Manual de técnicas y procedimientos para la detección de...

Manual de técnicas y procedimientos para la detección de Vibrio cholerae

en agua y alimentos

Manual de técnicas y procedimientos para la detección de Vibrio cholerae en agua y alimentos.

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DIRECTORIO

Secretario de Salud

José Narro Robles

Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios

Julio Sánchez y Tépoz

Comisionada de Control Analítico y Ampliación de Cobertura

Armida Zúñiga Estrada

Comisionada de Evidencia y Manejo de Riesgo

Rocío del Carmen Alatorre Eden-Winter

Comisionado de Operación Sanitaria

Álvaro Israel Pérez Vega

Directora Ejecutiva de Control Analítico

Imelda Rocío Guzmán Cervantes

Directora Ejecutiva de Innovación

Josefina Gutiérrez Ramírez


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Manual de técnicas y procedimientos para la detección de V. cholerae en agua y alimentos. DR © Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios. Calzada de Tlalpan 4492, Col. Toriello Guerra, Del. Tlalpan., C.P. 14050. Ciudad de México. Segunda Edición 2018.


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CONTENIDO I. Introducción. 5

II. Objetivo. 6

III. Muestreo y Preparación de muestras para el aislamiento de V. cholerae. 7

A. Muestreo y aislamiento de V. cholerae en muestras de alimentos. 7

B. Muestreo y aislamiento de V. cholerae en muestras de agua y hielo para uso y consumo humano. 11

C. Muestreo y aislamiento de V. cholerae en aguas superficiales (hisopo de Moore). 12

D. Muestreo y aislamiento de V. cholerae en aguas superficiales con baja contaminación (Trampa de Spira). 13

E. Muestreo de aguas con baja contaminación. Ultrafiltración 14

IV. Aislamiento e identificación de V. cholerae. 18

Anexo A. Medios de cultivo. 22

Anexo B. Pruebas Bioquímicas. 26

Anexo C. Diagrama de flujo. 27

Anexo D. Característica bioquímicas comunes. 29

Bibliografía. 30


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I. Introducción. El cólera es una infección intestinal aguda causada por la ingestión de alimentos o agua contaminados por la bacteria Vibrio cholerae. Tiene un periodo de incubación corto, entre menos de un día y cinco días, y la bacteria produce una enterotoxina que causa una diarrea copiosa, indolora y acuosa que puede conducir con rapidez a una deshidratación grave y a la muerte si no se trata prontamente. La mayor parte de los pacientes sufren también vómitos. La mayoría de las personas infectadas por V. cholerae no presentan síntomas, aunque la bacteria esté presente en sus heces durante los 1 a 10 días siguientes a la infección, con el consiguiente riesgo de infección de otras personas. En el 80% de las personas que presentan síntomas estos son de leves a moderados; un 20% padece diarrea acuosa aguda con deshidratación grave. Si no se da tratamiento, esta puede ocasionar la muerte. Debido al rápido tiempo de generación de V. cholerae, los períodos cortos de incubación son efectivos para el aislamiento. El agua peptonada alcalina (APA) proporciona un enriquecimiento adecuado durante períodos de incubación de 6 a 8 h; sin embargo la incubación en períodos de “toda la noche” (16 a 18 h), es generalmente utilizada, aunque no es lo ideal, para facilitar el análisis de muestras durante las horas de trabajo, esto debido a que en algunos alimentos el aislamiento de V. cholerae puede verse enmascarado por el crecimiento de microbiota competitiva cuando las muestras se incuban por periodos largos. Si el producto se sometió a una etapa de procesamiento, es decir, calentamiento, congelación, secado, etc. se recomienda la incubación durante la noche para resucitar a las células lesionadas. La incubación de muestras de moluscos bivalvos en APA a 42 °C durante 6 a 8 h ha demostrado ser efectiva para el aislamiento de V. cholerae. Sin embargo, DePaola y Hwang1 encontraron que si se usan inóculos bajos de V. cholerae O1, se obtiene una mayor recuperación cuando las muestras son incubadas durante 18 a 21 h. Debido a estas consideraciones, se recomienda realizar siembras a partir de los enriquecimientos de APA a las 6 a 8 h, y después de la incubación durante la noche. También se recomienda que los moluscos se diluyan en proporción de 1:100. Se considera que la principal fuente de contaminación de Vibrios es el agua, sin embargo el contacto con alimentos contaminados puede propagar el cólera, los alimentos que frecuentemente están asociados a las vías de transmisión son los pescados y mariscos, sin embargo en una epidemia los alimentos se contaminan principalmente por heces humanas2. V. cholerae sobrevive mejor en las muestras conservadas a temperaturas de refrigeración que de congelación, por lo que será conveniente mantenerlas a temperaturas de entre 7 °C y 10 °C3, transportando las muestras en hieleras rígidas con geles refrigerantes congelados. No se recomienda el uso de hielo, ya que este al deshelarse puede contaminar las muestras y las muestras pueden contaminar esta agua de deshielo y ser un riesgo de contaminación ambiental4. Las muestras deberán entregarse al laboratorio lo antes posible, preferentemente antes de 24h de haber sido colectadas, las muestras nunca deberán ser analizadas después de 48 h, después de su recolección5.

