Manual de Electroforesis de Proteinas

Serie

de

Norm

as

Técnicas

N°

39

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS

DE ELECTROFORESIS PARA

PROTEÍNAS Y ADN

Serie de Normas

Técnicas N° 38

Lima - 2003

CYAN MAGENTA AMARILLO NEGRO

CYAN MAGENTA AMARILLO NEGRO

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS

DE ELECTROFORESIS PARA

PROTEÍNAS Y ADN

Serie de Normas

Técnicas N° 38

Lima - 2003

MPR-CNSP-016 Instituto Nacional de Salud

Carátula: Frontis del local centraldel Instituto Nacional de Salud

ARTES & DISEÑOS LASER S.R.LTDA.Calle Las Turquesas 263-265-269 - Balconcillo - Lima 13Teléfono: 265-8320 Telefax: 266-0075e-mail: [email protected]

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Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pública

Volumen 19 Número 4 octubre – diciembre 2002

La Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pública es unapublicación trimestral del Instituto Nacional de Salud que estimula ladivulgación de trabajos teóricos o aportes prácticos desarrollados portécnicos y científicos, promueve el avance y la aplicación de lainvestigación y experiencia científica en salud

Los artículos firmados no expresan necesariamente la opinión de larevista, siendo los autores responsables de los criterios por ellos emitidos.

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Editor: Dr. Leonid Lecca GarcíaE-mail: [email protected]

I Instituto Nacional de Salud

Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN

MPR-CNSP-016

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESISPARA PROTEÍNAS Y ADN

ELABORACIÓN:

Blgo. Carlos Augusto Yábar Varas

División de Biología Molecular



Lima-Perú

II


Instituto Nacional de SaludMPR-CNSP-016

Catalogación hecha por el Centro de Documentación e Información del INS

AGRADECIMIENTO:Blgo. Roger Calderón Espinoza

Blgo. Carlos Padilla Rojas

Blgo. Christian Baldeviano Vidalón

Blgo. Omar Cáceres Rey

Blga. Gisely Hijar Guerra

Blga. Elizabeth Sánchez Romaní

División de Biología Molecular



Yábar Varas, Carlos. Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN / Elaborado porCarlos Yábar Varas. — Lima : Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud,2003. 59 p. : 30 cm. — (Serie de Normas Técnicas; 38)

1. PROTEINAS /aislamiento y purificación 2. ADN /aislamiento y purificación3. ELECTROFORESIS

I. Yábar Varas, CarlosII. Instituto Nacional de Salud (Perú)III. Perú. Ministerio de Salud

ISBN 9972 – 857 – 26 – 3 (O.C.)ISBN 9972 – 857 – 38 – 7 (N°38)ISSN 1607 – 4904Hecho el Depósito Legal Nº 1501152003-4205

©Ministerio de Salud, 2003Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jesús María, Lima, PerúTelf.: 431-0410

©Instituto Nacional de Salud, 2003Cápac Yupanqui 1400, Jesús María, Lima, PerúTelf.: 471-9920 Fax 471-0179e-mail: [email protected]ágina Web: www.ins.gob.pe

Publicación aprobada con R.J. Nº 460-2003-J-OPD/INS

Se autoriza su reproducción total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.

III Instituto Nacional de Salud


MPR-CNSP-016

CONTENIDO

INTRODUCCIÓN V

SECCIÓN 1: GENERALIDADES 11.1 Objetivo 11.2 Campo de aplicación 11.3 Abreviaturas y definiciones 1

SECCIÓN 2: MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 3

SECCIÓN 3: MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR 5

SECCIÓN 4: PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS 7

4.1 Objetivo 74.2 Materiales 74.3 Ensamblaje de la cámara de electroforesis 74.4 Preparación de geles de poliacrilamida 84.5 Preparación del gel de resolución 114.6 Preparación del gel de empacamiento 124.7 Preparación de la muestra biológica 124.8 Electroforesis 134.9 Coloración y visualización de las proteínas usando azul brillante de coomasie 164.10 Interpretación de resultados 174.11 Factores que afectan la migración de las proteínas 19

SECCIÓN 5: PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE ADN 215.1 Objetivo general 215.2 Electroforesis vertical 215.3 Electroforesis de ADN en geles de poliacrilamida 225.4 Preparación de geles de agarosa para ADN 255.5 Electroforesis de ADN 275.6 Coloración y visualización de ADN en geles de poliacrilamida y agarosa usando

bromuro de etidio 285.7 Coloración y visualización de ADN en geles de poliacrilamida con nitrato de plata 305.8 Factores que afectan la migración del ADN 32

SECCIÓN 6: VARIANTES DE ELECTROFORESIS 356.1 Electroforesis bidimensional 356.2 Electroforesis de capilaridad 356.3 Electroforesis en campo pulsado (PFEG) 36

SECCIÓN 7: VERIFICACIÓN DE LA CALIDAD ÓPTIMA DE LOS EQUIPOS Y REACTIVOS

EMPLEADOS 377.1 Generalidades 377.2 Buffer para electroforesis de proteínas y ADN 377.3 Persulfato de amonio 37

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IV



7.4 Bromuro de etidio 377.5 Agarosa 387.6 Poliacrilamida al 30% 387.7 Agua destilada 387.8 Equipos de laboratorio 38

SECCIÓN 8: REGISTROS Y ARCHIVOS 39

BIBLIOGRAFÍA 41

ANEXOS 43

ANEXO A: PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS YELECTROFORESIS DE ADN 43

ANEXO B: UNIDADES Y FÓRMULAS 49

ANEXO C: MEDIDAS A TOMARSE EN CASO DE CONTACTO ACCIDENTAL CONREACTIVOS TÓXICOS 51

ANEXO D: PROBLEMAS MÁS COMUNES DURANTE LOS PROCEDIMIENTOS DEELECTROFORESIS 53

ANEXO E: EJERCICIOS RESUELTOS PARA LA PREPARACIÓN DE SOLUCIONES 55

ANEXO F: PÁGINAS WEB RECOMENDADAS 59

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V Instituto Nacional de Salud


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INTRODUCCIÓN

La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario del análisis de los ácidos nucleicos y proteínas.Y así como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda aobservar los ácidos nucleicos y proteínas al final del procedimiento.

El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel u otro tipo dematriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamañoo peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón defragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualización delas moléculas a manera de simples bandas las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas.

En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sinembargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En laelectroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas, mientras que en la electroforesishorizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. De otro lado, existen otros métodos electroforéticos que presentanciertas modificaciones, así tenemos la electroforesis en campo pulsado, mayormente usada para separar fragmentosmuy grandes de ADN (ADN genómico), la electroforesis bidimensional para un análisis más sofisticado de lasproteínas etc.

Es importante señalar que la electroforesis en asociación con otras técnicas tales como PCR, e hibridación, brindauna gran ayuda en el campo de la salud. Gracias a esta técnica es posible visualizar las bandas de ARN o ADN depatógenos, detectar cambios o mutaciones a nivel genético, visualizar una nueva proteína, entre otros.

El presente manual de procedimientos es la recopilación de protocolos actualizados por los investigadores de laDivisión de Biología Molecular del Instituto Nacional de Salud. En este material se incluye, además de losprocedimientos técnicos de la electroforesis, un anexo indicando el modo de preparación de soluciones deelectroforesis, unidades y fórmulas básicas a ser aplicadas y algunas importantes medidas de bioseguridad quedeben considerarse durante la manipulación de los reactivos.

1 Instituto Nacional de Salud


MPR-CNSP-016

SECCIÓN 1

GENERALIDADES

1.1 OBJETIVO

Establecer los procedimientos de la técnica de electroforesis de ADN y proteínas para ser difundidasen la red de laboratorios.

1.2 CAMPO DE APLICACIÓN

Laboratorios de nivel de bioseguridad II que realicen análisis y determinación de ADN y proteínas engeneral.

1.3 ABREVIATURAS Y DEFINICIONES

1.3.1 ADN: ácido desoxirribonucleico.

1.3.2 ARN: ácido ribonucleico.

1.3.3 kDa: kilodaltons.

1.3.4 nM: nanomolar.

1.3.5 OD: densidad óptica.

1.3.6 pb: pares de bases.

1.3.7 PCR: reacción en cadena de polimerasa (Polimerase chain reaction).

1.3.8 pg: picogramo.

1.3.9 rpm: revoluciones por minuto.

1.3.10 µL: microlitro.

1.3.11 µM: micromolar.

1.3.12 ácido desoxirribonucleico: molécula compuesta de un anillo de desoxiribosa, una base nitrogenaday un grupo fosfato que en su conjunto forman una estructura de doble hebra tipo helicoidal. Constituyeel material genético de todo tipo de células y virus de ADN, y tiene como función transmitir la informacióngenética de una generación a otra.

1.3.13 ácido ribonucleico: molécula compuesta de un anillo de ribosa, una base nitrogenada y un grupofosfato. Presenta un rol informativo, estructural y enzimático a nivel de ADN y durante la síntesis deproteínas.

1.3.14 aminoácido: pequeñas moléculas conformadas por un grupo amino y otro carboxilo y que en suconjunto forman la estructura de las proteínas.

1.3.15 anfoterismo: propiedad de las proteínas para adaptarse al pH del medio y cambiar de carga,dependiendo del pH y su punto isoléctrico (pI).

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1.3.16 densidad óptica: unidad de medida de absorción de la luz, definido como el logaritmo de la intensidadde luz de entrada entre la intensidad de luz de salida.

1.3.17 desnaturalización de proteínas: pérdida de las estructuras nativas (secundaria, terciaria ycuarternaria) de una proteína, adoptando la estructura primaria únicamente.

1.3.18 electroforesis: técnica utilizada para separar partículas coloidales tales como proteínas o ácidosnucléicos a través una matriz sólida (gel de agarosa o poliacrilamida) de acuerdo a su tamaño ycarga eléctrica mediante la aplicación de un campo eléctrico (IUPAC, NHLBI, DOE).

1.3.19 enfoque isoeléctrico: técnica en gradiente de pH montada entre un ánodo y un cátodo, de dondeéste último tiene un pH más alto que el primero.

1.3.20 estructura cuaternaria: se refiere a la estructura tridimensional compleja adoptada por la proteínacompuesta de varios monómeros o polipéptidos.

1.3.21 estructura primaria de proteínas: se refiere a la estructura lineal formada por la unión secuencialde aminoácidos.

1.3.22 estructura secundaria de proteínas: se refiere a la estructura bidimensional formada por elplegamiento de la estructura primaria estabilizada por interacciones débiles.

1.3.23 estructura terciaria de proteínas: se refiere a la estructura tridimensional adoptada por la proteínaestabilizada por enlaces covalentes y no covalentes.

1.3.24 grado biología molecular: alto grado de pureza (ausencia de contaminantes externos comonucleasas, proteasas o pirógenos) que presentan algunos reactivos que son utilizados en pruebasmoleculares.

1.3.25 kilodalton: unidad de medida referente al peso molecular de las proteínas en general.

1.3.26 marcador estándar de peso molecular: fragmentos de ADN de peso molecular conocido utilizadospara determinar el tamaño de una molécula de ADN de interés por comparación después de unaelectroforesis.

1.3.27 pares de bases: cada par de nucleótidos complementarios que en conjunto forman una doble hebrade ADN.

1.3.28 PCR: polimerase chain reaction o reacción en cadena de la polimerasa; reacción enzimática in vitropor el cual mediante múltiples ciclos de denaturación, alineamiento y extensión se sintetizan grandescantidades de una región genética específica.

1.3.29 plásmido: moléculas de ADN circular que se encuentran en la mayoría de bacterias y otros organismosprocariontes y que pueden llevar información genética para el organismo que lo alberga.

1.3.30 polimerización: acción química por el cual las moléculas de acrilamida y bisacrilamida forman unentramado a manera de malla por la acción de catalizadores (TEMED y APS) generando una sustanciagelatinosa.

1.3.31 producto de amplificación: Moléculas de ADN sintetizadas en múltiples copias in vitro a partir deADN molde mediante el uso de PCR.



MPR-CNSP-016

SECCIÓN 2

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

2.1 Algunos reactivos utilizados en los procedimientos descritos en este manual tienen la característicade ser tóxicos, irritantes, corrosivos, cancerígenos, mutagénicos y neurotóxicos, por lo tanto elinvestigador siempre deberá usar guantes, mascarillas, lentes protectores y mandil para evitar uncontacto directo o accidental con ellos (Ver más adelante lista de estos reactivos).

