Lourdes Arce Departamento de Química Analítica...
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Lourdes Arce
Departamento de Química Analítica
Universidad de Córdoba
Toledo, 16 de marzo de 2016
II CONGRESO INTERNACIONAL DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN EXTRA
Problemática actual
Introducción a la técnica
Trabajos de investigación realizados
Transferencia de resultados de investigación al sector
Perspectivas y líneas de trabajo actuales
• Acidez (Valoración)
• Índice de peróxidos (Valoración)
• Espectroscopía UV
• Ceras (GC)
• Estigmatadienos (GC) • Isómeros trans de ácidos grasos (GC)
• Diferencia ECN42 (HPLC)
• Esteroles (GC)
• Eritrodiol (GC)
Método oficial
ANÁLISIS ORGANOLÉPTICO
Regulación (EC) No. 2568/1991
Largos tiempos de análisis
Alta cantidad de muestra
Uso de reactivos químicos
Personal cualificado…
¿CALIDAD DEL
ACEITE DE OLIVA?
Problemática actual
“Flavour”: aroma + sabor
ANÁLISIS ORGANOLÉPTICO
- No es posible la identificación de más de
3 o 4 componentes individuales.
- Sólo puede analizar 6 muestras por día.
- Diferentes percepciones de los
catadores para una misma muestra.
-Pocos laboratorios acreditados para el
análisis organoléptico.
ACEITE DE OLIVA VIRGEN EXTRA: AOVE
ACEITE DE OLIVA VIRGEN: AOV
ACEITE DE OLIVA LAMPANTE: L
Optimizar y validar un método instrumental que
permita responder a estas preguntas RETO ANALÍTICO
FlavourSpec
¿¿¿ACEITE DE OLIVA LAMPANTE???
¿Qué tipo de muestras se necesitan para validar esta metodología?
Muestras necesarias para validar la metodología
a.- Muestras trazables con características definidas
a.1.- Aceites de oliva virgen extra
a.2.- Aceites con defectos:
Atrojado, borras, avinado/avinagrado, madera húmeda, rancio,
humedad/tierra, moho, aceites de alpechinera, aceite de repaso,
aceite de orujo crudo (defecto quemado), aceites desodorizado…
b.- Muestras de distintos orígenes geográficos
b.1.- Graneles de almazaras
b.2.- Aceite envasado
Muestras necesarias para validar la metodología
TRAZABILIDAD DE LAS MUESTRAS DE ACEITE
1. Fecha de producción del aceite
2. Fecha de la toma de muestras
3. Variedad de la aceituna
4. Zona de recolección de la aceituna
5. Zona de la toma de muestra
6. Sistema de extracción empleado (aceites defectuosos)
7. Histórico
8. Forma de almacenamiento
9. Nº de lote (muestras envasadas)
10. Características del envase
11.Campaña de producción
12.Análisis físico-químico
13.Análisis sensorial
14.…
Muestras necesarias para validar la metodología
Problemática actual
Introducción a la técnica IMS
Trabajos de investigación realizados
Transferencia de resultados de investigación al sector
Perspectivas y líneas de trabajo actuales
ESPECTROMETRÍA DE MOVILIDAD IÓNICA PARA
CONOCER LA CATEGORÍA DEL ACEITE DE OLIVA
Ion Mobility Spectrometry (IMS)
¿Cuál es su
categoría?
Gas de deriva
Gas de salida
Campo eléctrico
Fuente de
ionización
Detector Región de deriva
Tratamiento
quimiométrico
OBJETIVO
Conocer la categoría de un aceite de oliva de forma rápida y fiable
AOVE
AOV
L
Introducción a la técnica IMS
ACEITE DE OLIVA VIRGEN EXTRA: AOVE
ACEITE DE OLIVA VIRGEN: AOV
ACEITE DE OLIVA LAMPANTE: L
ESPECTROMETRÍA DE MOVILIDAD IÓNICA (IMS)
Región de
ionización Región de deriva
CAMPO ELÉCTRICO
Gas de deriva
Placa de
Faraday
Salida de gas
Rendija de
entrada
Entrada de
muestra
Detector
Rendija de
salida Anillos de
voltaje
La IMS mide la distinta velocidad que experimentan los iones gaseosos en un
campo eléctrico la cual depende de la masa, carga, forma y tamaño.
