacterianafrente a Staphylococcus aureus 23-394.

ConclusionesLa lisozima de clara de huevo es una de las protenasalimentarias utilizada en la industria para diferentesfines por su demostrada actividad antibacteriana fren-te a bacterias Gram-positivas y su actividad antiviral. Esutilizada en la industria farmacutica, alimentaria, enveterinaria, en medicina y en la industria cosmtica.Muchas modificaciones de la protena permitenampliar su espectro antibacteriano logrando as afec-tar a bacterias Gram-negativas. Se ha demostrado queel tratamiento trmico de la protena a pH 6 potenciasu actividad antibacteriana. Los mismos resultados sehan conseguido con modificaciones qumicas redu-ciendo sus puentes disulfuro, con modificacionesgenticas e hidrlisis enzimtica. Esta nueva actividades independiente de la actividad muramidasa. Portodo lo anterior, la lisozima se ha convertido en unamolcula con muchas posibilidades de uso en laindustria alimentaria. La unin Europea ha reglamen-tado su uso en la elaboracin de vinos y en la fabrica-cin de quesos. Sin olvidar de ninguna manera sucapacidad alergnica en personas sensibilizadas y losposibles riesgos que conlleva para estas personas con-sumir alimentos que contengan lisozima.

Agradecimientos

Wilman Carrillo agradece a la Comunidad de Madrid y al Fondo Social Europeo porla concesin del Contrato Pre-doctoral de Personal de Apoyo de Investigacin.Tambin agradece al Instituto de Investigacin en Ciencias de la Alimentacin (CIAL-UAM-CSIC), al Consejo de Investigaciones Cientficas y la Universidad Autnoma deMadrid.

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