Manual de Microbiología buap

1

MANUAL DE LABORATORIO DE

MICROBIOLOGA

AUTORES:

M.E.C. ANA BERTHA ESCOBEDO LPEZ.

M.S.P. CARLOS CABRERA MALDONADO.

M.S.P. MARA DE LA CRUZ MENESES SNCHEZ.

M. en C. ALMA LPEZ GARCA.

M. en C. ALEJANDRO CSAR RUZ TAGLE.

M.S.P. CLAUDY LORENA VILLAGRN PADILLA.

2013

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA

2

ndice

NMERO DE LA

PRCTICA

TITULO DE LA PRCTICA PGINA

Prctica 1

Observacin de grupos microbianos 3

Prctica 2

Microscopio 6

Prctica 3

Preparacin de material y medios de cultivo 10

Prctica 4

Tcnicas para recuento de bacterias 15

Prctica 5 Aislamiento de microorganismos por estra cruzada

18

Prctica 6 Tcnicas de tincin diferenciales

21

Prctica 7

Efecto de los factores fsicos sobre el crecimiento

de los microorganismos

24

Prctica 8

Efecto de los agentes qumicos sobre el

crecimiento de los microorganismos

28

Prctica 9

Crecimiento de microorganismos Gamnegativos en

diferentes medios de cultivo

32

Prctica 10 Crecimiento de microorganismos Grampositivos

en diferentes medios de cultivo

34

Prctica 11

Observacin de morfologa colonial 36

Prctica 12

Pruebas bioqumicas 39

Bibliografa 44





3

Prctica No. 1

Observacin de grupos microbianos

Introduccin

La Microbiologa estudia a los microorganismos desde el punto de vista de su morfologa,

funcin, relacin con el ambiente y los mtodos que nos llevan a su identificacin. Los

estudios de cada grupo en particular corresponden a ramas especficas de la Microbiologa,

como son:

Bacteriologa (bacterias).

Micologa (hongos)

Ficologa (algas).

Protozoologa (protozoarios).

Virologa (virus).

En 1969 Whittaker propone un sistema de 5 reinos, basndose en tres puntos principales:

complejidad celular (procariontes y eucariontes), complejidad tisular (unicelular, multicelular-

multinucleados) y nutricin (absorcin, fotosntesis, ingestin) los cuales son: Monera,

Protista, Fung, Vegetal y Animal.

Protozoarios: Son clasificados dentro del reino Protista, siendo microorganismos

unicelulares y eucariotes. Son en tamao mayores a las bacterias y sus estructuras internas

muchas veces fcilmente observables. Por su morfologa se puede diagnosticar la especie.

Hongos: Son clasificados dentro del reino Fungi, siendo organismos multinucleados y

eucariotes, sus nutrientes los obtienen por absorcin. En cuanto a su tamao es variable,

presentan dos tipos de crecimiento: filamentoso y levaduriforme.





4

Los hongos filamentosos tienen como unidad funcional a la HIFA, el conjunto de hifas

es denominado MICELIO, el cual puede estar en contacto con el medio y se le denomina

VEGETATIVO, o bien por encima del sustrato denominndose micelio AREO. Estos

hongos tienen aspecto algodonoso o aterciopelado con crecimiento radial.

El otro tipo de crecimiento es el levaduriforme, el cual se caracteriza por su tipo de

multiplicacin o divisin llamado GEMACIN. En tamao son mayores a las bacterias, son

unicelulares y no desarrollan filamentos o micelio. Algunos gneros forman el llamado

pseudomicelio, con tinciones apropiadas podemos observar el ncleo, otros organelos como

mitocondrias o inclusiones como grnulos de volutina, estn presentes en el citoplasma, las

colonias de levaduras son de aspecto cremoso.

Bacterias: Se encuentran dentro del reino Monera, son clulas procariotas y

unicelulares, se reproducen por fisin binaria, pueden ser mviles por la presencia de flagelos

simples, las formas fundamentales de las bacterias son: esfricas (cocos), alargadas (bacilos),

helicoidales (espirilos), los cocos pueden agruparse en pares, cadenas, racimos o tetradas,

dependiendo del gnero.

Un grupo importante de microorganismos son las Archeas cuya forma fundamental es

diferente al de las bacterias, se pueden presentar en forma de estrella o en forma cuadrangular,

la caracterstica principal de este grupo microbiano es su crecimiento, requieren condiciones

especiales extremas, como altas temperaturas o altas concentraciones de sal.

Objetivo

Observar diferentes grupos microbianos, detectando forma y agrupacin, usando

microscopa ptica.

Observar diferentes crecimientos macroscpicos.

Material

Preparaciones fijas de bacterias, hongos y protozoarios.

Placas de cultivo con crecimiento de hongos y bacterias.

Microscopio ptico.

5

Desarrollo

Hacer la observacin microscpica y macroscpica de cada preparacin proporcionada y

dibuja tus observaciones.

Cuestionario

1. Qu caractersticas microscpicas diferencian a los hongos de las bacterias?

2. Cul es el tamao promedio de cocos, bacilos, levaduras y virus?

3. Menciona 5 beneficios de los microorganismos para la humanidad.

4. Menciona 5 consecuencias perjudiciales de los microorganismos para la humanidad.

5. Menciona en forma ascendente en tamao, los organismos observados.

6

Prctica No. 2

Microscopio

Introduccin

El microscopio es un instrumento que permite observar microorganismos imposibles de ver a

simple vista. A mediados del siglo XVII el holands, Antony van Leeuwenhoek, utilizando

microscopios simples de fabricacin propia, describi por primera vez protozoos, bacterias,

espermatozoides y glbulos rojos. Durante el siglo XVIII el microscopio tuvo diversos

adelantos mecnicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso. Carl Zeiss, mejor

la microscopa de inmersin sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener

aumentos de 2000 veces.

El microscopio ptico es un instrumento que contiene una o varias lentes que permiten

obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refraccin. El microscopio

ptico puede ser monocular, consta de un solo tubo y para la observacin se utiliza un solo

ojo. El binocular es cuando posee dos tubos y la observacin se hace con los dos ojos.

