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ELECTROFORESIS CAPILAR (CE)

Las separaciones electroforéticas se llevan a cabo habitualmente en dos modalidades que difieren notablemente: Electroforesis Convencional y Electroforesis Capilar (CE). La primera es la metodología clásica que ha sido utilizada durante muchos años para separar especies complejas, de elevado peso molecular, de interés biológico y bioquímico; por otro lado, la segunda es un método de separación que se basa en las diferentes velocidades de migración de especies cargadas, en el seno de una disolución amortiguadora a través de la cual se aplica un campo eléctrico constante. Esta técnica de separación fue desarrollada, en primer lugar, por el químico sueco ARNE TISELIUS, quien durante la década de los años treinta la aplico al estudio de las proteinas séricas1.

La electroforesis a escala macro se ha aplicado a diversos problemas de separaciones analíticas dificultosas: aniones y cationes inorgánicos, aminoácidos, catecolaminas, fármacos, vitaminas, carbohidratos, péptidos, proteinas, ácidos nucleicos, nucleótidos, polinucleótidos u otras especies numerosas. Hasta la aparición de la electroforesis capilar (CE), las separaciones electroforéticas no se realizaban en columnas, sino en un medio estabilizador plano como papel o gel semisólido poroso. En consecuencia, (CE) ha llegado a ser una herramienta importante para una gran variedad de problemas de separación analítica2.

A. EQUIPO DE ELECTROFORESIS CAPILAR

1. Capilar de Sílice Fundido2. Sistema de Refrigeración del

capilar 3. Fuente de Corriente Eléctrica4. Viales con Electrodo y Muestra

5. Electrodo de Platino6. Detector7. Sistema de Registro y Análisis

de señal

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Esquema de los elementos básicos de la Electroforesis Capilar1, 3.B. DIFERENCIAS EN LA TEMPERATURA Y EN LA CONVECCIÓN

Recordemos que el principal problema del calentamiento de Joule es que provoca convección en los tampones electroforéticos, y la mezcla convectiva disminuye la calidad de separación. Se puede esperar que la convección sea menor si se reducen las diferencias de temperatura en el tampón. Introduciendo el tampón en un capilar, las diferencias de temperatura se reducen de dos maneras2.

En primer lugar, una disminución en la sección transversal reduce la corriente que fluye a un voltaje determinado. Para un voltaje y un tampón fijo, la corriente que fluye disminuye cuando el área de la

sección transversal del líquido se reduce. Puesto que la sección transversal es π r2, el calentamiento de

Joule (potencia) disminuye fundamentalmente con el cuadrado del radio. Por tanto, disminuye el diámetro desde 100 m hasta 50 m, se espera que la corriente a un voltaje fijo disminuya por un factor de cuatro. El calentamiento de Joule, por tanto, se reducirá por un factor de cuatro; ya que, P = I x V 2.

En segundo lugar, la menor sección transversal hace que disminuya la distancia que el calor tiene que recorrer para igualar la temperatura con el tampón. Nivelando las diferencias de temperaturas con el tampón se reduce la convección .También, el aumento del calor total se hace más pequeño por la menor distancia al medio que lo rodea 2.

El diagrama muestra cómo cambia la temperatura desde su punto más alto en el centro del tampón en el capilar, hasta el menor nivel de temperatura, que es el medio que lo rodea.

Diagrama de las temperaturas relativas a través del

Capilar durante una Separación Electroforética2.

Pequeños tamaños no solo reducen el calor de Joule, sino también la magnitud de la convección en sí misma. En efecto, a pequeñas distancias de la superficie, la disolución acuosa es más resistente a la convección que a grandes distancias. La pared del capilar actúa como un polímero soportado en un gel para reducir la tendencia a la convección. Tanto la reducción del incremento de temperatura como el efecto de las pequeñas distancias a la pared del capilar permiten aplicar (de 5 a 40 kV) comparado con los sistemas más grandes, y se mejora así la calidad de la separación. El cambio en el radio también

Centro del capilar

∆ T

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reduce otros efectos de la temperatura cuando la separación se realiza por electroforesis capilar, que son grandes y complejos2.

C. FLUJO ELECTROOSMÓTICO (FEO) ó ELECTROOSMOSIS (EO) ó ELECTROENDOOSMOSIS EN CAPILARES.

Cuando se aplica un potencial elevado a través de un capilar que contiene un tampón, se origina normalmente un flujo electroosmótico, gracias al cual el disolvente migra hacia el cátodo o el ánodo. La velocidad de migración puede ser apreciable. Por ejemplo, se ha demostrado que una disolución tampón 50 mM de pH migra hacia el cátodo a través de un capilar de 50 cm a una velocidad de aproximadamente 5 cm/min cuando se aplica un potencial de 25 KV 2, 3.

En la figura de distribución de cargas, la causa del flujo electroosmótico es la doble capa eléctrica que se desarrolla en la interfase sílice/disolución. A valores de pH mayores de 3, la pared interna de un capilar de sílice se carga negativamente a causa de la ionización de los grupos silanol de superficie (Si-OH) 3.