2.2 La luz ultravioleta (UV) empleada para la visualización de ADN a 385 nm de longitud de onda con 8Wde potencia ocasiona graves daños oculares y epiteliales, por lo tanto, el investigador deberá contarcon una lámina de policarbonato transparente ubicada entre la lámpara y el punto de observación.Además, deberá usar lentes de protección contra rayos UV del mismo material.

2.3 El voltaje utilizado para la electroforesis puede generar quemaduras por descarga eléctrica. Aunquela mayoría de cámaras de electroforesis han sido diseñadas para evitar el contacto directo con laelectricidad, el operador deberá asegurarse de mantener la fuente poder apogada o desconectada almomento de manipular el equipo.

2.4 El proceso de ebullición de las proteínas en baño maría a 100ºC deberá realizarse con extremocuidado para evitar quemaduras. En este sentido, se recomienda utilizar envases de vidrio resistentesa altas temperaturas (por ejemplo: Pyrex) y gradillas flotantes de polipropileno para colocar los viales.

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MPR-CNSP-016

SECCIÓN 3

MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR

3.1 El investigador deberá usar guantes de látex mientras se encuentre trabajando con ADN y proteínas.Este paso ayudará a evitar la degradación de las biomoléculas por acción de las nucleasas o proteasaspresentes en la superficie de las manos. Asimismo, el uso de guantes evitará que el laboratorista seexponga ante algún posible riesgo de intoxicación por material infeccioso.

3.2 El material biológico debe ser conservado a bajas temperaturas. El ADN genómico y los productosde amplificación pueden ser almacenados a 4°C, mientras que el ADN plasmídico a - 20°C. Lasproteínas deben ser conservadas a -80°C o en su defecto a -20°C. Todas las muestras biológicasdeben ser repartidas en alícuotas y en volúmenes pequeños para evitar etapas de descongelamientoo congelamiento drásticos que ocasionarían un eventual deterioro de las moléculas.

3.3 Debido a la importancia que tiene la medición de volúmenes en los procedimientos de electroforesis,se sugiere que los insumos destinados para tal fin, las micropipetas y puntas de 10, 20, 200 y 1000µl, viales de 0,5 y 1,5, tubos de 15, 50 y 250 mL y los equipos de laboratorio, cuenten con uncertificado que acredite la calidad del producto (Ejm: certificado ISO 9000, ISO 8655, DIN 12650).

3.4 Se recomienda que las puntas que se insertan en las micropipetas y que tienen contacto directo conlas moléculas de ADN sean nuevas y estériles, a fin de evitar una posible contaminación de la muestracon nucleasas. Es importante señalar que es posible trabajar con puntas previamente usadas, siemprey cuando estén libres de restos orgánicos y hayan sido previamente esterilizadas en autoclave (121°Ca 1,5 psi). Con respecto a la manipulación de las proteínas, no se exige el uso de puntas nuevaspero sí se recomienda esterilizarlas previamente.

3.5 Se recomienda que los equipos empleados para los procedimientos descritos en este manual cuentencon un certificado de calidad que garantice su precisión y calibración (Ejm. ISO9000, ISO 8655, DIN12650).

3.6 Los reactivos a usarse durante los procesos de extracción y purificación de ácidos nucleicos y proteínasdeben tener grado "biología molecular" para asegurar el éxito del procedimiento. El uso combinadode reactivos de diferente grado de pureza puede llevar a un fracaso del experimento.

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MPR-CNSP-016

SECCIÓN 4

PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

4.1 OBJETIVO

Realizar el proceso de electroforesis vertical discontinua denaturante de proteínas.

4.2 MATERIALES

4.2.1 Cámara de electroforesis vertical y accesorios.

4.2.2 Micropipetas de 20, 200 y 1000 µL.

4.2.3 Vaso de precipitación de 500 mL de capacidad.

4.2.4 Flotadores para microtubos de 1,5 mL.

4.2.5 Lámina extensible de parafina.

4.2.6 Gradillas de plástico.

4.2.7 Puntas descartables de polipropileno con capacidad para 20, 200 y 1000 µL.

4.2.8 Solución de poliacrilamida al 30% (Anexo A).

4.2.9 Buffer Tris-HCL 1,5 M pH= 8,8 (Anexo A).

4.2.10 Buffer Tris-HCL 0,5M pH= 6,8 (Anexo A).

4.2.11 Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10% (Anexo A).

4.2.12 Persulfato de amonio (APS) al 10% recién preparado (Anexo A).

4.2.13 N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED solución stock).

4.2.14 Agua bidestilada.

4.2.15 Buffer de resolución Tris-Glicina (Anexo A).

4.2.16 Butanol-agua (Anexo A).

4.3 ENSAMBLAJE DE LA CÁMARA DE ELECTROFORÉSIS

4.3.1 El procedimiento para el ensamblaje de la cámara de electroforesis varía de acuerdo al modelo delequipo, en consecuencia el investigador deberá seguir las instrucciones que recomienda el fabricante.

4.3.2 Debido a que la mayoría de las cámaras de electroforesis parten del mismo principio técnico, hemosrepresentado gráficamente un modelo que permite orientar al investigador en el ensamblaje de esteequipo (Figuras N° 1-4).

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4.3.3 En general, una cámara de electroforesis vertical puede tener los siguientes componentes:

4.3.3.1 Dos placas de vidrio del mismo grosor y anchura, de acuerdo al fabricante. En algunos modelos, laaltitud de los vidrios es diferente (uno con mayor altitud que el otro). En general, el tamaño de losvidrios es variable, dependiendo de la dimensión de la cámara.

4.3.3.2 Dos espaciadores, que son dos placas largas de iguales dimensiones hechas de un material flexiblepero resistente (generalmente poliestireno o teflón). La función de los espaciadores es determinar elgrosor del gel.

4.3.3.3 Un peine, cuyos dientes pueden variar en número, tamaño y grosor. Tiene el mismo grosor de losespaciadores y está confeccionado del mismo material. Sirve para moldear los pocillos donde secolocarán las muestras

4.3.3.4 Un soporte o base: dispositivo que sirve para permitir el ensamblaje de los vidrios con los espaciadores,a través de unas serie de prensas que ejercen presión y mantiene fijo todo el sistema

4.3.3.5 El tanque de electroforesis: recipiente que contiene el buffer de corrida superior e inferior. En algunossistemas, este tanque contiene electrodos permanentes a lo largo de sus bases listos para serconectados. En otras cámaras existe una tapa que contiene los electrodos, de tal manera que elinvestigador ya no tiene contacto directo con el buffer durante el proceso de electroforesis.

4.3.3.6 Fuente de poder: aparato que tiene por función proveer de energía eléctrica a la cámara deelectroforesis. El voltaje, el amperaje y el tiempo, pueden ser regulados de acuerdo a las necesidadesdel investigador.

Es importante señalar que la cámara de electroforesis ya ensamblada deberá estar ubicada sobreuna superficie totalmente plana y nivelada. Este paso es importante en el momento en el que sevierte la solución del gel dentro de la cámara, ya que se evita el derrame de la solución y la generaciónde matriz desnivelada. Esta última podría generar la distorsión del perfil de las bandas de las proteínasal final de la electroforesis.

4.4 PREPARACIÓN DE LOS GELES DE POLIACRILAMIDA

4.4.1 La electroforesis de proteínas descrito en este manual corresponde al sistema discontinuo denaturante.Es discontinuo porque está conformado por dos geles de poliacrilamida de resolución y empacamientoque presentan diferente concentración, composición y pH. Ambos geles se encuentran unidos perolimitados por una fase de separación visible al trasluz. Debido a que en estado líquido ambos gelespueden mezclarse fácilmente, deben ser preparados por separado esperando la total polimeracióndel primero para continuar con la polimerización del otro. El gel de empacamiento generalmente selocaliza en la parte superior del sistema formando los pocillos donde se depositarán las muestras. Elgel de resolución por su parte forma el cuerpo del gel por donde migrarán y se separarán las proteínas.



MPR-CNSP-016

Figura N° 1. Componentes de una cámara de electroforesis vertical

Figura N° 2. Modo de ensamblar los vidrios y los espaciadores de una cámara de electroforesis vertical

Vidrio grande

PeineVidrio chico

Espaciadores

Cátodo

Tanque de electroforesisvertical

Anodo

Soporte

Ganchos o prensas

Base de jebe

Reguladores devoltaje

Fuente de Poder

Voltímetros

Electrodos Interruptor

PeinePeine

Espaciadores1 - 5 cm

Área para el gelde empacamiento

Área para el gelde resolución

Vidrio chico

Vidriogrande

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Figura N° 3. Procedimiento para el ensamblaje de un modelo de cámara de electroforesis vertical.

1. Ensamblar vidrios y espaciadores y colocar sobre unsoporte

Ganchos oprensas

Soporte

Presión

2. Añadir gel de resoluciónBase de jebe

3. Añadir butanolDejar gelificando

4. Remover el butanol con agua y añadir gelde empacamiento

5. Colocar peine y dejar polimerizar

6. Retirar el peine. Colocar sobre mesa nivelada

Peine

Peine



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4.5 PREPARACIÓN DEL GEL DE RESOLUCIÓN

4.5.1 Fundamento teórico

El gel de resolución es la matriz de poliacrilamida donde las moléculas de ADN o proteínas, van amigrar generando un perfil de bandas o patrón electroforético. Dicho patrón varía de acuerdo al pesomolecular de cada una de las moléculas y a la concentración del gel mismo.

4.5.2 Procedimiento

4.5.2.1 Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las soluciones.

4.5.2.2 Marcar el límite hasta donde la matriz de acrilamida será vertida, trazando una línea horizontal en elvidrio con un marcador indeleble. Para saber la ubicación exacta de la línea, colocar el peine entreambos vidrios y medir entre uno y cinco centímetros (dependiendo del tamaño de la cámara) pordebajo de los dientes del peine (Figura N° 2)

4.5.2.3 Realizar la preparación del gel de resolución a una concentración de acuerdo a las necesidades,mezclando los componentes en el orden que se indica en el Anexo A.

4.5.2.4 Aproximadamente 5 mL de solución deberán ser preparados en caso de trabajar con geles pequeñosde aproximadamente 8 - 10 cm de ancho por 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm. Laconcentración de poliacrilamida a usar dependerá de las necesidades del operador.

4.5.2.5 Una vez finalizada la preparación de la solución, añadir los catalizadores APS y TEMED uno por uno,tratando de mezclar cada reactivo de manera uniforme en todo el volumen.

Figura N° 4. Sistema de electroforesis vertical ensamblado

Cátodo Ánodo

Buffer deelectroforesis

Fuente de poderTanque de electroforesis

vertical

12



4.5.2.6 Agregar un volumen de la solución de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta la línea trazada.Posteriormente, añadir una capa de butanol-agua (aproximadamente 100 µL) sobre la solución depoliacrilamida para evitar el ingreso de moléculas de oxígeno que retarden la polimerización.

4.5.2.7 Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos, usando como control polimerizaciónla solución de poliacrilamida remanente.

4.5.2.8 Una vez formado el gel, descartar la capa de butanol y lavar la parte superior del gel varias veces conagua destilada hasta eliminar completamente los restos de acrilamida no polimerizada y butanol.

4.6 PREPARACIÓN DEL GEL DE EMPACAMIENTO

4.6.1 Fundamento teórico

El gel de empacamiento es la matriz de poliacrilamida que tiene como característica retener a lasproteínas manteniéndolas uniformes antes que ellas migren hacia el gel de resolución. Este procesopermite mejorar la resolución de las proteínas en la electroforesis.

4.6.2 Procedimiento


4.6.2.2 Mezclar los componentes del gel (Anexo A).

4.6.2.3 Una vez finalizada la preparación de la solución, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin deasegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen de la solución.

4.6.2.4 Agregar la poliacrilamida entre los vidrios de la cámara y sobre el gel de resolución ya polimerizado.Inmediatamente después, colocar el peine entre ambos vidrios secando con papel toalla los restosde poliacrilamida que lleguen a derramarse.

4.6.2.5 Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos usando como controlde la polimerización la solución de poliacrilamida que quedó remanente en el tubo.

4.6.2.6 Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados conchorro suave de agua destilada.

4.7 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA BIOLÓGICA

4.7.1 Objetivo

Someter las muestras de proteínas a procesos químicos y físicos que permitan su óptimofraccionamiento en la electroforesis vertical.

4.7.2 Materiales

4.7.2.1 Micropipetas para volúmenes de 20 µL, 200 µL y 1000 µL.



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4.7.2.2 Tubos de polipropileno de 1,5 mL y 15 mL de capacidad.