El microscopio ptico est conformado por tres sistemas:

a) El sistema mecnico constituido por una serie de piezas que permiten el movimiento

para el enfoque del objeto: brazo, base o pie, platina, pinzas de sujecin, tornillo

macromtrico, tornillo micromtrico y tubo.

b) El sistema ptico comprende el conjunto de lentes que permiten el aumento de las

imgenes que se observan a travs de ellas formado por el ocular y objetivos.

c) El sistema de iluminacin comprende una lmpara incandescente de tungsteno

sobrevoltada, el espejo, el diafragma y el condensador; dispuestos de tal manera que

ilumine la preparacin u objeto que se va a observar en el microscopio de la manera

adecuada.





7

La observacin por microscopio es el mtodo ms comn utilizado tanto para la

deteccin directa de microorganismos en las muestras mdicas como para la caracterizacin

de microorganismos desarrollados en los cultivos. La microscopa se define como el empleo

de un microscopio para aumentar de tamao objetos demasiado pequeos que no se pueden

observar a simple vista, de modo que puedan verse con facilidad.

El mtodo empleado para procesar las muestras del paciente est determinado por el

tipo y la fuente corporal de la muestra. Las coloraciones o los colorantes especficos aplicados

a las muestras, combinados con determinados mtodos de microscopa, pueden ayudar a

detectar los agentes etiolgicos de una manera rpida. La microscopia tambin desempea un

papel clave en la caracterizacin de microorganismos cultivados en el laboratorio.

Las clulas teidas que se van a observar en el microscopio deben parecerse lo ms

posible a las clulas vivas. La fijacin es el procedimiento que permite que las clulas se

conserven y adems permite que se fijen firmemente al portaobjetos, esto se puede lograr con

calor o con algn alcohol dependiendo de la naturaleza de la muestra.

Los microorganismos se pueden teir satisfactoriamente con un solo colorante, esto es

tincin simple, o bien utilizando tinciones diferenciales que permiten clasificar a las bacterias

segn sus propiedades de tincin.

Objetivos

a) Realizar una tincin simple de bacterias procedentes de distintas muestras naturales.

b) Realizar dos tipos de fijaciones bacterianas y saber en qu casos se recomienda una u

otra.

c) Practicar con el microscopio al mximo aumento y con el correcto empleo del aceite

de inmersin.

Material

Muestras bacterianas de origen natural: yogur, vinagre, sarro dental, suelo, etc.

Colorantes para tincin:

Cristal violeta

Safranina

Azul de metileno

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Microscopio y aceite de inmersin

Desarrollo

Bacterias del yogurt

1. Realizar el frotis disolviendo una mnima porcin de yogur en una pequea gota de

agua.

2. Fijar con metanol para eliminar parte de la grasa.

3. Teir con un colorante cualquiera de los arriba indicados durante 1-2 minutos.

4. Observar al mximo aumento del microscopio.

5. Realiza los dibujos de cada observacin

Bacterias del sarro dental

1. Con un palillo tomar una pequea porcin de sarro dental y disolverla en una gota de

agua sobre el portaobjetos.

2. Dejar secar y fijar con calor.

3. Teir 2-3 min, lavar el exceso de colorante y secar.


Bacterias del suelo

1. Dejar parcialmente enterrado en vertical un portaobjetos en la tierra de una maceta

2. Despus de varios das, las bacterias se habrn adherido al vidrio y slo habr que

fijarlas por calor y teirlas con un colorante cualquiera. Previamente hay que limpiar

los bordes del portaobjetos, as como la parte que no se va a teir.


Completa el siguiente dibujo

9

Cuestionario:

1. Qu tipos de microscopio existen, en qu se fundamenta cada uno de ellos y cul es

su utilidad?

2. En qu objetivo se usa el aceite de inmersin y cul es su funcin?

3. Cul es la diferencia entre una preparacin en fresco y una preparacin fija?

4. Qu fin tiene la fijacin de muestras al realizar un frotis bacteriano?

5. Investiga las diferentes morfologas que presentan las clulas bacterianas y sus

agrupaciones.

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Prctica No. 3

Preparacin de material y medios de cultivo

Introduccin.

El material del laboratorio de Microbiologa requiere de una preparacin especial, deber ser

estril, para que no ofrezca un riesgo de contaminacin de la(s) muestra(s) ya que de ellos

depender el xito o fracaso del estudio microbiolgico a realizar.

La esterilizacin se mide en grado absoluto, es decir, se encuentra o no estril, y se

define como el proceso (ya sea fsico o qumico) por el cual se elimina toda forma de vida

microbiana, incluyendo formas bacterianas esporuladas y vegetativas, virus, hongos y

parsitos. El mtodo de esterilizacin ms empleado en microbiologa es por calor hmedo

utilizando la autoclave, a 121C, 15 min y 15 lb. (ver figura 1)

Fig. 1. Partes de la autoclave

La desinfeccin no es sinnimo de esterilizacin, es un proceso qumico o fsico, por

el cual son eliminadas solo formas bacterianas vegetativas y no formas esporuladas.

Dentro de los procesos fsicos para la esterilizacin se encuentra el calor (hmedo y





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seco), la filtracin, las radiaciones, ultracentrifugacin y ultrasonido. Dependiendo de la

naturaleza del material (ya sea termorresistente o termolbil) se deber elegir el mtodo de

esterilizacin.

Los mtodos de esterilizacin pueden ser evaluados a travs de agentes fsicos

(termopares y termmetros), qumicos (cinta testigo) y biolgicos (ampolletas Sterikon).

Un medio de cultivo es un sustrato que proporciona los nutrientes necesarios para el

desarrollo del microorganismo a probar. Los microorganismos presentan diferencias en sus

requerimientos nutricionales que son reflejo de la extrema diversidad bioqumica y

fisiolgica. El agua, sales inorgnicas, fuentes de carbono, fuentes de nitrgeno y metales son

necesarios para los microorganismos. Existen bacterias que necesitan la presencia de

determinado nutriente, sin el cual no pueden desarrollarse, este nutriente se denomina: factor

de crecimiento y las bacterias que necesitan de ellos se llaman auxtrofos.

Los medios de cultivo con base a su contenido de material gelificante pueden ser:

lquidos, semislidos y slidos (los lquidos carecen de material gelificante). En

Microbiologa el material gelificante ms utilizado es el agar, qumicamente es un

polisacrido obtenido a partir de algas marinas, presentando entre sus ventajas que la mayora

de los microorganismos no lo utilizan como nutriente. La presencia y cantidad de ste permite

diferenciar los medios semislidos (0.2-0.5% de agar), slidos (1 a 2% de agar) y lquido que

carece de agar.

