M en C. Odette Monserrat Verdejo Torres
53
CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ESTUDIOS AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD ZACATENCO DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA, BIOFÍSICA Y manera dependiente de cSrc y ERK1/2” T E S I S Que presenta M en C. Odette Monserrat Verdejo Torres Para obtener el grado de Doctora en Ciencias en la Especialidad de Fisiología Celular y Molecular Director de Tesis: Dr. Rubén Gerardo Contreras Patiño Ciudad de México Junio, 2019 “La ouabaína acelera la migración colectiva activando a la metaloproteasa 2, de
Transcript of M en C. Odette Monserrat Verdejo Torres
CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ESTUDIOS AVANZADOS
DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD ZACATENCO DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA, BIOFÍSICA Y
manera dependiente de cSrc y ERK1/2”
T E S I S
Que presenta
M en C. Odette Monserrat Verdejo Torres
Para obtener el grado de
Doctora en Ciencias
en la Especialidad de
Fisiología Celular y Molecular
Director de Tesis: Dr. Rubén Gerardo Contreras Patiño
Ciudad de México Junio, 2019
“La ouabaína acelera la migración colectiva activando a la metaloproteasa 2, de
Este trabajo se realizó en el laboratorio 3 del departamento de Fisiología, Biofísica
y Neurociencias del Centro de Investigación y Estudios Avanzados (CINVESTAV-
IPN), de septiembre 2013 a junio 2019, bajo la dirección del Dr. Rubén Gerardo
Contreras Patiño, con apoyo del CONACyT (420904 y P221513) y SEP-Cinvestav
143.
Agradecimientos
A mi hermana Nataly, por enseñarme cada día que la vida es lo más preciado que tenemos, por su amistad y amor incondicional.
A mis padres, Sara y Arturo, por todo su amor, compresión, dedicación y apoyo absoluto que siempre me han dado para que cumpla cada una de mis metas profesionales y personales.
A mi compañero de vida, David, por su apoyo en mi crecimiento profesional.
A mis amigos y maestros, Dra. Catalina Flores Maldonado, Biol. Raúl Bonilla
Al Dr. Rubén Gerardo Contreras Patiño, por darme la oportunidad de trabajar en su laboratorio.
A la Dra. Teresita Padilla-Benavides, Dra. Ma. Eugenia Mendoza Garrido, .Dr. José Eduardo Pérez Salazar y Dr. Antonio Roberto de Jesús Lara Lemus. Al Sr. Eduardo Estrada por su apoyo técnico.
Moreno y Dra. Vicky García Hernández, por su apoyo, confianza y sus invaluables consejos que me han brindado desde el primer día.
ÍNDICE
Resumen………………………………………………………………………………………………. Abstract…………………………………………………………………………………………………
01 02
Introducción…………………………………………………………………………………………… La Ouabaína………………………………………………………………………………………….. La Na+,K+-ATPasa………………………………………………………………………………........ Na+,K+-ATPasa, ouabaína y adhesión celular…………………………………………………….. La Migración Celular Colectiva……………………………………………………………………… Las metaloproteasas en la migración celular………………………………………………………
03 03 05 09 12 15
Planteamiento del problema………………………………………………………………………… Hipótesis………………………………………………………………………………………………. Objetivo General……………………………………………………………………………………… Objetivos Particulares………………………………………………………………………………..
18 18 18 18
Métodos………………………………………………………………………………………………... Cultivo de células MDCK…………………………………………………………………………….. Ensayo de Migración Celular………………………………………………………………………... Actividad de MMPs: Zimograma en Gelatina……………………………………………………… Expresión de Proteínas: Western blot……………………………………………………………… Transfección celular………………………………………………………………………………….. Análisis Estadístico……………………………………………………………………………………
19 19 19 20 21 21 22
Resultados…………………………………………………………………………………………….. La ouabaína acelera la reparación de heridas…………………………………………………….. La ouabaína acelera la repararción de heridas a través de cSrc y ERK1/2………………........ El aumento de la migración inducido por la ouabaína requiere la activación de FAK………… La migración inducida por ouabaína depende de las MMPs…………………………………….. La migración inducida por ouabaína promueve la secreción de la MMP-2……………………. La secreción y activación de la MMP-2, inducida por la ouabaína, requiere de la activación de cSrc y ERK1/2……………………………………………………………………........................
23 23 24 25 27 28 30
Discusión……………………………………………………………………………………………….
32
Conclusión……………………………………………………………………………………………..
35
Perspectivas………………………………………………………………………………………....... Bibliografía……………………………………………………………………………………………..
36 37
1
Resumen
Los estudios realizados en la línea celular epitelial del riñón de perro Madin-
Darby (MDCK) mostraron que la ouabaína, el inhibidor especifico de la subunidad α
de la Na+,K+-ATPasa, regula la adhesión celular y algunos procesos biológicos
relacionados con la adhesión celular, tales como la migración. En esta Tesis
Doctoral, demostramos que la ouabaína (10 nM) acelera la migración celular
colectiva y repara las heridas en las monocapas de células MDCK cultivadas. La
aceleración de la migración celular inducida por la ouabaína depende de la
activación de la cascada de señalización cSrc-ERK1/2, ya que la migración celular
es bloqueada mediante los inhibidores de especificos de dichas cinasas: PP2 y
PD98059, respectivamente. La activación de la cascada de señalización cSrc-
ERK1/2 indujo la expresión y la activación de la metaloproteinasa-2 de matriz
extracelular (MMP-2). La inhibición de la actividad de MMP usando el inhibidor
genérico GM6001 o el potente inhibidor iMMP-2 impidió el efecto acelerador de la
ouabaína. Del mismo modo, la inhibición de la cinasa de adhesión focal (FAK)
mediante la transfección del péptido dominante negativo FRNK, bloqueó el efecto
de la ouabaína. Estos resultados sugieren que la unión de la ouabaína a la Na+,K+-
ATPasa acelera la migración colectiva de las células MDCK, a través de la
activación de la cascada de señalización cSrc-ERK1/2-FAK y promueve la
expresión, secreción y la actividad de MMP-2.
2
Abstract
Studies made in the Madin-Darby canine kidney (MDCK) epithelial cell line
showed that ouabain, the specific inhibitor of the α subunit of the Na+,K+-ATPase
regulates cell adhesion and cell-adhesion-related biological processes, such as
migration. In this doctoral thesis, we demonstrated that 10 nM ouabain accelerates
collective cell migration and heals wounds in cultured MDCK cell monolayers.
Ouabain-dependent acceleration of cell migration depends on activation of the cSrc-
ERK1/2 signaling cascades, as it was prevented by the specific kinase inhibitors PP2
and PD98059, respectively. Activation of the cSrc-ERK1/2 signaling pathway
increased expression and activation of the extracellular matrix metalloproteinase-2
(MMP-2). Inhibition of MMP activity using the generic inhibitor GM6001 or the
specific iMMP-2 inhibitor, prevented the accelerative effect of ouabain. Likewise,
inhibition of the Focal Adhesion Kinase (FAK) using the dominant negative peptide
FRNK impaired the effect of ouabain. These results suggest that ouabain binding to
the Na+,K+-ATPase accelerates collective migration of MDCK cells through
activation of the cSrc-ERK1/2-FAK signaling cascade and promoting secretion and
MMP-2 activity.
3
Introducción
La Ouabaína
La ouabaína pertenece a la familia de los esteroides cardiotónicos, que son
sustancias que ejercen un efecto inotrópico positivo sobre el miocardio.
Estructuralmente, la ouabaína es una molécula que incluye un núcleo esteroideo,
una lactona y un glucósido, que es una rhamnosa (Fig. 1). La ouabaína y otros
esteroides cardiotónicos, también se conoce como digitálicos porque algunos de
ellos suele purificarse de plantas como las del género Digitalis (Fig. 1) (Bagrov,
Shapiro y Fedorova 2009). La ouabaína se extrajo inicialmente de los tallos del árbol
africano Acokanthera ouabaio y es utilizado para la elaboración de las puntas de
flechas envenenadas por comunidades somalíes (Loubatieres y Arnaud 1948). De
hecho, la palabra somalí “ouabaio” significa veneno de flecha. Además de ser
utilizados en armas, los extractos de plantas que contienen a los esteroides
cardiotónicos se usan desde hace siglos para tratar exitosamente la insuficiencia
cardiaca congestiva (Withering 1785). La dosis terapéutica de los esteroides
cardiotónicos es muy estrecha, oscila entre 2-20 ng/ml, lo cual no impide que uno
de ellos, la digoxina, continúe siendo una alternativa terapéutica en la arritmia
cardiaca (Prassas y Diamandis 2008; Altamirano et al. 2006).
Los esteroides cardiotónicos no solo son de origen vegetal, se ha demostrado
la síntesis de estas sustancias en insectos, anfibios y mamíferos, incluyendo el
humano (Hamlyn et al. 1991). También, se ha demostrado que la ouabaína se
encuentra en el plasma, corteza suprarrenal, hipófisis e hipocampo de mamíferos
(Doris 1996; Doris et al. 1996; Schoner 2002). Por ejemplo, estímulos con hormona
adrenocorticotropa (ACTH) y angiotensina II, de las células de la corteza suprarrenal
cultivadas en medio definido, promueven la secreción de ouabaína al medio (Laredo
et al. 1994). Por otra parte, pacientes con feocromocitoma, tumor de la glándula
suprarrenal, presentan altas concentraciones de ouabaína plasmática (Nishimura,
Masuda y Takahashi 1999). Estos hechos demuestran que las glándulas adrenales
producen ouabaína y la liberan al plasma (Doris et al. 1996).
4
Figura 1. Estructura de la ouabaína.
Los efectos fisiológicos conocidos de la ouabaina incluyen la proliferación e
hipertrofia en cardiomiocitos (Kometiani 1998; Xie 1999); protección de células
epiteliales de la muerte celular inducida por suero, mediante la inducción de ondas
de Ca2+ citosólico y la translocación de factor de transcripción NFκB al núcleo
(Aizman et al. 2001); el aumento de la viabilidad de ciertas líneas celulares (Dvela
et al. 2012); y el aumento de la síntesis de glucógeno en células musculares (Kotova
et al. 2006). El alto consumo de sal, promueve un aumento de la ouabaína en
plasma, promoviendo un incremento en la presión arterial (Dvela et al. 2012;
Fedorova et al. 2010) y natriuresis (Nesher et al. 2009). Durante el ejercicio, la
ouabaína endógena aumenta rápida y transitoriamente, sugiriendo que participa en
la regulación de ese fenómeno fisiológico (Antolovic et al. 2000; Bauer et al. 2005).
La ouabaína, también promueve el rescate de las células epiteliales de apoptosis
en ratones desnutridos durante el desarrollo del riñón (Li et al. 2010), mostrando así
que es importante en el desarrollo.
Los efectos físiológicos mencionados anteriormente, resultan de la interacción
de la ouabaína con su receptor, la Na+,K+-ATPasa.
5
La Na+,K+-ATPasa
La Na+,K+-ATPasa, o bomba de sodio, es un transportador transmembranal de
las células eucariotas superiores (Skou 1957) (Fig. 2), que mantiene el gradiente
electroquímico transmembranal. Esta bomba, junto con las diferencias de
permeabilidad iónica de la membrana, producen las diferencias en las
concentraciones de Na+ y K+ que existe entre el interior y exterior celular, generando
una energía potencial electroquímica necesaria para el transporte de diversas
sustancias a través de la membrana plasmática, el control del volumen celular y el
mantenimiento de la actividad eléctrica de las células excitables (Blanco y Mercer
1998). La Na+,K+-ATPasa pertenece a la familia de las P-ATPasas, que se
caracteriza porque sus miembros presentan DKTGTLT residuos conservados que
se fosforilan transitoriamente durante el ciclo catalítico (Pedersen y Carafoli 1987;
Kaplan 2002).
Figura 2. Esquema de la Na+,K+-ATPasa. En azul se representa a la subunidad α, en rojo la
subunidad β y en amarillo la subunidad γ. La ouabaína en naranja.
La Na+,K+-ATPasa es un trímero proteínico constituido por las subunidades ,
y (Fig. 2). La es la subunidad catalítica que está compuesta por
aproximadamente 1000 residuos de aminoácidos, tiene una masa molecular de
6
aproximadamente 110 KDa, tiene 10 dominios transmembranales (representada en
azul, Figura 2), tanto el extremo amino como el carboxilo son intracelulares, el
primero incluye residuos de aspartato, se han identificado cuatro isoformas distintas
que tienen una expresión tejido-específica (Kaplan 2002). Esta subunidad tiene los
sitios de interacción con el Na+, K+, Mg+ y ATP involucrados en el transporte vectorial
(Kaplan 2002; Cereijido, Contreras y Shoshani 2004; Blanco y Mercer 1998). La
subunidad β es necesaria para el plegamiento correcto de la unidad completa, así
como de la translocación a la membrana, mantenimiento y función en la membrana
plasmática (Blanco y Mercer 1998). La subunidad β es también una molécula de
adhesión en células epiteliales (Shoshani et al. 2005) y esta propiedad permite que
las bombas se expresen específicamente en el dominio lateral, gracias a que el
dominio extracelular de una β se adhiere directamente al de la célula vecina y se
expresa de forma tejido-específica, estudios recientes sugieren que la ouabaína
modula la expresión de la subunidad β1 en la membrana, promoviendo la adhesión
celular (Padilla-Benavides et al. 2010; Cereijido et al. 2012; Vilchis-Nestor et al.