1 DePaola, A., and Hwang, G. C.1995. Effect of dilution, incubation time, and temperature of enrichment on cultural and PCR detection of Vibrio cholerae obtained from the oyster Crassostrea virginica. Molec. Cell. Probes. 9:75-81. 2 Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention. Chapter IV. Isolation of Vibrio cholerae from fecal specimens. http://www.cdc.gov/cholera/laboratory.html . 3 Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae Centers for Disease Control and Prevention. Chapter IV. Isolation of Vibrio cholerae from fecal specimens. http://www.cdc.gov/cholera/laboratory.html 4 Ídem 5 Artículo 401 Bis, Ley General de Salud.

http://www.cdc.gov/cholera/laboratory.html



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II. Objetivo.

El presente manual complementa y no sustituye a los métodos de análisis descritos en la Norma Oficial Mexicana Norma Oficial Mexicana NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y métodos de prueba. Apéndices B.18 y B19. El objetivo de este manual es mantener armonizados los procedimientos de muestreo utilizados por las Áreas de Protección Contra Riesgos Sanitarios (APCRS) y los métodos de análisis realizados por los Laboratorios Estatales de Salud Pública y Terceros Autorizados durante la búsqueda de V. cholerae durante una contingencia o en ausencia de un método normativo.


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III. Muestreo y Preparación de muestras para el aislamiento de V. cholerae.

El personal técnico responsable del muestreo deberá considerar precauciones incluyendo el uso de equipo de protección personal como el uso de guantes de látex estériles desechables; la muestra deberá ser colectada y depositada en recipientes estériles con tapa de rosca. Si es necesario el uso de bolsas de plástico, se deberá tener especial cuidado en que las bolsas estén íntegras y sean de cierre hermético, de tal manera que la muestra no presente derrames. Realizar el etiquetado de la muestra considerando como mínimo la siguiente información:

● Nombre del producto. ● Número de acta de muestreo. ● Nombre de la persona que realiza el muestreo. ● Procedencia (Domicilio o punto de muestreo o nombre del establecimiento). ● Fecha y hora de recolección.

A. Muestreo y aislamiento de V. cholerae en muestras de alimentos.

Método de referencia. Charles A. Kaysner y Angelo DePaola, Jr., Bacteriological Analytical Manual, Chapter 9, Vibrio, Procedimiento V. cholerae. FDA. USA Mayo 2014. Muestreo. Siempre que sea posible se deberán colectar las muestras conforme se indica en las siguientes tablas: Materiales.

Bolsas de plástico nuevas, guantes, hieleras y refrigerantes. Frutas y verduras. Tabla 1. Indicaciones para el muestreo de frutas y verduras.

Fruta o verdura Qué colectar o muestrear

Vegetales frescos pequeños con hojas. Ejemplo: cilantro, perejil, berro, pápalo, germinados, etc.

Seleccionar el total de manojos que en conjunto pesan como mínimo 200 g

Vegetales frescos medianos (con o sin hoja) medianos. Ejemplo: brócoli, rábanos, cebolla, jitomate, calabaza, betabel, camotes, zanahoria, jícama, etc.

Seleccionar 10 piezas de manera individual que en conjunto pesan como mínimo 250 g

Vegetales frescos grandes. Ejemplo: lechuga, espinaca, coliflor, apio, acelga, col, etc.

Seleccionar 10 piezas de manera individual que en conjunto pesan como mínimo 250 g.

Frutas pequeñas Ejemplo: fresas, zarzamora, uvas, etc.

10 submuestras que en total pesan como mínimo 250 g

Frutas medianas Ejemplo: duraznos, manzanas, aguacate, etc.