De acuerdo a la funcin de los medios de cultivo se pueden ser medios selectivos,

diferenciales, de enriquecimiento, enriquecidos, de transporte, de mantenimiento, de

caracterizacin bioqumica entre otros, el uso de cada uno de ellos depender de las

necesidades en el laboratorio.

El medio de transporte tiene como objetivo transportar los especmenes que contienen

a los microorganismos, del sitio de la toma de la muestra hasta el laboratorio donde va a

efectuarse el estudio, aseguran la viabilidad de los microorganismos desde el momento de la

toma de la muestra hasta su siembra en el laboratorio.

El medio de transporte Stuart modificado, es un medio semislido empleado en el

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transporte y conservacin de especmenes para cultivos de diversos microorganismos como

estreptococos, enterobacterias, Haemophilus y otros microorganismos exigentes. La siembra

debe efectuarse no ms de las 36 h siguientes a la obtencin de la muestra. Otro medio

utilizado para este fin es el medio de Cary Blair que se utiliza primordialmente en el

transporte de coprocultivos, debido, a que la viabilidad de las especies de Shigella es superior

que en otros medios de transporte.

Los medios de enriquecimiento generalmente son lquidos y estimulan la

multiplicacin de algn microorganismo determinado, sin llegar a inhibir totalmente el

crecimiento del resto. Por ejemplo, la utilizacin de caldo de tetrationato o caldo selenito para

el enriquecimiento de Salmonella en heces.

El medio enriquecido es aquel que tiene aadidos factores de crecimiento, como la

sangre y otros nutrientes especiales para favorecer el crecimiento de hetertrofos exigentes.

El medio selectivo permite el crecimiento de un tipo de microorganismos determinado,

inhibiendo el desarrollo de los dems y finalmente el medio diferencial aqul que contiene

indicadores de tipo cido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en las

caractersticas tpicas de las colonias, y que permite distinguir a simple vista dos o ms tipos

de bacterias en funcin de su distinto comportamiento respecto de algn nutriente del medio.

Los medios de cultivo para Microbiologa se fabrican de forma granulada o de polvo,

ambas presentaciones son higroscpicas por lo que deben mantenerse perfectamente cerradas

y en ambientes secos.

Objetivo

Preparar el material necesario para el Laboratorio de Microbiologa.

Preparar diferentes medios de cultivo slidos y aplicar la esterilizacin por calor hmedo.

Material

Algodn

Cajas Petri estriles

Matraz Erlenmeyer

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Pipetas

Mechero

Autoclave

Medios de Cultivo en polvo

Probeta

Balanza

Esptula o cuchara

Parrilla de calentamiento

Guantes para calor

Desarrollo

1. Preparar diferentes materiales que se utilizan para el aislamiento de los

microorganismos.

2. La forma en la cual se preparan los medios de cultivo viene indicada en cada etiqueta

y depende del fabricante. Se recomienda lo siguiente:

a) Utilizar un recipiente de volumen 2.5 veces mayor al que se va a preparar.

b) Al medio se le agrega aproximadamente la mitad del agua total a utilizar dejndolo

reposar unos 15 minutos.

c) Si es necesario calentar, el calentamiento debe ser paulatino y agitando continuamente,

evitar el calentamiento prolongado.

Proceso de esterilizacin

1. Verificar el nivel de agua de la autoclave.

2. Introducir al autoclave los medios de cultivo perfectamente cubiertos, (en el caso de

esterilizar medios de cultivo en tubos con tapn de rosca, estos deben estar tapados

flojamente y cerrados perfectamente despus de esterilizar).

3. Cerrar la tapa de la autoclave y esperar que se sature de aire caliente antes de poner

vlvula de presin.

4. Esterilizar a 121C (15 lbs de presin) por 15 min.

5. Deben incluirse controles de esterilizacin para autoclave.

6. Compuestos termolbiles no deben ser esterilizados en autoclave.

Cuestionario

1. Qu ocurrira si los medios de cultivo no se esterilizaran tras su preparacin?

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2. Qu es y cmo se lleva a cabo la esterilizacin por calor hmedo y por calor seco?

3. Describe los siguientes mtodos de eliminacin de microorganismos: tindalizacin,

pasteurizacin, filtracin, radiaciones y gases.

4. Qu es un bioindicador de esterilidad?

5. Qu ventajas presenta el agar?

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Prctica No. 4

Tcnicas para recuento de bacterias

Introduccin

Si se pretende conocer el nmero total de microorganismos presentes en una muestra lquida

o slida, es recomendable que se encuentren sta ltima en forma lquida y homogenizada,

adems de utilizar un mtodo apropiado. Es importante sealar que el nmero no guarda

relacin con el tipo de microorganismos patgenos, por lo que no puede usarse como ndice

de su presencia y slo debe considerarse como un indicador de las caractersticas higinicas

de la muestra.

Adems dependiendo de las caractersticas del medio utilizado y de las condiciones de

incubacin, los microorganismos analizados sern miembros de poblaciones diferentes. En

general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes aunque en

ciertas situaciones puede ser de inters hacer recuentos anaerobios totales.

Objetivo

Realizar el aislamiento de microorganismos a partir de muestras problema utilizando

el mtodo de diluciones y vertido en placa.

Material

Muestra de agua o de alimento.

Mechero bunsen.

3 Matraces conteniendo 500 mL de agar nutritivo estril cada uno.

30 Pipetas de 10 mL o puntas azules estriles y micropipeta con capacidad de 1000 L.

20 Tubos conteniendo 9 mL de solucin salida isotnica estril (diluyente).

30 Cajas Petri estriles desechables.

Benzal





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Algodn

Marcador de tinta permanente

Desarrollo

1. Colectar 100 mL de muestra en un frasco estril.

2. Limpiar el rea de trabajo con benzal y algodn.

3. Colocar en una gradilla 5 tubos conteniendo 9 mL de solucin salina estril

(diluyente) y numerarlos.

4. Tomar 1 mL de la muestra en condiciones de esterilidad y transferirlo a un tubo que

contenga 9 ml de diluyente, as se obtiene una dilucin 10-1

, homogenizar el

contenido.