Introducción a la técnica IMS
ESPECTROMETRÍA
DE MOVILIDAD
IÓNICA
Buena sensibilidad
Buena precisión
Rápida
Fácil de usar
Monitorización a tiempo real
Operación a presión ambiente
Portátil
-Selectividad baja si no se
acopla el equipo de IMS a una
columna de separación.
-Reacciones ión-molécula que
dificultan la interpretación del
espectro.
Introducción a la técnica IMS
TRITIO-COLUMNA DE GASES-
ESPECTRÓMETRO DE MOVILIDAD IÓNICA
FlavourSpec
Automuestreador
IMS Tª 60ºC
Columna Capilar
(30 m) Tª 40ºC
Jeringa Vinyección 100 mL
Tª 80ºC
Gas de arrastre (N2) 30 mL/min
Gas de deriva (N2) 500 mL/min
Gas de salida
Fuente
de tritio
(6.5 keV)
Placa de Faraday
Inyector Tª 80ºC
1 g de aceite de oliva Tiempo de incubación 10 min Tª 60ºC
Introducción a la técnica IMS
FlavourSpec
Tipo de datos que se obtienen de un IMS:
-Tiempo de retención (s)
-Tiempo de migración (ms)
-Intensidad (V)
INFORMACIÓN
TRIDIMENSIONAL
GLOBAL = Huella espectral
ESPECÍFICA = Compuestos químicos
Introducción a la técnica IMS
Objetivo 1: Búsqueda de una HUELLA ESPECTRAL
característica de cada tipo de aceite
VIRGEN
EXTRA
LAMPANTE VIRGEN
INFORMACIÓN TRIDIMENSIONAL GLOBAL
Introducción a la técnica IMS
Reduce la PROBLEMÁTICA de otros métodos analíticos
que no eran capaces de evaluar correctamente las
interacciones de los diferentes volátiles entre sí ya que usaban
solo la información de un grupo de compuestos químicos.
HUELLA ESPECTRAL
o FINGERPRINT
característica de cada tipo de aceite
VIRGEN
EXTRA
LAMPANTE VIRGEN
Uso de TODA la INFORMACIÓN del espectro de IMS
Información GLOBAL
Introducción a la técnica IMS
Objetivo 2: Búsqueda de COMPUESTOS QUÍMICOS que se puedan
asociar con atributos positivos o con defectos
INFORMACIÓN TRIDIMENSIONAL ESPECÍFICA
Introducción a la técnica IMS
Relación de COMPUESTOS QUÍMICOS con atributos y/o defectos presentes en los aceites
Defectos Compuestos
químicos Aroma Compuestos químicos Aroma
Humedad 3-penten-2-ol Hexanal 1-octen-3-ona 2-hexenal Ocimene 2-metil-1-butanol 3-metil-1-butanol 2-heptenal 6-metil-5-hepten-2-ona Piranona 2-heptanol
Perfume, madera Hierba, manzana verde Setas, hongos, picante Verde, almendras amargas moho Avinado, aromático Madera, dulce Picante, jabón Hierba, picante Vela quemada Tierra, dulce
2-octanol 1-octen-3ol 2,4-heptadienal 6-metil-5-hepten-3-ol Acido propanoico Acido butanoico Acido pentanoico Acido hexanoico Guaiacol Acido octanoico 3-xilenol
Tierra, grasa Moho, tierra Grasa, nuez Perfume, nuez Picante, amargo, moho Rancio, queso, dulce desagradable, picante Amargo, intenso Madera, humo, aromático Aceite, grasa Olor seco
Moho Octano Acetato de etilo 2-butanona Propanoato de etilo Acetato de butilo Butanoato de etilo Butanoato de propilo
Dulce, alcalino Pegamento, alcalino Etéreo, frutado Frutado, intenso Verde, frutado, picante Dulce, frutado Piña, intenso
Butanoato de 2-metilpropilo 2-butanol 1-pentanol 6-metil-5-heptne-2-one Acido acéitco Acido heptanoico
Desagradable, aviando, moho Avinado Pegamento, balsamico, fuerte Picante, verde Vinagre, amargo Rancio, grasa
Avinado/ avinagrado
Etanol 2-pentenal 2-heptanone
Alcohol Manzana, verde Dulce, frutado
2-octanone 1,2-butanediol 2-hexen-1-ol