10 piezas que en total pesan mínimo 250 g. Si sobrepasan este peso en conjunto, tomar 10 piezas de manera individual.

Frutas grandes Ejemplo: melones, sandía, etc.

2 pieza individuales las cuales corresponderá a una muestra

Fruta fresca picada o rebanada Muestrear mínimo 250 g

Vegetales picados o rebanados Muestrear mínimo 250 g


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Productos de pesca6 Tabla 2. Indicaciones para el muestreo de productos de la pesca.

Producto de la pesca Qué colectar o muestrear

Mariscos fresco o pre-cocido Tomar 10 submuestras aleatorias para completar un peso mínimo de 250 g que corresponden a una muestra.

Pescado fresco o congelado7 Tomar preferentemente mínimo 5 piezas enteras o en su defecto o contingencia, filetes.

Moluscos Bivalvos en concha8 Mínimo tomar 12 piezas, y para especies grandes considerar mínimo 3 piezas. La masa total del músculo y el líquido intervalvar deberá ser de al menos 200 g

Productos lácteos Tabla 3. Indicaciones para el muestreo de productos lácteos.

Productos lácteos Qué colectar o muestrear

Quesos frescos. Helados, sorbetes y bases para helados.

Tomar 10 submuestras aleatorias para completar un peso Mínimo de 250 g que corresponden a una muestra.

Quesos de suero.

Criterios de recepción de muestras9.

Tabla 4. Criterios para la recepción de muestras de Alimentos.

Tipo de Alimento. Criterio de recepción.

Frutas y hortalizas. Cantidad de muestra de acuerdo a la tabla arriba señalada. Temperatura de recepción por debajo de la temperatura ambiental. Las muestras que se encuentren en claro estado de descomposición deberán rechazarse Antes de 40 h posteriores a su muestreo.

Perecederos como productos lácteos y pescado fresco (refrigerados).

Cantidad de muestra de acuerdo a la tabla arriba señalada. Temperatura de recepción entre 4 °C y 10 °C Las muestras que se encuentren en claro estado de descomposición deberán rechazarse Antes de 40 h posteriores a su muestreo.

Congelados. Temperatura de recepción entre 4 °C y 10 °C , sin evidencia de descongelación total Las muestras que se encuentren en claro estado de descomposición deberán rechazarse Antes de 40 h posteriores a su muestreo.

6 Son fuentes de contaminación principalmente moluscos bivalvos y pescados recién colectados. Es de suma importancia que los pescados sean enteros, sin ser descamados o eviscerados. 7 Se debe considerar que en las vísceras existe una mayor posibilidad de encontrar al patógeno. 8 El manejo de moluscos bivalvos debe realizarse de acuerdo a lo recomendado en el Programa Mexicano de Sanidad de Moluscos Bivalvos. 9 El tamaño de la muestra puede ser menor al indicado, en este caso se debe notificar al usuario del incumplimiento y este debe autorizar la realización del ensayo.


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Marcha analítica.

Equipos, Materiales y reactivos.

● Licuadora y vasos de licuadora estériles.

● Frascos de vidrio de boca ancha tipo tarro de 500 ml de capacidad con tapa de rosca.

● Balanza granataria de 2000 g de capacidad y 0,2 g de sensibilidad.

● Incubadoras de 33 °C – 37 °C.

● Baño de agua 41.8 °C - 42.2 °C.

● Cucharas estériles u otros instrumentos apropiados para transferir muestras de alimentos.

● Pipetas estériles de 1 mL con graduación de 0,01 ml, de 5 y 10 ml con graduación de 0,1 mL.

● Tubos de cultivo o de ensayo de 16 x 150 mm y 20 x 150 mm.

● Tijeras y pinzas estériles.

● Mecheros.

● Bolsas de polietileno de 28 x 37 cm con cierre hermético.

Preparación de muestras.

Tabla 5. Procedimiento para la preparación de diferentes tipos de muestras de alimentos.

Tipo de Alimento. Procedimiento de preparación.

Vegetales frescos (con hoja) pequeños.

Pesar al menos 50 g del total de la muestra y diluir con una proporción igual (g/g)

de agua peptonada alcalina (1.0% p/v) (APA), homogeneizar utilizando una

licuadora a alta velocidad por 30s - 90 s (dependiendo de la dureza de la

muestra), transferir 50g del homogenizado a 200 g o mL de APA10.

Frutas pequeñas.

Fruta fresca picada o rebanada.