5. Transferir 1 mL a un tubo de dilucin que contenga 9 mL de diluyente, agitarlo

vigorosamente para homogenizar la muestra y obtener la dilucin 10-2

.

6. Realizar sucesivamente las siguientes diluciones, transfiriendo 1 mL de la muestra a

otro tubo con 9 mL de diluyente para obtener las diluciones 10-3

, 10-4

, 10-5

, 10-6

como

se indica en el esquema.

7. Pipetear 1 mL de cada una de las diluciones realizadas y transferirlos por separado a

una caja Petri estril vaca.

8. Adicionar inmediatamente en las cajas Petri de 10 a 15 mL de agar nutritivo

mezclando el inculo con el medio fundido, con movimientos rotatorios a la derecha, a

la izquierda y de arriba abajo.

9. Dejar gelificar las placas.

10. Rotular las placas indicando la dilucin que contienen y el tipo de muestra, incluir su

nombre as como la fecha de ingreso y de salida del material.

11. Colocar las placas en la estufa bacteriolgica y dejarlas durante 24 h a 37 C.

12. Limpiar nuevamente el rea de trabajo con benzal y algodn.

13. Evaluar el crecimiento a las 24 h, hacer el recuento de las unidades formadoras de

colonias (colonias) con ayuda del contador de colonias, registrar los resultados.

14. Seleccionar la placa representativa que corresponde a la dilucin que presente entre

30 y 300 unidades formadoras de colonias (UFC).

15. Multiplicar el No. de UFC por el inverso de la dilucin para obtener el No. de

unidades formadoras de colonias/ mL presentes en la muestra.

16. Colocar el material sucio en el cuarto de lavado.

17. Escribe el nmero de UFC encontradas en las placas sembradas en las diferentes

17

diluciones:

10-1

____________ 10 2

____________ 10 3

_____________

10 4

____________ 10 5

____________ 10 6

_____________

18. Cul fue tu placa representativa y cul fue la dilucin de la placa?

19. Calcula el no. de UFC/mL presente en la muestra (ver fig. 2)

Fig. 2. Mtodo de diluciones y vertido en placa

Cuestionario

1. Investiga las tcnicas que existen para el conteo total de microorganismos e indica

su fundamento.

2. Qu ventajas e inconvenientes presenta el mtodo utilizado en la prctica?

3. Escribe 3 ejemplos donde se aplique este procedimiento.

4. Por qu es necesario hacer diluciones en esta tcnica?

5. Cul es el criterio para seleccionar la placa representativa?

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Prctica No. 5

Aislamiento de microorganismos por estra cruzada

Introduccin

Para el microbilogo es de gran utilidad contar en el laboratorio con tcnicas que le permitan

estudiar un nico microorganismo separado del resto de la poblacin. Para lograr este fin se

necesita de un cultivo puro formado por clulas que provienen de una clula nica.

Aislamiento se define como la separacin de un microorganismo determinado de las

poblaciones mixtas que existen en la naturaleza; el cultivo, es el crecimiento de las

poblaciones microbianas en ambientes artificiales (medios de cultivo) en condiciones de

laboratorio. El proceso mediante el cual se separan los microorganismos se denomina

aislamiento y el microorganismo separado aislado.

La manera de inocular (sembrar) una muestra depende del tipo de medio de cultivo:

a) Medio lquido: la inoculacin se efecta mediante el asa bacteriolgica, pipeta o

hisopo.

b) Medio semigelificado (semislido): con ayuda del asa bacteriolgica recta, por

puncin.

c) Medio gelificado (slido): en caja Petri o en tubos con agar inclinado, la inoculacin

se realiza por estra o picadura.

Objetivo

Realizar el aislamiento de microorganismos utilizando placas con medio de cultivo

simple, con el asa bacteriolgica por el mtodo de estra cruzada.

Material

2 Placas con agar nutritivo.





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Mechero Bunsen.

Asa bacteriolgica.

Cepa bacteriolgica: Escherichia coli.

Benzal

Algodn

Desarrollo

1. Limpiar el rea de trabajo con benzal y algodn.

2. Flamear el asa bacteriolgica hasta llevarla al rojo vivo.

3. Dejar enfriar el asa.

4. Destapar el tubo o placa conteniendo la cepa problema.

5. Tomar la muestra con el asa bacteriolgica y volver a tapar el tubo.

6. Hacer las estras sobre la superficie del medio de cultivo, como se indica en el

esquema de trabajo teniendo cuidado de flamear el asa antes de cada serie de

estras y enfriarla en una orilla de la placa. Con la ltima serie de estras no volver

a tocar la primera serie de estras (ver fig. 3).

1 serie 2 serie 3 serie 4 serie

Fig. 3. Esquema de estra cruzada

7. Rotular las placas con su nombre, fecha de ingreso y de salida del material que se

va a meter a incubar.

8. Colocar las placas en la estufa bacteriolgica y dejarlas durante 24 horas a 37 C.

9. Limpiar nuevamente el rea de trabajo con benzal y algodn.

10. Evaluar el crecimiento a las 24 horas, identificando la presencia de colonias

aisladas y determinar si hubo cultivo puro o mixto.

11. Colocar el material sucio en el cuarto de lavado.

Otras formas para la siembra de cepas con asa bacteriolgica empleadas en microbiologa

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se muestran en la figura 4.

Fig. 4. Diferentes estras

Cuestionario

1. Por qu se incuban las cajas con las tapas hacia abajo?

2. Qu ventajas e inconvenientes ofrece el mtodo de estra cruzada?

3. Con que propsito se emplean las otras tcnicas de siembra diferentes a la estra

cruzada?

4. Cul es la diferencia entre un medio slido, semislido y lquido?

5. Qu tipo de medio es el agar nutritivo y para qu se utiliza?

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Prctica No. 6

Tcnicas de tincin diferenciales

Introduccin

Los organismos vivos son incoloros y presentan pobre contraste cuando se observan al

microscopio. Cuando los organismos son teidos antes de observarlos, aumenta en gran

medida el contraste de las clulas y su medio. Antes de teir es necesario hacer un frote y

fijarlo. Un frote es una delgada capa de clulas que cubre un rea de un portaobjetos, este

frote debe ser secado al aire y fijado por calor o qumicamente con alcohol. As los frotes no

fijados son lavados en el proceso de tincin.

