Electroforesis de Seroproteinas

*T. Hayde Ziga CceresELECTROFORESISLa electroforesis es el movimiento de molculas cargadas en un campo elctrico. Un aparato de electroforesis consiste de un nodo (+) y un ctodo (-) separado por acetato de celulosa en el cual migran las molculas de Hb. Cuando una corriente elctrica pasa a travs del medio permite que las diferentes molculas de proteinas con cargas elctricas diversas migren a lo largo de la tira a velocidades diferentes. Despus de un perodo especificado, la tira se retira y se tie.

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*T. Hayde Ziga CceresELECTROFORESISDE SEROPROTENASMtodo p separacin de protenas sricas (protenas transport., anticuerpos, inhibs enzims, facts. de la coag., etc.) x su migracin como partculas cargadas en un campo elctrico. Usado p. seroprotenas, lipoprotenas, isoenzimas, hemoglobinas, haptoglobinas, glicoprotenas, etc.


*T. Hayde Ziga CceresEn suero hum. existen + de 125 protenas identificadas, con diversas funciones. Protenas sricas totales o las proporciones de las fracciones proteicas cambian durante 1 variedad de enfs, por lo que cuantificarlas es de valor en el diagnstico clnico.


*T. Hayde Ziga CceresSOPORTES:CLASE I: Separan molculas en base a la carga molecular neta. Ej.: materiales de capa delgada: papel, acetato de celulosa y gel de agarosa. Se obs. 5 bandas de protenas sricas.CLASE II: Ade+ de la separacin electrosttica poseen un efecto de tamizado. Tamao del poro del gel es del mismo orden que el de las protenas. Ej.: almidn, gel de poliacril-amida. Actan como trampas p las grandes molcs y las + peqs. migran sin impedim. El poder de resolucin de estos geles es mucho >. Se visualizan 25 bandas o +.


*T. Hayde Ziga CceresBUFFERS y pH:

NH2NH3+ NH3+ | | | H C COO- H C COO- H C COOH | | |R R R pH bsico pH neutro pH cido Punto isoelctrico

Las protenas son molculas anfteras, son partculas no cargadas o cargadas positiva o negativamente segn el pH del buffer.


*T. Hayde Ziga CceresConociendo el valor del pH del punto isoelctrico ( pI ) p. las susts a ser separadas, se puede elegir un buffer p. su separacin; ej.: barbital, que no ppta ni desnaturaliza las protenas y confiere una carga ( - ) a la mayora de las protenas sricas a pH 8.6. En un campo elctrico, las molculas de protena negativamente cargadas migran hacia el nodo.


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ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA

Permite separar 5 a 6 bandas. C/fraccin electrofortica representa un conj. de protenas. til p. el diagnstico de gammopatas monoclonales, cirrosis heptica, insufic. renal, hipogammaglobulinemia, mieloma mltiple, etc.


*T. Hayde Ziga CceresREACTIVOS:

1. BUFFER:Tris 6.05 gBarbital Na10.30Barbital 2.57Agua c.s.p. 1 Litro ( pH 8.6; f.i. 0.05)Usar 100 mL p. humedecer tiras y 200 mL p. la cmara.Refrigerado sirve para 4 a 6 corridas.2. COLORANTE: Disolver 1 cps. de Rojo Ponceau S en 100 mL de c. tricloroactico al 5 %3. LAVADO: 300 mL de c. actico 5 % (3 baos de 100 mL c/u)4. SOLUCION DESHIDRATANTE: 100 mL. de metanol absoluto5. SOL. CLARIFICADORA: 100 mL. de 12 % de c. actico en metanol.


*T. Hayde Ziga CceresPROCEDIMIENTO:

A) SEPARACINB) COLORACINC) DECOLORACIND) DESHIDRATACIN E) CLARIFICACINF) CUANTIFICACIN: a) Scanneado en el densitmetro: b) Elucin en NaOH 0.1 N c) Disolucin en Acetona: Ac. actico glacial (1:1) Leer a 517 - 525 m vs el Bl. (disolucin de 1 porcin de la tira no coloreada).


*T. Hayde Ziga CceresRangos normales de fracciones proteicas por electroforesis en acetato de celulosaFraccin% del Total g/dLAlbmina54.0 - 74.03.7 - 5.7Globulinas:1 1.1 - 4.20.1 - 0.32 4.6 - 13.00.4 - 1.0 7.3 - 13.50.5 - 1.0 8.1 - 19.90.5 - 1.5Protenas totales: 100.06.5 - 8.2


*T. Hayde Ziga CceresPrincipales protenas encontradas en cada fraccin:

Albmina:Globulinas:1: 1-antitripsina, 1-lipoprotenas, 1-glucoprotena, Protrombina, Glob. fijadora de hormona tiroidea2: 2-macroglobulina, Haptoglobina, Ceruloplasmina, 2-lipoprotenas, Eritropoyetina.: Transferrina, -lipoprotenas, C3 y C4 componentes del complemento, Inactivador de estereasa C1, Hemopexina, : IgG, IgA, IgM, IgD, IgE.