Moho, verde Picante Hierba, hojas
Rancio Pentanal Heptanal Octanal Nonanal 2-octenal
Madera, amargo, aceitoso Aceitoso, grasa, madera Grasa, intenso Grasa, ceroso, picante Hierba, aromático
Decanal 2-decenal Nonanol 2,4-nonadienal 2,4-decadienal
penetrante, dulce, ceroso Pintura, pescado, grasa Grasa Jabonoso, penetrante Fuerte, grasa
Introducción a la técnica IMS
Problemática actual
Introducción a la técnica IMS
Trabajos de investigación realizados
Transferencia de resultados de investigación al sector
Perspectivas y líneas de trabajo actuales
UV-IMS Tritio-MCC-IMS
1 Trabajos de investigación realizados
Intervalo de tiempo de
retención: 2.7 - 68.6 s
(95 espectros)
Intervalo de tiempo de deriva:
6.6 - 11.3 ms (703 variables)
PORCENTAJE DE
ÉXITO
97 % clasificación
87 % predicción
Total muestras analizadas: 98
Virgen extra: 43
Virgen: 28
Lampante: 27
2 Trabajos de investigación realizados
3 Trabajos de investigación realizados
Automuestreador
IMS Tª 45ºC
Columna Multicapilar Tª 40ºC
Jeringa Vinyección 250 mL
Tª 80ºC
Gas de arrastre
(N2) 30 mL/min
Gas de deriva (N2)
250 mL/min
Gas de salida
Fuente
de tritio
(6.5 keV)
Placa de Faraday
Inyector Tª 80ºC
1 g de aceite de oliva
Tiempo de incubación 8 min
Tª 60ºC
Mejora de los resultados
cambiando
columna multicapilar por una
columna capilar de
30 m de longitud
Tubo de deriva de 5 o 10 cm
3 Trabajos de investigación realizados
CHEMICAL GROUP
ANALYTE ATTRIBUTE RETENTION
TIME WITH
CC (s) K0 (cm2V-1s-1)1
ODOUR THRESHOLD
VALUE (mg/kg)
LIMIT OF
DETECTION OF
THE METHOD
(mg/kg)
DESIRABLE UNDESIRABLE
Aldehydes Acetaldehyde - - 84.3 1.80 - -
Pentanal 0.05
2-Pentenal - Winey-vinegary 139.6 1.97/1.60 0.30
Hexanal green-sweet, green apple, grass Rancid 172.7 1.73/1.39 0.08 0.08
2-Hexenal freshly cut grass, banana - 260 1.84/1.43 0.42 0.01
Heptanal 0.02
2-Heptenal - Musty-humid, rancid 580 1.73/1.30 0.001 0.04
2,4-Heptadienal 0.3
Octanal - Rancid 831.6 1.53/1.20 0.32 0.4
2-Octenal - Rancid 1409 1.64/1.20 0.004 0.2
Decanal - Rancid 2012.5 1.54/1.16 - -
2-Decenal - Rancid 1526 1.45/1.03 0.01 -
Benzaldehyde - - 545 1.87/1.47 - 0.05
Ketones 2-butanone - Fusty 70 1.46/1.74 40 <0.01
1-Penten-3-one green- spicy - 96.3 1.70 0.7
6-methyl-5-hepten-2-one 50 0.2
2-Nonanone - Musty-humid 1860 1.54/1.15 <0.1 -
Alcohols 2-Butanol - Fusty 75.6 1.44/1.62 0.1 0.05
2-Methylbutanol - Fusty, winey-vinegary, musty-humid 130.7 1.46 0.48
3-Methylbutanol - Winey-vinegary, fusty 129.8 1.78/1.47 0.1
1-Pentanol spicy - 151 1.74/1.43 3.0
2-Penten-1-ol banana - 157.5 1.48/1.33 0.25
1-Hexanol Banana, freshly cut grass - 316.1 1.66/1.34 0.4
3-Hexen-1-ol Grass, green leaves, bitter almond - 275 1.61/1.20 5.0
2-Octanol - Musty-humid 910 1.54/1.19 0.1
1-Octen-3-ol - Musty-humid 722 1.88/1.36 0.001
Esters Ethyl acetate - Fusty, winey-vinegary 74.8 1.62 0.94 <0.01
Methyl butanoate <0.5
Ethyl butanonate - Fusty 180 1.40 0.03
Propyl butanoate - Fusty 310 1.25/1.67 0.15 0.05
Ethyl hexanoate 0.1
Hexylacetate Green, fruit, banana, flower - 960 1.56/1.15 0.0014 0.25
Hexenylacetate 0.3
Others a-pinene 0.2
2,5-dimethylfurane <0.1
limonene 2
Variando ligeramente la configuración del equipo se podrán identificar mas compuestos químicos.