2019). La subunidad tiene una expresión tejido-específica y regula la actividad
de la bomba (Béguin et al. 2001).
Interacción de la subunidad con la ouabaína
La subunidad α, además de tener la función catalítica, es el receptor a
esteroides cardiotónicos, principalmente la ouabaína (Rossi et al. 1982; Blanco y
Mercer 1998). Esta substancia accede a su sitio de unión en la subunidad α desde
el lado extracelular y se inserta en el dominio transmembranal de la proteína (Fig.
3) (Ogawa et al. 2009). Los esteroides cardiotónicos, en general, se unen a la
subunidad α con una selectividad y afinidad que dependen tanto de la isoforma α
involucrada, como del tipo de esteroide estudiado (Fedorova et al. 2010, Blanco y
Mercer 1998).
Mientras que las altas concentraciones de ouabaína inhiben el bombeo de
iones (Schatzmann 1953), concentraciones no saturantes revelaron que la
subunidad α se asocia con proteínas transductoras y activa varias vías de
señalización intracelular. Entre estas, se activa la cinasa oncogénica cSrc, que
7
transactiva al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), promoviendo
la activación de las cinasas reguladas extracelulares 1/2 (ERK1/2), que induce la
proliferación celular, la hipertrofia y la comunicación celular (Liu et al. 2000; Wang
et al. 2004), mientras que la asociación de la subunidad α al receptor de inositol
trifosfato (IP3R) induce cambios cíclicos en la concentración del Ca2+ citosólico, la
translocación de NFκB al núcleo y la sobrevivencia celular (Aizman et al. 2001;
Zhang, Wang y Chen 2006; Yuan et al. 2005).
Figura 3. Cristal de la Na+,K+-ATPasa unida a la ouabaína. (A) estructura de alambre de la
Na+,K+-ATPasa. N es el dominio de unión a nucleótidos, P es el de fosforilación, β señala los
dominios transmembranal y extracelular de la subunidad β, M membrana plasmática, M1-5 dominios
transmembranales de la subunidad α, FDXY es la subunidad, OBN ouabaína. (B) acercamiento del
sitio de unión de la ouabaína con la hormona representada con la estructura de alambre y la nube
de electrones (malla violeta). (C) estructura de líneas de la ouabaína con sus distintos componentes.
(Ogawa et al. 2009).
8
La activación de estas rutas en ocasiones es independiente de la actividad de
la bomba (Akimova et al. 2006; Contreras et al. 2004; Oweis et al. 2006). De hecho,
las funciones de bombeo y señalización se pueden disecar. Una mutación que
reduce el tamaño de las cadenas laterales de los aminoácidos que componen el
sitio de la Na+,K+-ATPasa que une a cSrc, impide que la ouabaína active a ERK1/2
sin alterar la actividad de transporte (Ye et al. 2013). Al activar rutas de señalización,
la Na+,K+-ATPasa modifica el estado diferenciado, la proliferación celular, así como
el transporte de sustancias transmembranal y transepitelial (Tian et al. 2006;
Contreras et al. 2006). La incubación de células epiteliales con ouabaína, induce la
endocitosis de la Na+,K+-ATPasa (Contreras et al. 2004; Larre et al. 2006; Liu et al.
2004) y del transportador Na+/H+ (Oweis et al. 2006), disminuyendo así el transporte
transepitelial de Na+ (Cai et al. 2008).
Figura 4. Bloqueo de la bomba de sodio por concentraciones saturantes de ouabaína.
La exposición de las células epiteliales a concentraciones saturantes de ouabaína, promueven la
inhibición catalítica de la bomba, y una cascada de señalización que involucra la activación de Src y
ERR1/2, que promueve la inhibición de la proteína RhoA, generando la endocitosis de las proteínas
de unión célula-célula y célula-sustrato, lo que lleva al despegue y muerte celular.
En las células de riñón de perro Madin-Darby (MDCK), la ouabaína a una
concentración de 10 nM, fortalece las uniones estrechas (Larre et al. 2010). Sin
embargo, una concentración saturante de ouabaína, ≥ 300 nM, induce endocitosis
y degradación de la adhesión célula-célula y célula-sustrato, y como consecuencia,
el despegue y la muerte de las células epiteliales a través de la activación de la vía
9
de señalización EGFR-cSrc-ERK1/2 (Orlov et al. 1999; Contreras et al. 1999;
Rincon-Heredia et al. 2014) (Fig. 4).
Na+,K+-ATPasa, ouabaína y adhesión celular
Adicionalmente, el mecanismo mediante el cual la Na+,K+-ATPasa participa en
la adhesión celular y el mantenimiento de la integridad epitelial, depende también
de la subunidad β. Esta subunidad es necesaria para la formación de uniones
estrechas (Rajasekaran et al. 2001), uniones adherentes (Vagin et al. 2006) y es
una molécula de adhesión en células gliales y epiteliales (Gloor et al. 1990;
Shoshani et al. 2005). El dominio extracelular de la subunidad β interactúa con un
dominio idéntico en la membrana plasmática de las células vecinas, lo que
contribuye a mantener el Na+,K+-ATPasa en la membrana lateral (Padilla-Benavides
et al. 2010; Contreras et al. 1995; Cereijido et al. 2012; Shoshani et al. 2005). Las
interacciones homotípicas mediadas por la subunidad β dependen del estado de
glicosilación de la proteína y de una región extracelular ácida de 10 residuos
(Tokhtaeva et al. 2012).
La expresión de la subunidad γ de la bomba de sodio, correlaciona con la
regulación negativa de la E-cadherina, lo que disminuye la adhesión celular y
promueve metástasis. Evidencias experimentales han mostrado que la subunidad γ
esta sobreexpresada en células cancerígenas (Tokhtaeva et al. 2016).
Experimentos en modelos in vitro de células epiteliales cultivadas, han
mostrado que la interacción de la subunidad con la ouabaína, a concentraciones
cercanas a los niveles fisiológicos (10 nM), induce la expresión de moléculas de
adhesión. Por ejemplo, la ouabaína favorece la síntesis de claudinas, proteínas
transmembranales que componen las uniones estrechas y modulan el grado de
sellado de la unión (Larre y Cereijido 2010) (Fig. 5). También induce la translocación
de la β-catenina al núcleo en las células MDCK (Contreras et al. 2004), esta proteína
citoplásmica, además de participar en la adhesión celular (Fig. 5), es un componente
crucial de la ruta de señalización de WNT, que promueve la supervivencia celular
(Conacci-Sorrell et al. 2002). Además, concentraciones nM de ouabaína, inducen
10
también la expresión de las conexinas 32 y 43 en la membrana plasmática de
células epiteliales y, en consecuencia, aumenta la comunicación intercelular
mediada por uniones comunicantes (Larre et al. 2006; Cereijido et al. 2012; Ponce
et al. 2016) (Fig. 5).
Figura 5. La ouabaína regula las uniones célula-célula. Cuando la bomba une ouabaína,
se activan las rutas de señalización como cSrc-ERK1/2 y -catenina (-CAT), que a su vez, modulan
distintos elementos de la adhesión celular como uniones estrechas (claudinas 1, 2 y 4, círculos rojo,
verde y morado, respectivamente), uniones adherentes (E-CADH,) y uniones comunicantes
(conexinas). La ouabaína es representada como anillos rojos y la bomba como silueta morada y
verde.
Actualmente, la ouabaína es considerada una hormona esteroidea de la
corteza suprarrenal y el hipotálamo (Schoner 2002), y la información previamente
descrita, sugiere que puede regular la adhesión celular (Contreras et al. 2006;
Cereijido et al. 2012), por lo tanto, es posible que también module los procesos
biológicos tales como la proliferación, diferenciación, comunicación, polaridad y
migración celular. Es aceptado que las uniones estrechas, comunicantes y al
11
substrato se modifican con la ouabaína (Larre et al. 2006; Larre y Cereijido 2010;
Cereijido et al. 2012; Contreras et al. 2006; Rincon-Heredia et al. 2013). También
se sabe que la ouabaína regula el proceso de polaridad en la línea celular de riñón
de perro MDCK, pues acelera expansiones celulares filiformes, es decir, el
desarrollo del cilio mayor e induce un incremento en su longitud, esta estructura es
considerada una característica importante de la polaridad (Larre et al. 2011) (Fig.
5). Por otro lado, la ouabaína y la marinobufagenina, otro esteroide cardiotónico,
también regulan la interacción de las células con el sustrato, ya que aumentan la
producción de colágena en fibroblastos y favorecen la cicatrización en la piel del
ratón (El-Okdi et al. 2008). En células MDCK, la ouabaína a 10 nM acelera la
migración celular (Cuellar 2007) (Fig. 6).
Figura 6. La migración de las células MDCK aumenta con la ouabaína. Usando el modelo
de reparación de herida en células MDCK cultivadas, se hicieron heridas a monocapas confluentes,
se incubaron 1 h con 4 μg/ml de mitomicina, para inhibir la proliferación celular, y se registró el
tamaño de la herida al tiempo 0. Posteriormente, se incubaron 5 h con ouabaína y se fotografiaron
de nuevo para calcular la distancia migrada. Control (círculos blancos) o con 5 (círculos rosas) o 10
nM (Círculos rojos) de ouabaína en el medio. n= a seis experimentos independientes. (Cuellar 2007).
12
La Migración Celular Colectiva
La migración celular colectiva es la movilización coordinada de grupos de
células bajo la guía de una o varias células líderes (Scarpa y Mayor 2016; Ridley et
al. 2003). Juega un papel fundamental durante el desarrollo normal y la metástasis
(Vedula et al. 2013) (Fig. 7).
Figura 7. Migración celular colectiva. A. La locomoción de las células en una monocapa
altamente densa están sujetas a la inhibición por contacto, todas las células son inhibidas
simétricamente, lo que resulta en poca migración. B. La disponibilidad de un espacio libre para
migrar, rompe la simetría y polariza las células posteriores al borde de migración. Esto supera las
señales inhibitorias y promueve la motilidad celular. C. Las células en movimiento que se encuentran
en el frente de migración, ejercen fuerzas atractoras sobre sus vecinas, que, a su vez, coordinan su
movimiento. D. Promoviendo un movimiento celular coordinado (Vedula et al. 2013).
13
En general, la migración celular es un proceso en el que una célula responde
a un estímulo formando y/o ampliando protuberancias localizadas específicamente
en la porción de la membrana que se orienta hacia el frente migratorio (Vedula et
al. 2013). Estas protuberancias membranales pueden ser lamelipodios, que son
grandes y laminares, y/o filopodios, de forma digitiforme (Vedula et al. 2013). Su
formación y función es impulsada por la polimerización de actina y se estabilizan
adhiriéndose a la matriz extracelular (MEC) o células adyacentes, a través de
receptores transmembranales que inducen la formación de complejos de adhesión
asociados al citoesqueleto (Vedula et al. 2013). En medios constituidos por mallas
tridimensionales de colagena, las células también pueden avanzar por movimiento
ameboideo, con protrusiones esféricas o “ámpulas”, por su nombre en inglés “blebs”
(Charras et al. 2008). Sobre superficies duras, las células, individualmente o en
grupos, avanzan formando adhesiones en el frente de migración y desmontándolas
en la parte trasera de las células (Lauffenburger y Horwitz 1996).
La migración celular requiere la formación cíclica y el ensamble y desensamble
de las adhesiones focales, que son complejos de proteínas integrales y asociadas
a la membrana, como las integrinas, que unen la célula a la matriz extracelular
(ECM) y la cinasa de adhesión focal (FAK), también fundamental en este proceso
(Burridge y Chrzanowska-Wodnicka 1996).
Una de las primeras proteínas de señalización reclutadas en la adhesión focal es
FAK, una tirosina quinasa no receptora que une talina y paxillin, a través de su
focalización en su dominio C-terminal, FAK es una proteína que desencadena la
respuesta celular a la MEC, actuando como un integrador de la señalización
(Mousson et al. 2018). En general, la fosforilación de FAK en el residuo de Y397
crea un sitio de unión para el dominio SH2 de cSrc, Dentro de este complejo, cSrc
fosforila a FAK en los residios Y576 y Y577, creando una conformación abierta de
FAK que funciona como un andamiaje y promueve el reclutamiento de más
proteínas al complejo, como vinculina, paxilina, talina entre otras (Mousson et al.
2018). El reclutamiento de proteínas en las adhesiones focales, es importante para
poder generar un cambio más dinámico de la polimerización de actina, a través del
14
cual se genera la fuerza de tracción necesaria para mover a la célula y al conjunto
celular que forma la monocapa en dirección a la migración (Vedula et al. 2013) (Fig.
8).
Figura 8. Participación de las adhesiones focales en la migración celular colectiva. Para
generar fuerza para el movimiento celular y las elongaciones de la membrana durante la migración,
es necesario la interacción del citoesqueleto con la matriz extracelular (MEC). Las adhesiones
focales están encargadas de dichos procesos, y son un conjunto dinámico de proteínas que
transmiten señales del exterior al interior celular y viceversa, debido a que este macrocomplejo de
proteínas conecta el citoesqueleto con la MEC. El cambio conformacional constante de las
Integrinas, en las células en movimiento, genera el reclutamiento, fosforilación y activación de las
cinasas FAK y cSrc (Mousson et al. 2018).