Existen varias tcnicas de tincin ocupadas en Microbiologa, por ejemplo:

Tincin simple o directa.

Tincin diferencial.

Tincin de estructuras.

Tincin negativa.

Tincin de material de reserva, etc.

La tincin ms empleada en Microbiologa es la de Gram, que es una tincin

diferencial. Los microorganismos difieren entre s desde el punto de vista qumico y fsico por

lo que reaccionan de manera diferente a los colorantes. Las tinciones diferenciales ocupan dos

colorantes, uno primario y otro de contraste o secundario. Para la tincin de Gram el colorante

primario es cristal violeta mientras que la safranina corresponde al de contraste. La tincin de

Gram clasifica a los microorganismos segn su capacidad de retener el colorante primario

(Grampositivos) o el colorante de contraste (Gramnegativas).





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La tincin de esporas y tincin negativa son tinciones de estructuras especficas, la

primera permite teir las endosporas bacterianas y la segunda revela la presencia de cpsulas.

Objetivo

a) Aprender el fundamento y la tcnica de la tincin de Gram para determinar la

morfologa microscpica de diferentes cepas bacterianas.

b) Aprender el fundamento de la tincin negativa para levaduras.

c) Aprender el fundamento de la tincin de esporas para bacterias.

Material

Mechero

Asas bacteriolgicas

Placas sembradas con diferentes microorganismos

Portaobjetos

Colorantes

Microscopios

Cepas

Desarrollo

Tcnica de Tincin de Gram

1. Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa bacteriolgica una

pequea muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua sobre un

portaobjetos. Extender esta suspensin y dejar secar.

2. Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero.

3. Cubrir el frote con cristal violeta y dejarlo actuar por un minuto. Escurrir el colorante

y lavar con chorro suave de agua corriente.

4. Cubrir el frote con lugol, dejarlo actuar por un minuto. Escurrir y lavar.

5. Decolorar el frote con alcohol-acetona, de 5-30 segundos. Escurrir y lavar.

6. Cubrir el frote con safranina y dejarlo actuar por 30 segundos. Escurrir y lavar.

7. Dejar secar al aire.

8. Observar el frote con objetivo de inmersin.

9. Determinar la morfologa microscpica y la respuesta a la Tincin de Gram de cada

cepa empleada.

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Tcnica de tincin negativa

1. Mezclar las levaduras con tinta china sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos.

2. Observar el frote con objetivo seco fuerte.

Tcnica de tincin de esporas (Tincin de Schaeffer y Fulton)

1. Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa bacteriolgica una

pequea muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua sobre un

portaobjetos. Extender esta suspensin y dejar secar.

2. Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero.

3. Cubrir el frote con verde de malaquita a emisin de vapores y dejarlo actuar por un

minuto. Escurrir el colorante y lavar con chorro suave de agua corriente.

4. Cubrir el frote con safranina, como colorante de contraste dejarlo actuar por un

minuto. Escurrir y lavar.

5. Observar el frote con objetivo de inmersin y dibjala

Cuestionario

1. Qu es un frotis y para qu se utiliza?

2. Qu es un colorante? Cmo est constituido? Cmo es que se combina con los

diferentes componentes celulares?

3. Qu factores intervienen para que los colorantes se combinen con los componentes

celulares?

4. Qu es un mordente? Menciona tres ejemplos.

5. Cul es el objetivo de calentar en la tincin de esporas?

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Prctica No. 7

Efecto de los factores fsicos sobre el crecimiento de los microorganismos

Introduccin

Para que los microorganismos puedan ser aislados en el laboratorio se deben satisfacer todos

sus requerimientos nutricionales, para ello deben sembrarse en condiciones de cultivo que

aseguren por un lado, el suministro de los sustratos adecuados y por otro el mantenimiento de

las condiciones fsicas ptimas, que nos ayuden a obtener un crecimiento satisfactorio. Los

factores fsicos que ms influyen en este aspecto y sobre los cuales se debe mantener un

control preciso, son: temperatura, pH, concentracin de azcares, luz y concentracin de

sales.

La temperatura influye sobre las reacciones metablicas que cada microorganismo

realiza, de manera que cada especie se desarrolla mejor en ciertos rangos de temperatura. As

tenemos que los microorganismos que crecen a temperaturas menores de 20C se denominan

psicrfilos. En el otro extremo encontramos a los que crecen a temperaturas mayores de 45C

y se denominan termfilos. Y por ltimo, los que crecen en rangos de 20 a 45C y se les

llama mesfilos. En los rangos, los extremos superior e inferior se designan como

temperaturas mxima y mnima de crecimiento respectivamente, sin embargo los

microorganismos se desarrollan mejor a un valor especfico de temperatura que se designa

entonces como temperatura ptima de crecimiento.

Segn el pH al que se desarrollan las bacterias se clasifican en acidfilos cuando

crecen en un rango de pH entre 1 y 5; neutrfilos cuando crecen entre 5.5 y 8.5 y los basfilos

crecen entre 9 y 12.

Existen organismos que para su crecimiento necesitan de altas concentraciones de





25

sales y se les denomina halfilos, mientras otros soportan esas altas concentraciones

denominndose como sal tolerantes, debe entenderse entonces que en el primer caso se refiere

a un requerimiento mientras en el segundo es una adaptacin a las condiciones de cultivo.

Objetivos

a) Determinar las condiciones ptimas de crecimiento de microorganismos cultivados

bajo diferentes variables de temperatura, pH, concentracin de sal y de azcar.

b) Determinar las diferencias en los parmetros anteriores de acuerdo al grupo

microbiano.

Material

Cepas de Pseudomonas sp, Escherichia coli, Candida spp, Staphylococcus aureus

Tubos con caldo nutritivo preparados bajo las siguientes variables:

a) pH: 2, 5, 7 y 12.

b) NaCl: 0.85%, 5.0%, 7.0% y 10%.

c) Sacarosa: 2.5%, 5.5%, 10.0% y 20%.

d) Normales para incubacin a diferentes temperaturas.

Desarrollo

1. Formar un grupo de 16 tubos con caldo nutritivo que contengan las cuatro variables de

cada uno de los factores a probar. Estos 16 tubos se emplearn para analizar el

comportamiento de una sola cepa.

2. Sembrar una asada de la cepa correspondiente en cada uno de los 16 tubos anteriores.

El procedimiento se ilustra en el esquema de abajo.