Vegetales picados o rebanados

Quesos frescos. Helados., sorbetes y bases para helados.

Vegetales, medianos y grandes. Colocar las piezas individuales en una bolsa de plástico estéril y enjuagar con 1 L

de APA. Frutas medianas y grandes.

Productos de la Pesca.

Es de suma importancia que los pescados sean enteros, sin ser descamados ni eviscerados, tomar tejidos superficiales, vísceras y agallas. Cortar en piezas pequeñas y colocar dentro de un vaso de licuadora estéril. Pesar al menos 50 g de todas las piezas de pescado adicionar una masa igual de APA (g/g). Licuar homogeneizando por 2 minutos a alta velocidad11. Por duplicado transferir 50 g del homogenizado a 200 g o mL APA.

Quesos de suero.

Pesar al menos 50 g del total de la muestra y diluir con una proporción igual (g/g) de agua peptonada alcalina (1.0% p/v) (APA) homogeneizar utilizando una licuadora a alta velocidad por 30s - 90 s (dependiendo de la dureza de la muestra), transferir por duplicado 50 g a 200 g o mL de APA.

10En casos de contingencia puede ser necesario utilizar porciones duplicadas. 11Cuando se observe crecimiento de biota acompañante que pueda enmascarar el crecimiento de V. cholerae, será necesario realizar diluciones decimales.


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Tipo de Alimento. Procedimiento de preparación.

Crustáceos.

Tomar el animal completo (si es posible) o la parte central, incluidas las vísceras. Pesar al menos 50 g de la muestra en una licuadora y adicionar una cantidad igual de APA (g/g) transferir 50g a 200 g o mL de APA, considera esta dilución como la dilución 1:10, realizar diluciones decimales 10-2 y 10-3.

Moluscos bivalvos. Ver el procedimiento en el “Manual de Laboratorios del Programa Mexicano de Sanidad de Moluscos Bivalvos.”

Enriquecimiento.

Incubar las muestras en APA en las siguientes condiciones. Tabla 6 Condiciones de incubación para diferentes tipos de alimentos.

Tipo de Alimento. Temperatura. Tiempo.

Todas las muestras con excepción de los moluscos bivalvos12, productos lácteos y quesos de suero.

33 °C – 37 °C 6 h a 8 h. Si es posible re-incubar las muestras adicionalmente por toda la noche.

Productos lácteos y quesos de suero 33 °C – 37 °C / 41.8 °C - 42.2 °C 6 h a 8 h. Si es posible re-incubar las muestras adicionalmente por toda la noche.

Continuar con lo indicado en “IV Aislamiento e identificación de V. cholerae”

12Para moluscos bivalvos, ver “Manual laboratorios del PMSMB.”


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B. Muestreo y aislamiento de V. cholerae en muestras de agua y hielo para uso y consumo humano.

Método de referencia. Métodos de laboratorio para el diagnóstico de la disentería y el cólera epidémicos, WHO/CDC/CSR/EDC/99.8, Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, Georgia 2002. Muestreo. Materiales.

● Frascos de plástico o vidrio estériles de 5 L ● Bolsas de plástico gruesas nuevas de capacidad para muestrear 3 kg. ● Tiosulfato de sodio estéril al 1%

Toma de muestras. Mientras más grande es el tamaño de la muestra más probable es el aislamiento del patógeno. El tamaño mínimo de muestra recomendado es de 3 L o 3 kg. Las muestras deben ser colectadas en recipientes de polipropileno limpios y estériles, los contenedores no deberán llenarse por arriba de ¾ partes del volumen total del recipiente. Las muestras de agua deben analizarse lo más pronto posible después de su recolección; para lo cual se deberán enviar al laboratorio en condiciones de refrigeración (7 °C a 10 °C). No deberá transcurrir un periodo de más de 12 h entre la colecta de la muestra y el inicio del análisis. Adicionalmente se recomienda que durante el muestreo, se colecten datos como (temperatura, salinidad, conductividad, pH, oxígeno disuelto y cloro libre residual) pues estos pueden influir en la densidad celular de V. cholerae presente. Para desactivar el cloro residual en muestras de agua para uso y consumo humano, el recipiente deberá contener 0.1 mL de tiosulfato de sodio estéril al 1%13 por cada 120 mL de muestreo. Marcha Analítica Equipos, Materiales y reactivos.