Una parte esencial de la migración celular es la MEC, que está compuesta por
una gran cantidad de fibras proteicas, proteoglicanos y proteínas asociadas a la
matriz (Mouw y Weaver 2014). Las modificaciones postraduccionales y la
composición bioquímica y biomecánica de la MEC están reguladas dinámicamente,
a través de receptores transmembranales especializados que incluyen a las
integrinas, que una vez activados, reconocen motivos específicos dentro de la MEC,
induciendo cambios conformacionales en el complejo proteico de las adhesiones
15
focales y posteriormente, activan la señalización para influir en la migración celular
colectiva (Kai et al. 2019).
Adicionalmente, las células regulan la composición de la ECM al secretar
metaloproteinasas de matriz dependientes de Zn2 + (MMPs) en respuesta a
factores de crecimiento, hormonas y citoquinas (Page-McCaw et al. 2007; Duarte et
al. 2015; Ra y Parks 2007).
Las metaloproteasas en la migración celular
Las MMPs regulan la migración celular, la remodelación de tejidos, la
cicatrización de heridas, la angiogénesis y desempeñan un papel en la artritis, el
cáncer y la ulceración de tejidos (Vargová et al. 2012). Estas proteasas son
dependientes de Zn2+ y Ca2+ y pueden ser solubles (MMPs) o de membrana (MT-
MMPs). Según el sustrato que degraden, reciben los nombres de gelatinasas,
colagenasas, matrilasas, entre otras (Fig. 9).
Figura 9. Estructura de la familia de metaloproteasas. En verde se representa la secuencia
señalizadora; en marrón el propéptido: el rectángulo naranja es el sitio catalítico de unión al Zn2; y
los círculos naranjas representan el dominio de hemopexinas.
Las MMPs se sintetizan como zimógenos inactivos en estado latente (pro-
MMPs), debido a que el prodominio enmascara el sitio activo al prevenir la
hidratación del ión Zn2+, una vez secretadas las MMPS, se hidrata el sitio activo del
16
prodominio y se activan (Sternlicht y Werb 2001). La activación de las MMPs se da
en respuesta a estímulos como son los factores de crecimiento, las hormonas, las
citosinas y sus inhibidores específicos (TIPMs) (Visse y Nagase 2003; Sternlicht y
Werb 2001) (Fig. 10). Rara vez la actividad aumenta por síntesis de nuevas MMPs
(Borkakoti 2004).
Figura 10. Mecanismo de activación de la pro-MMP-2 mediada por MT1-MMPy TIMP-2.
En gris se representa a la colágena y en flechas rojas a la laminina, blancos de degradación de las
MMPs activas (círculos verdes, amarillos y naranjas). El cuadro de la derecha, representa la
activación dela MMP-2: MT1-MMP se dimeriza y TIMP2 sirve de andamio para unir a la MMP-2 y
poder así activar a la MMP-2.
La MMP-2 es una gelatinasa involucrada en la migración de las células
epiteliales, fibroblastos y del sistema inmune (Giannelli et al. 1997), promoviendo
los cambios estructurales en la MEC, necesarios para la remodelación de tejidos y
la invasión celular. Por ejemplo la MMP-2 corta a la laminina-5, dejando descubierto
un sitio pro-migratorio que promueve la motilidad en células de epiteliales de mama
(Giannelli et al. 1997). La MMP-2 (gelatinasa A) y la MMP-9 (gelatinasa B) degradan
fácilmente el colágeno y la gelatina, la estructuras de estas enzimas tienen tres
repetidos de dominios fibronectina insertados en el dominio catalítico en el cual se
encuentra el Zn, que se une a la gelatina, a las colágenas y las lamininas (Fig. 9C)
(Visse y Nagase 2003). La pro-MMP-2 es activada en la superficie celular y es
17
mediada por la MT-MMPs, entre ellas se encuentra la MT1-MMP, MT3-MMP, MT5-
MMP y MT6-MMP (Fig. 9B). La activación de la pro-MMP-2 mediada por la MT1-
MMP requiere de la asociación de TIMP-2 a ésta, inhibiendo su actividad (Visse y
Nagase 2003). La MT1-MMP puede formar dímeros o multímeros en la superficie
celular a través de la interacción de los dominios hemopexina e unir a TIMP-2.
Posteriormente la pro-MMP-2 se une al dominio C–terminal de TIMP-2 a través de
su dominio de hemopexina, permitiendo que la MT1-MMP vecina hidrolice a la
MMP-2, liberándose de la membrana en su forma activa (Visse y Nagase 2003) (Fig.
10). La MMP-2 activa, han sido implicada en el control de del procesamiento de
factores de crecimiento que se encuentran en la membrana plasmática,
promoviendo la transactivación de los receptores a factores de crecimiento,
promoviendo procesos como la migración celular, el desarrollo muscular, la
fertilización y diferenciación celular (Roelle et al. 2003).
18
Planteamiento del problema
¿Cuál es el mecanismo mediante el cual la ouabaína promueve la migración
colectiva de las células MDCK?
Hipótesis
La ouabaína estimula la migración de células epiteliales a través de la
Na+,K+-ATPasa-cSrc-ERK1/2, promoviendo la activación de FAK y aumentando la
secreción y activación de la MMP-2.
Objetivo General
Investigar el mecanismo por el que la ouabaína promueve la migración
colectiva de las células MDCK.
Objetivos Particulares
1. Evaluar si cSrc y ERK1/2 participan en la migración colectiva de las células
MDCK inducida por ouabaína.
2. Investigar si FAK participa en la migración colectiva de las células MDCK inducida
por ouabaína.
3. Examinar la participación de las MMPS en la migración colectiva de las células
MDCK inducida por ouabaína.
4. Identificar cual gelatinasa participa en la migración colectiva de las células MDCK
inducida por ouabaína.
5. Analizar si la secreción y activación de la MMP-2 participa en la migración
colectiva de las células MDCK inducida por ouabaína.
6. Averiguar si cSrc y ERK1/2 participan en la secreción y activación de la MMP-2
inducida por ouabaína.
19
Métodos
Cultivo de células MDCK
Las células MDCK se sembraron en placas de Petri (Corning Costar) a 70%
de densidad y se incubaron 24 h a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 % en medio
de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Life Technologies) suplementado con
penicilina (10.000 unidades/ml), estreptomicina (10 mg/ml, in vitro) y 10 % de suero
bovino fetal (FBS) suplementado con hierro (Life Technologies). En preparación
para los experimentos, las células se privaron de suero, incubándolas durante 20 h
en DMEM complementado con penicilina (10.000 U/ml) y estreptomicina (10 mg/ml).
Ensayo de Migración Celular
Las monocapas confluentes de MDCK, depletadas de suero, se incubaron
durante 1 h con 4 mg/ml de mitomicina C para inhibir la proliferación celular, y en
presencia o ausencia de cada uno de los siguientes inhibidores: GM6001 (N - [(2R)
2- (hidroxamidocarbonilmetil) -4-metilpentanoil] l-triptófano metilamida), inhibidor
genérico de MMPs (Sigma-Aldrich); PP2 (4-amino-5- (4-clorofenil) -7 (dimetiletil)
pirazolo [3,4-d] pirimidina), inhibidor de cSrc (Merck); PD98059 (2'-amino-3'-
metoxiflavona), inhibidor de la quinasa MEK1/2 que afecta la activación de ERK1/2
(Merck); y iMMP-2 ((2R) - [(4-bifenililsulfonil) amino] N-hidroxi-3-fenilpropionamida),
inhibidor específico de MMP-2 (Merck). La mitomicina C bloquea la proliferación, es
un anticarcinógeno usado contra el glaucoma que entrecruza guaninas contiguas
frenando así la replicación y la proliferación (Mao et al. 199). PP2 inhibe a cSrc, al
unirse a un área de la molécula que no se superpone con el dominio de unión a ATP
(Hanke et al.1996). PD98059 es un inhibidor potente y selectivo de las MAP cinasas
cinasas (MAPKK), MEK1 y MEK2 (Alessi et al.1995). Se une a la forma inactiva de
MAPKK y evita la activación por parte de activadores ascendentes como cRaf. El
GM6001 inhibe a las MMPs porque su estado aniónico del grupo ácido hidroxámico
forma un complejo bidentado con el sitio activo de Zn2+ (Santiskulvong et al.2003).
20
Se usó una punta de pipeta de 1 ml esterilizada para generar heridas a través
de la monocapa de las células MDCK, y los residuos se lavaron con PBS. Después,
las monocapas se incubaron, con 10 nM de ouabina durante 5 h. La parte inferior
de la placa se marcó como referencia y el mismo campo de las monocapas se
fotografió inmediatamente después de practicar la herida (tiempo = 0 h) y 5 h
después de la incubación con ouabaína (t = 5 h), se analizaron 18 imágenes por
placa. La distancia entre los bordes de la herida se midió en el momento 0 y a las 5
h, y la distancia migrada reportada en las figuras, corresponde a la diferencia entre
estos dos. Las distancias entre los bordes de cada imagen se calcularon a partir del
área libre de células dividida por la altura de la imagen, utilizando el software ImageJ
y la herramienta de coherencia de cicatrización de heridas MRI (Schneider et al.
2012).
Actividad de MMPs: Zimograma en Gelatina
Se colectaron los medios de cultivo de células MDCK usadas en el ensayo de
migración celular a las 5 h, descritas anteriormente. Las muestras de proteínas se
precipitaron con ácido sulfosalicílico al 3% y la actividad proteolítica de las MMPs
se analizó en geles de gelatina-sustrato como se describió anteriormente (Charvat
et al. 1998; Heussen y Dowdle 1980). Brevemente, 30 µg de proteína no
desnaturalizadas, se mezclaron con solución amortiguadora de muestra no
desnaturalizante (SDS al 2.5%, sacarosa al 1% y rojo de fenol al 4%) y se separaron
en geles de poliacrilamida al 8 % co-polimerizados con gelatina (1 mg/ml). La
electroforesis se realizó a 72 V durante 2 h. Los geles se enjuagaron dos veces en
Triton X-100 al 2.5 % para eliminar el SDS y luego se incubaron en el buffer de
ensayo (Tris-HCl 50 mM, pH 7.4 y 5 mM CaCl2) a 37 ° C durante 48 h. Los geles se
fijaron y se tiñeron con Azul de Coomassie Brillante, G-250, al 0.25% en ácido
acético al 10% y metanol al 30% (Cortes-Reynosa et al. 2008). Los geles se pasaron
a imágenes por medio de un escáner.
21
Expresión de Proteínas: Western blot
Las células MDCK con heridas, incubadas 5 h en diferentes condiciones
indicadas en las figuras, se lavaron dos veces con PBS frío, suplementado con 1.8
mM Ca2+ y posteriormente se incubaron durante la noche a -20 °C con solución
amortiguadora de lisis (Tris 20 mM pH 7.0, 2 mM EGTA, 5 mM EDTA, 30 mM NaF,
40 mM β-glicerofosfato, 1 mM Na3VO4, 3 mM benzamidina, 0,5% Nonidet P-40,
Sigma-Aldrich) complementado con inhibidor de proteasa completo (Roche Applied
Science). Los extractos celulares se almacenaron a -20 ºC hasta su uso.
Los extractos se descongelaron y pasaron 10 veces a través de una aguja de
calibre 21. El contenido total de proteínas se cuantificó utilizando el ensayo BCA
siguiendo las instrucciones del fabricante (Thermo Fisher Scientific). Las muestras
se diluyeron en buffer de muestra Laemmli, se resolvieron mediante SDS-PAGE al
10% y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF, BioRad).
Las membranas se incubaron con un anticuerpo policlonal de conejo anti-MMP-2
(Santa Cruz Biotechnologies) durante 2 h a 37 °C seguido de un anticuerpo
secundario de cabra anti-conejo IgG (H + L) acoplado a HRP (Thermo Fisher
Scientific). Las bandas se revelaron con el reactivo de detección de transferencia
Western Prime de ECL (General Electric Company). Los análisis densitométricos se
realizaron utilizando el software ImageJ.
Transfección celular
Las células MDCK sembradas al 80 % de confluencia, fueron transfectadas
usando Lipofectamina 2000, según las instrucciones del fabricante (Thermo Fisher
Scientific). Las células se transfectaron con 2.5 µg/ml de vector de expresión
pFLAG-CMVtm-2, que contiene el dominio no-cinasa relacionado con FAK humana
(FRNK, por sus siglas en inglés), que consiste en el dominio FAT C-terminal de FAK,
un fragmento que actúa como un regulador dominante negativo de la actividad de
cinasa de FAK (Heidkamp et al. 2002; Koshman et al. 2010). Después de 5 h en la
mezcla de transfección, las monocapas se lavaron y se incubaron en DMEM
complementado con FBS al 10% durante 20 h. Antes de comenzar los ensayos de
22
migración, las monocapas se cultivaron durante 20 horas adicionales en medio sin
suero.
Análisis Estadístico
La significancia estadística se calculó utilizando pruebas t no pareadas o
análisis de varianza de una vía (ANOVA), seguido de pruebas de comparación
múltiple de Bonferroni, utilizando Prism 5 (software GraphPad). Los asteriscos
representan: * p>0.05; ** p<0,01; y *** p<0.001. Para la distancia migrada, los datos
experimentales se normalizaron multiplicándolos por un factor que consiste en el
promedio total de todas las mediciones de control, dividido por el promedio de los
controles correspondientes.