Distribución de las cargas en la interfaz del capilar de Sílice y flujo electroosmótico resultante3.

Los cationes del tampón se congregan en una doble capa eléctrica adyacente a la superficie negativa del Capilar de sílice. Los cationes de la parte exterior difusa de la doble capa son atraídos hacia el cátodo o electrodo negativo. Dado que estos cationes están solvatados, arrastran consigo el grueso de disolvente.

En la Figura perfiles de flujo de líquido, puesto que el flujo se origina en las paredes del tubo, la electroósmosis da lugar a un flujo de la disolución con un perfil plano a través del tubo 4.

Perfiles de flujo de líquidos bajo (a) flujo electroosmótico y (b) flujo inducido por presión1, 4.

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Este perfil contrasta con el perfil laminar (parabólico) que se observa en el flujo impulsado por la presión que se emplea en HPLC. Dado que el perfil es esencialmente plano, el flujo electroosmótico no contribuye apreciablemente al ensanchamiento de banda, a diferencia de lo que ocurre con el flujo impulsado por la presión en la cromatografía de líquidos3.

La velocidad del flujo electroosmótico suele ser mayor que las velocidades de migración electroforéticas de los iones individuales y, en efecto, se convierte en la bomba de la fase móvil en la electroforesis capilar de zona. Aun cuando los analitos migran según sus cargas dentro del capilar, la velocidad de flujo electroosmótico generalmente es suficiente para arrastrar todas las especies positivas, neutras e incluso negativas, hacia el mismo extremo del capilar, de manera que todas pueden ser detectadas a su paso por un punto común2, 3.

La Figura velocidades en presencia de flujo electroosmótico. La longitud de la flecha que está junto al ion indica la magnitud de su velocidad; la dirección de la flecha muestra la dirección del movimiento. El electrodo negativo está a la derecha y el electrodo positivo a la izquierda de esta parte de la disolución. El electroferograma resultante tiene la apariencia de un cromatograma, pero con picos más estrechos1, 2.

Velocidades en presencia de flujo electroosmótico 1.

Cuando se aplica un potencial entre los extremos de un tubo aislante que contiene un líquido, este líquido se mueve a lo largo de todo el tubo como si fuera un enchufe largo. La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del tampón y depende de la carga en la superficie del interior del capilar. Es esencial el control del FEO para la reproducibilidad de los resultados en electroforesis capilar2.

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Una gran ventaja que presenta el flujo electroosmótico es que la separación electroforética y la detección se pueden realizar a la vez para cationes y aniones. La velocidad de flujo electroosmótico se suma a la velocidad de electroforesis de los iones. Puesto que el flujo electroosmótico es también proporcional al potencial, es conveniente usar una movilidad para definir también al FEO2, 3.

La movilidad electroforética es la relación entre la velocidad de migración de un ion y un campo eléctrico3.

D. ALTURA DE PLATOS o EFICACIA EN ELECTROFORESIS CAPILAR

En cromatografía, tanto la difusión longitudinal como la resistencia a la transferencia de masa contribuyen al ensanchamiento de banda. Sin embargo, dado que, en la electroforesis solamente está implicada una única fase, solo es necesario considerar la difusión longitudinal. Para la electroforesis se ha demostrado que el número de platos (N) viene dado por la siguiente expresión:

N = μeV2 D

Donde D es el coeficiente de difusión del soluto en cm2 S-1.

Debido a que la resolución se incrementa al aumentar el número de platos, es aconsejable aplicar potenciales elevados con la finalidad de obtener separaciones con una elevada separación de resolución; ya que, para la electroforesis, el número de platos no se incrementa con la longitud de la columna. En la electroforesis convencional en gel, el calentamiento por efecto Joule limita la magnitud del potencial aplicado a un valor en torno a 500 V. Es aquí donde radica una de las ventajas del formato capilar comparado con el formato convencional4.

La larga longitud y la pequeña sección del capilar hacen que la resistencia de la disolución en el capilar sea excepcionalmente proporcional a la resistencia se pueden aplicar potenciales muchísimo más altos. Además, el capilar proporciona una eficaz refrigeración por su elevada relación superficie-volumen. Como resultado de estos factores el ensanchamiento de banda debido a la convección térmica no tiene lugar o es insignificante. Con la electroforesis capilar los potenciales normalmente utilizados varían entre 20.000 y 60.000 V y estos potenciales elevados producen las correspondientes mejoras en la rapidez y en la resolución con respecto a la disposición convencional4, 5.

Suma vectorial de las movilidades eléctricas y de FEOFormación de la doble capa eléctrica y del

FEO al aplicar diferencias de potencial en extremos de un capilar de Si

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La anchura de pico, en la electroforesis capilar, alcanza a menudo el límite teórico marcado por la difusión longitudinal. La electroforesis capilar genera normalmente un número de platos comprendido entre 100.000 a 20.000 comparados con los típicos 5.000 a 20.000, platos que se obtienen en el HPLC5.