4 Trabajos de investigación realizados
Estudio de la vida útil del aceite de oliva según el tipo de envase
4 Trabajos de investigación realizados
Estudio de la vida útil del aceite de oliva según el tipo de envase
Bag in
box
Lata
Vidrio negro
Vidrio transparente
Botella de plástico (pet)
4 Trabajos de investigación realizados
2-heptenal
1-penten-3-one
Se asocia con el OLOR A RANCIO.
La concentración del compuesto se
asocia con la oxidación del aceite.
Su alta concentración se asocia con
aceites de ALTA CALIDAD y se puede
asociar con las notas verdes y
picante de un aceite.
4 Trabajos de investigación realizados
¿Puede un AOVE mantener su calidad durante un año?
El mantenimiento de la calidad se puede controlar a
través de las condiciones de almacenamiento
4
RETO:
Revisar el consumo preferente dependiendo
del tipo de envase.
Trabajos de investigación realizados
Problemática actual
Introducción a la técnica
Trabajos de investigación realizados
TRANSFERENCIA de resultados de INVESTIGACIÓN al sector
Perspectivas y líneas de trabajo actuales
Transferencia de resultados de investigación al sector
MUESTRAS FASE I
Total de muestras de aceite analizadas durante la fase I: 460
Muestras ciegas: 124
MUESTRAS DE ACEITE ANALIZADAS
MUESTRAS FASE II
Total de muestras de aceite analizadas durante la fase II: 394
Muestras ciegas: 78
Transferencia de resultados de investigación al sector
MÉTODO usando GC-IMS
Automuestreador
IMS Tª 45ºC
Tª 40ºC
Jeringa VInyección 200 mL
Tª 80ºC
Gas de arrastre (N2) 5 mL/min
Gas de deriva (N2) 250 mL/min
Gas de
salida
Fuente
de tritio
(6.5 keV)
Placa de Faraday
Inyector Tª 80ºC
1 g de aceite de oliva
Tiempo de incubación 8 min
Tª 60ºC
Columna Capilar (apolar, 30m, 0.44mm
OD, 0.32mm ID FS-SE-54-
CB-0.25)
FlavourSpec®
Tiempo global de
análisis/muestra:
30 min (incluyendo la limpieza
del equipo)
48 muestras/día
Transferencia de resultados de investigación al sector
EVALUACIÓN DE RESULTADOS USANDO TODA LA HUELLA ESPECTRAL
Encontrar posibles marcadores químicos en las muestras dudosas
que permitan identificar defectos para clasificar una muestra de
forma inequívoca.
- Las muestras para calibrar los equipos se han catado por un solo
panel sensorial (100 % fiabilidad al panel sensorial), el error del panel
se ha transferido a los métodos.
DEBILIDADES
ALTERNATIVAS EN ESTUDIO
FORTALEZAS DEL MÉTODO DE GC-IMS
- % de predicción similares a los obtenidos con el análisis sensorial.
- Método instrumental de fácil uso, rápido y de bajo coste.