23
Resultados
1. La ouabaína acelera la reparación de heridas
La Na+,K+-ATPasa, como receptor de la ouabaína, desencadena vías de
señalización que promueven cambios en la adhesión célula-célula y célula-sustrato
(Contreras et al. 1999, 2004; Rincon-Heredia et al. 2014). En este trabajo,
investigamos el efecto de una concentración fisiológica de ouabaína en la migración
de células MDCK, utilizando un ensayo clásico de cicatrización de heridas.
Figura 11. La ouabaína acelera la reparación de heridas. Las imágenes A-D, son
representativas de microscopía de luz del ensayo de reparación de heridas con células MDCK. A y
B, son heridas de monocapas de MDCK a las 0 h. C y D, muestran los mismos campos después de
5 h con y sin 10 nM de ouabaína. E, es la cuantificación de la distancia migrada de células MDCK
durante el tratamiento con ouabaína. La caja blanca representa las células control; la caja azul son
las células incubadas con 10 nM de ouabaína. *** p <0,001, prueba de t no pareada de dos colas.
Este ensayo consiste en rasgar una monocapa de células confluentes y medir
el grado de cierre de la herida en un marco de tiempo determinado. Las imágenes,
representativas de microscopía de luz de campo amplio, mostraron el tamaño de la
herida inmediatamente después de realizarse (Fig. 11A,B), y 5 h más tarde en las
condiciones de control (Fig. 11C) o tratadas con ouabaína (Fig. 11D). Encontramos
que 10 nM ouabaína aceleró la migración colectiva de las monocapas de células
24
MDCK. La medición de 19 experimentos independientes mostró que la distancia de
las células MDCK tratadas con ouabaína aumentó significativamente en
comparación con las células de control (Fig. 11E).
2. La ouabaína acelera la repararción de heridas a través de cSrc y ERK1/2
Nuestro grupo ha reportado, que la ouabaína afecta la adhesión celular y la
polaridad a través de una vía de señalización intracelular que incluye a las cinasas
cSrc y ERK1/2 (Cereijido et al. 2012). Nuestra hipótesis es que estas cinasas
también pueden regular la migración de células MDCK tras la estimulación con
ouabaína. Por lo tanto, probamos el efecto del PP2, un inhibidor de cSrc, y el
PD98059, un inhibidor de MEK1/2, que impide la activación de ERK1/2, sobre el
efecto inducido por la ouabaína en la migración colectiva de células MDCK. La figura
12 muestra imágenes representativas de microscopía de luz de células MDCK
cultivadas en condiciones de control (Fig. 12A) y también tratadas con 10 nM de
ouabaína (Fig. 12B). La adición de 10 µM de PP2 a los medios de cultivo (Fig.
12C,D) y de 25 µM de PD98059 (Fig. 12E,F) bloqueó el efecto de 10 nM de
ouabaína en la migración celular. La medida de la distancia migrada de cuatro
réplicas biológicas independientes (Fig. 12G), confirmó que la inhibición de las
cinasas cSrc y ERK1/2, impiden el efecto de la ouabaína observado en la migración
colectiva de células MDCK, lo que demuestra la participación de la activación de
cSrc y ERK1/2 en este proceso. Las imágenes presentadas en la figura 12H, son
western blots representativos que demuestran que la ouabaína activó a cSrc y
ERK1/2, y que PP2 y PD98059 bloquearon esta activación, como se había mostrado
anteriormente (Rincon-Heredia et al. 2014).
25
Figura 12. La ouabaína acelera la cicatrización de heridas a través de cSrc y ERK1/2.
Las imágenes son representativas de microscopía de luz del ensayo de reparación de heridas con
las células MDCK. Las monocapas de MDCK heridas se incubaron 5 h (A) sin o (B) con 10 nM
ouabaína, con o sin un inhibidor de cSrc (C,D; PP2 10 µM) o ERK1 / 2 (E,F; PD98059 de 25 μM)
durante 5 h. Los inhibidores se añadieron a los medios de cultivo 1 h antes de la ouabaína. G, El
gráfico muestra el análisis estadístico de la distancia que las células MDCK migraron colectivamente
durante el ensayo de cicatrización de heridas. Las cajas blancas representan células de control; Las
cajas azules son las células incubadas con ouabaina. H, Imágenes representativas de western blots
de extractos de células enteras con anticuerpos contra el total (tcSrc, 60 KDa) o fosforilado (pcSrc)
cSrc, o total (tERK1/2, 42 y bandas de 44 KDa) o fosforilado (pERK1/2) ERK1/2. * p <0.05, prueba
ANOVA, Bonferroni.
3. El aumento de la migración inducido por la ouabaína requiere la
activación de FAK
La migración celular colectiva requiere de una unión más laxa en la adhesión
célula-célula de la región cercana a la herida, el ensamblaje y desmontaje cíclico de
las adherencias focales y la activación de FAK, una cinasa que participa en ambos
procesos (Bjerke et al. 2014). Estos hechos nos llevaron a investigar si FAK es
necesaria para la inducción del efecto de la ouabaína en la migración colectiva de
células MDCK. Para probar esta posibilidad, expresamos el péptido dominante
26
negativo FRNK, en las células MDCK (Heidkamp et al. 2002; Koshman et al. 2010),
y realizamos ensayos de reparación de herida. La figura 13 muestra imágenes
representativas de microscopía de luz de células MDCK, cultivadas en condiciones
control (Fig. 13A,C) y también tratadas con ouabaína 10 nM (Fig. 13B,D), que
muestra la reparación de la herida que produce la ouabaína. La expresión del FRNK
transfectado (Fig. 13C,D), no altera la herida del control, pero bloquea el efecto del
cierre impuesto por la ouabaína (Fig. 13D), produciendo distancias de migración
similares a las de las células control. Como se esperaba, las células transfectadas
con el fragmento FRNK expresaron el péptido dominante negativo, como se muestra
en un western blot representativo en la figura 13E, pero no así las células que se
transfectaron con el vector vacío.
Figura 13. El aumento de la migración inducido por la ouabaína requiere la activación
de FAK. Imágenes representativas, obtenidas por microscopía de luz, de monocapas de MDCK
transfectadas sin (A, B) o con (C, D) un plásmido que codifica FRNK, una secuencia negativa
dominante de FAK. A las 24 h después, las monocapas se incubaron durante 5 h sin (A,C) o con
(B,D) 10 nM de ouabaína. E, imágenes de electrotranferencia e inmunodetección representativas
que muestran la expresión de FRNK y de actina de las monocapas de MDCK. F, muestra la
cuantificación de la distancia migrada de las células MDCK tras la incubación de ouabaína. Las cajas
blancas representan células control; Las cajas azules son las células incubadas con ouabaína. *
p<0.05, prueba ANOVA, Bonferroni.
27
La distancia migrada de las células MDCK que expresan el FRNK fue
estadísticamente idéntica a la de las células control y confirmó que la inhibición de
FAK, con la expresión del FRNK, impidió el efecto de la ouabaína en la migración
colectiva de células MDCK (Fig. 13F).
4. La migración inducida por ouabaína depende de las MMPs
Otro mecanismo bien conocido para la inducción de la migración celular
consiste en la secreción de MMPs que modifican la MEC o eliminan o liberan
péptidos, como el HB-EGF, a partir de sus precursores membranales o de sus
almacenes en la MEC, que provocan una migración celular más rápida (Lu et al.
2011; Mifune et al. 2005). Nos preguntamos si las concentraciones fisiológicas (10
nM) de ouabaína, también pueden inducir la activación de las MMPs para acelerar
la migración. Para probar esta hipótesis, utilizamos el inhibidor genérico de MMPs,
GM6001, en el ensayo de reparación de heridas.
Figura 14. La migración inducida por ouabaína depende de las MMPs. A-D, son imágenes
representativas de microscopía de luz de células MDCK durante un ensayo de reparación de heridas.
Las monocapas de células se incubaron 5 h sin (A,C) o con (B,D) 10 nM de ouabaína, C y D con 25
µM de GM6001, inhibidor genérico de las MMPs. El GM6001 se añadió 1 h antes de la ouabaína. E,
representa la medición de la distancia migrada de las células MDCK después de los tratamientos.
Las cajas blancas representan células control; las cajas azules son las células incubadas con
ouabaína. * p<0.05, prueba ANOVA, Bonferroni.
28
Las imágenes de la figura 14 (A,C) son representativas de microscopía de luz
de las células MDCK de control y tratadas con GM6001 tratadas, las cuales no
mostraron diferencias cuando las células se cultivaron en ausencia de ouabaína.
Sin embargo, cuando se añadió el inhibidor a los medios de cultivo en presencia de
la ouabaína, se eliminó el efecto de la hormona en la reparación de las heridas (Fig.
14D) en comparación con las células tratadas solo con ouabaína (Fig. 14B), según
lo confirma el análisis estadístico. Estos datos sugieren que las un mecanismo
potencial mediante el cual la ouabaína induce la migración celular es la activación
de MMPs.
5. La migración inducida por ouabaína promueve la secreción de la MMP-2
A continuación investigamos cual MMP podría estar involucrada en la
migración celular. Por la facilidad de estudiarlas, restringimos el análisis a las MMP
secretadas con actividad gelatinolítica en los medios de cultivo de monocapas de
células MDCK. Esta actividad en particular, resulta de la activación de la MMP-2 y
la MMP-9, según lo detectado por la actividad gelatinolítica de bandas ubicadas
entre 72 y 63 KDa (MMP-2) y 93 KDa (MMP-9). Los medios de cultivo de monocapas
de células MDCK, que se obtuvieron de los ensayos de reparación de heridas,
muestran las bandas características de 72–63 KDa que resultan de la actividad de
la MMP-2 en el zimograma (Fig. 15A). Esta señal se intensificó significativamente
por adición de la ouabaína al medio de cultivo (Fig. 15A,B). Es importante destacar
que no se detectó ninguna banda a 93 KDa, lo que sugiere que MMP-9 no está
asociada con los procesos de migración celular de las células MDCK inducidos por
ouabaína (Fig. 15A).
Un western blot representativo mostró que la MMP-2 aparecía como bandas
de 72 y 63 KDa, correspondientes a sus formas inactiva y activa, respectivamente
(Fig. 15C,D). El aumento en la actividad gelatinolítica inducida por 5 h de incubación
con ouabaína, correlacionó con un aumento en la cantidad de proteína de la MMP-
2 en el medio de cultivo (Fig. 15D) y una reducción en los extractos de proteína
celular total (Fig. 15C), lo que sugiere que la ouabaína indujo la secreción y la
activación de la MMP-2, que ya estaba presente en las células. Estos resultados
29
sugieren que la ouabaína promueve la secreción y la activación de la MMP-2 en la
migración de las células MDCK.
Figura 15. La ouabaína induce la secreción y activación de la MMP-2. A, muestra un
zimograma representativo de un gel de gelatina, que contiene proteínas secretadas al medio de
cultivo de las monocapas de MDCK, que se utilizaron en el ensayo de reparación de heridas después
de 5 h de incubación con o sin ouabaína 10 nM. B, corresponde al análisis densitométrico de los
zimogramas. C, muestra el western blot representativo de MMP-2 obtenida de los lisados celulares
de las monocapas de MDCK y la cuantificación de las bandas obtenidas sin y con ouabaína. D,
muestra el inmunoblot representativo de MMP-2 obtenida de los medios de cultivo de células y la
cuantificación de las bandas obtenidas sin y con ouabaína. La banda a 72 KDa, muestra pro-MMP-
2 y la banda a 63 KDa, muestra la MMP-2 activa. * p<0.05, prueba ANOVA, Bonferroni; ** p<0.01
prueba t no pareada.
Posteriormente, investigamos si la activación de la MMP-2 correlaciona con el
efecto inducido por la ouabaína en la migración celular colectiva, mediante el cultivo
de las células tratadas con ouabaína y con el inhibidor iMMP-2 (Fig. 16). Las
imágenes representativas de microscopía de luz, muestran que la migración
inducida por ouabaína (Fig. 16A vs. B), fue bloqueada por iMMP-2 (Fig. 16C vs. D).
De acuerdo con nuestra hipótesis, encontramos diferencias significativas entre las
células tratadas con el iMMP-2 y las células control (Fig. 16E). Estos datos
demostraron que el iMMP-2 tiene un efecto que bloquea la migración inducida por
30
ouabaína, lo que sugiere que la MMP-2 puede ser una de las MMPs necesarias
para la migración inducida por ouabaína en el modelo epitelial cultivado de MDCK.
Figura 16. La migración inducida por la ouabaína requiere de la activación de la MMP-2.
Las imágenes de microscopía de luz A-D son representativas del ensayo de reparación de heridas
de las células MDCK. Las células se cultivaron sin (A, C) o con (B, D) ouabaína 10 nM durante 5 h,
(C, D) con o (A, B) sin el inhibidor de la MMP-2, el iMMP-2 (20 µM). E, muestra la cuantificación de
la migración de las células MDCK en el ensayo de reparación de heridas. Las cajas blancas
representan células control; las cajas azules son las células incubadas con ouabaína. *** p<0,001,
prueba ANOVA, Bonferroni.