También se han descrito números de platos de 3.000.000 en el caso de las separaciones por electroforesis capilar de zonas de aminoácidos dansilados y de 10.000.000 para las separaciones de polinucleótidos por electroforesis capilar en gel4.

Puesto que los analitos separados por electroforesis capilar se pueden detectar al pasar el detector, los electroferogramas tienen la misma apariencia general. La nomenclatura utilizada para describir la separación de las bandas en cromatografía también se usa para la electroforesis capilar. Aquí la mayor diferencia es que la posición de los picos se determina por las movilidades electroforéticas4.

La temperatura es un factor a tener en cuenta puesto que la disolución está más caliente en el centro del capilar, y la migración es más rápida. La zona se extiende hacia el centro, tiende a desplazarse hacia la periferia4.

Una zona de la muestra excesivamente larga determina el límite para el valor mínimo de N. Sin embargo, por simplificación se dice que si la longitud de la zona es de 3 mm o menor en un capilar de 100 cm, puede generalmente ignorarse esta contribución en el ensanchamiento de la banda. Zona más larga de muestras con analitos cargados, se pueden acortar electrofocalizando con un aumento concomitante en la eficiencia4.

Es interesante destacar que N se usa para describir separaciones tanto cromatográficas como electroseparaciones, incluso pensando que es un concepto que deriva del número de platos teóricos, como si estas técnicas dependieran de un numero de destilaciones secuenciales. Es decir, en la cromatografía no se interpreta adecuadamente una serie de extracciones secuenciales, pero se mantiene el término N. La electroforesis incluso más claramente no se parece a tales procesos químicos. Sin embargo, ignoramos el origen de N y retenemos este concepto tan útil para describir la calidad de las separaciones electroforéticas2, 5.

En la figura efecto de la eficacia de un analito, la unión de dicho analito se cuantifica como un factor de capacidad k, como el usado en cromatografía. La eficacia de N disminuye rápidamente con la unión2.

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Efecto en la eficacia de un analito unido reversiblementeal capilar en electroforesis capilar2.

E. RESOLUCION

La resolución electroforética se define de forma análoga en cromatografía.

Resolucion=Rs= tR2−tR11/2(W 2+W 1)

= Separacion del picoAnchura mediadel pico

El valor de W1 es la anchura d ela línea base de los picos, y el numerador es su separador, que resulta de las diferentes en las movilidades electroforéticas2.

F. INTRODUCCIÓN ó INYECCION A LA MUESTRA

Para evitar el ensanchamiento de picos la consiguiente pérdida de resolución, el volumen de muestra introducida en el capilar no deberá exceder el 1-2% del volumen total del mismo. El volumen total de un capilar de 1m de longitud y 100 m de diámetro es de aproximadamente 3 L, ello implica que la cantidad de muestra consumida para la realización del análisis será de unos pocos nL 3.

Los métodos más comunes de introducción de las muestras son la inyección electrocinética, la inyección hidrodinámica y la inyección hidrostática 3, 4, 5.

En el método de inyección electrocinética, se retiran del depósito del tampón uno de los extremos del capilar y el correspondiente electrodo, y se colocan en un pequeño recipiente donde está situada la muestra. Se aplica entonces un potencial durante un tiempo determinado, lo que hace que la muestra penetre en el capilar debido a la actuación conjunta de los fenómenos de migración iónica y flujo electroosmótico. El extremo del capilar y el electrodo vuelven a introducirse en la disolución tampón, donde se mantienen durante el resto del proceso de separación. Esta técnica de inyección es discriminatoria al introducir mayor cantidad de los iones más móviles respecto a los más lentos3, 4.

En el método de inyección hidrodinámica, el extremo del capilar se coloca momentáneamente en un pequeño recipiente que contiene la muestra, y se utiliza una diferencia de presión para conducir la muestra al interior del capilar. Esta diferencia de presión proviene de aplicar vacío en el extremo del detector o de la aplicación de presión en el recipiente que contiene la muestra, o bien se consigue por elevación del extremo que contiene la muestra. La inyección por presión no diferencia los iones según su movilidad; sin embargo, no puede utilizarse en capilares rellenos de gel4.

Tanto en el caso de la inyección electrocinética como en el de la inyección hidrodinámica, el volumen inyectado se controla por la duración de la inyección. Los volúmenes de inyección más habituales están comprendidos entre 5 y 50 nL, pero se han llegado a emplear volúmenes por debajo de 100 pL. Para un tampón de densidad y viscosidad similares a las del agua, una diferencia de altura de 5 cm durante 10 se inyecta aproximadamente 6 nL en un capilar cuyo diámetro interno es de 75 μm5.

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El empleo de puntas de Microinyección construidas a partir de capilares estrechados hasta diámetros muy pequeños permite la toma de muestras de entidades cuyo volumen es el orden de los pico litros, como sucede con las células aisladas y estructuras subcelulares en el interior de éstas. Esta técnica se ha empleado para estudiar aminoácidos y neurotransmisores procedentes de una sola célula5.