4.7.2.3 Guantes.

4.7.2.4 Cocinilla de asbesto.

4.7.2.5 Vaso de precipitación de 500 mL.

4.7.2.6 Gradilla para tubos de 1,5 mL.

4.7.2.7 Buffer de la muestra (Anexo A).

4.7.2.8 Puntas de 20 µL, 200 µL y 1000 µL.

4.7.3 Principio del procedimiento

La preparación de la proteína consiste en un proceso fisico-químico, en el cual se rompen enlacespeptídicos y puentes disulfuro gracias a la acción de detergentes iónicos, reactivos reductores y altastemperaturas, los que en conjunto consiguen desnaturalizar la proteína hasta su estructuraprimaria.

4.7.4 Procedimiento

4.7.4.1 Mezclar la proteína con el buffer de la muestra concentrada por cuatro veces (4x) en proporción 3:1(tres partes de la muestra y una de buffer).

4.7.4.2 Asegurar la tapa de los tubos con lámina extensible de parafina y someter la muestra a una temperaturade 100° C durante 5 minutos. Para tal efecto colocar los viales en una gradilla para microtubos dentrode un recipiente o vaso de precipitación con agua hirviendo.

4.7.4.3 Controlar la temperatura con un termómetro adecuado.

4.7.4.4 Finalizado el procedimiento, retirar los tubos del vaso de precipitación y centrifugarlos por diez segundosa 12 000 rpm. Mantenerlos en una gradilla para microtubos dentro de un recipiente con hielo hastael proceso de electroforesis.

4.8 ELECTROFORESIS

4.8.1 Objetivo

Fraccionar las proteínas de acuerdo a su peso molecular en una matriz de poliacrilamida usando uncampo eléctrico.

4.8.2 Materiales

4.8.2.1 Micropipetas para volúmenes de 20 µL.

4.8.2.2 Cámara de electroforesis vertical y accesorios.

14



4.8.2.3 Fuente de poder.

4.8.2.4 Buffer de electroforesis para proteínas (Anexo A).

4.8.2.5 Guantes.


4.8.2.7 Puntas para micropipeta de 20 µL.

4.8.2.8 Envase con lejía al 10% para descarte de puntas.


En el proceso de la electroforesis se realizará la separación de las proteínas a analizar, de acuerdo asu peso molecular. Dicha distribución dependerá de la concentración del gel de resolución con elque se esté trabajando.

4.8.4 Procedimiento

4.8.4.1 Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar la degradación de las moléculas porla acción de las proteasas presentes en la mano.

4.8.4.2 Sumergir el sistema contiendo los geles polimerizados en un tanque conteniendo buffer deelectroforesis o de resolución para proteínas 1X. Dicho tanque lleva dos electrodos: uno positivo yotro negativo (frecuentemente representados por colores rojo y negro, respectivamente) que seránconectados a una fuente poder (Figuras N° 1 y 5). Al momento de sumergir los geles en el tanque,asegurarse que los pocillos del gel estén totalmente cubiertos por el buffer.

4.8.4.3 Mediante el uso de puntas de hasta 20 µL y 30 µL de capacidad proceder a depositar cuidadosamentela muestra en los pocillos evitando la contaminación del pocillo contiguo.

4.8.4.4 Considerar el uso de un marcador estándar de proteínas para la medición del peso molecular de lamuestra. Dicho marcador debe ser sometido a los mismos tratamientos de la proteína, excepto cuandose trate de un marcador previamente teñido en que el que se obviará el uso del buffer de lamuestra.

4.8.4.5 Una vez finalizada la colocación de las proteínas en cada pocito del gel, cubrir el tanque con la tapay conectar los cables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.

4.8.4.6 Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje y amperaje correspondientes.

4.8.4.7 Para el cálculo del voltaje es importante conocer la distancia en centímetros del gel desde la partesuperior hasta la parte inferior de la matriz. La distancia multiplicada por voltios (8V - 15 V) permitirádeterminar el voltaje total. El voltaje óptimo dependerá de la naturaleza de la molécula de ADN quese piensa separar, en consecuencia, se recomienda estandarizar este procedimiento.

4.8.4.8 El valor del amperaje o corriente eléctrica (medida en amperios o miliamperios) dependerá de lafuerza iónica del buffer. En el caso de trabajar con buffer Tris-Glicina 1X (Ver solución stock, Anexo A),el valor recomendado es de 25 a 30 miliamperios.



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4.8.4.9 Realizar la electroforesis hasta que el frente de corrida (visualizado como una línea azul por el colorantedel buffer) haya llegado a los límites de la parte inferior del gel.

4.8.4.10 Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con desconectar loselectrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema que contiene el gel depoliacrilamida.

4.8.4.11 Levantar lentamente uno de los espaciadores de tal manera que se vaya realizando la separación delos vidrios que contienen el gel.

4.8.4.12 Separar el gel de empacamiento del gel de resolución realizando un corte transversal.

4.8.4.13 Hacer una pequeña muesca en una de las esquinas del gel, a fin de que sirva de orientación paraubicar el orden en que fueron cargadas las muestras.

4.8.4.14 Remover el gel. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado pues el gel es muy frágily puede romperse con facilidad especialmente cuando se seca o es de baja concentración. Paradesprender el gel del vidrio remojarlo nuevamente con buffer de electroforesis o agua destilada yusar uno de los espaciadores a manera de espátula para levantarlo por una de las puntas. Coger elgel cuidadosamente (usar guantes) y luego sumergirlo en un envase conteniendo el colorante azulbrillante de coomasie.

4.8.4.15 El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior uso, pudiendo serreciclado hasta cinco veces, después de los cuales se deberá preparar una nueva solución dado quepuede afectar el tiempo de corrida de la prueba.

4.8.4.16 Los vidrios, los espaciadores y el tanque deberán ser lavados con abundante agua y detergentesespeciales que puedan ser fácilmente removidos. Posteriormente, enjuagarlos con agua destilada ysecarlos a temperatura ambiente o en una estufa a 37°C.

Figura N° 5. Interior de una cámara de electroforesis vertical en operación: a) Durante la colocación de la muestra en el pocillo delgel, b) Después de aplicar un voltaje determinado el cual genera el empacamiento uniforme de las proteínas, c, d y e) las proteínasmigran hacia el ánodo y se distribuyen en el gel a manera de bandas.(e-)= electrones

CÁTODO ÁNODO

Buffer deresolución

Gel deempacamiento

Gel deresolución


e-

e-

a

e-

e-

e

d

c

b

e-e-

e- e- e- e- e- e- e- e- e-

e-

16



4.9 COLORACIÓN Y VISUALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS USANDO AZUL BRILLANTE DECOOMASIE

4.9.1 Objetivo

Visualizar las proteínas en el gel de poliacrilamida.

4.9.2 Materiales

4.9.2.1 Frasco oscuro de 1 L para el colorante azul brillante de coomasie.

4.9.2.2 Recipiente para colorear el gel.

4.9.2.3 Solución de trabajo de azul brillante de coomasie R-250 (Anexo A).

4.9.2.4 Solución de decoloración rápida (Anexo A).

4.9.2.5 Solución de decoloración lenta (Anexo A).

4.9.2.6 Solución glicerol-metanol (Anexo A).

4.9.2.7 Agua destilada.

4.9.2.8 Guantes.


El proceso de coloración se basa en la atracción electrostática del enlace peptídico de las proteínassobre grupos de ácido sulfónico que son los que tiñen la proteína de color azul. Asimismo, las fuerzasde Van der Waals y las interacciones hidrofóbicas participan en este proceso de unión mecánica.Este paso permite la visualización de proteínas en un rango de sensibilidad entre 0,5 µg y 2 µg.

4.9.4 Procedimiento

4.9.4.1 Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar algún tipo de contacto con losreactivos.

4.9.4.2 Sumergir el gel de poliacrilamida en un envase de vidrio o teflón, conteniendo solución de trabajo deazul brillante de coomasie en un volumen que permita cubrir completamente el gel. Dejar incubandocon un suave movimiento rotatorio por 15 a 20 minutos. Es importante precisar que el tiempo deincubación dependerá del grado de sensibilidad requerida en la prueba, de la concentración del gel yde la sensibilidad del azul brillante de coomasie propiamente dicho. En ese sentido, una máximasensibilidad de coloración puede ser obtenida incubando por ejemplo un gel al 5% en 1 hora y un gelal 10% por 2 horas.

4.9.4.3 Evitar la coloración del gel por más de dos horas, debido a que el colorante puede quedar retenidofuertemente en el gel generando un fondo oscuro por sobretinción que impediría la visualización delas proteínas.



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4.9.4.4 Culminado el tiempo de incubación, depositar el colorante en su frasco original.

4.9.4.5 Cubrir el gel teñido con solución de decoloración rápida e incubar por 30 minutos. Eliminar la solucióndecolorante rápida y añadir un segundo volumen de la misma solución hasta apreciar las primerasbandas. Acto seguido, eliminar la solución de decoloración rápida y añadir la solución decolorantelenta. Dejar destiñendo a movimiento constante por lo menos una hora, cambiando la solución poruna nueva cuantas veces sea necesario. Seguir destiñendo hasta que las bandas de las proteínaspuedan ser apreciadas claramente.

4.9.4.6 Finalizada la remoción del azul de coomasie, descartar el decolorante usado y lavar el gel. Parapoder analizar los resultados es recomendable secar el gel usando un equipo secador a vacío omanualmente.

4.9.5 Secado manual de geles de poliacrilamida

4.9.5.1 Remojar el gel teñido en el reactivo glicerol-metanol por 2 horas con un movimiento de rotaciónsuave.

4.9.5.2 Posteriormente, remojar una lámina de celofán de aproximadamente 15 x 15 cm en agua y colocarloencima de un bastidor cuyo tamaño dependerá del tamaño del gel. Seguidamente, colocar el gelsobre el celofán y observar que no se formen burbujas.

4.9.5.3 Cubrir el gel con un segundo celofán previamente remojado en agua y presionar el sistema tipo"sandwich" con grapas en todos los lados. Dejar secar por 2 días.

4.9.5.4 Remover las grapas y desprender de la placa de vidrio el celofán que contiene el gel.

4.9.5.5 Cortar y guardar el exceso de celofán.

Nota importante: el celofán debe ser hidrofílico y no plastificado

4.10 Interpretación de resultados

4.10.1 Las proteínas fijadas en geles de poliacrilamida y teñidas con azul brillante de coomasie se observancomo bandas azules de diferentes pesos moleculares.

4.10.2 El peso molecular de una proteína se mide en kilodaltons (Equivalente a 1 000 Daltons) y puede serdeterminado comparando la banda con un patrón de proteínas estándar de peso conocido denominadomarcador de peso molecular.

4.10.3 La distribución de las proteínas depende de la concentración del gel, por lo tanto, el operador deberáseleccionar el marcador de peso molecular más adecuado.

4.10.4 Algunas proteínas suelen migrar anómalamente y muchas veces aparecen con un mayor peso delesperado; ello se debe a que algunas de ellas presentan modificaciones postraduccionales en suestructura como residuos de glicosilación, fosforilación y acetlización, las cuales podrían retardar lamigración de las muestras.

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4.10.5 Las proteínas degradadas (desnaturalización de las proteínas por causa de un agente químicocatalizador, ejm: proteasas) suelen dejar manchas difusas en todo el frente de corrida y a vecessuelen confundirse con proteínas de menor peso molecular (Figuras N° 6 y 7)

Figura N° 6. Electroforesis de proteínas totales del virus de la fiebre amarilla en geles de poliacrilamida al 10%. Carril 1 al 5:concentraciones de 1, 2, 3, 4 y 5 µg de proteína. Carriles 6 y 7: proteínas degradadas.

Figura N° 7. Electroforesis de proteínas purificadas (Carriles 2 y 4) y proteínas totales de Leishmania brazilensis.

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5

97,4 -66 -

45 -

31 -

21,5 -



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4.11 FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

Los principales factores que afectan la migración de las proteínas durante la electroforesis son lassiguientes:

4.11.1 Fuerza del campo eléctrico (E)

Es la fuerza que determina el movimiento o migración de la proteína a través del campo eléctrico. Suunidad de medición es voltios/cm y es por esa razón que la tasa de migración de una proteína puedeser alterada cambiando tanto la distancia comprendida entre los electrodos (cm) como el potencialeléctrico del sistema (Voltaje). Del mismo modo, los valores de E dependen de la fuerza direccional(Fa) y de la carga neta de la molécula (Q). Puede ser calculada a través de la siguiente fórmula:

E = Fa/QE= v/d

Donde:Fa = Fuerza direccional.v = voltios.d = distancia de los electrodos (en centímetros)Q = carga en (coulomb)

4.11.2 Temperatura

Depende básicamente del voltaje de la electroforesis, la concentración de sales (poder deconductancia) del buffer y del pH. Un aumento en la temperatura del buffer genera el efecto "sonrisa"o smiling (Figura Nº 8).

