MANIPULACION DEL ADN EXTRAÍDO

ENDONUCLEASAS Y ENZIMAS MODIFICADORAS DEL ADN

A. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

• Son enzimas con capacidad de reconocer, unirse y cortar el enlace fosfodiéster de los nucleótidos

• Reconocen secuencias de 6-8 nt.

B. ENZIMAS QUE MANIPULAN EL ADN

1. Nucleasas2. Ligasas3. Fosfatasa alcalina4. Polinucleótido cinasa

2.1 nucleasas• Estas enzimas degradan el ADN rompiendo los

enlaces fosfodiester

LAS NUCLEASAS MAS UTLIZADAS

• DNasa I Y RNasa A, • Endo y exonucleasas• Purificadas a partir de páncreas bovino

DNasa I• Tambien llamada deoxiribonucleasa I• Corta el ADN de cadena sencilla o doble • Preferentemente las pirimidinas (C o T)• Aplicaciones:

– Eliminación del ADN partir de extracciones de ARN

RNasa A • Tambien llamada

ribonucleasa A• Endoribonucleasa• Corta el ARN de

cadena sencilla en residuos de pirimidina

• Aplicaciones– Eliminación de ARN a

partir de extracciones de ADN

2.2 Ligasas

• Catalizan la formación del enlace fosfodiester entre el PO4 5` de una hebra y el OH 3`de otro fragmento

• Usos: – Unión covalente entre dos moléculas de ADN

(ADN recombinante: ADN + vector)– Se extrae del bacteriófago T4 (T4 DNA ligase)

• Ligación: unión de dos fragmentos lineales de ADN mediante enlaces covalentes

• fragmentos con extremos cohesivos (preferentemente)

• INGREDIENTES

– FRAGMENTOS DE ADN (CON EXTREMOS COHESIVOS )

– UN BUFFER QUE CONTENGA ATP

– LIGASA T4 (USAR 1 a 0.01 U DE ENZIMA)

Temp 16 C (4C OV, TA 2 hrs)

3. Fosfatasa alcalina

• REMUEVE EL GRUPO FOSFATO 5` DE UN FRAGMENTO DE ADN

• TRABAJA A pH alcalino • Calf intestinal alkaline phosphatase (CIP)

• USOS:1. Remover grupos PO4 5` de los vectores que han sido

cortados con enzimas de restricción. • Por tanto, se previene la recircularizacion del vector• Si se tratan extremos lineales, agregar un exceso de la

enzima o prolongar el tiempo de incubación

2. Remover PO4 5` de los fragmentos de ADN para su marcaje con fosfato radiocativo

4. Polinucleótido cinasa (PNK)

• Cataliza la transferencia de un grupo fosfato desde el ATP al extremo 5`del ADN o ARN

• Usos• Fosforilacion de fragmentos de ADN previo a su

LIGACION en vectores

• Marcaje radioactivo con P32

C. POLIMERASAS

– E. coli DNA Polymerase I– Klenow Fragment of E. coli DNA Polymerase I– T4 DNA Polymerase– T7 DNA Polymerase– Terminal Transferase– Thermostable DNA Polymerases (Taq, Pfu, Vent, etc.)– Reverse Transcriptases– Bacteriophage RNA Polymerases

• Son enzimas que incorporan nucleótidos (dNTP´s o ddNTP´s) para “alargar” una cadena de ADN o ARN a partir de otra llamada templado o cadena molde.

• Estas sintetizan en dirección 5´---- 3´• Requieren de la presencia de in “cebador” o

“primer” que contenga un extremo 3´OH libre

• Pueden presentar 3 actividades:

• Actividad polimerasa 5´ → 3´

• Actividad exonucleasa 3´ → 5´• actividad

correctora: hidroliza el enlace fosfodiéster y elimina el nucleótido erróneo

• Actividad exonucleasa 5´ → 3´

• El fragmento Klenow (extraído de la ADN pol I)Presenta actividad de exonucleasa 3´---5´