El agua no fluye fácilmente a través de los capilares cuyo diámetro interno oscile entre 50 y 100 μm, que es el rango más común usado en la CE. Por tanto, la inyección de la muestra en electroforesis capilar se hace de dos únicas formas. Una supone aplicar una diferencia de presión entre los extremos del capilar. Por ejemplo, uno de los extremos del capilar se sitúa sobre la muestra, y durante un tiempo determinado la superficie del líquido de la cubeta se aumenta por encima del nivel del tampón situado al final del detector. Y otra forma alternativa es consiguiendo el mismo resultado haciendo vacío en el comportamiento del tampón del final del detector o una presión positiva de aire a la muestra. En cualquier sea el caso, un protocolo sin cambios debería inyectar una longitud fija de zona de muestra en el capilar5.

Posteriormente, el final de la inyección se lleva al tampón y comienza la electroforesis. Este método se llama inyección hidrostática de la muestra, se da cuando dos viales que contienen a dicha muestra y al tampón se sitúan a diferente altura3, 4.

Hidrodinámico

Electrocinético

Hidrostático

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Introducción a la muestra3.

G. MODALIDADES o INSTRUMENTACION DE TRABAJO

Cuando el ánodo (+) está en el extremo de inyección del capilar se dice que se opera en modo normal. Cuando el cátodo (-) está al final de la inyección, es el modo de polaridad inversa. Se pueden aplicar potenciales de hasta 1000 Vcm-1 6.

La potencia suministrada por equipos comerciales puede operar de diferentes maneras: a corriente constante, a potencial constante o a potencia constante. También, útil poder trabajar con gradientes en los tres casos. Los gradientes se usan para mejorar la cuantificación al asegurar que toda a muestra se lanza hacia el capilar, y una vez que se ha introducido, no puede expulsarse durante la expansión inicial del electrolito produciendo por el calentamiento de Joule6.

Surgen diferentes comportamientos si se opera con protocolos a corriente constante o a potencial constante. En el modo de corriente constante, se cambia internamente el campo eléctrico (el potencial disminuye) al cambiar la temperatura6.

En el modo de potencial constante, el campo eléctrico no cambia, pero la corriente varia (y por lo tanto la resistencia interna) con los cambios de temperatura. Estas propiedades son fáciles de entender con la simple descripción de ley de Ohm, V= IR. La cuantificación del analito puede ser mejor en el modo de potencial constante que en corriente constante6.

H. DETECCIÓN

Debido a que en la mayoría de las modalidades de electroforesis capilar los analitos separados se desplazan pasando por un punto común, los detectores son semejantes en diseño y función a los de HPLC, ya descritos. Sin embargo, se encuentra una diferencia de comportamiento en los detectores, porque en la electroforesis capilar cada ion migra a una velocidad determinada por su movilidad electroforética1, 2.

Por tanto, las bandas de analito atraviesan el detector a diferentes velocidades, lo cual hace que las áreas de los picos sean ligeramente dependientes de los tiempos de retención. En cambio, en HPLC todas las especies pasan a través del detector a la velocidad de la fase móvil, y las áreas de los picos son independientes de los tiempos de retención. Normalmente, esta dependencia del tiempo tiene poca importancia práctica2.4.

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Modalidades de detección CE 1.

TIPOS DE DETECCIÓN:

1. Deteccion por absorbancia

Los detectores de fluorescencia y absorbancia se han empleado ampliamente en electroforesis capilar, aunque los últimos son más comunes debido a que su campo de aplicación es mayor. Para que el volumen de detección se mantenga dentro del orden de magnitud de nL o inferior, la detección se lleva a cabo en columna1,6.

Para ello, se elimina el recubrimiento protector de poliimida de la parte externa de una pequeña sección de la columna por combustión, disolución o raspado, y esa parte del capilar hace las veces de la celda de detección. Desgraciadamente, el camino óptico para tales medidas no es mayor de 50 a 100 µm, lo cual restringe los límites de detección en términos de concentración; sin embargo, debido a los pequeños volúmenes que están involucrados, los límites de detección en términos de masa son iguales o mejores que los obtenidos en HPLC1,6.

Uno de estos métodos, que está comercializado, se basa en doblar el extremo del capilar en forma de “z”, obteniéndose un camino óptico de 3 mm. La mejora de sensibilidad lograda con este método es inferior a la esperada, probablemente debido a un enfoque inadecuado de la radiación. (a)

Una segunda estrategia para aumentar el camino óptico, consistente en formar una búrbuja cerca del extremo del capilar. (b)

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Un tercer método para incrementar el camino óptico de la radiación por reflexión, es en donde se deposita en el extremo del capilar un recubrimiento de plata reflectante, y la radiación experimenta numerosas reflexiones antes de salir del capilar. (c)1, 6

2. Detección indirecta:

Se ha utilizado el método de detección indirecta de absorbancia para lograr la detección de especies que, debido a su pequeña absortividad molar, resultan difíciles de detectar sin derivatización. Se incorpora un cromóforo iónico al tampón de la electroforesis, lo que hace que el detector reciba una señal constante debida a la presencia de esta sustancia6.