● Refrigerador capaz de operar entre 5 °C - 8 °C ● Equipo de filtración

○ Embudo de filtración ○ Matraz Kitazato ○ Manguera látex ○ Bomba de vacío ○ Pinzas ○ Membranas de filtración de nitrocelulosa, tamaño de poro 0.45 µm, diámetro 47 mm.

● Incubadora calificada a 35 °C +/- 2 °C ● Incubadora calificada a 42 °C +/- 0.2 °C

Preparación de la muestra. Para muestras de hielo, este deberá fundirse completamente antes de su análisis, por lo que se puede dejar toda la noche en la parte baja del refrigerador, no se recomienda colocar las muestras en un baño de agua ya que V. cholerae es susceptible a cambios bruscos de temperatura. Homogenizar la muestra, y filtrar todo el volumen de muestra líquida, a través de una membrana estéril de nitrocelulosa de 0.45 μm de tamaño de poro. Dividir la membrana y colocar cada mitad en 10 mL de APA y agitar en vórtex por 90 s. En ocasiones dependiendo de la cantidad de sólidos en la muestra de agua puede ser necesario realizar la filtración de porciones de la muestra, a través de diferentes membranas. Enriquecimiento. Colocar los tubos con la membrana a 35 °C +/- 2 y 42 °C +/- 0.2 °C por toda la noche. Continuar con lo indicado en “IV Aislamiento e identificación de V. cholerae”

13 Este puede adicionarse antes de la esterilización de los frascos


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C. Muestreo y aislamiento de V. cholerae en aguas superficiales (hisopo de Moore).

La técnica del hisopo de Moore es considerada de gran utilidad para la búsqueda de V. cholerae en aguas superficiales de ríos contaminados. Esto debido a la facilidad con la que se elaboran y colocan los hisopos en el flujo de agua. Método de referencia. Métodos de laboratorio para el diagnóstico de la disentería y el cólera epidémicos, WHO/CDC/CSR/EDC/99.8, Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, Georgia 2002. Materiales e instrucciones para la preparación de los hisopos Para elaborar 10 hisopos de Moore considerar el siguiente material:

● 12 m de gasa de algodón.

● 100 m de hilo de pescar de nylon (resistencia tensil ≥11.35 Kg).

● 10 Frascos de capacidad mínima de 1000 mL conteniendo 500 mL de APA Cortar un trozo de gasa de 90 cm de ancho por 180 cm de largo. La gasa se dobla 5 veces en sentido longitudinal obteniéndose las siguientes dimensiones: 30 cm de ancho por 36 cm de largo. A partir de la base inferior de 30 cm se cortan 6 tiras de 5 cm de ancho y 26 cm de largo, dejándose 10 cm en la parte superior sin cortar. En este sitio se amarra con un cáñamo de nylon o de otro material fuerte. Se coloca en papel kraft (o equivalente) y esterilizar a 121 °C / 15 lb / 15 minutos.

Figura 1. Hisopo de Moore14 Toma de muestras. La colocación de hisopos debe hacerse corriente arriba del punto de contaminación en el río o de la zona donde se presentan los brotes o donde exista un asentamiento urbano. Suspenda el hisopo en la corriente de agua a analizar. Se deja colocado entonces el hisopo durante 24 h a 48 h. Utilizando guantes15, recolectar los hisopos y colocarlos en frascos de 1000 mL con 500 mL de APA. Transportar inmediatamente al laboratorio. No es necesario refrigerar las muestras. Enriquecimiento de las muestras Incubar el frasco de APA a 35 °C +/- 2 °C por toda la noche, continuar con lo indicado en “IV Aislamiento e identificación de V. cholerae”

14 https://www.cdc.gov/cholera/index.html 15 Cambiar los guantes entre muestra y muestra.

https://www.cdc.gov/cholera/index.html


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D. Muestreo y aislamiento de V. cholerae en aguas superficiales con baja contaminación (Trampa de Spira).

Para las muestras provenientes de aguas superficiales poco contaminadas, se recomienda realizar el método de hisopo de Spira, consiste en someter el agua de análisis a un filtrado a través de gasa de algodón. Previo a la toma, se debe medir la temperatura ambiente y determinar el pH en el punto en que se tomará la muestra. Método de referencia. Métodos de laboratorio para el diagnóstico de la disentería y el cólera epidémicos, WHO/CDC/CSR/EDC/99.8, Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, Georgia 2002. Materiales e instrucciones para la preparación de las trampas.

● Frascos de plástico con tapa de rosca, limpios y estériles de 500 mL o 1000 mL con un orificio de 2 cm de diámetro en el fondo.