• Aplicaciones:– Síntesis de ADN de doble cadena (dsDNA) a partir de

templados de cadena sencilla, eliminando los primers rio abajo

– Pej. Durante la síntesis del ADNc o síntesis de sondas radioactivas

– Durante la secuenciación

• Rellenar fragmentos de ADN• Cuando se han dejado extremos cohesivos, después del

corte con enzimas de restricción, para “rellenar” esos espacios y dejar extremos lineales

• Las ADN Polimerasas termoestables son empleadas en la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

• La mas común es purificada a partir de Thermus aquaticus

• Aislada por primera vez en 1976 • La Taq ha revolucionado el mundo de la

Biología molecular

• Funciona como polimerasa• Su actividad catalítica requiere los 75-80ºC

Polymerase 3'->5'Exonuclease Source and Properties

Taq No From Thermus aquaticus. Halflife at 95C is 1.6 hours.

Pfu YesFrom Pyrococcus furiosus. Appears to have the lowest error rate of known thermophilic DNA polymerases.

Vent YesFrom Thermococcus litoralis; also known as Tli polymerase. Halflife at 95 C is approximately 7 hours.

• La transcriptasa inversa, utiliza como templado ARN no ARN

• Se obtiene de retrovirus (copian su propio genoma de ARN en ADN antes de integrarlo al genoma del huésped) Moloney murine leukemia virus, Avian myeloblastosis virus

• Comúnmente empleada para generar el ADN complementario o ADNc, a partir de una cadena sencilla de ARN.

• Esta enzima tiene actividad de polimerasa y de RNasa H (degrada el ARN de los híbridos ADN-ARN)

• ARNm + oligo dT----- alineación con la cola de poliA + transcriptasa ---síntesis de la hebra complementaria ss (ADNc ss)

• RT-PCR

LIGACION

• El paso final en la reconstrucción del ADN recombinante

• Los extremos pegajosos incrementan la eficiencia de ligación

• Colocando extremos cohesivos en una molécula con extremos lisos: linkers

INTRODUCIENDO EL ADN ENCÉLULAS VIVAS

TRANSFORMACIÓN: INTRODUCCION DEL ADN EN BACTERIAS

• E. coli, Bacillus y Streptococcus

• “Células competentes”: tratamientos físicos o químicos que aumentan su habilidad para incorporar material genético

• Selección de las células transformadas: resistencia a antibióticos

Selección de las células transformadas: selección por lac Z

Introducción de ADN en células no bacterianas

• El termino transformación cambia dependiendo de la célula a tratar

• Células animales: transfección

CUESTIONARIOA. VECTORES DE CLONACION PARA

CÉLULAS EUCARIONTES1. Menciona las características de los

vectores YAC´s así como usos y aplicaciones de éstos.

2. Describe las características de los vectores de clonación para plantas: A. tumefasiens, transferencia directa, vectores virales (geminivirus y caulimovirus)

3. Que son los elementos P y cuál es su aplicación

4. Describe el proceso de clonación mediante el empleo de baculoviruses

5. Menciona 2 vectores de clonación para mamíferos

6. Describe brevemente la técnica de clonación en mamíferos sin el empleo de vectores

B. VECTORES DE EXPRESION

1. Que son los vectores de expresión2. Describe el funcionamiento general

de los vectores de expresión. 3. Menciona las características del

pTracer-EF/V5-His tales como promotor, marcadores de selección, genes reporteros, detección de la proteína expresada.

C. TECNICAS PARA LA SELECCIÓN DE LAS CLONAS RECOMBINANTES

1. En qué consiste la hibridación en colonia. Realiza un esquema

2. Para qué sirven las técnicas conocidas como Southern Blot, Northern Blot y Western Blot. Realiza un esquema

3. Describe la técnica de detección inmunológica por medio de anticuerpos para el análisis de los productos expresados

3. Que es la PCR4. Describe los pasos a seguir durante

la PCR. Realiza un esquema5. Que características deben contener

los primers o cebadores durante la PCR

6. Que es la Tm, cómo se calcula y cual es su importancia durante la PCR

7. Describe la técnica de PCR cuantitativa o en tiempo real.

8. Menciona dos aplicaciones de la PCRq.