6. La secreción y activación de la MMP-2, inducida por la ouabaína, requiere
de la activación de cSrc y ERK1/2
Si la MMP-2 participa en la migración inducida por ouabaína, su secreción
debe ser controlada por la misma vía de señalización, cSrc-ERK1/2, que controla la
migración celular, como un efector río abajo de esta ruta. Para probar esta hipótesis,
utilizamos el PP2 y el PD98059 para bloquear la activación de cSrc y ERK1/2,
respectivamente, y evaluamos el efecto de inhibir estas vías de señalización en la
secreción y activación de la MMP-2 inducida por ouabaína. Un western blot
representativo, mostró que la inhibición de cSrc o ERK1/2, bloquea el efecto de
ouabaína sobre la activación de la MMP-2 en los medios de cultivo (Fig. 17). La
medición de al menos cuatro experimentos independientes, sugiere que la ouabaína
31
promueve la migración colectiva de células MDCK, que están asociadas con la
secreción de la MMP-2, dependiente de cSrc y ERK1/2.
Figura 17. La secreción y activación de la MMP-2, inducida por la ouabaína, depende de
la activación de cSrc y ERK1/2. Western blot representativo de la MMP-2 secretada y activa de
células MDCK después del ensayo de reparación de heridas. Las células se incubaron con o sin 10
nM ouabaína y con o sin 10 µM PP2 (inhibidor de cSrc) o 25 µM PD98059 (inhibidor de ERK1/2).
Las barras blancas representan las células control y las barras azules representan las células
incubadas con ouabaína. * p<0.05, prueba ANOVA, Bonferroni.
Estos resultados sugieren que la unión de la ouabaína a la Na+,K+-ATPasa
acelera la migración colectiva de las células MDCK, a través de la activación de la
cascada de señalización cSrc-ERK1/2-FAK y promoviendo la expresión, secreción
y la actividad de MMP-2.
32
Discusión
La Na+,K+-ATPasa es un transportador de membrana que actúa como una
molécula de adhesión celular (Gloor et al. 1990; Shoshani et al. 2005) y un receptor
que activa diferentes vías de señalización (Aperia et al. 2016). Es importante
destacar que la Na+,K+-ATPasa responde a la ouabaína (Schatzmann 1953), que
es uno de los varios esteroides cardiotónicos endógenos con papeles fisiológicos,
en gran parte desconocidos (Hamlyn y Manunta 2015). Nuestro grupo reportó
anteriormente que una concentración alta de ouabaína (≥300 nM) induce
endocitosis y degradación de las moléculas de adhesión celular y, en consecuencia,
el desprendimiento de células de entre ellas y del substrato (Contreras et al. 1999;
Contreras et al. 2004; Rincon-Heredia et al. 2014). También, mostramos que la
concentración de 10 nM de ouabaína fortalece las uniones estrechas (Larre et al.
2010), aumenta la comunicación celular mediada por uniones GAP (Larre et al.
2006; Ponce et al. 2014, 2016) y la cantidad de E-cadherina y β-catenina en la
membrana plasmática, así como la cantidad de esta última proteína en el núcleo
(Castillo et al. 2019).
En el presente trabajo, propusimos que la ouabaína, a una concentración de
10 nM, regula la adhesión celular y los procesos celulares asociados, debería
regular la migración celular colectiva, ya que este proceso requiere de uniones
célula-célula y un montaje de contactos focales en la proximidad del borde de
migración, la actividad contráctil de las fibras de estrés de actina y el desmontaje de
los contactos focales que se encuentran en regiones posteriores al borde de
migración (Vedula et al. 2013).
En este estudio, mostramos que la migración celular colectiva inducida por
ouabaína, requiere la activación de las cinasas cSrc, ERK1/2 y FAK, ya que su
inhibición bloquea el aumento que produce la ouabaína en la migración celular
colectiva. El mecanismo más simple para explicar este proceso, implicaría que estas
cinasas operan de manera orquestada y lineal. Dado que cSrc y ERK1/2 se activan
dentro de los 15 min, posteriores a la exposición de la ouabaína (RinconHeredia et
33
al. 2014), es posible que cSrc se active primero, lo que lleva a la activación de
ERK1/2, o que ambas cinasas se activen y funcionen simultáneamente para
acelerar la migración. De manera similar, el receptor al EGF activa tanto a cSrc
como a ERK1/2 en los 5 min, después de la exposición al EGF, para inducir el
sellado de uniones estrechas de células MDCK (García-Hernández et al. 2015). Sin
embargo, es necesario investigar más a fondo la activación de la cinasa a una
resolución temporal y espacial más alta para comprender mejor la secuencia de
señalización en la migración inducida por ouabaína.
La cinasa FAK modula las adhesiones focales, las uniones adherentes, el
reciclaje de los componentes de adhesión en el endosoma, así como la expresión
genética de supresores de tumor, p53 y p21, en respuesta al estrés de daño celular
(Kleinschmidt y Schlaepfer 2017). La eliminación genética de FAK exhibe una gran
cantidad de adhesiones focales, lo que sugiere que la función normal de FAK es
debilitar de las uniones focales y adherentes (Sieg et al. 2000). El hecho de que la
migración inducida por ouabaína requiera de la activación de FAK, coincide con este
desensamble dinámico de las uniones de FAK en el complejo proteico de las
adhesiones focales y adherentes.
La inhibición de cSrc por el PP2 impidió no solo la aceleración de la migración
inducida por ouabaína, sino que disminuyó el promedio la migración basal a un nivel
más bajo que el observado en la condición control. Sin embargo, la diferencia no
fue estadísticamente diferente. Esta diferencia podría explicarse por el hecho de
que mientras que cSrc es estructural y funcionalmente un componente esencial de
las adhesiones focales, también es un residente transitorio pero importante
regulador de otras uniones célula-célula (Horton et al. 2016; Zaidel-Bar et al. 2007;
Ebnet 2008; Flores-Maldonado et al. 2017). Estos hechos abren la posibilidad de
que cSrc ejerza su papel en múltiples lugares de la célula: como un activador trans
de la vía de señalización del receptor al EGF y como socio de FAK o como
componente transitorio de las uniones célula-célula y célula-sustrato. Es necesario
realizar más investigaciones para comprender completamente el papel de la cSrc
en la migración inducida por ouabaína.
34
Posteriormente, propusimos que una consecuencia plausible del tratamiento
con ouabaína y la activación de cSrc-ERK1/2, es la secreción y activación de una
de las varias MMPs. De acuerdo con esta hipótesis, demostramos que la activación
de las MMPs sensibles al G6001 y al iMMP-2, son necesarias para la migración
inducida por ouabaína. La actividad gelatinolítica basal de MMP-9 de los medios de
las células migratorias es despreciable y el tratamiento con ouabaína no la modifica,
lo que indica que esta MMP no desempeña un papel en la inducción de la migración
por ouabaína. Teniendo en cuenta las limitaciones técnicas de los zimogramas de
gelatina, es difícil atribuir la activación de la MMP-2 a la ouabain. Por esta razón, los
datos obtenidos a través de los zimogramas generalmente se interpretan como la
"cantidad" en lugar de la "actividad" de las MMPs (Soto-Guzman et al. 2010). Sin
embargo, nuestros análisis de western blots mostraron niveles significativamente
más altos de la forma activa de MMP-2, de 63 KDa. Nuestros datos sugieren
fuertemente que la ouabaína induce la síntesis y la secreción de MMP-2, que puede
desempeñar un papel importante en la migración celular inducida por ouabaína. Sin
embargo, el GM6001 y el iMMP-2 pueden inhibir otras MMP solubles y las MMPs
de la familia A de las Desintegrinas y Metaloproteasas (ADAMs, por sus siglas en
inglés) (Mifune et al. 2005; Reiss y Bhakdi 2017). Por lo tanto, no podemos descartar
la posibilidad de la participación de otras MMPs solubles o algún miembro de la
familia ADAM, en la aceleración de la migración colectiva de células MDCK, bajo el
tratamiento con ouabaína.
El aumento de la secreción de la MMP-2 y otras MMPs, puede cambiar la
composición de la MEC y, por lo tanto, acelerar la migración celular colectiva
(Vedula et al. 2013). Nuestros resultados demuestran que la actividad de al menos
una MMP es esencial para este proceso, ya que GM6001 y iMMP-2 bloquearon la
migración inducida por ouabaína. Proponemos que la ouabaína puede aumentar la
migración por dos mecanismos potenciales: primero, una mayor activación de la
MMP podría inducir el procesamiento del precursor del EGF en la membrana
plasmática, liberando EGF maduro y activo en los medios, donde se uniría al EGFR
y, a su vez, aceleraría la migración. Al respecto, se ha demostrado que el EGF
aumenta la producción de MMPs en las células de cáncer de pulmón (Liu et al.
35
2013). Además, otro miembro de la familia del EGF, el HB-EGF, también promueve
la migración de las células MDCK (Singh et al. 2004). En segundo lugar, la MMP-2
podría modificar directamente el ECM, facilitando el movimiento celular (Visse y
Nagase 2003; Vargová et al. 2012).
Conclusión
Nuestro estudio demuestra que ouabaína, a una concentración de 10 nM,
promueve la secreción de la MMP-2 dependiente de la activación de cSrc-ERK1/2-
FAK y quizás alguna otra MMPs, que a su vez, aceleran la reparación de heridas en
monocapas de células MDCK (Fig. 18).
Figura 8. Señalización en la migración celular colectiva inducida por ouabain. La
ouabaína induce la incorporación de Na+,K+-ATPasa en un signalosoma, que incluye al EGFR y cSrc,
donde cSrc transactiva el EGFR, que induce la activación de ERK1/2 y FAK. La activación de estas
cinasas provoca un aumento en la secreción y activación de la MMP-2 en los medios, necesaria para
acelerar la migración celular colectiva de las células MDCK.
36
Perspectivas
El hecho que la ouabaína sea producida de manera endógena en el
organismo, abre posibilidades muy interesantes que merecen ser estudiadas. Por
ejemplo:
1. ¿Cuál es el mecanismo por el cual la ouabaína promueve la activación de la
MMP-2?
2. ¿La MMP-2 se encuentra interaccionando con proteínas de unión célula-
célula para direccionar la migración inducida por ouabaína?
3. ¿Cuál es el complejo de polaridad que dirige la migración inducida por
ouabaína?
4. ¿Cuáles otras MMPs participan el proceso de migración inducido por
ouabaína?
Figura 19. Perspectivas
37
Bibliografía
Aizman, Oleg, Per Uhlén, Mark Lal, Hjalmar Brismar, and Anita Aperia. 2001. “Ouabain, a Steroid Hormone That Signals with Slow Calcium Oscillations.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98 (23): 13420–13424. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=60886&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
Akimova, Olga A, Alexandra Grygorczyk, Richard A Bundey, Nathalie Bourcier, Michael Gekle, Paul A Insel, and Sergei N Orlov. 2006. “Transient Activation and Delayed Inhibition of Na+,K+,Cl- Cotransport in ATP-treated C11-MDCK Cells Involve Distinct P2Y Receptor Subtypes and Signaling Mechanisms.” The Journal of Biological Chemistry 281 (42): 31317–31325.
Alessi DR, Cuenda A, Cohen P, Dudley DT, Saltiel AR. 1995. PD 098059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase kinasein vitro and in vivo. J Biol Chem. Nov 17;270(46):27489-94.
Altamirano, Julio, Yanxia Li, Jaime DeSantiago, Valentino Piacentino, Steven R Houser, and Donald M Bers. 2006. “The Inotropic Effect of Cardioactive Glycosides in Ventricular Myocytes Requires Na+-Ca2+ Exchanger Function.” The Journal of Physiology 575 (Pt 3): 845–54. doi:10.1113/jphysiol.2006.111252. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1995692&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
Antolovic, R, N Bauer, M Mohadjerani, H Kost, H Neu, U Kirch, E G Grünbaum, and W Schoner. 2000. “Endogenous Ouabain and Its Binding Globulin: Effects of Physical Exercise and Study on the Globulin’s Tissue Distribution.” Hypertension Research Official Journal of the Japanese Society of Hypertension 23 Suppl: S93–S98.
Aperia A, Akkuratov EE, Fontana JM, Brismar H (2016) Na+-K+-ATPase, a new class of plasma membrane receptors. Am J Physiol Cell Physiol 310(7):C491–C495. https ://doi. org/10.1152/ajpce ll.00359 .2015.
Arnaud A (1888) Sur la matière cristallisée active des flèches empoisonnèes des çomalis extraite du bois d’ouabaio. Comt Rendus 106:1011–1014.
Bagrov, Alexei Y, Joseph I Shapiro, and Olga V Fedorova. 2009. “Endogenous Cardiotonic Steroids: Physiology, Pharmacology, and Novel Therapeutic Targets.” Pharmacological Reviews 61 (1): 9–38. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2763610&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
Bauer, Natali, Jochen Müller-Ehmsen, Ulrike Krämer, Njde Hambarchian, Carsten Zobel, Robert H G Schwinger, Horst Neu, Ulrike Kirch, Ernst-Günther Grünbaum, and Wilhelm Schoner. 2005. “Ouabain-like Compound Changes Rapidly on Physical Exercise in Humans and Dogs: Effects of Beta-blockade and Angiotensin-converting Enzyme Inhibition.” Hypertension 45 (5): 1024–1028. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15837822.
Béguin, Pascal, Gilles Crambert, Saida Guennoun, Haim Garty, Jean-Daniel Horisberger, and Käthi Geering. 2001. “CHIF, a Member of the FXYD Protein Family, Is a Regulator of Na,K-ATPase
38
Distinct from the Γ-subunit.” The The European Molecular Biology Organization Journal 20 (15): 3993–4002.