El analito desplaza algunos de esto iones, como en la cromatografía de intercambio iónico, de tal manera que la señal detectada desciende cuando una banda del analito atraviesa el detecto. El analito se cuantifica por el descenso en el valor de la absorbancia6.

3. Detección por fluorescencia:

Al igual que en HPLC, la detección por fluorescencia incrementa la sensibilidad y selectividad para los analitos fluorescentes o los productos derivatizados fluorescentes. Se prefiere la instrumentación basada en el empleo de láser, con la finalidad de focalizar la radiación excitadora en una pequeña zona del capilar y lograr los bajos límites de detección inherentes al empleo de fuentes intensas7.

La detección de fluorescencia con láser ha permitido la detección de tan sólo 10 zeptomoles, o 6000 molécula7.

4. Detección electroquímica:

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Se han utilizado 2 tipos de detección electroquímica en electroforesis capilar: conductimétrica y amperométrica. Uno de los problemas de la detección electroquímica ha sido el de aislar los electrodos del detector de la influencia de los elevados potenciales necesarios para la separación7.

Uno de los métodos de aislamiento consiste en unir el capilar a un segundo capilar que contiene los

electrodos del detector mediante una unión de vidrio poroso o grafito7.

Detector amperométrico 7.

5. Detección por espectrometría de masas:

Los flujos tan pequeños, de alrededor de 1 µL/min, que proceden de los capilares de la electroforesis, hacen posible el acoplamiento directo del efluente del capilar de un dispositivo electroforético a la fuente de ionización de un espectrómetro de masas1, 3.

En la actualidad la interfase más empleada para el proceso de introducción de las muestras/ionización es el sistema de electronebulización, aunque también se ha empleado el bombardeo por átomos rápidos1, 3.

La electroforesis capilar con detector espectrométrico de masas tiene solamente una década y media, pero ha llegado a ser de gran interés para biólogos y bioquímicos para la determinación de moléculas grandes de origen natural, como las proteínas, fragmentos de ADN y péptidos1, 3.

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I. APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR

Las separaciones por electroforesis capilar se llevan a cabo de distintas maneras, también llamadas modalidades. Estas modalidades se emplearon en primer lugar en la electroforesis convencional, y se adaptaron posteriormente a la electroforesis capilar. Estas modalidades son la electroforesis capilar en gel (CGE), isoelectroenfoque capilar (CIEF) e isotacoforesis capilar (CITP)1, 3, 8 ,9.

ELECTROFORESIS CAPILAR DE ZONA

En la electroforesis capilar de zona (CZE), la composición del tampón es constante en toda la zona de separación. El potencial aplicado hace que los diferentes componentes iónicos de la mezcla migren cada uno según su propia movilidad y se separen en zonas que pueden estar completamente resueltas o parcialmente solapadas. Entre las zonas completamente resueltas hay huecos ocupados por el tampón. Esta situación es análoga a la que se da en la cromatografía de elución en columna, donde se observan regiones de fase móvil entre las zonas que contiene analitos separados1, 3.

1. Separación de los iones pequeños

En la mayoría de las separaciones electroforéticas de iones pequeños, se ha observado que lo más favorable para lograr tiempos de análisis breves es hacer que los analitos se muevan en el mismo sentido que el flujo electroosmótico. Así en las separaciones de cationes en capilares cuyas paredes no han sido tratadas, tanto el flujo electroosmótico como los cationes se desplazan hacia el cátodo. Por otro lado, para las separaciones de aniones, el flujo electroosmótico se invierte normalmente debido al tratamiento de las paredes del capilar con una sal de alquilamonio, como el bromuro de cetil trimetilamonio1, 3.

Los tamaños de muestra para la electroforesis son del orden de nL, mientras que normalmente se necesitan tamaños de muestra mucho mayores, del orden de L, para los otros tipos de análisis de iones pequeños. Por ello, los métodos electroforéticos son más sensibles que los métodos donde se determina la masa (pero no lo son más que en otros los que se determina la concentración)1, 3.

2. Separación de moléculas

Puede separarse y analizarse por CZE una gran variedad de moléculas de pequeño tamaño, tales como herbicidas sintéticos, pesticidas y fármacos, siempre que sean moléculas cargadas o puedan derivatizarse para dar un ion1, 3.

Proteínas, aminoácidos e hidratos de carbono se han separado en tiempos mínimos por CZE. En el caso de los hidratos de carbono, que sean compuestos neutros, las separaciones están precedidas por la formación de complejos de borato cargados negativamente, que se forman fácilmente si se emplea un tampón borato como medio de separación1, 3.

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3. Separación de iones pequeños

En la mayoría de las separaciones electroforéticas de iones pequeños, el menor tiempo de análisis se registra cuando los iones del analito se mueven en la misma dirección que el flujo electroosmótico. Así, para separaciones de cationes, las paredes del capilar no se someten a tratamiento alguno, y tanto el flujo electroosmótico como el movimiento de cationes se dirigen hacia el cátodo1, 3.