3. Incubar todos los tubos de pH, NaCl y sacarosa a 37C durante 24 h.

4. Incubar los tubos con caldo nutritivo preparado normalmente a las siguientes

temperaturas: 4, 25, 37 y 45C durante 24 h.

5. Observando el crecimiento de las cepas sembradas, reporte sus resultados en el cuadro

de reporte.

26

6. Para el llenado siga el mtodo de las cuatro cruces. Comparando simultneamente los

cuatro tubos de las variantes de un mismo factor, asigna valores de 1-4 cruces segn la

turbidez presente en el medio. Donde no exista crecimiento asigne 0.

7. Construye una grfica para cada factor fsico.

8. Determina las condiciones ptimas de crecimiento para las diferentes cepas empleadas

con respecto a cada factor valorado.

9. Completa la siguiente tabla

pH % Sacarosa % NaCl Temperatura enC

2 5 7 12 2.5 5.5 10 20 0.85 5 7 10

CEPA

Incubar a 37C / 24 hrs. Incubar por 24 hrs. a

4 25 37 45

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Cuestionario

1. Menciona un ejemplo de microorganismo psicrfilo, de un mesfilo y de un

microorganismo termfilo.

2. Menciona un ejemplo de microorganismo acidfilo, de un neutrfilo y de un

microorganismo basfilo.

3. Define: microorganismo aerobio estricto, anaerobio facultativo, anaerobio y

microaeroflico.

4. Da un ejemplo de un microorganismo halfilo y de uno sal tolerante.

5. Explica a que se deben las diferencias de crecimiento, si las hay, para los

microorganismos sembrados bajo las variantes de cada factor.

Microorganismo

TEMPERATURA

4C 25C 37C 45C

1

2

Microorganismo

DIFERENTES pH

2 5 7 12

1

2

Microorganismo

% NaCl

0.85 5.0 7.0 10.0

1

2

Microorganismo

% SACAROSA

2.5 5.5 10 20

1

2

28

Prctica No. 8

Efecto de los agentes qumicos sobre el crecimiento de los microorganismos

Introduccin

Para el control del crecimiento microbiano o la eliminacin total de las poblaciones

microbianas podemos emplear sustancias qumicas conocidas como desinfectantes o

antispticos, que actan sobre el microorganismo por los siguientes mecanismos:

Ruptura de pared.

Alterando la naturaleza coloidal del protoplasma.

Alterando la permeabilidad.

Inactivando enzimas.

Desnaturalizando protenas.

Disminuyendo la tensin superficial.

Entre los agentes qumicos empleados tenemos: cidos, bases, jabones, detergentes,

alcoholes, metales pesados y colorantes. El trmino desinfectante est restringido a las

sustancias que son aplicadas sobre superficies. La accin desinfectante se ve aumentada por la

temperatura y la concentracin.

Un mtodo que permite evaluar la accin de los agentes qumicos sobre el crecimiento

microbiano es el de difusin en disco, consiste en impregnar un disco de papel filtro con una

cantidad determinada del agente qumico a probar y colocarlo sobre una superficie de agar en

la cual se ha distribuido un inculo del microorganismo, se formar por difusin del agente

qumico un gradiente de concentracin alrededor del sensidisco y la sensibilidad del





29

microorganismo estar indicada por el tamao de la zona de inhibicin del crecimiento

bacteriano. El gradiente se forma aproximadamente en 6 horas y la zona de inhibicin

depender del equilibrio entre la difusin del agente y la velocidad de crecimiento del

microorganismo.

Objetivo

Observar el efecto de diversos agentes qumicos sobre el crecimiento de los

microorganismos y determinar la diferente susceptibilidad de los organismos.

Material

Placas con agar nutritivo

Hisopos estriles

Discos de papel filtro impregnados con los siguientes agentes:

a) Agentes surfactantes: benzal, jabn, detergente y sales biliares

b) Metales pesados: merthiolate

c) Desinfectantes: Cloro, yodo

d) Colorantes: cristal violeta, safranina

e) Antibiticos

Pinzas

Cepas de microorganismos

Desarrollo

1. Ajustar el inculo a 0.5 de densidad en SSI con un densitmetro.

2. Con la disolucin, sembrar las placas con agar nutritivo en forma masiva, empleando

hisopos estriles con cada uno de los microorganismos proporcionados, en 3 diferentes

direcciones y alrededor de la placa (ver fig. 5 y 6)

Fig. 5. Esquema para estriado masivo

30

Fig. 6. Halos de inhibicin

3. Empleando pinzas flameadas en el mechero, colocar adecuadamente discos de papel

filtro, impregnados con el agente qumico a probar. La distancia entre cada disco no

debe ser menor a 2 cm. Debido a que la difusin del disco comienza instantneamente

despus de apoyado sobre el agar, stos no deben levantarse para cambiarlos de lugar.

4. Incubar todas las placas a 37C durante 18-24 h.

5. Hacer lectura midiendo en mm el dimetro de los halos de inhibicin alrededor de los

discos de papel filtro impregnados con el agente qumico.

6. Menciona si crecieron igual los diferentes microorganismos frente a los diferentes

agentes qumicos. Explica a que crees que se deban las diferencias si las hay.

7. Completa el siguiente cuadro registrando los resultados de cada cepa.

Crecimiento

microbiano Papel filtro impregnado con agente qumico

Halo de inhibicin del crecimiento bacteriano

31

Cuestionario

1. Menciona, a qu se le llama halo de inhibicin?

2. Indica la importancia de estandarizar el inculo.

3. Indica a cuntas UFC/mL corresponde 0.5 de densidad?

4. Explica, qu indica el dimetro del halo de inhibicin?

5. Menciona un mtodo para realizar un antibiograma y menciona su utilidad.

Nombre de la cepa:

Agente qumico Tamao de halo de

inhibicin

Sensible (S), Intermedio (I) o

Resistente (R)

32

Prctica No. 9

Crecimiento de microorganismos gramnegativos en diferentes medios de

cultivo

Introduccin

El grupo de bacterias Gramnegativas incluye una amplia variedad de tipos bacterianos. Se

encuentran en ambientes como el suelo, mucosas de diversos hospederos como parte de su

flora normal o hasta contaminando alimentos.