Betanzos, A, P Nava, B E Jaramillo, L Gonz, and Ave Polit. 2003. “Tight Junction Proteins” 81: 1–44.
Bjerke MA, Dzamba BJ, Wang C, DeSimone DW (2014) FAK is required for tension-dependent organization of collective cell movements in Xenopus mesendoderm. Dev Biol 394(2):340–356. https ://doi.org/10.1016/j.ydbio .2014.07.023.
Blanco, G, and R W Mercer. 1998. “Isozymes of the Na-K-ATPase: Heterogeneity in Structure, Diversity in Function.” American Journal of Physiology 275 (5 Pt 2): F633–F650. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9815123.
Bolívar, J J, A Lázaro, S Fernández, E Stefani, V Peña-Cruz, C Lechene, and M Cereijido. 1987. “Rescue of a Wild-type MDCK Cell by a Ouabain-resistant Mutant.” American Journal of Physiology 253 (1 Pt 1): C151–C161. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=3300360.
Borkakoti, N. 2004. “Matrix Metalloprotease Inhibitors: Design from Structure.” Biochemical Society Transactions 32 (Pt 1): 17–20. doi:10.1042/. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14748704.
Burridge K, Chrzanowska-Wodnicka M (1996) Focal adhesions, contractility, and signaling. Annu Rev Cell Dev Biol 12(1):463–518. https ://doi.org/10.1146/annur ev.cellb io.12.1.463.
Cai, Haiping, Liang Wu, Weikai Qu, Deepak Malhotra, Zijian Xie, Joseph I Shapiro, and Jiang Liu. 2008. “Regulation of Apical NHE3 Trafficking by Ouabain-induced Activation of the Basolateral Na+-K+-ATPase Receptor Complex.” American Journal of Physiology. Cell Physiology 294 (2) (February): C555–63. doi:10.1152/ajpcell.00475.2007. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18077602.
Carru, Ciriaco, Luca Deiana, Salvatore Sotgia, Giovanni Mario Pes, and Angelo Zinellu. 2004. “Plasma Thiols Redox Status by Laser-induced Fluorescence Capillary Electrophoresis.” Electrophoresis 25 (6) (March): 882–9. doi:10.1002/elps.200305768. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15004850.
Castillo A, Ortuño-Pineda C, Flores-Maldonado C, Larre I, Martínez Rendón J, Hinojosa L, Ponce A, Ogazón A, Serrano M, Valdes J, Contreras RG, Cereijido M. 2019. Ouabain Modulates the Adherens Junction in Renal Epithelial Cells. Cell Physiol Biochem. 2019;52(6):1381-1397. doi: 10.33594/000000097.
Cereijido, M, R G Contreras, and L Shoshani. 2004. “Cell Adhesion, Polarity, and Epithelia in the Dawn of Metazoans.” Physiological Reviews 84 (4) (October): 1229–62. doi:10.1152/physrev.00001.2004. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15383651.
Cereijido, M, R G Contreras, L Shoshani, M R Garc, and D F. 2003. “Membrane Targeting” 81: 81–115.
Cereijido, M, R G Contreras, L Shoshani, and I Larre. 2012. “The Na+-K+-ATPase as Self-adhesion Molecule and Hormone Receptor.” American Journal of Physiology. Cell Physiology 302 (3) (February 1): C473–81. doi:10.1152/ajpcell.00083.2011. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22049208.
39
Cereijido, M, L Shoshani, and R G Contreras. 2000. “Molecular Physiology and Pathophysiology of Tight Junctions. I. Biogenesis of Tight Junctions and Epithelial Polarity.” American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology 279 (3) (September): G477–82. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10960345.
Cereijido M, Shoshani L, Contreras RG. 2001. “The Polarized Distribution of Na+, K+-ATPase and Active Transport Across Epithelia.” The Journal of Membrane Biology 184 (3) (December 1): 299–304. doi:10.1007/s00232-001-0097-y. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11891555.
Charras GT, Coughlin M, Mitchison TJ, Mahadevan L. 2008. "Life and times of a cellular bleb". Biophys. J. 94 (5): 1836-53. doi:10.1529/biophysj.107.113605. PMC 2242777.
Charvat S, Chignol M-C, Souchier C, Le Griel C, Schmitt D, Serres M (1998) Cell migration and MMP-9 secretion are increased by epidermal growth factor in HaCa T-Ras transfected cells. Exp Dermatol 7(4):184–190. https ://doi.org/10.1111/j.1600-0625.1998. tb003 22.x
Chávez, Enrique, Luis Castro-Sánchez, Mineko Shibayama, Victor Tsutsumi, Eduardo Pérez Salazar, Mario G Moreno, and Pablo Muriel. 2012. “Effects of Acetyl Salycilic Acid and Ibuprofen in Chronic Liver Damage Induced by CCl4.” Journal of Applied Toxicology : JAT 32 (1) (January): 51–9. doi:10.1002/jat.1638. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21360558.
Conacci-Sorrell, Maralice E, Tamar Ben-Yedidia, Michael Shtutman, Elena Feinstein, Paz Einat, and Avri Ben-Ze’ev. 2002. “Nr-CAM Is a Target Gene of the beta-catenin/LEF-1 Pathway in Melanoma and Colon Cancer and Its Expression Enhances Motility and Confers Tumorigenesis.” Genes & Development 16 (16): 2058–2072. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=12183361.
Contreras, R G, D Flores-Beni Tez, C Flores-Maldonado, I Larre, L Shoshani, and M Cereijido. 2006. “Na+,K+-ATPase and Hormone Ouabain:new Roles for an Old Enzyme and an Old Inhibitor.” Cellular and Molecular Biology NoisyleGrand France 52 (8): 31–40. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=17535734.
Contreras, R G, C Flores-Maldonado, A Lázaro, L Shoshani, D Flores-Benitez, I Larré, and M Cereijido. 2004. “Ouabain Binding to Na+,K+-ATPase Relaxes Cell Attachment and Sends a Specific Signal (NACos) to the Nucleus.” The Journal of Membrane Biology 198 (3): 147–158. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15216416.
Contreras, R G, A Lázaro, A Mújica, L González-Mariscal, J Valdés, M R García-Villegas, and M Cereijido. 1995. “Ouabain Resistance of the Epithelial Cell Line (Ma104) Is Not Due to Lack of Affinity of Its Pumps for the Drug.” The Journal of Membrane Biology 145 (3): 295–300. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=7563030.
Contreras, R G, L Shoshani, C Flores-Maldonado, A Lázaro, and M Cereijido. 1999. “Relationship Between Na(+),K(+)-ATPase and Cell Attachment.” Journal of Cell Science 112 ( Pt 2: 4223–4232. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=10564641.
Cortes-Reynosa P, Robledo T, Macías-Silva M, Wu S, Salazar E (2008) Src kinase regulates metalloproteinase-9 secretion induced by type IV collagen in MCF-7 human breast cancer cells. Matrix Biol 27(3):220–231. https ://doi.org/10.1016/j.matbi o.2007.11.003
40
Dmitrieva, R I, A Y Bagrov, E Lalli, P Sassone-Corsi, D M Stocco, and P A Doris. 2000. “Mammalian Bufadienolide Is Synthesized from Cholesterol in the Adrenal Cortex by a Pathway That Is Independent of Cholesterol Side-chain Cleavage.” Hypertension 36 (3): 442–448. http://hyper.ahajournals.org/cgi/content/abstract/36/3/442.
Doris, P A. 1996. “Endogenous Inhibitors of the Na,K Pump.” Mineral And Electrolyte Metabolism 22 (5-6): 303–310.
Doris, P A, A Hayward-Lester, D Bourne, and D M Stocco. 1996. “Ouabain Production by Cultured Adrenal Cells.” Endocrinology 137 (2): 533–539.
Du, Dan, Feilai Xu, Lihou Yu, Chenyi Zhang, Xuefeng Lu, Haixin Yuan, Qin Huang, et al. 2010. “The Tight Junction Protein, Occludin, Regulates the Directional Migration of Epithelial Cells.” Developmental Cell 18 (1) (January 19): 52–63. doi:10.1016/j.devcel.2009.12.008. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20152177.
Duarte S, Baber J, Fujii T, Coito AJ (2015) Matrix metalloproteinases in liver injury, repair and fibrosis. Matrix Biol 44–46(May):147– 156. https ://doi.org/10.1016/j.matbi o.2015.01.004.
Dvela, Moran, Haim Rosen, Hagit Cohen Ben-Ami, and David Lichtstein. 2012. “Endogenous Ouabain Regulates Cell Viability.” American Journal of Physiology. Cell Physiology 302 (2) (January 15): C442–52. doi:10.1152/ajpcell.00336.2011. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22031604.
Ebnet K (2008) Organization of multiprotein complexes at cell– cell junctions. Histochem Cell Biol 130(1):1–20. https ://doi. org/10.1007/s0041 8-008-0418-7.
Elkareh J, Kennedy DJ, Yashaswi B, Vetteth S, Shidyak A, Kim EGR, Smaili S et al (2007) Marinobufagenin stimulates fibroblast collagen production and causes fibrosis in experimental uremic cardiomyopathy. Hypertension 49(1):215–224. https ://doi. org/10.1161/01.HYP.00002 52409 .36927 .05.
Ellerbroek, S M, Y I Wu, C M Overall, and M S Stack. 2001. “Functional Interplay Between Type I Collagen and Cell Surface Matrix Metalloproteinase Activity.” The Journal of Biological Chemistry 276 (27) (July 6): 24833–42. doi:10.1074/jbc.M005631200. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11331272.
El-Okdi, Nasser, Sleiman Smaili, Vanamala Raju, Amjad Shidyak, Shalini Gupta, Larisa Fedorova, Jihad Elkareh, et al. 2008. “Effects of Cardiotonic Steroids on Dermal Collagen Synthesis and Wound Healing.” Journal of Applied Physiology (Bethesda, Md. : 1985) 105 (1) (July): 30–6. doi:10.1152/japplphysiol.00119.2008. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2494826&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
Fedorova, Olga V, Igor A Zhuravin, Natalia I Agalakova, Liubov A Yamova, Mark I Talan, Edward G Lakatta, and Alexei Y Bagrov. 2007. “Intrahippocampal Microinjection of an Exquisitely Low Dose of Ouabain Mimics NaCl Loading and Stimulates a Bufadienolide Na/K-ATPase Inhibitor.” Journal of Hypertension 25 (9): 1834–1844. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17762648.
Flores-Maldonado C, Verdejo-Torres O, Campos-Blázquez J, Cabrera AR, García-Hernández V, Rincon-Heredia R, Contreras RG (2017) Lysosomal degradation of junctional proteins. In: Lysosomes—associated diseases and methods to study their function. InTech, London. https ://doi.org/10.5772/intec hopen .69370.
41
Furuse, M, K Fujita, T Hiiragi, K Fujimoto, and S Tsukita. 1998. “Claudin-1 and -2: Novel Integral Membrane Proteins Localizing at Tight Junctions with No Sequence Similarity to Occludin.” The Journal of Cell Biology 141 (7) (June 29): 1539–50. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2132999&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
Furuse, M, K Furuse, H Sasaki, and S Tsukita. 2001. “Conversion of Zonulae Occludentes from Tight to Leaky Strand Type by Introducing Claudin-2 into Madin-Darby Canine Kidney I Cells.” The Journal of Cell Biology 153 (2) (April 16): 263–72. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2169456&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
Furuse, M, T Hirase, M Itoh, a Nagafuchi, S Yonemura, and S Tsukita. 1993. “Occludin: a Novel Integral Membrane Protein Localizing at Tight Junctions.” The Journal of Cell Biology 123 (6 Pt 2) (December): 1777–88. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2290891&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
García-Hernández V, Flores-Maldonado C, Rincon-Heredia R, Verdejo-Torres O, Bonilla-Delgado J, Meneses-Morales I, Gariglio P, Contreras RG (2015) EGF regulates Claudin-2 and -4 expression through Src and STAT3 in MDCK cells. J Cell Physiol 230(1):105–115. https ://doi.org/10.1002/jcp.24687.
Giannelli, G, J Falk-Marzillier, O Schiraldi, W G Stetler-Stevenson, and V Quaranta. 1997. “Induction of Cell Migration by Matrix Metalloprotease-2 Cleavage of Laminin-5.” Science 277 (5323): 225–228.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=9211848.
Gloor S, Antonicek H, Sweadner KJ, Pagliusi S, Frank R, Moos M, Schachner M (1990) The adhesion molecule on glia (AMOG) is a homologue of the beta subunit of the Na,K-ATPase. J Cell Biol 110(1):165–174. https ://doi.org/10.1083/jcb.110.1.165.
Goldstein I, Lax E, Gispan-Herman I, Ovadia H, Rosen H, Yadid G, Lichtstein D (2012) Neutralization of endogenous digitalis-like compounds alters catecholamines metabolism in the brain and elicits anti-depressive behavior. Eur Neuropsychopharmacol 22(1):72–79. https ://doi.org/10.1016/j.euron euro.2011.05.007.
Hamlyn JM, Manunta P (2015) Endogenous cardiotonic steroids in kidney failure: a review and an hypothesis. Adv Chronic Kidney Dis 22(3):232–244. https ://doi.org/10.1053/j.ackd.2014.12.005.