4.11.3 Carga neta de la molécula

La presencia de aminoácidos de diferentes grupos bioquímicos otorga a una determinada proteínauna carga neta totalmente diferente a otra, compuesta por diferentes grupos de aminoácidos. Debido

Figura Nº 8. Gel de electroforesis en SDS-PAGE para proteínas mostrando el efecto "sonrisa" o smiling. Figura extraída de Internet.(http://www.cas.vanderbilt.edu/bsci11a/protein-electro/protein-electro.htm).

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a que en la electroforesis, las muestras son sometidas a un determinado campo eléctrico, la migraciónde las proteínas en el gel dependerá básicamente de su carga y no de su peso molecular. Para evitareste efecto, es importante igualar la carga neta de todas las proteínas aprovechando sus propiedadesanfotéricas. En ese sentido, el SDS evita el efecto de diferencias de carga entre las proteínas, a fin defavorecer la separación de ésta únicamente por su peso molecular.

4.11.4 Tamaño y forma de la molécula

4.11.4.1 Las proteínas tienen características moleculares que actúan como factores intrínsecos durante laelectroforesis alterando su migración y generando bandas de diferentes tamaños, que nonecesariamente van acorde al peso molecular real del polipéptido. Ciertas modificacionespostraduccionales, multimerización y formación de complejos con otro tipo de moléculas generanmodificaciones en el tamaño de la proteína dando pesos moleculares aparentes en el momento delanálisis.

4.11.4.2 Debido a la dificultad de reconocer la naturaleza bioquímica de una proteína no caracterizada,perviamente deberá estandarizarse diversas condiciones experimentales a fin de optimizar el análisisde la proteína por electroforesis.



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SECCIÓN 5

PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS DE ADN

5.1 OBJETIVO GENERAL

Conocer los procedimientos básicos del proceso de electroforesis horizontal y vertical para ADN.

5.2 ELECTROFORESIS VERTICAL

5.2.1 Objetivo

Conocer el procedimiento técnico de la electroforesis vertical para ADN en geles de poliacrilamida.

5.2.2 Materiales

5.2.2.1 Cámara de electroforesis vertical y accesorios.

5.2.2.2 Micropipetas de 20 µ, 200 µL y 1 000 µL.

5.2.2.3 Lámina extensible de parafina.

5.2.2.4 Puntas de polipropileno con capacidad para 20 µ, 200 µ y 1 000 µl.

5.2.2.5 Buffer de resolución stock TBE 5X (Anexo A).

5.2.2.6 Buffer de resolución TBE 1X (Anexo A).

5.2.2.7 Poliacrilamida al 30%.

5.2.2.8 APS al 10%.

5.2.2.9 TEMED.

5.2.3 Ensamblaje de la cámara de electroforesis vertical

El modo de ensamblar una cámara de electroforesis vertical fue detallado en la sección 4.3. Sinembargo, toda cámara de electroforesis vertical viene acompañada de una serie de especificacionestécnicas de los fabricantes, en tal sentido recomendamos leer el manual del equipo.

5.2.4 Preparación del gel de resolución

5.2.4.1 El sistema de electroforesis vertical para ADN corresponde al sistema continuo no denaturante. Estesistema, a diferencia de la electroforesis para proteínas, no utiliza un gel de empacamiento y loscomponentes del gel de resolución son totalmente diferentes.

5.2.4.2 Procedimiento

a. Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las soluciones.

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b. No será necesario marcar el límite hasta donde será vertida la poliacrilamida, debido a que el gelusado es continuo.

c. Realizar la preparación del gel siguiendo el orden que se indica en el Anexo A.

d. Aproximadamente 5 mL de la solución deberán ser preparado en caso de trabajar con geles pequeños(aproximadamente 8 - 10 cm de ancho x 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm). Laconcentración de poliacrilamida para ADN dependerá de los objetivos de trabajo del operador.

e. Una vez finalizada la preparación de la solución, agitar moderadamente sin hacer burbujas a fin deasegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen.

f. Agregar un volumen de la solución de poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta el tope.Inmediatamente después, colocar el peine de teflón entre ambos vidrios secando con papel toalla losrestos de poliacrilamida que se lleguen a derramar.

g. Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 - 30 minutos, usando como controlla solución de poliacrilamida que quedó remanente en el tubo.

h. Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos ya formados conchorro suave de agua destilada.

5.3 ELECTROFORESIS DE ADN EN GELES DE POLIACRILAMIDA

5.3.1 Objetivo

Separar las moléculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a través de geles de poliacrilamida.

5.3.2 Materiales

5.3.2.1 Micropipetas para volúmenes de 20 µl.

5.3.2.2 Cámara de electroforesis.


5.3.2.4 Poliacrilamida al 30%.

5.3.2.5 TEMED.

5.3.2.6 APS 10%.

5.3.2.7 Buffer de electroforesis para ADN TBE (Anexo A).

5.3.2.8 Buffer de la muestra para ADN (Anexo A).

5.3.2.9 Guantes.


5.3.2.11 Puntas para micropipeta de 20 µl.



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5.3.2.12 Envase para descarte de puntas.


En el proceso de la electroforesis se realizará la separación de las moléculas de ADN a analizar deacuerdo a su peso molecular. Dicha distribución será afectada por la concentración del gel de resoluciónque se esté trabajando.

5.3.4 Procedimiento

5.3.4.1 Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las muestras, los reactivos y el equipo.

5.3.4.2 Sumergir el sistema conteniendo los geles polimerizados en su tanque correspondiente. Existen dostanques de electroforesis y cada uno de ellos lleva dos electrodos: uno de polo positivo y otro de polonegativo que serán conectados a una fuente de poder. Asimismo, contiene el buffer de electroforesispara ADN, en este caso el buffer TBE 1X (Figura N° 9). Al momento de sumergir los geles en eltanque, asegurarse que los pocillos del gel estén totalmente saturados de buffer.

5.3.4.3 Para colocar el ADN en los pocillos es importante mezclar cinco volúmenes de solución que contieneel ácido nucleico con un volumen del buffer de la muestra de ADN concentrada 6 veces o buffer demuestra 6X. Añadir un volumen de buffer de la muestra repartidos en alícuotas, de acuerdo al númerode muestras que se colocarán en los pocillos, sobre un pedazo de lámina extensible de parafina(Figura N° 10). Acto seguido, añadir cinco volúmenes de cada una de las muestras de ADN sobre lasalícuotas de buffer de la muestra y mezclar totalmente.

5.3.4.4 Mediante el uso de puntas de 20 µl proceder a cargar cuidadosamente la muestra en los pocillosevitando la contaminación del pocillo contiguo (Figura N° 9).

Figura N° 9. Interior de una cámara de electroforesis vertical para ADN en operación. A: Durante el depósito de la muestra de ADNmezclado con el buffer de muestra. B-D: Aplicación del voltaje y migración del ADN a través del gel poliacrilamida. E: Las moléculasde ADN se agrupan en la matriz formando una banda que puede ser visualizada por fluorescencia tiñiendo el ADN con bromuro deetidio y aplicando luz ultravioleta.

e-

e- e- e- e- e- e- e- e- e-

e-

e-

e-

CÁTODO ÁNODO

e-

e-

AB C D E

e-


Banda de ADN

Gel de resolución

Punta de lamicropipetadepositando lamuestra en el pocillo

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5.3.4.5 Considerar el uso de un marcador de peso molecular estándar de ADN para la determinación delpeso molecular de la muestra. Preparar el marcador de acuerdo a las intrucciones del fabricante.

5.3.4.6 Una vez finalizada la colocación del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar loscables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.

5.3.4.7 Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje adecuado. El voltaje dependeráprincipalmente de las necesidades del operador y del tipo de ADN que es utilizado. Para el caso deproductos de PCR, el voltaje puede estar comprendido entre 75 a 100 voltios. Es importante señalarque en la electroforesis de ADN el valor del voltaje debe ser constante, a diferencia del valor delamperaje que dependerá principalmente del valor del voltaje.

5.3.4.8 Luego de seleccionar las condiciones de voltaje, iniciar el proceso de la electroforesis. Durante elproceso se evidenciarán dos frentes de corrida de diferente color y distancia de migración. Amboscolores, azul oscuro y azul claro corresponden a los colorantes azul de bromofenol y xilene cianol,respectivamente, que conforman el buffer de la muestra. El xilene cianol en geles de poliacrilamidaal 8% migra de manera similar a un fragmento de ADN de 160 pb, mientras que el azul de bromofenola esta misma concentración de poliacrilamida es equivalente a un fragmento de 45 pb (Anexo B1.3).

5.3.4.9 Detener la electroforesis hasta que ambos frentes de corrida se localicen en la posición deseada porel operador (este proceso debe ser estandarizado).

5.3.4.10 Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con la desconección delos electrodos de la fuente de poder, removiendo el sistema que contiene el gel de poliacrilamida.

5.3.4.11 Levantar lentamente uno o ambos espaciadores a la vez, de tal manera que se vaya realizando laseparación de los vidrios que contienen el gel.

5.3.4.12 Remover el gel de uno de los vidrios. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado, puesel gel es muy frágil y puede romperse con facilidad. Para desprender el gel del vidrio, remojarlonuevamente con buffer de electroforesis y usar uno de los espaciadores a manera de espátula paralevantarlo por una de las puntas. Desplazar el gel hacia un envase limpio para su respectiva tinciónen bromuro de etidio o en nitrato de plata ( Anexo C).

5.3.4.13 Los vidrios, los espaciadores y el tanque deberán ser lavados con abundante agua y detergente queno deje residuos. Posteriormente enjuagarlos con agua destilada y secarlos a temperatura ambienteo en una estufa a 37° C.

Figura N° 10. El ADN es mezclado con el buffer de la muestra usando una lámina extensible de parafina antes de colocar lasmuestras en el gel de electroforesis.

Micropipeta

Lámina extensiblede parafina

Alícuotas de bufferde la muestra



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5.3.4.14 El proceso de visualización de ADN se describe en la sección 5.8

5.4 PREPARACIÓN DE GEL DE AGAROSA PARA ADN

5.4.1 Objetivo

Realizar la electroforesis de moléculas de ADN mayores de 100 pb.

5.4.2 Materiales

5.4.2.1 Cámara de electroforesis horizontal y accesorios.

5.4.2.2 Agarosa de porcentaje requerido por el operador (Anexo A).

5.4.2.3 Buffer TAE 50X (Anexo A).

Nota: Para la preparación del gel es importante tener completamente ensamblada la cámara deelectroforesis ubicándola sobre una superficie totalmente plana asegurando que no presente algúntipo de declive.

5.4.3 Preparación del gel de resolución


5.4.3.2 Preparar la agarosa de acuerdo al protocolo contemplado en el Anexo A.

5.4.3.3 Licuar la agarosa y posteriormente enfriarla en baño maría hasta que alcance una temperatura entre50ºC y 60°C.

5.4.3.4 Añadir agarosa en un volumen dependiente del tamaño de la cámara (20mL-25 mL son suficientespara dimensiones de L x A x H del gel: 8 x 6 x 0,5 cm) asegurando tener los peines debidamenteinsertados (Figura N° 11). Luego dejar enfriar por espacio de 20 minutos.

5.4.3.5 Después que la agarosa haya quedado completamente solidificada, añadir el buffer de electroforesisTAE 1X entre 0,5 y 1 cm por encima del gel (Figura N° 12). Posteriormente empezar a colocar lasmuestras (Figuras N° 10,13 y 14).

Figura N° 11. Preparación de la cámara de electroforesis para ADN en geles de agarosa.

Agarosa

Peine para moldearlos pocillos

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Figura N° 14. Detalle de la muestra de ADN ingresando en el pocillo de la cámara de electroforesis.

Figura N° 13. Sembrando ADN en la cámara de electroforesis.

Cámara deelectroforesis

Fuente depoder

Figura N° 12. Corte sagital de un sistema de electroforesis de ADN en geles de agarosa. En la figura seindica el nivel del buffer con respecto al gel de agarosa.

Cámara de electroforesis horizontal

Pocillo Buffer deelectroforesis

Tanque 1 Tanque 2Gel de agarosa

Base o contenedor del gel

Electrodos

0.5 - 1 cm.