Independientemente de su respuesta a la tincin de Gram, los microorganismos poseen

complejidad bioqumica y fisiolgica con caractersticas que se hacen evidentes al emplear

medios de cultivo de composicin qumica especial, que ponen de manifiesto alguna

propiedad metablica.

Las bacterias Gramnegativas, enterobacterias y algunos no fermentadores como

Pseudomonas crecen en diversos medios de cultivo como Mac Conkey, Salmonella-Shigella,

Verde Brillante, Sulfito de Bismuto, Eosina Azul de Metileno, Xilosa-Lisina-Desoxicolato

entre otros; todos estos medios comparten la caracterstica de ser medios selectivos porque

contienen diferentes inhibidores que permiten en diferente medida el crecimiento de los

gramnegativos e inhiben a las bacterias Grampositivas y son diferenciales porque permiten

distinguir alguna caracterstica bioqumica importante para su identificacin.

Objetivo

Manejar los medios de cultivo adecuados para bacterias Gramnegativas e interpretar

los cambios bioqumicos presentados en ellos.





33

Material

Placas de Petri preparadas con los medios de cultivo: Mac Conkey, EMB, Verde Brillante y

Sulfito de Bismuto.

Mechero Bunsen

Asa bacteriolgica

Cepas de bacterias Gramnegativas

Desarrollo

1. Sembrar por el mtodo de estra cruzada cada uno de los medios, con la cepa

seleccionada.

2. Incubar las placas sembradas a 37C por 18-24 h.

3. Hacer la lectura detallando el tipo de crecimiento en cada uno de los medios

sembrados y determinar el medio de cultivo ptimo para el aislamiento de cada cepa.

4. De los medios utilizados en la prctica llena el siguiente cuadro

Medio Tipo de

medio Indicadores

Vire del indicador (pH) Inhibidores

Fuente de

carbono

fermentable cido neutro bsico

5. Qu indica el vire del indicador en los medios empleados?

6. Dibuja las placas antes y despus de inocular

Cuestionario

1. Menciona la caracterstica de la pared celular de las bacterias Gramnegativas.

2. Da 5 ejemplos de microorganismos Gramnegativos.

3. Qu componentes deben estar presentes en un medio de cultivo?

4. Menciona el fundamento del Mac Conkey.

5. Qu otros medios de cultivo, diferentes a los empleados en esta prctica, pueden ser

utilizados para el crecimiento de gramnegativos?

34

Prctica No. 10

Crecimiento de microorganismos Grampositivos en diferentes medios de

cultivo

Introduccin

El grupo de bacterias Grampositivas comprende un espectro muy amplio de tipos

morfolgicos, la mayora son hetertrofos que crecen como saprfitos viviendo de materia

orgnica muerta. Las bacterias Grampositivas generalmente abundan en el suelo aunque un

nmero importante de ellas son patgenos de plantas y animales. Un nmero menor de las

bacterias Grampositivas son auttrofas y producen cido actico a partir de dixido de

carbono e hidrgeno. Dentro de las bacterias Grampositivas tambin se ha descrito un grupo

fotosinttico, las heliobacterias.

Las bacterias Grampositivas contienen mayor cantidad de pptidoglucano que las

bacterias Gramnegativas, y sus paredes carecen de lipopolisacrido, componente

caracterstico en las Gramnegativas. Entro de las bacterias Grampositivas de inters mdico se

encuentran los cocos Grampositivos de los gneros Streptococcus y Staphylococcus que

crecen en medios enriquecidos principalmente.

Objetivo

Manejar los medios de cultivo adecuados para bacterias Grampositivas e interpretar

los cambios bioqumicos presentados en ellos.

Material

Placas de Petri preparadas con los medios de cultivo: Sal y Manitol; Agar sangre de carnero y

Agar Chocolate.

Mechero





35

Asa bacteriolgica

Cepas de cocos Grampositivos

Desarrollo

1. Sembrar por el mtodo de estra cruzada cada uno de los medios, con la cepa

proporcionada por el profesor.

2. Incubar las placas sembradas a 37C por 18-24 h.

3. Hacer la lectura detallando el tipo de crecimiento en cada uno de los medios

sembrados y determinar el medio de cultivo ptimo para el aislamiento de cada cepa.

4. Para el caso del medio Agar sangre de carnero, determinar el patrn de hemlisis

presentado por cada cepa de acuerdo al siguiente criterio:

Alfa-hemlisis: parcial aclaramiento alrededor de la colonia con decoloracin

verde en el medio.

Beta-hemlisis: zona de completo aclaramiento debido a la lisis total de los

glbulos rojos.

Gamma-hemlisis: no hemlisis.

5.- De los medios utilizados llenar el siguiente cuadro:

Medio Tipo de

medio Indicadores

Vire del indicador (pH) Inhibidores

Fuente de

carbono

fermentable cido neutro bsico

Cuestionario

1. Menciona las caractersticas principales de la pared celular de las bacterias

Grampositivas

2. Menciona 5 ejemplos de bacterias Grampositivas

3. Qu otros medios de cultivo, diferentes a los empleados en esta prctica, pueden

ser utilizados para el crecimiento de Grampositivos?

4. Menciona el fundamento del sal y manitol e indica el grupo bacteriano que crece

en este medio.

5. Investiga otros medios utilizados para el crecimiento de Grampositivos.

36

Prctica No. 11

Observacin de morfologa colonial

Introduccin

Las muestras sembradas en los medios adecuados y bajo las condiciones ambientales ptimas

crecern como un agregado macroscpico de muchas e idnticas clulas provenientes de una,

formando una colonia en la superficie de un medio de cultivo slido. Una vez aisladas las

colonias los pasos a seguir para llegar a la identificacin del tipo bacteriano son:

a) Determinar las caractersticas de la morfologa colonial.

b) Determinar la pureza de las cepas por medio de tinciones.

c) Observacin de cambios alrededor de las colonias, que reflejan alguna actividad

metablica.

d) Realizar pruebas metablicas diferenciales.

Morfologa colonial, ver figura 7.

Las caractersticas que determinan la morfologa colonial son:

1. Tamao de las colonias en milmetros.

2. Color de las colonias.

3. Forma: puntiforme, circular, irregular, filamentosa

4. Elevacin: plana, elevada, convexa, pulvinada, umbonada

5. Superficie: lisa, rugosa, granular

6. Aspecto: hmedo, seco.

7. Bordes: enteros, ondulados, filamentosos

8. Luz reflejada: brillante o mate.

9. Luz transmitida: opaca, translcida, transparente.

10. Consistencia: suave (butirosa, mucoide o friable) o dura.





37

Fig. 7. Diferentes morfologas coloniales

Objetivo

Aprender a leer la morfologa colonial.