Sin embargo, para la separación de aniones, el flujo electroosmótico se invierte habitualmente tratando las paredes del capilar con una sal de alquilamonio, como el bromuro de cetiltrimetilamonio. Los iones amonio cargados positivamente son atraídos por la superficie de sílice cargada negativamente y, a su vez, crean una doble capa de disolución con carga negativa que es atraída por el ánodo, lo cual invierte el flujo electroosmótico3.

4. Separación de especies moleculares

Se han separado y analizado por CZE una gran variedad de pequeños herbicidas sintéticos, plaguicidas y productos farmacéuticos que son iones o pueden derivarse para producir iones.

Las proteínas, aminoácidos y carbohidratos también han sido separados e tiempos mínimos por CZE. En el caso de carbohidratos neutros, las separaciones van precedidas de la formación de complejos con borato cargados negativamente3.

SEPARACIONES ELECTROFORÉTICAS EN GEL

Los métodos clásicos de electroforesis realizan la separación de un gel polimérico (como gelatina). Los geles que se emplean son redes tridimensionales de polímeros ramificados que tienen los espacios entre ramificaciones rellenos de líquidos. Las redes de polímeros no solo suprimen la convección, sino que también actúan como cribas que pueden retardar y hasta bloquear la migración de los analitos poliméricos más grandes. Sin embargo, los iones pequeños pueden moverse libremente a través de la estructura porosa del gel8.

De este modo, la electroforesis en gel tiene dos mecanismo diferentes de separación: por electroforesis, que separa por la relación carga-tamaño, y tamizado, que separa en su mayor parte por tamaño. El efecto tamiz es proporcional al tamaño de las macromoléculas y a la densidad de las moléculas del gel, porque la migración de las macromoléculas disminuye al chocar estas con las moléculas del gel. Como resultado, cuanto más grandes son las macromoléculas, más se chocan con el gel y más disminuye la migración8.

De forma similar, si las moléculas de gel están más concentradas, se producen más colisiones y la migración disminuye. Decimos que el tamaño de poro es menor para geles más concentrados. Es como si el gel fuera un filtro con pequeños poros8.

Sin embargo, los geles son redes tridimensionales de moléculas, y a medida que la matriz está más concentrada, hay conductos que son más pequeños y tortuosos que la media8.

1. Los geles

Se emplean dos materiales distintos para realizar la mayoría de las electroforesis con geles: agarosa y poliacrilamida, tienen dos características en común2, 8.

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En primer lugar adquieren la misma forma, también forman tubos cuyos diámetros interno es de 5 nm, y estos geles se denominan geles de tubo o geles de disco. Los geles también se emplean en capilares con un diámetro interno inferior a 0,5 mm2, 8.

En segundo lugar, ambas estructuras están libres de cargas iónicas, así evita que la disolución del tampón se desplace por el gel cuando se active el campo eléctrico: FEO. Importante recordar que, obtener geles excelentes es una arte, significa que tenemos que controlar tanto los detalles de elaboración así como la práctica, cuyos requisitos para un análisis es una muestra de patrones internos2, 8.

ISOTACOFOROSIS CAPILAR (CITP)

En la CITP, las bandas de todos los analitos migran, finalmente, a la misma velocidad; por eso recibe este nombre de iso, igual y taco, velocidad. En cualquier aplicación concreta, bien los cationes o bien los aniones pueden ser separados, pero no ambos al mismo tiempo1.

En una separación, la muestra se inyecta entre dos tampones; el frontal, que consiste los iones de menor movilidad que los iones de la muestra. Por otro lado para las separaciones de aniones, la disolución del electrolito conductor se conecta al ánodo y la del terminal se conecta con el cátodo1.

Cuando en una separación por CITP se aplica un potencial, los iones migran como en la electroforesis de zona, cada ion a una velocidad característica que viene dada por el producto de eE. La diferencia en las velocidades de migración da lugar a la separación de los distintos analitos en bandas adyacentes, con la especie más rápida situada en la banda más próxima al tampón conductor y la más lenta por delante del tampón terminal1.

Una vez que se han formado todas las bandas, todas ellas se mueven a la misma velocidad. La razón por la que todas las bandas se mueven a la misma velocidad es que el potencial se hace más reducido para las bandas más móviles y se hace más intenso para las bandas más lentas, de tal forma que la corriente es la misma en todas al zonas del tampón1.

La corriente iónica que se origina como consecuencia del flujo de los iones en el tampón es semejante al de la corriente continua en un circuito formado por varias resistencias conectadas en serie a una pila en este caso, la corriente debe ser idéntica en todas las resistencias; por ello, el potencial varia en todas y cada una de ellas según predice la ley de Ohm1.