● Gasa de 30 cm de ancho y 120 cm -180 cm de longitud. ● Frascos de 2000 mL con 100 mL de APA concentración 10X.

La gasa se introduce en un frasco de plástico doblándose en capas, para generar un paquete regularmente firme que ocupe cerca de las 2/3 partes del volumen del frasco. Esterilizar las trampas de Spira envolviendo cada frasco en papel de estaño o de estraza y esterilizar por 121 °C / 15 min / 15 lb. Siembra de las trampas Cuando el muestreo se hace en cuerpos de agua en movimiento, por ejemplo ríos limpios, se coloca la trampa en el cuerpo del río por lo menos durante 24 h, permitiendo que el flujo del agua entre por la boca del recipiente y salga por el orificio inferior. Para el caso de cuerpos de agua sin movimiento, por ejemplo lagos, lagunas y estanques; verter el agua por la boca del frasco indicando el volumen muestreado, el cual deberá ser como mínimo 5 L, dejando escurrir por el fondo. Verter por la boca del frasco el agua que se va a muestrear y se deja escurrir por el fondo, posteriormente la gasa se retira del frasco Spira y se coloca en un matraz o frasco con 100 mL de APA 10x y utilizando agua de la misma área muestreada agregar la cantidad suficiente para obtener un volumen final de 1 L. Trasladar la muestra al laboratorio a temperatura ambiente16. Enriquecimiento de las muestras Incubar el frasco de APA a 35 °C +/- 2 °C por toda la noche, continuar con lo indicado en “IV Aislamiento e identificación de V. cholerae”

16 Las muestras no se deben transportar en refrigeración.


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E. Muestreo de aguas con baja contaminación. Ultrafiltración

Introducción. El método de ultrafiltración o concentración a través de fibra hueca sin salida para el muestreo, es un método adecuado para la recuperación de virus, bacterias y parásitos en grandes volúmenes de agua. Esta técnica es conocida como ultrafiltración, es aplicable a todas las muestras de agua, sin embargo el agua con turbiedad puede afectar las tasas de filtración. La técnica ha demostrado ser efectiva para el agua de proceso que contenga valores de turbiedad < 5UNT (unidades nefelométricas de turbidez), así como para muestras de aguas residuales y muestras de agua con una turbiedad de hasta 80 UNT. Este método puede realizarse en campo o laboratorio con un mínimo entrenamiento técnico del personal. La técnica es útil para cualquier cuerpo de agua, ya sea presurizadas como el caso de ríos, agua de la llave con o sin presión como son pozos y lagunas. Método de referencia. Mull, B and Hill, VR. (2012). Recovery of diverse microbes in high turbidity surface water samples using dead-end ultrafiltration. J. Microbiol. Meth. 91:429-433. Equipo e instrumentos

● Bomba peristáltica ● Totalizadora de flujo de agua, caudalímetro o

probeta graduada de 1L ● Balanza

● Pipeteador automático ● Micropipeteador de 1000 μL ● Pinzas manuales ● Cronómetro con segundero de mano

Reactivos

● Polifosfato de sodio (NaPP). ● Tween 80 ● Emulsión antiespumante Y-30

● Tiosulfato de sodio ● Agua desionizada, dH2O ● APA 2X (doble concentración)

Suministros.

● Filtro de diálisis Modelo -REXEED-25S- ● Tubería de silicón L/S 36 ● Tubería de silicón I/P 89 ● Adaptador DIN ● Tapas de puerto ● Tapas de almacenamiento para filtros ● Conector de reducción 5/8" x 3/8" ● Abrazaderas, SNP-8 ● Abrazaderas, SNP-12 ● Abrazaderas, SNP-14 ● Abrazaderas, SNP-19

● Adaptador 3/4" GHT ● Adaptador de inserción giratorio x NPT ● Contenedores plegables de 20 L ● Pipetas desechables de plástico de 10mL ● Guantes de látex ● Vasos de precipitado de 1L ● Botellas pyrex de tapa rosca de 500mL ● Botellas de plástico de 1L ● Botellas de plástico de 125 mL ● Jeringas de 60 mL ● Puntas para micropipeta de 1000 μL


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Instalación del equipo Ensamblar el dispositivo acorde a la siguiente figura:

Figura 2. Instalación del equipo para ultrafiltración. Se utilizará un caudalímetro para medir el volumen de agua filtrada y así calcular la totalidad; registrar el volumen inicial en la hoja de datos

