1Electroforesis Capilar (CE).

Bases de Electroforesis Capilar.

23

Qu es la Electroforesis?

Es el movimiento de una molcula cargada debido a un campo elctrico externo, es decir, si se coloca una muestra inica y le es aplicado un potencial, sta tender a dirigirse hacia el polo opuesto a su propia carga.

+

+

-

4

Movimiento de una molcula cargadadebido a un campo elctrico externo.

35

Fuerza de aceleracin

Fuerza de friccin

fvqE =

La movilidad electrofortica es la constante de proporcionalidad entre la velocidad del in y la fuerza del campo elctrico.

EEfqv =

q = carga del ionE = campo elctricof = coeficiente de friccinv = velocidad del ion

6

Separacin dentro de tubos capilares.

N

N

N

N

47

Un poco de Historia Es una tcnica relativamente

nueva, el primer instrumento comercial apareci en los aos 80s.

La EC experiment desde su aparicin un crecimiento muy importante, situndose rpidamente para el anlisis de una gran variedad de muestras, compitiendo en la mayora de ellas con las tcnicas de mayor tradicin analtica como HPLC y CG.

8

Principales Caractersticas de CE.

Se desarrolla en un capilar de slice fundida (i.d. 25-150 m).

Opera en medio acuoso (aunque actualmente se est desarrollando en solventes orgnicos polares [NACE]).

59

Principales Caractersticas de CE.

Se requieren volmenes muy pequeos de muestra (1-50 nL inyectados).

A travs del capilar son aplicados altos voltajes (10 a 30 kV) y campos elctricos (100 a 1000 V cm-1)

10

Principales Caractersticas de CE. La alta resistencia del capilar limita la

generacin de corriente y el calentamiento interno.

Presenta alta eficiencia (N>105 a 106) y tiempos de anlisis cortos.

Tiene numerosas modalidades y un amplio rango de aplicacin.

611

Principales Caractersticas de CE. El desarrollo del mtodo es muy simple.

Instrumentacin automatizada.

La deteccin se puede llevar a cabo de 2 formas: On-capillary. Decoupled detection cell.

Instrumentacin.

713

14

Principio de CE.

815

Mtodos de Inyeccin de Muestra.

Inyeccin Hidrodinmica.

16

Mtodos de Inyeccin de Muestra.

Inyeccin Electrocintica.

917

Mtodos de Inyeccin de Muestra.

Inyeccin por Vaco.

18

Mtodos de Inyeccin de Muestra.

Inyeccin por Sifoneo.

10

19

Cmo detecto las especies?

20

Flujo Electroosmtico

(EOF)

11

21

Superficie de Slice fundida cargada negativamente.

22

Los cationes hidratados se acumulan cerca de la superficie.

12

23

El flujo va en direccin hacia el ctodo cuando se aplica el campo elctrico.

24

EOFEOF

13

25

Caractersticas:

Flujo electroosmtico Flujo parablico

CE GC, HPLCCE GC, HPLC

Menor ancho de bandaMenor ancho de banda Mayor ancho de bandaMayor ancho de banda

26

La velocidad del EOF es mayor a la movilidad de cualquier especie, independientemente de su carga.

Caractersticas:

14

27

N

N

N

N

Separacin por Electroforesis Capilar

28

Electroferograma

Tiempo de migracin (min)

Sea

l

15

Modos de Operacin de EC.

30

Hidrofbicas/ interacciones inicas con micelas/retardacin.

Cromatografa MicelarElectrocintica (MEKC)

Tamao y CargaElectroforesis Capilar en Gel (CEG)

Solucin Libre/relacin masa carga.(FS/ capilares fundidos)

Electroforesis Capilar de Zona (CZE)

Bases de la Separacin.Modo de Operacin

16

31

Movimientos FronteraIsotacoforesis (ITP)

Interaccin con fases slidas/retardacin.

ElectrocromatografaCapilar (CEC)

Punto Isoelctrico.Electroforesis de Enfoque Isoelctrico (IEF)

Bases de la Separacin.Modo de Operacin

32

Electroforesis Capilar de Zona

Forma

ms

simple

de EC

Migracin por

diferencia de carga.

17

33

Mecanismo de Separacin por Electroforesis Capilar de Zona

Desarrollada en capilares de slice descubiertos y permanentemente o dinmicamente en capilares cubiertos.