ÁNODO

Buffer de corrida

CÁTODO



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5.5 ELECTROFORESIS DE ADN

5.5.1 Objetivo

Separar las moléculas de ADN de acuerdo a su peso molecular a través de geles de agarosa.

5.5.2 Materiales

5.5.2.1 Cámara de electroforesis incluyendo gel preparado.


5.5.2.3 Buffer de solución stock ADN TAE 50X (Anexo A).

5.5.2.4 Buffer de la muestra para ADN (Anexo A).

5.5.2.5 Guantes.

5.5.2.6 Gradilla para tubos de 1,5 mL

5.5.2.7 Micropipetas para volúmenes de 20 µL.

5.5.2.8 Puntas para micropipeta de 20 µL.

5.5.2.9 Envase para descarte de puntas.

5.5.2.10 Lámina extensible de parafina.


En el proceso de la electroforesis se realizará la separación de las moléculas de ADN a analizar deacuerdo a su peso molecular. Dicha distribución dependerá de la concentración del gel de resoluciónque se esté trabajando.

5.5.4 Procedimiento

5.5.4.1 Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las soluciones, las muestras y el equipo.

5.5.4.2 Mezclar cinco volúmenes de solución conteniendo ADN con un volumen del buffer de muestra 6X.Para realizar la mezcla, añadir 1 volúmen de buffer de muestra, repartidos en alícuotas de acuerdo alnúmero de muestras a cargar, sobre un pedazo de lámina extensible de parafina (Figura N° 10).Añadir cinco volúmenes de cada una de las muestras de ADN sobre las alícuotas de buffer de lamuestra y mezclar totalmente.

5.5.4.3 Mediante el uso de puntas de 20 µL proceder a cargar cuidadosamente la muestra en los pocillos,evitando la contaminación del pocillo contiguo (Figuras N° 13 y 14).

5.5.4.4 Considerar el uso de un marcador estándar de ADN para la medición del peso molecular de la muestra.Dicho marcador también debe ser mezclado con buffer de la muestra excepto cuando ya se encuentrapreviamente mezclado con el buffer.

28



5.5.4.5 Una vez finalizada la colocación del ADN en los pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar loscables correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.

5.5.4.6 Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje adecuado.

5.5.4.7 Aplicar un voltaje de acuerdo al peso molecular de las moléculas de ADN que se va a separar. Parael caso de productos de PCR (entre 100 pb a 1,5 kb), se recomienda usar voltajes comprendidosentre 75 a 100 voltios. Para muestras de ADN genómico y plasmídico (>2kb) se recomienda aplicarvalores entre 25 y 75 voltios. Los criterios para aplicar un determinado voltaje son explicados en lasección 5.8.

5.5.4.8 Calibrar el tiempo de electroforesis de acuerdo a la posición adoptada por los indicadores azul debromofenol y xilencianol en la matriz de agarosa. Esta posición permitie que el investigador tengauna idea de la ubicación aproximada de su muestra de ADN en el gel. Sin embargo, es importanteque el nvestigador estandarice el tiempo de electroforesis a fin de conseguir la mejor resolución deADN.

5.5.4.9 Luego de seleccionar las condiciones de voltaje iniciar la electroforesis. Durante el proceso se definendos frentes de corrida de diferente color y distancia de migración. Ambos colores, azul y verdecorresponden a los colorantes azul de bromofenol y xilene cianol respectivamente que conforman elbuffer de la muestra. En geles de agarosa dentro del rango de 0,5 a 1,4% el xilene cianol migra demanera similar a un fragmento de ADN de 4 Kilopares de bases (Kb), mientras que el azul de bromofenolse comporta como un fragmento de 300 pb.

5.5.4.10 Detener la electroforesis hasta que ambos frentes de corrida se localicen en la posición deseada porel investigador.

5.5.4.11 Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con desconectar loselectrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema que contiene el gel de agarosa.

5.5.4.12 El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior uso en un siguienteprocedimiento. Limpiar la cámara de electroforesis con chorro suave de agua destilada. Secar atemperatura ambiente.

5.6 COLORACIÓN Y VISUALIZACIÓN DEL ADN EN GELES DE POLIACRILAMIDA Y AGAROSAUSANDO BROMURO DE ETIDIO

5.6.1 Objetivo

Visualizar moléculas de ADN por coloración con bromuro de etidio.

5.6.2 Materiales

5.6.2.1 Bromuro de etidio (Anexo A).

5.6.2.2 Transiluminador.

5.6.2.3 Guantes.

5.6.2.4 Agua destilada.



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El proceso de coloración de ADN se basa en la propiedad del bromuro de etidio para intercalarseentre las bases del ADN y posteriormente fluorecer frente a la exposición con rayos ultravioleta. Susensibilidad es de aproximadamente 30 pg de ADN por banda, dependiendo del grosor de la matrizen el que se esté visualizando.

ADVERTENCIA: Debido a las propiedades mutagénicas, teratogénicas y carcinogénicas delbromuro de etidio, se recomienda realizar el procedimiento con guantes.

5.6.4 Procedimiento

5.6.4.1 Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de los reactivos.

5.6.4.2 Sumergir el gel de poliacrilamida o agarosa en un envase de teflón conteniendo bromuro de etidio auna concentración de 1µg/mL y dejar incubando por 5 minutos en reposo.

5.6.4.3 Devolver la solución de bromuro de etidio en su frasco original y lavar el gel cuidadosamente conabundante agua.

5.6.4.4 Trasladar el gel hacia un cuarto oscuro donde se encuentre un transiluminador de luz UV.

5.6.4.5 Depositar el gel cuidadosamente sobre la pantalla del transiluminador.

5.6.4.6 Visualizar el ADN usando lentes protectores contra la luz UV.

5.6.5 Interpretación de resultados

5.6.5.1 Las moléculas de ADN son visualizadas indirectamente cuando son coloreadas con bromuro deetidio, fluoreciendo como bandas de un color naranja frente a la luz UV. Las moléculas de ADN queson más grandes, generalmente migran más retardadamente que las moléculas de menor peso(Figura N° 15).

Figura N° 15. Resultado de una electroforesis horizontal de ADN en gel de agarosa. Carril 1:marcador de peso molecular. Carril 2y 3: moléculas de ADN del gen ial de Bartonella baciliformis.

4000-

1000-

500

1 2 3

30



5.6.5.2 Para determinar el peso molecular del ADN es necesario usar un marcador estándar de peso molecularconocido, el cual al ser comparado con la muestra problema permite determinar de manera aproximadael número de pares de bases de la molécula a analizar. Estos marcadores comerciales ademáspueden ser útiles como controles positivos del sistema de visualización del ADN, principalmentecuando se piensa evaluar la calidad del bromuro de etidio de la matriz (agarosa o poliacrilamida), opara determinar la intensidad del ADN que estamos evaluando (cálculos cualitativos de concentraciónde ADN), etc.

5.6.6 Descontaminación del bromuro de etidio usando carbón activado

5.6.6.1 Cubrir el fondo de un embudo con capacidad para 100 mL de solución con papel filtro Whatman N° 1.

5.6.6.2 Añadir 300 mg de carbón activado sobre el papel filtro y filtrar la solución de bromuro usado sobre elcarbón.

5.6.6.3 Descartar el filtrado al desagüe o alcantarillado.

5.6.6.4 Repetir el proceso cuantas veces sea necesario durante un año.

5.6.6.5 Eliminar el carbón de un año de antigüedad así como los geles de agarosa teñidos con bromuro deetidio en bolsas de plástico de bioseguridad.

5.6.6.6 Incinerar.

5.7 COLORACIÓN Y VISUALIZACIÓN DEL ADN EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON NITRATODE PLATA

5.7.1 Ventajas y desventajas

5.7.1.1 De manera alternativa, es posible visualizar ADN en geles de poliacrilamida a través del método detinción con plata. La ventaja de este método es que es de dos a cinco veces más sensible que elbromuro de etidio (detecta desde 0,1 a 0,001 ng de ADN por banda) y es menos tóxico. Del mismomodo, puede teñir ADN precoloreado con bromuro de etidio sin interferir en el resultado final.

5.7.1.2 Entre las desventajas que tiene este método es que también utiliza reactivos peligrosos, como elformaldehído, y requiere el uso de solución de nitrato de plata en cantidades moderadamente altasque con el tiempo resultaría muy costoso.

5.7.1.3 Es importante señalar que el método de tinción con plata también puede ser aplicado para lavisualización de proteínas usando un protocolo similar que no será descrito en este manual. Para elcaso de las proteínas, la sensibilidad del método es de 10 a 50 veces más alto que usando azulbrillante de coomasie (Puede detectar de 0,1 a 1,0 ng de polipéptido).

5.7.1.4 En general, el proceso de tinción con plata surge como una buena alternativa para la visualización deADN y proteínas; sin embargo, el procedimiento demanda mucho tiempo y esfuerzo, y en muchoscasos es necesario estandarizar las condiciones.

5.7.2 Materiales

5.7.2.1 Guantes.



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5.7.2.2 Pizeta con agua destilada.

5.7.2.3 Micropipetas para volúmenes de 20 y 200 µL.

5.7.2.4 Agua bidestilada.

5.7.2.5 Solución de fijación (Anexo A).

5.7.2.6 Solución de tinción (Anexo A).

5.7.2.7 Solución de revelado (Anexo A).

5.7.2.8 Solución de detención (Anexo A).

5.7.2.9 Formaldehído al 37% (Anexo A).

5.7.2.10 Tiosulfato de sodio (frasco stock).

5.7.3. Procedimiento


5.7.3.2 Colocar el gel de poliacrilamida en una bandeja conteniendo solución de fijación e incubar en agitaciónconstante durante 30 minutos. Alternativamente, el gel puede dejarse en solución de fijación, enreposo durante toda la noche.

5.7.3.3 Retirar el gel de la solución de fijación y colocarlo en un recipiente con agua destilada.

5.7.3.4 Lavar el gel con agua destilada agitando constantemente durante dos minutos, repetir esta operacióntres veces.

5.7.3.5 Retirar el gel del recipiente (dejar secar sobre una lámina de plástico o placa petri por 10 a 20segundos).

5.7.3.6 Colocar el gel en la solución de tinción y dejar en agitación constante durante 30 minutos.

5.7.3.7 Retirar el gel de la solución de tinción y lavar en agua destilada durante 5 segundos.

5.7.3.8 Añadir en el momento 150 µL de formaldehído (37% concentración comercial) y 1 mg de tiosulfato desodio pentahidratado para preparar la solución de revelado y enrazar hasta 100 mL.

5.7.3.9 Inmediatamente colocar el gel en la solución de revelado (Anexo A) y dejar en agitación constantehasta que empiecen a aparecer las bandas.

5.7.3.10 Cuando las bandas hayan alcanzado la intensidad deseada, agregar una solución fría (4°C -8°C) dereactivo de parada o detención y dejar en agitación hasta que no aparezcan más burbujas.

5.7.3.11 Secar el gel para registrar el resultado final (Figura N° 16)

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5.8 FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DEL ADN

Existen diferentes factores que tienen una marcada influencia sobre la distribución de las moléculasde ADN. Generalmente, estos factores suelen confundir los resultados finales, por lo que se recomiendaal investigador estandarizar algunos parámetros importantes que en la práctica suelen pasardesapercibidos. Estos factores pueden ser:

5.8.1 Tamaño del ADN

Generalmente la tasa de migración del ADN es inversamente proporcional al log10 del número depares de bases que conforman la molécula. Esto significa que las moléculas de ADN más grandesgeneralmente migran más lentamente que las más pequeñas.

5.8.2 Concentración de la agarosa

Una molécula de ADN migrará y se distribuirá de modo diferente a medida que varíe la concentraciónde la matriz de agarosa o poliacrilamida. Este fenómeno se puede explicar matemáticamente mediantela siguiente fórmula:

log µ = log µo - KrtDonde logm es el logaritmo de la movilidad electroforética del ADN, t es la concentración de laagarosa, mo es la libre movilidad electroforética del ADN y Kr es el coeficiente de retraso relacionadoa las propiedades del gel y del tamaño y forma de las moléculas que se desplazan (Anexo B).

5.8.3 Conformación del ADN

Existen moléculas de ADN que a pesar de presentar el mismo peso molecular adoptan conformacionesestructurales diferentes. Un ejemplo de ello son los plásmidos que en la mayoría de los casos generanestructuras superenrrolladas, formas lineales o formas circulares menos enrolladas o relajadas. Enla electroforesis, estos plásmidos migran de manera no uniforme y se distribuyen en la matriz deagarosa de tal manera que dan la impresión de tratarse de moléculas de diferente peso molecular.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Figura N° 16. Gel de poliacrilamida teñido con plata para la visualización de moléculas de ADN. Carril1: Marcador de peso molecular.Carril del 2 al 12: ADN ribosomal de mosquito Aedes aegypti.