Hamlyn, J M, M P Blaustein, S Bova, D W DuCharme, D W Harris, F Mandel, W R Mathews, and J H Ludens. 1991. “Identification and Characterization of a Ouabain-like Compound from Human Plasma.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88 (July): 6259–6263. http://www.pnas.org/content/88/14/6259.full.pdf.
Hanke, JH; Gardner, JP; Dow, RL; Changelian, PS; Brissette, WH; Weringer, EJ; Pollok, BA; Connelly, PA (1996). "Discovery of a novel, potent, and Src family-selective tyrosine kinase inhibitor. Study of Lck- and FynT-dependent T cell activation". The Journal of Biological Chemistry. 271 (2): 695–701.
Heidkamp MC, Bayer AL, Kalina JA, Eble DM, Samarel AM (2002) GFP-FRNK disrupts focal adhesions and induces anoikis in neonatal rat ventricular myocytes. Circ Res 90(12):1282–1289. https ://doi.org/10.1161/01.RES.00000 23201 .41774 .EA
42
Heussen C, Dowdle EB (1980) Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal Biochem 102(1):196– 202. https ://doi.org/10.1016/0003-2697(80)90338 -3.
Horton ER, Humphries JD, Stutchbury B, Jacquemet G, Ballestrem C, Barry ST, Humphries MJ (2016) Modulation of FAK and Src adhesion signaling occurs independently of adhesion complex composition. J Cell Biol. https ://doi.org/10.1083/jcb.20150 8080.
Huber, D. 2000. “Occludin Modulates Transepithelial Migration of Neutrophils.” Journal of Biological Chemistry 275 (8) (February 25): 5773–5778. doi:10.1074/jbc.275.8.5773. http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.275.8.5773.
Ikenouchi, Junichi, Hiroyuki Sasaki, Sachiko Tsukita, Mikio Furuse, and Shoichiro Tsukita. 2008. “Loss of Occludin Affects Tricellular Localization of Tricellulin” 19 (November): 4687–4693. doi:10.1091/mbc.E08.
Kai F, Drain AP, Weaver VM. 2019. The Extracellular Matrix Modulates the Metastatic Journey. Dev
Cell. May 6;49(3):332-346. doi: 10.1016/j.devcel.2019.03.026.
Kaplan JH. 2002. Biochemistry of Na,K-ATPase. Annu Rev Biochem. 71:511-35. Epub 2001 Nov 9.
Kleinschmidt EG, Schlaepfer DD (2017) Focal adhesion kinase signaling in unexpected places. Curr Opin Cell Biol 45(April):24–30. https ://doi.org/10.1016/j.ceb.2017.01.003.
Koefoed-Johnsen, Valborg, and Hans H Ussing. 1958. “The Nature of the Frog Skin Potential.” Acta Physiologica Scandinavica 42 (3-4): 298–308. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1748-1716.1958.tb01563.x/abstract.
Kometiani, P. 1998. “Multiple Signal Transduction Pathways Link Na+/K+-ATPase to Growth-related Genes in Cardiac Myocytes. THE ROLES OF Ras AND MITOGEN-ACTIVATED PROTEIN KINASES.” Journal of Biological Chemistry 273 (24) (June 12): 15249–15256. doi:10.1074/jbc.273.24.15249. http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.273.24.15249.
Kong, Ling, Lei Sun, Hongxin Zhang, Qin Liu, Ye Liu, Linhua Qin, Guojun Shi, et al. 2009. “An Essential Role for RIG-I in Toll-like Receptor-stimulated Phagocytosis.” Cell Host & Microbe 6 (2) (August 20): 150–61. doi:10.1016/j.chom.2009.06.008. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19683681.
Koshman YE, Kim T, Chu M, Engman SJ, Iyengar R, Robia SL, Samarel AM (2010) FRNK inhibition of focal adhesion kinasedependent signaling and migration in vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 30(11):2226–2233. https :// doi.org/10.1161/ATVBA HA.110.21276 1.
Kotova, Olga, Lubna Al-Khalili, Sara Talia, Catherine Hooke, Olga V Fedorova, Alexei Y Bagrov, and Alexander V Chibalin. 2006. “Cardiotonic Steroids Stimulate Glycogen Synthesis in Human Skeletal Muscle Cells via a Src- and ERK1/2-dependent Mechanism.” The Journal of Biological Chemistry 281 (29): 20085–94. doi:10.1074/jbc.M601577200. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16714287.
Larre, Isabel, Aida Castillo, Catalina Flores-Maldonado, Ruben G Contreras, Ivan Galvan, Jesus Muñoz-Estrada, and Marcelino Cereijido. 2011. “Ouabain Modulates Ciliogenesis in Epithelial Cells.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108
43
(51): 20591–6. doi:10.1073/pnas.1102617108. http://www.pnas.org/content/108/51/20591.abstract.
Larre, Isabel, and Marcelino Cereijido. 2010. “Na,K-ATPase Is the Putative Membrane Receptor of Hormone Ouabain.” Communicative Integrative Biology 3 (6): 625–628. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21331260.
Larre, Isabel, Arturo Ponce, Rosana Fiorentino, Liora Shoshani, Rubén G Contreras, and Marcelino Cereijido. 2006. “Contacts and Cooperation Between Cells Depend on the Hormone Ouabain.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103 (29): 10911–10916. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1544148&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
Lauffenburger, D a, and a F Horwitz. 1996. “Cell Migration: a Physically Integrated Molecular Process.” Cell 84 (3) (February 9): 359–69. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8608589.
Li, J, Georgiy R , Markus Kruusmägi, Padideh Kamali-Zare, Xiao-Li Liu, Ann-Christine Eklöf, Sergey Zelenin, Hjalmar Brismar, and Anita Aperia. 2010. “Ouabain Protects Against Adverse Developmental Programming of the Kidney.” Nature Communications 1 (May) (January): 42. doi:10.1038/ncomms1043. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2963829&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
Liu, Jiang, Riad Kesiry, Sankaridrug M Periyasamy, Deepak Malhotra, Zijian Xie, and Joseph I Shapiro. 2004. “Ouabain Induces Endocytosis of Plasmalemmal Na/K-ATPase in LLC-PK1 Cells by a Clathrin-dependent Mechanism.” Kidney International 66 (1) (July): 227–41. doi:10.1111/j.1523-1755.2004.00723.x. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2904182&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
Liu J, Tian J, Haas M, Shapiro JI, Askari A, Xie Z (2000) Ouabain interaction with cardiac Na+/K+-ATPase initiates signal cascades independent of changes in intracellular Na+ and Ca2+ concentrations. J Biol Chem 275(36):27838–27844. https ://doi.org/10.1074/jbc. M0029 50200.
Loubatieres A, Arnaud A.1948. Pouvoirs inotrope positif et chronotrope négatif de l'ouabaïne mis en évidence sur les mouvements automatiques du muscle papillaire du coeur foetal humain. C R Seances Soc Biol Fil. Jun; 142(11-12):795-7.
Lu P, Takai K, Weaver VM, Werb Z (2011) Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol 3(12):a005058. https ://doi.org/10.1101/cshpe rspec t.a0050 58
Mao, Y.; Varoglu, M.; Sherman, D.H. "Molecular characterization and analysis of the biosynthetic cluster for the antitumor antibiotic mitomycin C from Streptomyces lavendulae NRRL 2564."Chemistry & Biology 1999, 6, 251–263
Matsuda M., Kubo A., Furuse M. and Tsukita S. 2004. “A peculiar internalization of claudins, tight junctionspecific adhesion molecules, during the intercellular movement of epithelial cells”. Journal of Cell Science. November: 117 (7).
McNulty, Amy L, J Brice Weinberg, and Farshid Guilak. 2009. “Inhibition of Matrix Metalloproteinases Enhances in Vitro Repair of the Meniscus.” Clinical Orthopaedics and Related Research 467 (6) (June): 1557–67. doi:10.1007/s11999-008-0596-6.
44
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2674160&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
Mifune M, Ohtsu H, Suzuki H, Nakashima H, Brailoiu E, Dun NJ, Frank GD. 2005. G protein coupling and second messenger generation are indispensable for metalloprotease-dependent, heparinbinding epidermal growth factor shedding through angiotensin II type-1 receptor. J Biol Chem 280(28):26592–26599. https ://doi. org/10.1074/jbc.M5029 06200.
Mousson A, Sick E, Carl P, Dujardin D, De Mey J, Rondé P. 2018. Targeting Focal Adhesion Kinase Using Inhibitors of Protein-Protein Interactions. Cancers (Basel). 2018 Aug 21;10(9). pii: E278. doi: 10.3390/cancers10090278.
Mouw, J.K., Ou, G., and Weaver, V.M. (2014). Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 771–785.
Nesher, Maoz, Moran Dvela, Vincent U Igbokwe, Haim Rosen, and David Lichtstein. 2009. “Physiological Roles of Endogenous Ouabain in Normal Rats.” American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology 297 (6) (December): H2026–34. doi:10.1152/ajpheart.00734.2009. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19837951.
Nishimura, Noriko, Midori Masuda, and Hakuo Takahashi. 1999. “Increases in Plasma Ouabainlike Immunoreactivity During Surgical Extirpation of Pheochromocytoma”: 135–139.
Ogawa, Haruo, Takehiro Shinoda, Flemming Cornelius, and Chikashi Toyoshima. 2009. “Crystal Structure of the Sodium-potassium Pump (Na+,K+-ATPase) with Bound Potassium and Ouabain.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106 (33) (August 18): 13742–7. doi:10.1073/pnas.0907054106. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2728964&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
Orlov SN, Thorin-Trescases N, Kotelevtsev SV, Tremblay J, Hamet P (1999) Inversion of the intracellular Na+/K+ ratio blocks apoptosis in vascular smooth muscle at a site upstream of Caspase-3. J Biol Chem 274(23):16545–16552. https ://doi.org/10.1074/ jbc.274.23.16545.
Oweis, Shadi, Liang Wu, Pawel R Kiela, Hui Zhao, Deepak Malhotra, Fayez K Ghishan, Zijian Xie, Joseph I Shapiro, and Jiang Liu. 2006. “Cardiac Glycoside Downregulates NHE3 Activity and Expression in LLC-PK1 Cells.” American Journal of Physiology. Renal Physiology 290 (5) (May): F997–1008. doi:10.1152/ajprenal.00322.2005. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16352745.
Padilla-Benavides, Teresita, María L Roldán, Isabel Larre, David Flores-Benitez, Nicolas Villegas-Sepúlveda, Ruben G Contreras, Marcelino Cereijido, and Liora Shoshani. 2010. “The Polarized Distribution of Na+,K+-ATPase: Role of the Interaction Between β Subunits.” Edited by Keith E Mostov. Molecular Biology of the Cell 21 (13): 2217–2225.
Page-McCaw A, Ewald AJ, Werb Z (2007) Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol 8(3):221–233. https ://doi.org/10.1038/nrm21 25.
Pedersen, Peter L, and Emesto Carafoli. 1987. “Ion Motive ATPases . I . Obiquity , Properties , and Significance to Cell Function”: 146–150.
Pilcher, B. K. 1997. “Cell Type-specific Inhibition of Keratinocyte Collagenase-1 Expression by Basic Fibroblast Growth Factor and Keratinocyte Growth Factor. A COMMON RECEPTOR
45
PATHWAY.” Journal of Biological Chemistry 272 (29) (July 18): 18147–18154. doi:10.1074/jbc.272.29.18147. http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.272.29.18147.
Ponce A, Larre I, Castillo A, García-Villegas R, Romero A, FloresMaldonado C, Martinez-Rendón J, Contreras RG, Cereijido M (2014) Ouabain increases gap junctional communication in epithelial cells. Cell Physiol Biochem 34(6):2081–2090. https ://doi. org/10.1159/00036 6403.
Ponce A, Larre I, Castillo A, Flores-Maldonado C, Verdejo-Torres O, Contreras RG, Cereijido M (2016) Ouabain modulates the distribution of connexin 43 in epithelial cells. Cell Physiol Biochem 39(4):1329–1338. https ://doi.org/10.1159/00044 7837
Prassas, Ioannis, and Eleftherios P Diamandis. 2008. “Novel Therapeutic Applications of Cardiac Glycosides.” Nature Reviews Drug Discovery 7 (11): 926–935. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18948999.
Reiss K, Bhakdi S (2017) The plasma membrane: penultimate regulator of ADAM Sheddase function. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res 1864(11 Pt B):2082–2087. https ://doi.org/10.1016/j.bbamc r.2017.06.006.
Rhaleb, Nour-Eddine, Saraswati Pokharel, Umesh C Sharma, Hongmei Peng, Edward Peterson, Pamela Harding, Xiao-Ping Yang, and Oscar a Carretero. 2013. “N-acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro Inhibits Interleukin-1β-mediated Matrix Metalloproteinase Activation in Cardiac Fibroblasts.” Pflugers Archiv : European Journal of Physiology (May 8). doi:10.1007/s00424-013-1262-8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23652767.
Ra H-J, Parks WC (2007) Control of matrix metalloproteinase catalytic activity. Matrix Biol 26(8):587–596. https ://doi.org/10.1016/j.matbi o.2007.07.001.
Rajasekaran SA, Palmer LG, Moon SY, Peralta Soler A, Apodaca GL, Harper JF, Zheng Y, Rajasekaran AK (2001) Na, K-ATPase activity is required for formation of tight junctions, desmosomes, and induction of polarity in epithelial cells. Mol Biol Cell 12(12):3717–3732. https ://doi.org/10.1091/mbc.12.12.3717.