Transferencia de resultados de investigación al sector
Estudio de las muestras de aceite
usando marcadores químicos
Transferencia de resultados de investigación al sector
Heptanal
2y 3-metilbutanol
6-metil-5-
hepten-2-ona
2-heptenal
Defectos
1-penten-3-one t-2-hexenal y 2-hexen-1-ol hexilacetato
Frutado
(defectos: moho-humedad 5.1 y atrojado-borras 3.1)
1. Muestra LAMPANTE por análisis sensorial
Usando TODA LA HUELLA ESPECTRAL sería una MUESTRA DUDOSA
Usando MARCADORES QUÍMICOS esta muestra NO podría ser EXTRA porque
los compuestos de frutado tienen una intensidad muy baja y presenta algunos
compuestos de defectos
Transferencia de resultados de investigación al sector
(Madera húmeda 6.5)
2 y 3-metilbutanol
(defecto madera húmeda)
Decidir si siempre que se encuentre
2 y 3 metilbutanol y
tenga valores bajos de 1-penten-3-ona
se clasifica como AOV o L.
2. Muestra LAMPANTE por análisis sensorial
Usando TODA LA HUELLA ESPECTRAL sería una muestra VIRGEN con el 80%
de probabilidad.
Bastante intensidad de t-2-hexenal pero
poca intensidad de 1-penten-3-ona
Transferencia de resultados de investigación al sector
Según la cata es EXTRA con un 2.7 de frutado
Heptanal, compuesto característico
de rancio.
LOD: 0.02 mg/kg << OTV: 0.5 mg/kg
2 y 3-metilbutanol asociados a varios
defectos (moho-humedad, avinado,
atrojado)
LOD: 0.01-0.05 mg/kg < OTV: 0.5-0.1 mg/kg
El método GC-IMS ha encontrado algunos compuestos asociados a defectos
cuyo LOD está por debajo del OTV
1. Muestra EXTRA por análisis sensorial
Usando TODA LA HUELLA ESPECTRAL sería una MUESTRA DUDOSA.
6-metil-5-hepten-2-ona, compuesto
característico de moho-humedad.
LOD: 0.2 mg/kg << OTV
OTV: odor treshold value o umbral de percepción
Transferencia de resultados de investigación al sector
Presencia de 2 y 3-metilbutanol
LOD 0.01-0.05 mg/kg < OTV
2. Muestra EXTRA por análisis sensorial
Según la cata es EXTRA con un 4,6 de frutado
Usando TODA LA HUELLA ESPECTRAL sería una MUESTRA DUDOSA.
El método GC-IMS ha encontrado algunos compuestos asociados
con defectos por lo tanto NO podría ser EXTRA
Decidir si:
A. Siempre que se detecten algunos compuestos químicos asociados a
defectos ya NO se puede clasificar como EXTRA.
o si…
B. Dependiendo del nivel de concentración se clasifica como EXTRA a
pesar de detectar estos compuestos químicos (asociados con defectos).
Transferencia de resultados de investigación al sector
CONCLUSIONES
• La GC-IMS es un método que proporciona resultados prometedores
para clasificar las muestras de aceite de oliva como AOVE, AOV o L.
• El uso de métodos quimiométricos es indispensable para tratar toda
la INFORMACIÓN GLOBAL DEL ESPECTRO.
Transferencia de resultados de investigación al sector
•Las muestras clasificadas como dudosas con los métodos
instrumentales usando toda la información química se deben valorar
usando los marcadores químicos asociados con atributos positivos o
negativos.
• Establecer límites para que el método de GC-IMS no sacrifique (¿o
si?) los AOVE* que tengan compuestos asociados a defectos a un
nivel de concentración por debajo del umbral de percepción.
• Establecer límites para los defectos que permitan clasificar las
muestras como AOV o L.
RETOS
Transferencia de resultados de investigación al sector
*clasificada según la información global (huella espectral).
Problemática actual
Introducción a la técnica
Trabajos de investigación realizados
Transferencia de resultados de investigación al sector
Perspectivas y líneas de trabajo actuales
¿Es posible buscar unos marcadores químicos asociados a defectos
y valores límite que permitan clasificar las muestras dudosas* como
NO EXTRA (VIRGEN o LAMPANTE)?
Estos valores límites se deben buscar con ayuda del PANEL DE CATA
Perspectivas y líneas de trabajo actuales
Si
*clasificada según la información global (huella espectral).