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Sin embargo, estas diferencias pueden ser alteradas variando algunos parámetros físicos como lafuerza iónica del buffer, el voltaje aplicado o la concentración misma de agarosa (Figura N° 17).

5.8.4 Voltaje aplicado

Este parámetro es muy importante en la electroforesis ya que permite la movilización de las moléculasde ADN de un polo a otro. Es de resaltar que a medida que aumenta la fuerza del campo eléctrico(aumento de voltaje), se incrementa la movilidad de las moléculas de ADN de alto peso molecularpero de manera indistinta. Ello genera que las moléculas no se separen completamente unas deotras pese a aumentar la velocidad de la electroforésis. En consecuencia, se recomienda no aplicarmás de 5V/cm para moléculas de ADN mayores de 2 Kb.

5.8.5 Dirección del campo eléctrico

Durante una electroforesis normal, las moléculas de ADN migrarán a través de una determinadadirección influenciada por un campo eléctrico. Esta dirección tiene singular repercusión sobre la tasade migración de una molécula de ADN. Mientras este factor permanezca constante, la dirección dela migración del ADN se mantendrá inalterable. Sin embargo, existe la posibilidad de alterar la direccióndel campo eléctrico y con ello es posible cambiar el curso de la migración del ADN. En ese sentido, siconsideramos fraccionar dos grandes moléculas de ADN que miden entre 50 y 100 kb (por ejm. ADNgenómico) bajo un campo eléctrico de una sola dirección el resultado final será la presencia de una

Figura N° 17. Electroforesis de ADN plasmídico de E. coli fraccionado en agarosa a diferentes concentraciones. Carril 1: Marcadorde peso molecular Lambda Hind III en agarosa al 1,5% Carril 2: Plásmido en agarosa al 1,5%, Carril 3: Plásmido en agarosa al 1%.Carril 4: Plásmido en agarosa al 0,8% . Las flechas indican las distintas conformaciones estructurales del ADN plasmídico. En elcarril 3 se puede apreciar una menor concentración de ADN.

23130-

9416-

6557-

4361-

2322-2027-

ADN circularrelajadoADN circularenrollado

ADNsuperenrollado

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sola banda difusa en el que se encuentren ambos fragmentos. Pero, si realizamos un cambio en ladirección del campo eléctrico, las moléculas más grandes de 100 kb se autoalinearán, alterarán sumigración y se podrán separar en dos fragmentos completamente distinguibles. Este tipo deelectroforesis es conocido como electroforesis de campo pulsado (PFGE o Pulse Field GelElectrophoresis), y es bastante usado para la separación de moléculas de ADN de grandes tamaños(por encima de 100 kb).

5.8.6 Composición de las bases y temperatura

En geles de agarosa, la composición de las bases del ADN y la temperatura no son factores queinfluyen sobre la migración del ADN. En ese sentido no existen diferencias de migración de lasmoléculas de ADN desde 4° C a 30° C. Sin embargo, en concentraciones de ADN por debajo del0,8%, un eventual aumento de temperatura por encima de 50°C (cambio que puede ocurrir al aumentarel voltaje de electroforesis o por la alta fuerza iónica del buffer) puede generar la licuación del gel y enconsecuencia la pérdida de la muestra del ADN.

5.8.7 Presencia de agentes intercalantes

Algunos investigadores prefieren mezclar el ADN con el bromuro de etidio antes de realizar laelectroforesis. Ello genera que el bromuro de etidio se intercale entre las bases del ácido nucleicoproduciendo una alteración del peso molecular del ADN y reduciendo su movilidad durante laelectroforesis, en aproximadamente un 15%. Para evitar este problema se recomienda realizar primerola electroforesis y posteriormente la tinción del gel de agarosa con bromuro de etidio a fin de evitardistorsiones en la migración del ADN.

5.8.8 Composición del buffer de electroforesis

La migración del ADN es afectada por la composición y la fuerza iónica del buffer de electroforesis.En un caso hipotético en que por error se llevase a cabo la electroforesis usando agua en lugar debuffer, la conductividad eléctrica disminuiría drásticamente por la falta de iones y, en consecuencia,la migración del ADN sería casi nula. Si la concentración de iones fuera excesivamente alta, laconductividad eléctrica sería muy eficiente y se generaría un sobrecalentamiento del buffer. El calorexcesivo podría causar la licuación de la agarosa o la denaturación del ADN.

Actualmente se dispone de distintos buffers para electroforesis de ADN de doble hebra. Los másusados son el buffer TAE (Tris, ácido acético y EDTA) y el TBE (Tris Borato EDTA). La ventaja de usarTAE es que es menos costoso y a diferencia del TBE permite que las moléculas de ADN migren 10%más rápido. El TBE por su parte es un buffer muy eficiente y no se sobrecalienta fácilmente a grandesvoltajes. Por esta razón, este buffer es usado para la resolución de grandes fragmentos de ADN enmatrices poco concentradas.



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SECCIÓN 6

VARIANTES DE ELECTROFORESIS

Nuevos protocolos y técnicas basadas en la electroforesis de ADN y proteínas, han venido apareciendoen los últimos años. Mencionaremos brevemente los más importantes:

6.1 ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

6.1.1 Es un proceso de separación e identificación de proteínas en dos dimensiones, orientando los frentesde corrida en ángulo recto uno de otro. En tal sentido, las moléculas primero son separadas por sucarga o punto isoeléctrico (pI) por la técnica de enfoque isoeléctrico o IEF (Isoelectric Focusing).Posteriormente, las proteínas son separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular porelectroforesis en SDS PAGE (Figura N° 18).

6.1.2 A diferencia de la electroforesis en una dimensión en el que se puede resolver cerca de 50 bandas,la electroferesis de dos dimensiones permite resolver 2500 manchas de polipéptidos.

6.2 ELECTROFORESIS DE CAPILARIDAD

6.2.1 Como su nombre lo indica este tipo de electroforesis se lleva a cabo en finos capilares de sílicafundida cubierta con poliamida. Los tubos de sílica tienen una longitud de 30 a 100 cm con un diámetrode 25 a 100 µm y presentan radicales oxidrilo que al disociarse confieren una carga neta negativa.

6.2.2 El proceso se realiza en condiciones de alto voltaje y de campo eléctrico, donde el calor generado eseficientemente disipado gracias a la acción de los pequeños capilares. Para este propósito, el bufferutilizado en el sistema Tris 0,02 M pH = 8,6 pasa por los capilares removiendo los H+ de los radicalesoxidrilos. Con ayuda de corriente eléctrica se generará un flujo de protones hacia el cátodo, procesoconocido como flujo endo-osmótico.

Figura N° 18. Electroforesis en dos dimensiones de proteínas totales de Caenorhabditis elegans (Tomado de: http://www.aber.ac.uk/parasitology/Proteome/Tut_2D.ht).

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6.2.3 Este tipo de electroforesis permite separar una gran variedad de moléculas entre las cuales tenemos:proteínas, péptidos, aminoácidos, ácidos nucleicos, iones inorgánicos, bases orgánicas, ácidosorgánicos y células en general.

6.2.4 En este sistema el tiempo de separación es relativamente corto (5 a 10 minutos), mientras que laeficiencia de separación es muy alta (Figura N° 19).

6.3 ELECTROFORESIS EN CAMPO PULSADO (PFEG)

Es una técnica diseñada especialmente para la separación de ADN de alto peso molecular (>100kilopares de bases). PFEG (Pulsed-Field Electrophoresis Gel) opera alternando dos diferentes camposeléctricos sobre una matriz de agarosa; de esta manera es posible alterar la migración del ADN haciadiferentes direcciones facilitando la separación de dos grandes moléculas de ADN.

Figura N° 19. Esquema representativo de un modelo de electroforesis capilar (E= campo eléctrico, V = voltaje, d= distancia). Lafigura es una versión modificada de http://ntri.tamuk.edu/ce/ce.html

DetectorFuente de luz280 nm

Ánodo (+) Cátodo (-)

Buffer Buffer

Foto-receptor

Computadoracon registrador

E = V/d



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SECCIÓN 7

VERIFICACIÓN DE LA CALIDAD ÓPTIMA DE LOS EQUIPOS Y REACTIVOS EMPLEADOS

7.1 GENERALIDADES

7.1.1 Se recomienda que los equipos utilizados en biología molecular cuenten con un certificado de calidadavalado por sus propios fabricantes, a fin de asegurar el óptimo funcionamiento de las pruebasmoleculares.

7.1.2 Asimismo, los reactivos que se empleen deberán ser de grado biología molecular a fin de asegurarresultados satisfactorios después de cada experimento. Para el caso de algunos reactivos queexigen mantenerse en refrigeración, deberán ser evaluados por el propio investigador que los adquirióantes de realizar cualquier experimento. Para el caso del TEMED, el cual es adquirido en condicionesde refrigeración, el control de calidad se realiza preparando geles de poliacrilamida. Generalmente,la polimerización no debe demorar más de media hora.

7.1.3 La acrilamida/bisacrilamida es otro reactivo importante que en polvo puede guardarse a temperaturaambiente; sin embargo, en estado de solución puede mantenerse en refrigeración hasta por 6 meses.

7.1.4 Es importante verificar la calidad de los reactivos y soluciones de trabajo preparados en laboratorio.

7.2 BUFFER PARA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS Y ADN

7.2.1 Tanto el buffer de electroforesis para proteínas como de ADN, deberán ser preparados adecuadamentey renovados en forma periódica. En tal sentido, se recomienda preparar solución stock de buffer deelectroforesis concentrado 10 veces para proteínas (Anexo A) ó 50 veces para ADN (Anexo A). Estepaso permite conservar la reproducibilidad del experimento.

7.3 PERSULFATO DE AMONIO

7.3.1 En el caso del APS es un reactivo que se caracteriza por ser altamente higroscópico, es decir, suelehidratarse con facilidad. Por lo tanto, deberá realizarse un control periódico del frasco que lo contienea fin de evitar la humedad en su interior y consecuentemente la pérdida de sus propiedades químicasdurante el proceso de polimerización.

7.3.2 Para controlar la calidad de este reactivo verificar que el contenido no se encuentre endurecido nique se hallen gotas de agua en su interior. De otro lado, preparar geles de poliacrilamida usandoAPS al 10% y verificar que la polimerización no demore por más de media hora.

7.3.3 Para evitar la hidratación del APS se recomienda guardarlo en ambientes secos asegurando la tapacon lámina extensible de parafina.

7.4 BROMURO DE ETIDIO

7.4.1 La solución de trabajo (1 µg/mL) debe tener un color casi transparente. Una vez preparada la solución,forrar el frasco con papel aluminio y rotular.

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7.4.2 La calidad del bromuro de etidio puede ser verificado visualizando concentraciones de ADN desde 50pg (Sección 6.3) en un gel de agarosa incubado durante 5 minutos. La visualización de la mínimaconcentración de ADN permitirá determinar la calidad óptima del bromuro de etidio.

7.4.3 El contacto de este reactivo con la luz puede ocasionar la pérdida de sus propiedades fluorescentespor lo que se recomienda incubar los geles en oscuridad.

7.5 AGAROSA

7.5.1 La continua licuación de la agarosa incrementa su concentración por deshidratación alterando elperfil de las bandas al final del resultado. Por lo tanto, se recomienda preparar soluciones de agarosaen volúmenes no mayores de 200 mL y verificar constantemente la turbidez de la agarosa antes de lapreparación del gel.

7.5.2 De otro lado también se recomienda, verificar la presencia de residuos extraños en la solución ya quepueden interferir con el análisis del resultado final y con la electroforesis misma. Por lo tanto, seránecesario preparar una nueva solución a fin de superar este inconveniente.

7.6 POLIACRILAMIDA AL 30%

Esta solución de trabajo debe ser renovada cada mes debido a que la constante exposición a la luzy el cambio de temperatura fácilmente deterioran su calidad.

7.7 AGUA DESTILADA

7.7.1 En biología molecular la calidad del agua (grado de pureza) es imprescindible para obtener óptimosresultados en cada experimento. En ese sentido, se recomienda preparar tanto los buffers paraproteína y ADN, así como también para los geles de poliacrilamida y agarosa con agua bidestilada. Siel investigador cuenta con un equipo de destilación asegúrese que el agua presente una resistividadeléctrica dentro de un rango de 10 a 18 Meghoms (rango por el cual existe una mínima concentraciónde iones y cationes de agua, lo cual indica un alto grado de pureza).