En un experimento de isotacoforesis cuando se alcanza el equilibrio, se llega a una situación en la cual cada uno de los componentes de la muestra migra en una banda que se está intercalada entre aquella más próxima que contiene los iones que se mueven más rápidamente. Las separaciones entre las bandas son nítidas, si un soluto empieza a difundir a la banda próxima más rápida, se encuentra con un campo más bajo, lo cual reduce su velocidad hasta caer de nuevo, en su banda original1.

ISOELECTROENFOQUE CAPILAR (CIEF)

El CIEF se utiliza para la separación de especies anfóteras como aminoácidos y proteinas, que presentan en su estructura un grupo carboxílico (ácido débil) y un grupo amino (base débil). En si viene hacer una variante de CE que separa anfolitos (molécula que pueden ser neutras o con cargas dependiendo de pH).

Cuando se aplica corriente, las moléculas cargadas positivamente migran hacia el cátodo, mientras que las cargadas negativamente migran hacia el cátodo. El analito dejara de migrar en el punto del capilar cuyo pH sea igual a su punto isoeléctrico (pH al cual la molécula no tiene carga)3, 4, 5.

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ETAPAS

1. Carga:

La muestra se mezcla con el anfolito que cree un gradiente de pH apropiado. La concentración final de este anfolito suele ser 1-2%. La mezcla se carga en el capilar por el método hidrodinámico (aplicando presión)3.

2. Enfoque:

El vial en el extremo del cátodo debe contener hidróxido sódico, mientras que el vial del ánodo debe contener ácido fosfórico. En estas condiciones se aplica un campo eléctrico del orden de 500-700 V/cm. El campo eléctrico aplicado trae la mezcla de muestra y anfolito hacia el detector3.

Cuando pH donde no está cargado, se detiene y eso provoca una disminución d ela corriente. Se considera que el enfoque se ha completado cuando la corriente cae por debajo de 1 A 3, 4.

3. Movilización :

La movilización se puede reducir en dirección el cátodo o al ánodo. Para la movilización catódica el vial suele contener una mezcla de hidróxido sódico/ cloruro sódico3.

En la movilización anódica el vial se realiza comparado el tiempo de migración de patrones de punto isoeléctrico conocido 3, 4.

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Aplicaciones de la electroforesis capilar 1.

ELECTROCROMATOGRAFIA CAPILAR (CEC)

La electrocromatografia es un hibrido de la electroforesis capilar y el HPLC que presenta algunas de las mejores características de cada una de estas dos técnicas. En los comienzos de 1980 se desarrollaron dos tipos de electrocromatografia capilar: en columna empaquetada o rellena, y electrocinética micelar. Hasta la fecha esta última técnica es la que tiene más aplicaciones1, 3.

La CEC, parece tener varias ventajas sobre técnicas de las que procede. Primero, como HPLC, se puede utilizar para la separación de especies no cargadas. Segundo, como en electroforesis capilar, proporciona una elevada eficacia en las separaciones, de micro volúmenes de disolución de muestra, sin necesidad de aplicar un sistema de bombeo de alta presión 2, 3.

En electrocromatografia, la fase móvil se transporta a través de la fase estacionaria por el bombeo ejercido por el flujo electroosmótico y no por un bombeo mecánico, lo que simplifica notablemente el equipo. Además, el sistema de bombeo electroosmótico origina un perfil de flujo plano. Este perfil da lugar a bandas estrechas, por lo tanto una alta eficiencia de separación3.

ELECTROCROMATOGRAFIA CAPILAR EN COLUMNA EMPAQUETADA ó RELLENA

La electrocromatografia en columna empaquetada es la menos madura entre todas las técnicas electroseparacion. En este método, un disolvente polar suele ser impulsado por el flujo electroosmótico través de un capilar relleno de un empaquetamiento de HPLC en fase reversa. Las separaciones dependen de la distribución de los analitos entres la fase móvil y la fase estacionaria liquida contenida en el empaquetamiento3, 4.

En la figura se muestra un electrocromatograma típico para la separación de 16 hidrocarburos polioaromaticos en un capilar de 33 cm de largo cuyo diámetro es de 75 m. la fase móvil consistió en acetonitrilo en una disolución de borato de sodio 4 mM. La fase estacionaria eran partículas de octadecilsilica3, 4.

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Electrocromatograma que muestra la separación electrocromatografia de 16 PAHs 3.

CROMATOGRAFIA CAPILAR ELECTRONICA MICELAR

Los métodos de electroforesis capilar que hemos descrito hasta ahora no son aplicables a la separación de solutos no cargados. Sin embargo, en 1984 TERABE y colaboradores describieron una modificación del método que permitía la separación de fenoles y niotroderivados aromáticos de bajo peso molecular. Esta técnica implica la introducción de un tensioactivo, como por ejemplo el dodecil sulfato de sodio (SDS), en un nivel de concentración en el cual se formen micelas. Las micelas se forman en disolución acuosa cuando la concentración de las sustancias tensioactivos que tienen una larga cadena hidrocarbonada y un grupo iónico se incrementa por encima de un cierto valor denominado concentración micelar crítica (CMC) 1.