Material

Mechero.

Asas bacteriolgicas.

Placas sembradas con diferentes microorganismos.

Desarrollo

1. Identifique las caractersticas morfolgicas de las colonias crecidas en los

diferentes agares.

2. Realiza la tincin de Gram y dibuja tu observacin.

3. Completa la siguiente tabla:

38

Caracterstica Agar: Agar: Agar: Agar:

1. tamao (mm)

2. color

3 Forma: puntiforme

circular

irregular

4. elevacin: plana

elevada

convexa

pulvinada

umbonada

5. superficie: lisa

rugosa

6. aspecto: hmedo

seco

7. bordes: enteros

irregulares

filamentosos

8. luz reflejada: brillante

mate

9.luz transmitida: opaca

translcida

transparente

10. consistencia: butirosa

mucoide

friable

Dura

Cuestionario

1. Se present la misma morfologa en los diferentes medios de cultivo?, si hubo

variaciones explica a qu crees que se deban?

2. Qu entiendes por el trmino butirosa?

3. Qu entiendes por el trmino friable?

4. Cul es la importancia de realizar la morfologa colonial de las bacterias?

5. Por qu crees que vara el tamao de las colonias bacterianas?

39

Prctica No. 12

Pruebas bioqumicas

Introduccin

El aislamiento de bacterias de productos biolgicos es un procedimiento de rutina en un

laboratorio clnico, que tiene como finalidad encontrar al agente causal de algn cuadro

infeccioso. El xito del aislamiento de bacterias depende en un principio de la correcta toma

de la muestra, que deber ser representativa del estudio deseado (exudado farngeo,

coprocultivo, urocultivo, exudado de herida, exudado tico, hemocultivo, cultivo de lquido

cefalorraqudeo, etc.), el siguiente paso es la seleccin de los medios de cultivo adecuados,

que debern ser selectivos, diferenciales y/o enriquecidos dependiendo de los

microorganismos buscados.

Una vez que se obtienen los cultivos puros, el siguiente paso, generalmente para la

identificacin de los microorganismos son las pruebas metablicas o pruebas bioqumicas, las

cuales se basan en la determinacin de enzimas, productos finales del metabolismo, etc.

Dichas pruebas son caractersticas de cada gnero y especie, para esto se siembra a los

microorganismos en medios que contienen un sustrato especfico, un indicador de pH, y los

nutrientes necesarios para su crecimiento (en algunas ocasiones es necesario agregar algunos

reactivos al medio donde se ha desarrollado el microorganismo para visualizar la reaccin

bioqumica).

Objetivos

Conocer el fundamento de las pruebas metablicas

Material

Tubos con agar TSI





40

Tubos con agar LIA

Tubos con agar MIO

Tubos con agar Citrato

Tubos con agar Urea

Reactivos para la prueba de Catalasa

Reactivos para la prueba de Oxidasa

Colorantes de Gram

Portaobjetos

Asa bacteriolgica

Mechero

Microscopios

Cepa a estudiar

Desarrollo

Pruebas metablicas

Al trmino de la incubacin pasar a la identificacin de bacterias de inters mdico, para lo

cual se utilizarn las pruebas metablicas o bioqumicas, de la siguiente manera:

1. Realizar tincin de Gram.

2. Con la ayuda de un aplicador estril tomar una colonia de inters y colocarla en un

portaobjetos con una gota de perxido de hidrgeno al 10% (prueba de catalasa).

3. De igual forma hacer prueba de oxidasa.

4. Con el asa bacteriolgica estril en punta tomar una colonia y depositarla en el tubo

con agar TSI.

5. Con la misma asa sin esterilizar sembrar los tubos con el resto de las bioqumicas.

Poner atencin a las indicaciones del maestro para la siembra de estos tubos.

6. Rotular e incubar a 37C por 18-24 h.

7. Leer e interpretar las pruebas bioqumicas. Para la lectura de produccin de indol

agregar una gota de reactivo de Kovacs, (apyese en la siguientes tablas para la

identificacin de enterobacterias).

8. Completa la siguiente tabla

41

Prueba

bioqumica Indicador

Fuente de

carbono

Pruebas a

realizar

Todas las

posibles

lecturas

Dibujo del

medio sin

inocular

TSI

LIA

MIO

Citrato

Urea

Catalasa

Oxidasa

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Cuestionario

1. Menciona el mecanismo de las bacterias para utilizar a la lactosa.

2. Indica la reaccin de la descarboxilacin de la lisina.

3. Menciona a las enterobacterias H2S positas, mviles y que desaminan la lisina.

4. Qu otro medio de cultivo, diferente al MIO, se puede utilizar para determinar la

movilidad?

5. Cul es la reaccin entre el indol y el reactivo de Kovacs?

44

Bibliografa

a) Cowan y Steel. 1988. Manual para la identificacin de bacterias de inters mdico. Ed.

Editorial Panamericana.

b) Diario Oficial de la Federacin. NOM-109-SSA-1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo

para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis

microbiolgico. 12 diciembre 1994.

c) Diario Oficial de la Federacin. NOM-110-SSA-1-1994. Bienes y servicios. Mtodo

para la cuenta de bacterias mesoflicas aerobias en alimentos. 12 diciembre 1994.

d) Diario Oficial de la Federacin. NOM-111-SSA-1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo

para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. 15 agosto 1994.

e) Diario Oficial de la Federacin. NOM-113-SSA-1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo

para la cuenta de microorganismos coliformes totales en alimentos. 15 septiembre

1994.

f) Freeman B. A. 1985. Microbiologa de Burrosws. 22 Ed. Editorial Mac Graw-Hill.

g) Koneman. 2008. Diagnstico Microbiolgico. Ed. Panamericana.

h) Madigan M. T. B. 1999. Biologa de los microorganismos. Prentice-Hall

i) Presscot.1999. Microbiologa 4a Ed Mac Graw Hill Interamericana.

j) Tortora G, Funke B, Case C. 1998. Microbiology. 5a ed. Editorial

Benjamin/Cummings.

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