7.8 EQUIPOS DE LABORATORIO

7.8.1 Los equipos que se usan en biología molecular deben pasar por un proceso de mantenimientopreventivo continuo por lo menos una vez al año. Este proceso deberá ser realizado por personaltécnico altamente capacitado o de preferencia por representantes de la misma compañía fabricante.



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SECCIÓN 8

REGISTROS Y ARCHIVOS

Para llevar a cabo el registro y archivo de resultados finales es importante seguir los siguientespasos:

8.1 Para conservar los resultados en el cuaderno de trabajo a partir de un gel de agarosa visualizado conla luz UV, tomar una fotografía con una cámara fotográfica resistente a este tipo de luz.

8.2 En caso de no ser posible tomar una fotografía, tratar de dibujar con un lápiz el resultado lo másparecido posible a lo que se observa. De manera alternativa, usar un forro de plástico para cuaderno,colocarlo sobre la lámina de protección de luz UV y dibujar el gel con un marcador para vidrio.

8.3 Para la conservar los resultados a partir de geles de poliacrilamida para ADN, el proceso puederealizarse usando una cámara fotográfica. Sin embargo, es posible recurrir a la tinción con plata ysecar el gel para su posterior análisis y registro. Para el caso de proteínas teñidas con azul brillantede ccomasie también se recomienda secar el gel.

8.4 Registrar los resultados obtenidos siguiendo el Esquema N° 1.

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CARRIL 1: _________________________________

CARRIL 2: _________________________________

CARRIL 3: _________________________________

CARRIL 4: _________________________________

CARRIL 5: _________________________________

CARRIL 6: _________________________________

CARRIL 7: _________________________________

CARRIL 8: _________________________________

CARRIL 9: _________________________________

CARRIL 10: _________________________________

CARRIL 11: _________________________________

CARRIL 12: _________________________________

CARRIL 13: _________________________________

CARRIL 14:_________________________________

OBSERVACIONES: __________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________________________

___________________________________________

ESQUEMA N° 1

RESULTADOS EXPERIMENTO N°_________

FECHA: _______________

OBJETIVO DELEXPERIMENTO: _____________________________________________________________________________

CONCENTRACIÓN DEL GEL:



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ANEXOS

ANEXO A

A.1 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

A.1.1 BUFFER DE LA MUESTRA 4X PARA PROTEÍNAS

Mezclar los componentes arriba mencionados.

A.1.2 BUFFER DE ELECTROFORESIS TRIS-GLICINA 10X PARA PROTEÍNAS

Reactivos Concentración final

Tris 0,5 M, pH 6,8 2,5 mL 0,125 M

SDS al 10 % 2,5 mL 2.5 %

2-Mercaptoetanol 2,5 mL 25 %

Glicerol 2,5 mL 25 %

Azul de bromofenol 1 mg 0,1 mg/mL

Completar con 100 mL de agua bidestilada.

A.1.3 SOLUCIÓN DE TRABAJO ACRILAMIDA/BISACRILAMIDA AL 30%

Disolver con 100 mL de agua bidestilada. Filtrar para remover las impurezas en papel Whatman N° 1y forrar el recipiente con papel aluminio o kraft.

A.1.4 BUFFER TRIS 1,5 M pH= 8,8

Pesar 181,65 g de tris base y enrasar con agua bidestilada hasta un volumen de 1 L. Ajustara pH= 8,8 con HCl.

A.1.5 BUFFER TRIS 0,5 M pH=6,8

Pesar 60,55 g de tris base y enrasar con agua bidestilada hasta un volumen de 1 L. Ajustar apH = 6,8 con HCl.


STris base 3,038 gr 0,25 M

Glicina 15,01 gr 2 M

SDS 1 gr 1 %


Acrilamida 29,2 gr 29,2%

Bisacrilamida 0,8 gr 0,8%

Mezcla total 30 gr 30%

44



A.1.6 PERSULFATO DE AMONIO (APS 10%)

Pesar 100 mg y diluir en un volumen final de 1 mL con agua tridestilada. Este reactivo en polvo esaltamente hidrofílico, por lo tanto, es importante mantener el envase herméticamente cerrado. Estapreparación debe ser de 1 semana de antigüedad como máximo.

A.1.7 BUTANOL-AGUA

Mezclar un volumen de butanol más un volumen de agua destilada y mezclar. Tomar la fase superiorde la mezcla.

A.1.8 PREPARACIÓN DE GELES POLIACRILAMIDA DE RESOLUCIÓN DE ACUERDO A SUCONCENTRACIÓN Y VOLUMEN

COMPONENTES DE LA SOLUCIÓN VOLUMEN FINAL DE LA SOLUCIÓN

GEL AL 6 5 mL 10 mL 15 mL 20 mLAgua bidestilada 2,6 5,3 7,9 10,6Acrilamida/bisacrilamida 30% 1,0 2,0 3,0 4,0Tris 1,5 m pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0SDS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2Persulfato de amonio 10% 0,025 0,05 0,075 0,1TEMED 0,0025 0,05 0,0075 0,01COMPONENTES DE LA SOLUCIÓN 5 mL 10 mL 15 mL 20mLGEL AL 8%Agua bidestilada 2,3 4,6 6,9 9,3Acrilamida/bisacrilamida 30% 1,3 2,7 4,0 5,3Tris 1,5 m pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0SDS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2Persulfato de amonio 10% 0,025 0,05 0,075 0,1TEMED 0,0025 0,05 0,0075 0,01

GEL AL 10%Agua bidestilada 1,9 4,0 5,9 7,9Acrilamida/bisacrilamida 30% 1,7 3,3 5,0 6,7Tris 1,5 m pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0SDS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2Persulfato de amonio 10% 0,025 0,05 0,075 0,1TEMED 0,0025 0,05 0,0075 0,01 VOLUMEN FINAL DE LA SOLUCIÓNGEL AL 12%Agua bidestilada 1,6 3,3 4,9 6,6Acrilamida/bisacrilamida 30% 2,0 4,0 6,0 8,0Tris 1,5 m pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0SDS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2Persulfato de amonio 10% 0,025 0,05 0,075 0,1TEMED 0,0025 0,05 0,0075 0,01



MPR-CNSP-016

A.1.9 PREPARACIÓN DE GELES DE EMPACAMIENTO AL 5% DE ACUERDO A SU VOLUMEN

GEL AL 15%Agua bidestilada 1,1 2,3 3,4 4,6Acrilamida/bisacrilamida 30% 2,5 5,0 7,5 10,0Tris 1,5 m pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0SDS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2Persulfato de amonio 10% 0,025 0,05 0,075 0,1TEMED 0,0025 0,05 0,0075 0,01

COMPONENTES DE LA SOLUCIÓN 3 mL 4 Ml 6 mL 8 mLAgua bidestilada 1,1 2,3 3,4 4,6Acrilamida/bisacrilamida 30% 2,5 5,0 7,5 10,0Tris 1,5 m pH 8,8 1,3 2,5 3,8 5,0SDS 10% 0,05 0,1 0,15 0,2Persulfato de amonio 10% 0,025 0,05 0,075 0,1TEMED 0.0025 0.05 0.0075 0.01

A.1.10 SOLUCIÓN DE TRABAJO DE AZUL BRILLANTE DE COMASIE R250

Disolver 0,25 g de azul brillante de coomasie R250 en 90 mL de metanol:H2O (v/v 1:1) y 10 mL deácido acético glacial. Filtrar la solución a través de un papel Whatman N° 1 para eliminar los residuosextraños. Antes de usar dejar en reposo por una semana en un frasco oscuro.

A.1.11 SOLUCIÓN DE DECOLORACIÓN RÁPIDA

Mezclar 10 mL de ácido acético glacial con 50 mL de metanol. Llevar la solución a 100 mL con 40 mLde agua destilada.

A.1.12 SOLUCIÓN DE DECOLORACIÓN LENTA

Mezclar 10 mL de ácido acético glacial con 5 mL de metanol. Llevar la solución a 100 mL con 85 mLde agua destilada.

A.1.13 SOLUCIÓN GLICEROL METANOL

Mezclar 4 mL de glicerol con 45mL de metanol. Llevarlo a un volumen de 100 mL de agua destilada.

A.1.14 SDS 10%

Disolver 10 g de SDS en 80 mL de agua bidestilada, una vez disuelto se lleva a pH 7,2 con 10 N deNaOH, finalmente se completa hasta 100 mL con agua bidestilada.

Calentar a 68° C para disolver completamente el SDS.

46



A.2 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE ADN

A.2.1 BUFFER DE RESOLUCIÓN STOCK TRIS-BORATO (TBE) 5X

Reactivo Cantidad Concentración final

Tris base 54 g 0,45 M

Ácido bórico 27,5 g 0,45 M

EDTA 0,5M Ph 8,0 20 Ml 0,01 M

Llevar a un volumen de un litro con agua bidestilada

A.2.2 BUFFER DE RESOLUCIÓN STOCK TRIS-ACETATO (TAE) 50X

Preparar:


Tris base 242 g 1,9 M

Ácido acético glacial 571 Ml 57,1%

EDTA 0,5M Ph8,0 100 Ml 0,05 M

Completar con 1 Litro de agua bidestilada

A.2.3 BUFFER DE MUESTRA PARA ADN (6X)

Preparar:


Azul de bromofenol 25 mg 0,25% w/v

Xilene cianol FF 25 mg 0,25% w/v

Sucrosa 4 g 40% w/v

Disolver en 10 mL de TAE 1X

A.2.4 PREPARACIÓN DE GELES DE POLIACRILAMIDA PARA ADN

Reactivos 3,5% 5,0% 8,0% 10% 12,0% 20%

Acrilamida/bisacrilamida

al 30%11,6 16,6 26,6 33,3 40,0 66,6

Agua bidestilada 67,7 62,7 52,7 46,0 39,3 12,7

TBE 5X 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0

APS 0,7 0,7 0,7 0,70 0,7 0,7

Mililitros de reactivo para la preparación de geles a variasconcentraciones (Volumen final 100 mL)

Añadir 35 µL de TEMED por cada 100 mL de solución.



MPR-CNSP-016

A.2.5 AGAROSA 0,8%, 1,5% Y 2%

Disolver 0,8 g, 1,5 g ó 2 g de agarosa en 98 mL de agua bidestilada. Adicionar a la solución 2 mL deTAE 50X, homogeneizar y disolver la agarosa en horno microondas o en baño María.

A.2.6 SOLUCIÓN STOCK DE BROMURO DE ETIDIO (10mg/mL)

Nota: El bromuro de etidio es un agente cancerígeno y moderadamente tóxico. Usar guantes paramanipular este reactivo

Pesar 100 mg de bromuro de etidio en 10 mL de agua bidestilada. Forrar el recipiente con papelaluminio u otro que impida el paso de la luz.

A.2.7 SOLUCIÓN DE TRABAJO DE BROMURO DE ETIDIO (1 µg/mL)

Diluir 100 µL de bromuro de etidio a partir de la solución stock en 100 mL de agua bidestilada. Forrarel recipiente con papel aluminio u otro que impida el paso de la luz.

A.2.8 SOLUCIÓN DE FIJACIÓN/ DETENCIÓN AL 10% PARA TINCIÓN CON PLATA

Mezclar 10 mL. de ácido acético glacial y 90 mL de agua bidestilada.

A.2.9 SOLUCIÓN DE TINCIÓN CON PLATA

Disolver 0,1 gr de nitrato de plata en 80 mL de agua, agregar 150 µL de formaldehído al 37%,completar la solución hasta 100 mL.

A.2.10 SOLUCIÓN DE REVELADO PARA TINCIÓN CON PLATA

Disolver 3 gr de carbonato de sodio (Na2CO3) en 100 mL de agua bidestilada. Dejar enfriar Agregar150 µL de formaldehído al 37% y 1 mg de tiosulfato de sodio pentahidratado segundos antes de serusado.