34

CE + Crom. = MECK

Caracterstica: separa especies neutras

Adici

n de te

nsoacti

vos

por arr

iba de s

u CMC

N

N

N

N

N

N

N

N

CMC=concentracin micelar crtica

Cromatografa Micelar Electrocintica.

18

35

Electroforesis Capilar en Gel

Basada en laElectroforesis en Gel

convencional.

Separacinbasada en el

tamao.

Capilar relleno conpolmero, acta como

tamiz molecular.

Algunas protenas y ADNtienen masa/carga similaresdeben separarse por CGE.

36

Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

Separacinbasada en el

Punto Isoelctrico.

Generacinde un gradiente

de pH

19

37

Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

Separacinbasada en el

Punto Isoelctrico.

Generacinde un gradiente

de pH

pH

38

Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

pH

Separacinbasada en el

Punto Isoelctrico.

Generacinde un gradiente

de pH

20

39

Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

pH

Separacinbasada en el

Punto Isoelctrico.

Generacinde un gradiente

de pH

40

Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

pH

Separacinbasada en el

Punto Isoelctrico.

Generacinde un gradiente

de pH

21

41

Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

Separacinbasada en el

Punto Isoelctrico.

Generacinde un gradiente

de pH

Instrumentacin.

22

43

Reservorios

Electrolitos

Muestras

Fuente de poder

Sistema de deteccinCapilar

44

Electrolito Electrolito

Capilar

MuestraON

OFF

Fuentede poder

O NO FF

150 mV

DetectorControl

PC

-+

23

45

Capilares

Composicin (Slice).Dimetro interno (25-75 m).Longitud (30-75 cm).Modificados.Control temperatura.

46

Detectores

UV-VISDiseo especial

Deteccin Universal

Amplio intervalo DAD

Fluorescencia

Fcil adaptacin

Alta sensibilidad

Derivatizacin

24

47

Detectores

Espectrometra Masas

Problema de interfase (electro-spray)

Caracterizacin absoluta

Verstil

Aplicaciones.

25

49

Separaciones quirales

Biociencia

Medioambiente

Alimentos

Industria

50

Separaciones Quirales.

Gran importancia en Farmacia y Alimentos Tradicionalmente se realizan por HPLC y GC D,L aminocidos Frmacos Ismeros

26

51

Biociencia

Gran cantidad de aplicaciones.

Pptidos y protenas (caracterizacin, secuenciacin, pI,

etc.)

cidos nucleicos y pruebas de pureza

Drogas, frmacos y metabolitos (tabletas, inyectables,

etc.)

Forense (LSD, morfina, cocana, plvora, etc.)

52

Medioambiente

Variedad de anlisis medioambientales:

Aguas (ros, lagos, lluvia, potable, residuales, etc.)

Suelos (cultivos, lixiviados, suelos varios)

Ejemplos de aplicaciones: cidos orgnicos, colorantes,

sustancias hmicas, pesticidas, iones inorgnicos,

aminas, tensoactivos, cidos aromticos, etc.

27

53

Alimentos Muestras analizadas:AguasFrutasBebidas refrescantesBebidas alcohlicasLeche y productos lcteosPescados y mariscosCarnesHortalizas y vegetalesCerealesY ms...

54

Alimentos

Sustancias estudiadas:Iones inorgnicos (sodio, potasio, calcio, magnesio,

cloruros, fosfatos, citratos, etc.).

cidos orgnicos (maleato, citrato, acetato, lactato, ascrbico, etc.)

Otros compuestos Orgnicos (cafena, histaminas, pesticidas, azcares, edulcorantes artificiales, etc.)

Protenas (Suero de leche, queso, preparados protenicos, etc.)

28

55

Industria

Diversas reas de aplicacin: materia prima, control

de calidad, aguas residuales, etc.

Caracterizacin de polmeros

Compuestos sintticos

Contaminantes

Se incluyen las aplicaciones anteriores

56

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

30.0

35.0

40.0

45.0

50.0

6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5

Tiempo (min)

Abs

(mU

.A.)

(Orina)

(Estndar)

(Orina dopada)

T

OTC

DTR1

OH O

CH3R2 R3H

N(CH3)2

OHOH O

OH

O

NH2

pKa1

pKa2

pKa3

pKa4

-OH-H-ClDoxitetraciclina-H-OH-HOxitetraciclina-H-OH-HTetraciclinaR3R2R1Nombre comn