Colocar una manguera de PVC en la entrada azul del filtro de diálisis, coloque el otro extremo de la manguera dentro de la matriz a muestrear. Inserte la manguera en la bomba peristáltica y asegure su cierre. Conecte la bomba a una fuente de poder portátil (12-18 V DC 70 watts o 90-260V AC 47-65Hz). Asegúrese que la dirección del flujo sea correcta, permitiendo el flujo del agua dentro del filtro de diálisis. Inicialmente asegúrese de que la velocidad de la bomba esté en cero. Encienda la bomba y ajuste gradualmente la velocidad del filtrado. Determine la velocidad de flujo utilizando un caudalímetro o en su ausencia, calcule el flujo de agua con ayuda de una probeta y un cronómetro. Calcule el tiempo necesario de muestreo adecuado para muestrear el volumen deseado de muestra. Registre el tiempo de inicio de la filtración y la velocidad de flujo. Se recomienda tomar las lecturas intermedias, ya que la velocidad puede modificarse debido a la saturación del filtro, en ese caso se deberán realizar los cálculos para determinar el volumen de agua muestreado en total. Estimar el volumen total de agua filtrada al multiplicar el tiempo de filtración contra la velocidad de flujo. Mantener registros. Durante la filtración, inspeccione visualmente el caudal de la tubería de efluentes. Cambios drásticos en el caudal indican una saturación del filtro debida a los sólidos en el agua. Detener la bomba o cerrar el paso de agua después del volumen de agua filtrado y registrar el tiempo final de la filtración. Retire todas las mangueras del filtro y coloque sus tapas en todos los puertos, almacene dentro de bolsas de plástico nuevas, coloque dentro de una hielera y envíe inmediatamente al laboratorio para su análisis. No es necesario colocar el filtro en refrigeración para su transporte al laboratorio. Las mangueras antes de los filtros pueden ser desechados después de la colecta de la muestra, las mangueras del filtrado puede ser reutilizada para consecuentes muestreos. Registrar todos los datos obtenidos en la hoja de campo utilizada (figura 3).


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Recuperación de la muestra colectada por Ultrafiltración. (Retro enjuague) Reactivos.

● Preparar una solución de polifosfato de sodio al 10% adicionando 1 g a 10 mL de agua desionizada. ● Preparar la solución emulsionante al 1% de antiespumante Y-30 (Sigma Aldrich A5758), adicionando 100 μL a 9.9

mL de agua desionizada. ● Preparar la solución de enjuague (Tween 80 al 0.5%, polifosfato de sodio 0.01% y 0.001% antiespumante Y-30)

adicionando 2.5mL de Tween 80, 500 μL de solución de polifosfato de sodio al 10% y 500 μL de la solución de antiespumante Y-30 al 1% y complementar con 496.5 mL de agua desionizada.

Para enjuagar el filtro montar el equipo como se muestra en la siguiente figura:


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Figura 4. Instalación de equipo de ultrafiltración para retrolavado. Retirar las tapas de la entrada (puerto final azul y naranja). Conecte una manguera limpia al puerto lateral naranja y asegure con una abrazadera de manguera. Coloque la manguera a través de la bomba peristáltica y lleve el extremo de la tubería dentro de la solución de enjuague para el retrolavado. Mantener el puerto final azul sobre un recipiente de 1 L para capturar la solución de retrolavado. Bombear 500 mL de la solución de enjuague a través del ultrafiltro a 650 mL/min, recolectando la solución de enjuague en un frasco o recipiente estéril. El flujo a través de la bomba debe ser bajo. Enriquecimiento de las muestras En un recipiente estéril de 1.5 L, mezclar 500 mL del agua del retrolavado de la ultrafiltración con 500 mL de APA 2X, dividir la muestra en dos porciones. Incubar la muestras a 35 °C +/- 2 y 42 °C +/- 0.2 °C por toda la noche, continuar con lo indicado en “IV Aislamiento e identificación de V. cholerae”


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IV. Aislamiento e identificación de V. cholerae. Método de referencia. Charles A. Kaysner y Angelo DePaola, Jr., Bacteriological Analytical Manual, Chapter 9, Vibrio, Procedimiento V. cholerae. FDA. USA Mayo 2014. Materiales, medios de cultivo y reactivos

Varilla de vidrio de 3mm de diámetro y 20cm de largo, con un doblez terminal en ángulo recto de 4cm.

Incubadoras de 39-40ºC.