Los iones empiezan a formar agregados esféricos, de entre 40 y 100 iones, cuyas cadenas hidrocarbonadas se orientan hacia el interior mientras que los extremos cargados quedan orientados hacia el exterior, en contacto con el agua1, 3, 4.

Las micelas constituyen una segunda fase estable que es capaz de alojar compuestos no polares en el interior de la micela, entre las cadenas hidrocarbonadas, solubilizando así compuestos no polares. La solubilizarían se produce, habitualmente, cuando se lava con una disolución detergente un material o una superficie grasa4.

Cuando la electroforesis capilar se llevó a cabo en presencia de micelas se denomina cromatografía capilar electrocinética micelar y se designa con las siglas MECC o MEKC. En esta técnica, los tensioactivos se

Las moléculas se unen libremente en una forma aproximadamente

esférica con las cabezas cargadas hacia el exterior y las cadenas

orgánicas juntas hacia el interior. Una micela con una cadena de

carbonos como SDS (Dodecilsulfato), tiene 64

moléculas de tamaño medio.

SDS

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añaden al tampón en cantidades que superen el valor de la concentración micelar crítica. Hasta la fecha, en la mayoría de las aplicaciones en tensioactivo utilizado es el dodecil sulfato de sodio3, 4.

La superficie de una micela de este tipo es anionica y posee una elevada carga negativa, lo cual hace que tenga una movilidad electroforética alta, desplazándose hace el electrodo positivo. Sin embargo, algunos de los tampones presenta una velocidad de flujo electro electroosmótico hacia el electrodo negativo tan alta que hace que las micelas anionicas también se desplacen hasta este electrodo, pero a una velocidad muy reducida. Así, en la práctica, la mezcla tampón está formada por iones de la fase micelar que se mueve más lentamente4.

Cuando una muestra se introduce en este medio los distintos en este medio los distintos componentes se distribuyen entre la fase acuosa y la fase hidrocarbonada del interior de las micelas. Las situaciones resultantes de estos equilibrios de distribución dependerán de la polaridad de los solutos. Si los solutos son polares se ve favorecida se permanencia en la fase acuosa, si los compuestos son no polares, el entorno preferido es el hidrocarbonado de la micela2.

El sistema anteriormente descrito es bastante similar al que tiene lugar en una columna cromatografía de reparto líquido, excepto que la fase estacionaria se va desplazando también a lo largo de la columna, pero a una velocidad mucho más lenta que la fase móvil. El mecanismo por el cual se produce la separación es idéntico en ambos casos y depende de las diferencias de los coeficientes de distribución de los analitos entre la fase móvil acuosa y la fase pseudoestacionaria hidrocarbonada. El proceso que tiene lugar es una verdadera cromatografía y de allí el nombre cromatografía capilar electrocinética micelar2, 3.

La cromatografía capilar en presencia de micelas parece tener un futuro muy prometedor. Una ventaja de esta técnica hibrida sobre el HPCL es que la eficacias de la columna son mucho más electrizadas (100.000 platos o más). Además, cambiar la segunda fase en la MECC es sencillo, solo es necesario cambiar la composición de la micela en el tampón, al contrario que en el HPLC donde la segunda fase solo puede modificarse mediante el cambio de tipo de relleno de la columna3.

Separación típica por MECC. (a) Algunos compuestos de prueba: 1=metanol, 2= resorcinol, 3=fenol, 4= p-nitroanilina, 5= nitrobenceno, 6= tolueno, 7= 2-naftol, 8= sudan III; capilar, 50  µm de diámetro interno, 500 mm hasta el detector; voltaje aplicado, Ca. 15kV; absorción de la detección UV a 210 nm. (b) Análisis de una medicina para el resfriado 1= acetaminofén, 2= cafeína, 3= sulpirina, 4= naproxeno, 5= guaifenesin, 10= noscapina, 11= clorofeniramina y tipepidina; voltaje aplicado, 20 kV; capilar, como en (a); detección por absorción UV a 220 nm 2, 3.

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REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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instrumental.5°, ed. Editorial: Mc Graw Hill. Madrid – España. 2001. pp: 843-862.

2) KENNETH RUBINSON, JUDITH RUBINSON. Análisis instrumental. Editorial: Pearson

Educación, S.A. Madrid – España. 2001. pp: 722-744.

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Editorial: Díaz santos. Barcelona – España. 2006. pp: 223 – 243.

4) DOUGLAS SKOOG. Fundamentos de química analítica. 8°, ed. Editorial: Cengage learning.

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5) CARMEN DOCON, SAAVEDRA JOSE. Fundamentos y técnicas de análisis bioquímicos:

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6) ANGEL MEJIA. Interpretación clínica del laboratorio. 7°, ed. Editorial: Medica Panamericana.

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8) JOSE BUITRAGO. Técnicas y métodos de laboratorio clínico. 2°, ed. Editorial: Masson Ediciones.

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Norbert Wiener. Lima – Perú. 2009. pp: 525-526.

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