Máximos permitidos CE Aceite de Oliva Virgen Extra (AOVE)
Grado de acidez (%) <0,8
Índice de peróxidos (mEq O2/Kg) <20
Espectrometría UV (K270) < 0,22
Espectrometría UV (∆K) < 0,01
Espectrometría UV (K232) < 2,50
Tabla 1. Valores máximos permitidos para los índices de calidad del AOVE.
Búsqueda de marcadores químicos asociados a defectos y valores límite que permitan clasificar una muestra como VIRGEN o LAMPANTE
En el ÁREA CLÍNICA existen niveles para
determinados compuestos que permiten
valorar si un paciente tiene una enfermedad.
Estos valores se han establecido después de observar a un número elevado de
enfermos y estudiando los niveles encontrados de un determinado compuesto
químico y la patología que presenta dicho enfermo.
Existen revisiones de límites establecidos debido a que se ha visto que estos
límites son a veces muy permisivos o restrictivos para relacionarlos con una
determinada enfermedad.
Búsqueda de marcadores químicos asociados a defectos y valores límite que permitan clasificar una muestra como VIRGEN o LAMPANTE
¿Cómo se podrían establecer estos
nuevos límites para clasificar un aceite?
…al igual que se hace en otras áreas
Con estudios colaborativos
¿Conoce el consumidor la diferencia entre un AOVE y uno Virgen?
Para ESTABLECER LOS NIVELES DE CONCENTRACIÓN LÍMITE para
determinados compuestos relacionados con atributos negativos de un
ACEITE DE OLIVA se deberían tener en cuenta estas PREGUNTAS:
¿Se debería reservar el nombre AOVE para un aceite que
no tenga
o
tenga por debajo de un valor
compuestos químico asociado a defectos?
Búsqueda de marcadores químicos asociados a defectos y valores límite que permitan clasificar una muestra como VIRGEN o LAMPANTE
¿Estos valores se deben establecer teniendo en cuenta el nivel de percepción de expertos catadores o el de los consumidores?
• ¿cada vez exige aceites de más calidad?
• ¿Prefiere comprar un aceite de menor precio aunque este tenga
algunos atributos negativos?
El consumidor …
…. La optimización de los métodos analíticos no se podrán terminar
de poner a punto sin la respuesta a las preguntas anteriores.
…. mientras llegan estas respuestas seguimos mejorando la tecnología
Estudio colaborativo
ANÁLISIS QUÍMICO SECTOR OLEICO
PANEL DE CATA
Búsqueda de marcadores químicos asociados a defectos y valores límite que permitan clasificar una muestra como VIRGEN o LAMPANTE
Aprox. 12.500 €
Cromatógrafo de Gases
Acoplamiento 5000 €
4. Desarrollo de software para realizar tratamiento de datos automático. 5. Uso de librería de espectros para identificar mas señales
3. Detector de Movilidad Iónica Drift tube inner diameter: 15.2 mm Drift tube /lenght: 98 mm Drift field strength: 500 V/cm
Temperature/Heating: up to 100°C (optional)
DESARROLLO TECNOLÓGICO
1. Columnas cromatográficas apolar y polar 2. Horno cromatográfico
Aprox. 40.000 €
Perspectivas y líneas de trabajo actuales
TRABAJOS DE INVESTIGACIÓN EN CURSO
3. Estudio de la mejora del % clasificación al usar la información
obtenida por técnicas analíticas complementarias (GC-MS)
a la GC-IMS.
1. Estudio de la idoneidad de integrar muestras de varias
campañas en los modelos de calibración usados para asignar la
categoría correcta a un aceite.
2. Comparación de los resultados obtenidos al analizar un
mismo grupo de muestras por varios paneles de cata y varias
técnicas analíticas.
Perspectivas y líneas de trabajo actuales
4. Identificación y cuantificación de marcadores químicos
en las muestras dudosas.
Perspectivas y líneas de trabajo actuales
-Dra. Rocío Garrido-Delgado
- Interprofesional del aceite de
oliva español
-Empresa SOVENA
- Empresa El Olivo Global
Departamento de Química Analítica
Universidad de Córdoba
Agradecimientos
Lourdes Arce
Departamento de Química Analítica
Universidad de Córdoba
Toledo, 16 de marzo de 2016
II CONGRESO INTERNACIONAL DEL ACEITE DE OLIVA VIRGEN EXTRA