*T. Hayde Ziga CceresELECTROFORESIS DE SEROPROTEINAS NORMAL Y PATOLGICAS


*T. Hayde Ziga CceresELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINAS


*T. Hayde Ziga CceresPauling e Itano en 1949: 1a identif. de 1 variante de Hb: HbS.

Hb normal de un adulto en acetato de celulosa pta.:HbA: 95-98 % HbA2: < 3.5 % Anhidrasa carbnica I y II.


*T. Hayde Ziga CceresElectroforesis en acetato de celulosa a pH alcalinoPrincipio: En tampn alcalino de tris-EDTA-borato, pH 8,4, la > parte de las Hbs. tienen una carga negativa y en un campo elctrico migran desde el punto de aplicacin catdico hacia el nodo ( + ). La electroforesis en acetato de celulosa es un mtodo semicuantitativo de screening para las Hbs A, A2, F, S, G, C, E, O y D



Preparacin del hemolizado

Principio: La cuantificacin y diferenciacin de las Hbs requiere de sangre hemolizada. La sangre anticoag. se conc. x centrifug. y hemoliza por adicin de:Agua+congelamiento+cloroformo, Agua+ tolueno o solucin de saponina. Glbs bls, plaquetas, estroma y protenas plasms se eliminan x centrifug y lavado con sol. salina.


*T. Hayde Ziga CceresMacromtodoCentrif. 5 mL de sangre anticoag., remover el plasma y lavar los GRs 3 v. con sol. salina fisiolg. Elim. la sol. salina sobrenad. final y registrar el volumen de GR empaquetados.Por c/mL de GR aadir 1.5 mL de agua dest., agitar, y poner congelar. Remover y dejar descong 15. Agregar 0.4 mL de cloroformo x mL de GR empaquetados. Agitar vigorosam. x 5 y centrif. x 15 a 3000 rpm. El hemolizado est en la capa superior.


*T. Hayde Ziga CceresMicromtodo

Reactivo: Reactivo lisante saponina:1. Solucin de reserva: Polvo de saponina 1 g. Agua c.s.p. 100 mL.

2. Solucin de trabajo: Solucin de reserva:10 mL Agua 90 mL KCN al 3 %. 2 mL


*T. Hayde Ziga CceresProcedimiento:Llenar 2 tubos heparinizados con sangre de puncin dactilar. Cerrar 1 extremo con plastilina y centrifugar x 5. Muestra estable x 1 sem. en nevera. Con lima realizar una muesca en c/tubo de Hcto a 1.6 cm x encima de la plastelina y romper el tubo. Vaciar la columna de GR empaquetados en un tubo de ensayo q contenga 6 gotas de Sol. de trabajo de saponina como agente hemolizante. Sacudir x 15 p. sacar la sangre del tubo y hemolizarlo.


*T. Hayde Ziga CceresProcedimiento:Separacin:Igual que para seroprotenas, usando en vez de suero el hemolizado de los GR.Buffer: Tampn Tris-EDTA-cido brico, pH 8.4:Tris 10.2 g; EDTA 0.6 g, cido brico 3.2 g Agua c.s.p. 10 dL.Conectar a la fuente de poder a 250 voltios por 30 minutos.


*T. Hayde Ziga CceresInterpretacin y comentarios:Todas las Hbs se desplazan del pto de aplicacin hacia el nodo (+). El pto de aplicacin puede ser poco visible y al mismo nivel 1 banda tenue de anhidrasa carbnica. Segn su movilidad las variantes de la Hb pueden clasificarse en: Hbs lentas (A2, C, CHarlem, E y O) agrupadas en las proximidades del ctodo Hbs intermedias que se ubican entre la Hb C y A (S, Lepore, D, (G) y F)Hbs ms rpidas (ms andicas) que la Hb A: (K-Woolwich, J, N, I, Barts y H).


*T. Hayde Ziga CceresLas Hbs con idntica movilidad electrofortica pueden diferenciarse x otros mtodos. Ej.: pruebas de drepanocitemia, solubilidad, desnaturalizacin alcalina y electroforesis en agar-citrato. Tambin pueden diferenciarse por consideraciones cuantitativas.


*T. Hayde Ziga CceresLa cantidad de Hb en cada banda se cuantifica mediante densitometra y luego son comparadas con la muestra normal. Las variantes de Hb anormal tienen alteracin en las cargas debido a sustituciones nicas de aminocido en sus cadenas de globina y este cambio en la carga elctrica permite la separacin entre la mayor parte de las variantes anormales de la Hb y la Hb A en un pH alcalino. Se puede cambiar el medio (de acetato de celulosa a gel de almidn) o su pH (de 6.2 a 8.6) para separar claramente las Hbs y expandir el rango de esta prueba ms all de las Hbs A1, A2, S y C


*T. Hayde Ziga CceresResultados normales: En los adultos las sgtes. Hbs son las ms frecuentes: Hb A1: 95% a 98% Hb A2: 2% a 3% Hb F: 0,8% a 2%


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