Reiss K, Bhakdi S (2017) The plasma membrane: penultimate regulator of ADAM Sheddase function. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res 1864(11 Pt B):2082–2087. https ://doi.org/10.1016/j.bbamc r.2017.06.006.
Ridley AJ, Schwartz MA, Burridge K, Firtel RA, Ginsberg MH, Gary Borisy J, Parsons T, Horwitz AR (2003) Cell migration: integrating signals from front to back. Science 302(5651):1704–1709. https :// doi.org/10.1126/scien ce.10920 53.
Rincon-Heredia Ruth, Flores-Benitez David, Flores-Maldonado Catalina, Bonilla-Delgado José, García-Hernández Vicky, Verdejo-Torres Odette M., Castillo Aida M., Larré Isabel, Poot-Hernández Augusto C., Franco Martha, Gariglio Patricio, Reyes José L. and Contreras Rubén G. 2013. “Ouabain Induces Endocytosis and Degradation of Tight Junction Proteins through ERK1/2-dependent Pathways.” Experimental Cell Research.
Roelle, S. et al. (2003) Matrix metalloproteinases 2 and 9 mediate epidermal growth factor receptor trransactivation by gonadotropinreleasing hormone. J. Biol. Chem. 278, 47307–47318.
Rossi B, Ponzio G, Lazdunski M (1982) Identification of the segment of the catalytic subunit of (Na+, K+)ATPase containing the digitalis binding site. EMBO J 1(7):859–861.
46
Saitou, M, M Furuse, H Sasaki, J D Schulzke, M Fromm, H Takano, T Noda, and S Tsukita. 2000. “Complex Phenotype of Mice Lacking Occludin, a Component of Tight Junction Strands.” Molecular Biology of the Cell 11 (12) (December): 4131–42.
Santiskulvong C, Rozengurt E. 2003. "Galardin (GM 6001), a broad-spectrum matrix metalloproteinase inhibitor, blocks bombesin- and LPA-induced EGF receptor transactivation and DNA synthesis in rat-1 cells". Exp. Cell Res. 290 (2): 437–46. doi:10.1016/S0014-4827(03)00355-0.
Sawaya, R, Y Go, a P Kyritisis, J Uhm, B Venkaiah, S Mohanam, Z L Gokaslan, and J S Rao. 1998. “Elevated Levels of Mr 92,000 Type IV Collagenase During Tumor Growth in Vivo.” Biochemical and Biophysical Research Communications 251 (2) (October 20): 632–6. doi:10.1006/bbrc.1998.9466. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9792825.
Scarpa E, Mayor R (2016) Collective cell migration in development. J Cell Biol 212(2):143–155. https ://doi.org/10.1083/jcb.20150 8047.
Schatzmann HJ (1953) Cardiac glycosides as inhibitors of active potassium and sodium transport by erythrocyte membrane. Helv Physiol Pharmacol Acta 11(4):346–354.
Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW (2012) NIH image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods 9(7):671–675. https ://doi. org/10.1038/nmeth .2089
Schoner, Wilhelm. 2002. “Endogenous Cardiac Glycosides, a New Class of Steroid Hormones.” The Federation of European Biochemical Societies Journal 269 (10): 2440–2448. http://doi.wiley.com/10.1046/j.1432-1033.2002.02911.x.
Shin, Kunyoo, Vanessa C Fogg, and Ben Margolis. 2006. “Tight Junctions and Cell Polarity.” Annual Review of Cell and Developmental Biology 22 (January): 207–35. doi:10.1146/annurev.cellbio.22.010305.104219. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16771626.
Shin, Kunyoo, Qian Wang, and Ben Margolis. 2007. “PATJ Regulates Directional Migration of Mammalian Epithelial Cells.” EMBO Reports 8 (2) (February): 158–64. doi:10.1038/sj.embor.7400890. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1796763&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
Shoshani, Liora, Rubén G Contreras, María L Roldán, Jacqueline Moreno, Amparo Lázaro, María S Balda, Karl Matter, and Marcelino Cereijido. 2005. “The Polarized Expression of Na+,K+-ATPase in Epithelia Depends on the Association Between Beta-subunits Located in Neighboring Cells.” Molecular Biology of the Cell 16 (March): 1071–1081. doi:10.1091/mbc.E04. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=551474&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.
Sieg DJ, Hauck CR, Ilic D, Klingbeil CK, Schaefer E, Damsky CH, Schlaepfer DD (2000) FAK integrates growth-factor and integrin signals to promote cell migration. Nat Cell Biol 2(5):249–256. https ://doi.org/10.1038/35010 517.
Simon, D. B. 1999. “Paracellin-1, a Renal Tight Junction Protein Required for Paracellular Mg2+ Resorption.” Science 285 (5424) (July 2): 103–106. doi:10.1126/science.285.5424.103. http://www.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.285.5424.103.
47
Singh, Nripen, Kara Pizzelli, Jonathan K Romero, James Chrostowski, Greg Evangelist, James Hamzik, Neil Soice, and K S Cheng. 2013. “Clarification of Recombinant Proteins from High Cell Density Mammalian Cell Culture Systems Using New Improved Depth Filters.” Biotechnology and Bioengineering 110 (7) (July): 1964–72. doi:10.1002/bit.24848. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23334838.
Singh AB, Tsukada T, Zent R, Harris RC (2004) Membrane-associated HB-EGF modulates HGF-induced cellular responses in MDCK cells. J Cell Sci 117(Pt 8):1365–1379. https ://doi.org/10.1242/ jcs.01037.
Skou, J C. 1957. “The Influence of Some Cations on an Adenosine Triphosphatase from Peripheral Nerves.” Biochimica et Biophysica Acta 23 (2): 394–401. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13412736.
Soto-Guzman A, Navarro-Tito N, Castro-Sanchez L, Martinez-Orozco R, Salazar EP (2010) Oleic acid promotes MMP-9 secretion and invasion in breast cancer cells. Clin Exp Metas 27(7):505–515. https ://doi.org/10.1007/s1058 5-010-9340-1.
Staehelin, L a. 1973. “Further Observations on the Fine Structure of Freeze-cleaved Tight Junctions.” Journal of Cell Science 13 (3) (November): 763–86. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4203962.
Stebbing, J, A Filipović, and G Giamas. 2013. “Claudin-1 as a Promoter of EMT in Hepatocellular Carcinoma.” Oncogene. doi:10.1038/onc.2012.591. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23318416.
Sternlicht, Mark D, and Zena Werb. 2001. “How Matrix Metalloproteinases Regulate Cell Behaviour.” Annual Review of Cell and Developmental Biology 17: 463–516.
Steroids, Endogenous Cardiotonic. 2010. “NIH Public Access” 1802 (12): 1230–1236. doi:10.1016/j.bbadis.2010.03.011.ENDOGENOUS.
Sukita, S Hoichiro T. 1999. “Claudin Multigene Family Encoding Four-transmembrane Domain” 96 (January): 511–516.
Terauchi, R, and N Kitamura. 2000. “Requirement of Regulated Activation of Ras for Response of MDCK Cells to Hepatocyte Growth Factor/scatter Factor.” Experimental Cell Research 256 (2) (May 1): 411–22. doi:10.1006/excr.2000.4850. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10772814.
Tian, Jiang, Ting Cai, Zhaokan Yuan, Haojie Wang, Lijun Liu, Michael Haas, Elena Maksimova, Xin-Yun Huang, and Zi-Jian Xie. 2006. “Binding of Src to Na+/K+-ATPase Forms a Functional Signaling Complex.” Edited by Guido Guidotti. Molecular Biology of the Cell 17 (1): 317–326. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16267270.
Tokhtaeva E, Sachs G, Sun H, Dada LA, Sznajder JI, Vagin O (2012) Identification of the amino Acid region involved in the intercellular interaction between the Β1 subunits of Na+/K+-ATPase. J Cell Sci 125(Pt 6):1605–1616. https ://doi.org/10.1242/jcs.10014 9.
Tokhtaeva E, Sun H, Deiss-Yehiely N, Wen Y, Soni PN, Gabrielli NM, Marcus EA et al (2016) The O-glycosylated ectodomain of FXYD5 impairs adhesion by disrupting cell–cell trans-dimerization of Na, K-ATPase Β 1 subunits. J Cell Sci 129(12):2394–2406. https ://doi. org/10.1242/jcs.18614 8.
48
Torre C, and Steven J Wang. 2010. “NIH Public Access” 136 (5): 493–501. doi:10.1001/archoto.2010.25.Reduction.
Tsukita, S, M Furuse, and M Itoh. 1999. “Structural and Signalling Molecules Come Together at Tight Junctions.” Current Opinion in Cell Biology 11 (5): 628–633. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/Entrez/referer?http://www.biomednet.com/article/cbb503.
Tymiak AA, Norman JA, Bolgar M, DiDonato GC, Lee H, Parker WL, Lo LC, Berova N, Nakanishi K, Haber E (1993) Physicochemical characterization of a ouabain isomer isolated from bovine hypothalamus. Proc Natl Acad Sci USA 90(17):8189–8193. https ://doi. org/10.1073/pnas.90.17.8189.
Vagin O, Tokhtaeva E, Sachs G (2006) The role of the Β1 subunit of the Na, K-ATPase and its glycosylation in cell–cell adhesion. J Biol Chem 281(51):39573–39587. https ://doi.org/10.1074/jbc.M6065 07200.
Vargová V, Pytliak M, Mechírová V (2012) Matrix metalloproteinases. In: Gupta SP (ed) Matrix metalloproteinase inhibitors, vol 103. Experientia Supplementum. Springer Basel, Basel, pp 1–33. https ://doi. org/10.1007/978-3-0348-0364-9_1.
Vasioukhin, V, C Bauer, M Yin, and E Fuchs. 2000. “Directed Actin Polymerization Is the Driving Force for Epithelial Cell-cell Adhesion.” Cell 100 (2) (January 21): 209–19. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10660044.
Vedula SR, Ravasio A, Lim CT, Ladoux B (2013) Collective cell migration: a mechanistic perspective. Physiology (Bethesda) 28(6):370– 379. https ://doi.org/10.1152/physi ol.00033 .2013.
Vilchis-Nestor CA, Roldán ML, Leonardi A, Navea JG, Padilla-Benavides T, Shoshani L. 2019.
Ouabain Enhances Cell-Cell Adhesion Mediated by β1 Subunits of the Na+,K+-ATPase in CHO
Fibroblasts. Int J Mol Sci. Apr 29;20(9). pii: E2111. doi: 10.3390/ijms20092111.
Visse, Robert, and Hideaki Nagase. 2003. “Matrix Metalloproteinases and Tissue Inhibitors of Metalloproteinases: Structure, Function, and Biochemistry.” Circulation Research 92 (8) (May 2): 827–39. doi:10.1161/01.RES.0000070112.80711.3D. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12730128.
Wang H, Haas M, Liang M, Cai T, Tian J, Li S, Xie Z (2004) Ouabain assembles signaling cascades through the caveolar Na+/ K+-ATPase. J Biol Chem 279(17):17250–17259. https ://doi. org/10.1074/jbc.M3132 39200.
Whittaker, Mark, and Andrew Ayscough. 1988. “Matrix Metalloproteinases and Their Inhibitors – Current Status and Future Challenges” 17 (1): 3–12.
Xie, Z. 1999. “Intracellular Reactive Oxygen Species Mediate the Linkage of Na+/K+-ATPase to Hypertrophy and Its Marker Genes in Cardiac Myocytes.” Journal of Biological Chemistry 274 (27) (July 2): 19323–19328. doi:10.1074/jbc.274.27.19323. http://www.jbc.org/cgi/doi/10.1074/jbc.274.27.19323.
Yamada K, Goto A, Nagoshi H, Terano Y, Omata M (1997) Elevation of ouabainlike compound levels with hypertonic sodium chloride load in rat plasma and tissues. Hypertension 30(1 Pt 1):94–98. https ://doi. org/10.1161/01.HYP.30.1.94.
49
Ye, Qiqi, Fangfang Lai, Moumita Banerjee, Qiming Duan, Zhichuan Li, Shuyi Si, and Zijian Xie. 2013. “Expression of Mutant Α1 Na/K-ATPase Defective in Conformational Transition Attenuates Src-mediated Signal Transduction.” The Journal of Biological Chemistry 28 (8) (February 22): 5803–14. doi:10.1074/jbc.M112.442608. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23288841.
Yuan, Zhaokan, Ting Cai, Jiang Tian, Alexander V Ivanov, David R Giovannucci, and Zijian Xie. 2005. “Na / K-ATPase Tethers Phospholipase C and IP3 Receptor into a Calcium-regulatory Complex” 16 (September): 4034–4045. doi:10.1091/mbc.E05.
Zaidel-Bar R, Itzkovitz S, Ma’ayan A, Iyengar R, Geiger B (2007) Functional atlas of the integrin adhesome. Nat Cell Biol 9(8):858–867. https ://doi.org/10.1038/ncb08 07-858.
Zhang, M, J J Wang, and Y J Chen. 2006. “Effects of Mechanical Pressure on Intracellular Calcium Release Channel and Cytoskeletal Structure in Rabbit Mandibular Condylar Chondrocytes.” Life Sciences 78 (21) (April 18): 2480–7. doi:10.1016/j.lfs.2005.10.043. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16325208.