48





MPR-CNSP-016

ANEXO B

B.1 UNIDADES Y FÓRMULAS

B.1.1 EQUIVALENCIAS DE VALORES EN PESO

1 mg = 10-3 g1 µg = 10-6 g1 ng = 10-9 g1 pg = 10-12 g1Kb de ADN equivale a 333 aminoácidos de capacidad codificante = 37,000 Daltons

B.1.2 VALORES PARA CUANTIFICAR ADN Y ARN

Una unidad de densidad óptica (OD) a 260 nm de ADN de cadena doble= 50 µgUna unidad de densidad óptica (OD) a 260 nm de ADN de cadena simple= 37 µgUna unidad de densidad óptica (OD) a 260 nm de ARN de cadena simple= 40 µg

B.1.3 Rango de movilidad del ADN, xilene cianol y azul de bromofenol por diferentes concentracionesde geles de poliacrilamida

Acrilamida(% peso/volumen)

3,5 1000 - 2000 460 100

5,0 80 - 500 260 65

8,0 40 - 200 160 45

12,0 60 - 400 70 20

15,0 25 - 150 60 15

20,0 6 - 100 45 12

Rango de separaciónefectiva en pb

XileneCianol FF (*)

Azul debromofenol (*)

(*) Los números dados son los tamaños aproximados en pares de bases de fragmentos de ADN decadena doble con lo cual los colorantes migran en conjunto (Fuente: Sambrook et. al., 1989)

B.1.4 RANGO DE SEPARACIÓN DEL ADN EN GELES QUE CONTIENEN DIFERENTESCONCENTRACIONES DE AGAROSA (FUENTE: SAMBROOK et. al., 1989)

Concentración de agarosa en gel (% [w/v])

0,3 5 - 60

0,6 1 - 20

0,7 0,8 - 10

0,9 0,5 - 7

1,2 0,4 - 6

1,5 0,2 - 3

2,0 0,1 - 2

Eficiente rango de separación de ADN lineal en Kilopares de bases (Kb)

50



Concentración de poliacrilamida (%)

15 12 - 43

10 16 - 68

7,5 36 - 94

5,0 57 - 212

Rango lineal de separaciónen Kilodaltons (kDa)

B.1.5 RANGO DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS EN GELES QUE CONTIENEN DIFERENTESCONCENTRACIONES DE POLIACRILAMIDA (RADIO 29:1 DE ACRILAMIDA/ BISACRILAMIDA)



MPR-CNSP-016

ANEXO C

C.1 MEDIDAS A SEGUIRSE EN CASO DE CONTACTO ACCIDENTAL CON REACTIVOS TÓXICOS

En casi todos los casos en los que se tiene contacto con los reactivos que se mencionan en la listaadjunta, es importante seguir los siguientes pasos como medida de emergencia:

• Si el reactivo hizo contacto con los ojos, lavar con abundante agua por espacio de 15 a 20 minutoshasta que no haya evidencia de restos del reactivo. Si el contacto fue en la piel, lavar con jabón yabundante agua.

• Si hubo inhalación, trasladarse inmediatamente hacia un área donde haya aire fresco.

• Recibir asistencia médica inmediatamente.

C.2 LISTA DE REACTIVOS USADOS EN ELECTROFORESIS CON SUS CARACTERÍSTICAS TÓXICASY QUÍMICAS

REACTIVO CARACTERISTICA

Acido acético glacial Irritante por inhalación, corrosivo.Acido bórico Dañino por inhalación o por contacto con la piel. Irrita los ojos, sistema

respiratorio y piel. Posible riesgo de efecto irreversible. Posibleteratógeno. Puede causar daño al sistema nervioso central.

Acrilamida Neurotóxico, cancerígeno, genera daño genético heredable.Agarosa No se reporta algún grado de toxicidad.Azul de bromofenol Puede ocasionar asfixia por inhalación.Bisacrilamida Neurotóxico, nocivo e inflamable.Bromuro de etidio Genera daño genético heredable, irrita los ojos el sistema respiratorio y

la piel.Butanol Nocivo.Dodecil sulfato de sodio (SDS) Tóxico, nocivo, puede causar severa irritación a las vías respiratorias,

piel y ojos.EDTA Nocivo.Glicerol Irrita ojos y piel.Glicina No se reporta algún grado de toxicidad.Mercaptoetanol Tóxico por inhalación o contacto con la piel, genera severa irritación.Metanol Tóxico e inflamable.Persulfato de amonio Corrosivo, inflamable, nocivo por inhalación, produce quemaduras en la

piel.Sucrosa No se reporta algún grado de toxicidad.TEMED Corrosivo, inflamable, nocivo por inhalación, produce quemaduras en la

piel.Tris Posible cancerígeno, produce irritación al sistema respiratorio y piel.Xilene cianol Irrita ojos, piel y sistema respiratorio.

52





MPR-CNSP-016

ANEXO D

PROBLEMAS MÁS COMUNES PRESENTES DURANTE LOS PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS

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54





MPR-CNSP-016

ANEXO E

E.1 EJERCICIOS RESUELTOS PARA LA PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

E.1.1 Preparar 500 ml de Buffer TAE 1X a partir de una solución stock de TAE 50X

Solución

Si se toma un volumen inicial de la solución stock concentrada 50X de buffer TAE para diluirla conagua hasta obtener 500 mL de buffer TAE concentrado a 1X. ¿Cómo calcular dicho volumen?Se tiene los siguientes datos:Volumen inicial 1 (V1)= ? Concentración inicial 1 (C1) = 10XVolumen final 2 (V2)= 500 mL Concentración final 2 (C2) = 1X

Aplicando el siguiente factor de dilución: V1 x C1 = C2 x V2 y reemplazando valores se tiene:V1(50X) = (1X)(500 mL)

Despejando V1 y cancelando el factor X nos queda: V1= 10 mL

Rp.- Debemos tomar 10 mL de TAE 50 X y llevarlo hasta 500 mL con 490 mL de agua bidestilada

E.1.2 Preparar 250 mL de agarosa al 1,5% en TAE 1X

Solución

Calcular cuanto de agarosa debemos pesar y qué volumen de TAE 50X emplear para un volumenfinal de 250 mL de agarosa al 1,5%.

Calculando el peso de la agarosa.

Cuando nos referimos a agarosa al 1,5% decimos que 1,5 g de agarosa deben estar contenidos en100 mL de volumen total de TAE 1X.En consecuencia si 1,5 g es para 100 mL x g será para 250 mLPor regla de tres simple

x = 1,5g x 250 mL = 3,75 g100 mL

Calculando volumen de TAE 50X:

Recordando el factor de dilución: V1 x C1 = C2 x V2

El volumen inicial: V1 = (1X)(250 mL) 50X

V1 = 5 mLRp.- Pesar 3,75 g de agarosa, luego añadir 5 mL de TAE 50X y llevar toda la mezcla a un volumen de250 mL con agua bidestilada.

56



E.1.3 Preparar 450 mL de buffer TBE 1X a partir de un stock de 10X

Solución

Empleando la fórmula conocida: V1 x C1 = C2 x V2

V1 = (1X) (450 mL)10X

V1 = 45 mLRp.- Usaremos 45 mL de TBE 10 X para preparar 450 mL de TBE 1X

E.1.4 Preparar 100 mL de bromuro de etidio a una concentración de 1µg/µl a partir de una soluciónstock de 10 mg/mL.

Solución

En este caso también usar la fórmula: V1 x C1 = C2 x V2 ..................................(1)Donde: V1 = ?, C1 = 10 mg/mL, V2 = 100 mL, C2 = 1 µg/µLConvirtiendo 10 mg/mL a µg/µL:En 10 mg hay 10 000 µg. En 1 mL hay 1000 µL. Dividiendo:

10 000 µg = 10 µg/µL = C11000 µL

Reemplazando en (1)V1 (10 µg/µL) = (1 µg/µL)(100 mL)V1 = 10 mLRp.- Se necesita un volumen de 10 mL de stock de bromuro de etidio (10 mg/mL) para diluirlo con990 mL de agua bidestilada.

E.1.5 Preparar 50 mL de una solución de EDTA al 0,5M. El peso molecular del EDTA es de 336,2 g/Mol

Solución

El EDTA es un agente quelante cuya presentación comercial es en forma de polvo. En consecuencia,debemos calcular cuanto de EDTA debemos pesar para preparar una solución de 0,5 M.Aplicando la siguiente fórmula:

W = M x PM x V.........................(a)

Donde: W = es el peso que queremos calcular expresado en gramos, PM= corresponde al pesomolecular del compuesto compuesto en g/Mol y V = Volumen expresado en litros.

Datos:PM del EDTA = 336,2 g/Mol.Molaridad = M = 0,5M = 0,5 Moles/Litro.Volumen EDTA que se quiere preparar = 50 mL. Convirtiendo 50 mL a litros (Lt):1 Lt contiene 1000 mLx Lt habrá en 50 mL



MPR-CNSP-016

Aplicando regla de tres simple:x = (50 mL) (1Lt) = 0,05 Lt1000 mLReemplazando y despejando unidades(a):

W = (0,5Moles) (336,2g) (0,05 Lt) Lt Moles

W = 8,405 gRp.- Diluir 8,405 g de EDTA en 50 mL de agua para preparar una solución 0,5 M de EDTA.

E.1.6 Preparar 10 mL de una solución de butanol-agua en proporción 1:1

Solución

Cuando se refiere a una proporción 1:1 significa que se debe realizar una mezcla de volúmenesproporcionalmente iguales entre ambas soluciones. Así tenemos:Butanol = 5 mLAgua = 5 mLVolumen final 10 mL

Rp.- Mezclar 5 mL de butanol más 5 mL de agua.

E.1.7 ¿Qué volumen de una solución stock de Tris 5M pH = 8,8 se necesita para preparar un volumende 250 mL Tris-HCl de Buffer Tris 1,5M pH= 8,8?

Solución

Aplicando la fórmula y reemplazando valores:V1 x C1 = C2 x V2(V1 ) (5M) = (1,5M) (250 mL)V1 = 75 mL

Rp.- Se necesita un volumen de 75 mL de Tris 5M pH= 8,8.

E.1.8 ¿Cuánto de acrilamida y bisacrilamida se necesita para preparar 100 mL de una solución al30% si se desea mantener una proporción de 29:1 de acrilamida:bisacrilamida respectivamente?

Solución

La proporción 29:1de acrilamida/bisacrilamida indica que son 29 partes de acrilamida sobre 1 debisacrilamida. Asimismo, nos indica que la concentración final de la solución será de 30%, es decir 30partes de la mezcla en un total de 100 partes de la solución.

Así tenemos:

29:1 = 29 g de acrilamida + 1g de bisacrilamida.Volumen final = 100 mL

Rp.- Se necesitan 29 g de acrilamida y 1 g de bisacrilamida.

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MPR-CNSP-016

ANEXO F

F.1 PAGINAS WEB RECOMENDADAS

F.1.1 ELECTROFORESIS EN GENERAL:

• DNA Electrophoresis.http://www.protocol-online.net/molbio/DNA/dna_electrophoresis.htm.

• Polyacrilamide gel electrophoresis (Page):http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mm/page.html#sds_bact

• Electroforesis vertical:http://matematicas.udea.edu.co/~carlopez/cnq533/ELECTROFORESIS_VERTICAL.pdf

• Electrophoresis lecture notes.http://www.tulane.edu/~wiser/methods/handouts/elect.PDF.

• Electrophoresis. Agarose gel electrophoresis of PCR products. En: Rob Cruickshank's Protocol Book.http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/~rcruicks/pb.html

• Gustafsson J, Blomberg A, Rudemo M (2001). Warping two-dimensional electrophoresis gel imagesto correct for geometric distortions of the spot pattern.http://www.math.chalmers.se/Math/Research/Preprints/2001/73.pdf

F.1.2 BIOSEGURIDAD:

• ORS chemical safety. Decontamination of Ethidium Bromide.http://www.northwestern.edu/research-safety/chem/ethid2.htm

• Sinclair Bob. An Eye for a Dye. Safe and sensitive new stains replace ethidium bromide for routinenucleic acid detection. (2000) The Scientist 14[8]:31. Pag Web:http://www.the-scientist.com/yr2000/apr/profile_000417.html(Previa subscripción gratutita)

F.1.3 UNIDADES Y FÓRMULAS:

• Roe, B. Units and formulas. Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Oklahoma,Norman, Oklahoma 73019 [email protected]://www.genome.ou.edu/protocol_book/protocol_adxG.html

F.1.4 PROTEÓMICA:

• Introduction to Proteomics. Pág. Web: http://www.bb.iastate.edu/~chitnis/joe/papers/wilder.html

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ARTES Y DISEÑOS LASER S.R.Ltda.Calle Las Turquesas 263-265-269

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Telf.: 265-8320 Telefax: 266-0075

Setiembre 2003

Tiraje: 3,000 ejemplares

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SEDE CENTRAL

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Telf.: (51-1) 471 9920 - Fax: (51-1) 471 0179E-mail: [email protected]ágina Web: www.ins.gob.pe

Manual de Electroforesis de Proteinas

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