Baño de agua de 42 ± 0,2ºC y 35-37ºC.

Cajas Petri estériles de 15 x 100 mm de plástico.

Pipetas estériles de 1 mL con graduación de 0,01mL, de 5 y 10 mL con graduación de 0,1mL.

Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro de nicromel o platino.

Tubos de cultivo o de ensayo de 16 x 150 mm y 20 x 150 mm.

Tubos para bioquímicas o ensaye de 10 x 75 mm o 13 x 100 mm.

Tijeras y pinzas estériles.

Lámpara (para observar reacciones serológicas).

Mecheros.

Papel pH (rango 1-14) con un máximo de graduación de 0,4 unidades de pH por cambio de color.

Agua Peptonada Alcalina (APA).

Agua Peptonada Alcalina doble concentración (APA 2X)

Agua Peptonada Alcalina deca-concentrado (APA 10x).

Agar Tiosulfato, citrato, Sales Biliares y Sacarosa (TCBS).

Agar T1N1 (Agar triptona y Sal).

Agar Gelatina.

Agar Gelatina con Sal

Medio base de descarboxilasa (Arginina, Lisina y Ornitina).

Caldo triptona y Caldos triptona Sal T1N0, T1N1, T1N3 y T1N6, T1N8 y T1N10 FÓRMULA.

Caldo Soya Tripticasa (CST).

Agar Soya Tripticasa (AST).

Agar de Hierro Kligler (KIA).

Agar Arginina glucosa Inclinado.

Agar Triple Azúcar y Hierro (TSI).

Agar de Hierro y Lisina (LIA).

Solución salina reguladora de fosfatos.

Medio AKI.

Caldo Rojo de Metilo y Voges Proskauer (RM-VP).

Medio para prueba de movilidad (Semisólida).

Agar modificado de celobiosa, Polimixina, B- colistina (mCPC).

Solución salina 0.85% en agua destilada.

Reactivo de desoxicolato de sodio (0.5%) para la prueba del hilo

Prueba de rojo de metilo.

Prueba de Voges-Proskauer.

Prueba de Oxidasa.


Siembra en medios selectivos. Prepare placas con la superficie seca de TCBS (agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa) y mCPC (agar modificado con celobiosa-polimixina B y colistina) o alternativamente CC. Utilizando una asa bacteriológica de 3 mm, transfiera la película de la superficie del APA a la superficie de una placa de TBCS, mCPC o CC y estríe para tener colonias aisladas. Incube las placas a las siguientes condiciones. Tabla 7. Condiciones de incubación de los medios selectivos para el aislamiento de V. cholerae

Medio Temperatura Tiempo

TCBS 33 °C – 37 °C Toda la noche17

mCPC y CC 39 °C - 40 °C18 Toda la noche.

17 La incubación de toda la noche es una definición operativa empleada en microbiología, para permitir que los tiempos de incubación sean compatibles con la operación de los laboratorios, generalmente este tiempo resultaría entre 16 y 18 h, considerando que se inicia la incubación al final de la jornada de trabajo y termina al día siguiente en la primera hora de la jornada laboral (ver instrucción en este manual). 18 Si no está disponible una incubadora a 39 °C - 40 °C, puede incubarse a 33 °C - 37 °C ya que la capacidad selectiva del medio está dada por los antibióticos más que por la temperatura de incubación.


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Selección de colonias típicas. Las colonias típicas en TCBS son grandes (2 a 3 mm de diámetro), suaves, amarillas, ligeramente aplanadas con centros opacos y bordes translúcidos. Las colonias típicas en mCPC y CC son pequeñas, suaves, opacas y de color verde a púrpura con un fondo púrpura cuando se amplía la incubación. Confirmación bioquímica19. Si el crecimiento en las placas es masivo entonces las colonias sospechosas deberán primero aislarse en un medio no selectivo de agar como T1N1, T1N3 o AST 2%. Incube las placas entre 33°C - 37°C, realice la confirmación bioquímica solo con colonias aisladas. Sub-cultivar tres o más colonias típicas de cada medio de cultivo en placas con agar inclinado T1N1 o por picadura en medio de movilidad. Incubar durante la noche a 33 °C - 37 °C. Tabla 8. Procedimiento e interpretación de pruebas bioquímicas.

Prueba Procedimiento Interpretación.

Agar Arginina glucosa Inclinado (AAG)

Inocular cada cultivo sospechoso de T1N1 en AAG, estriando la superficie del medio y picando el fondo. Incubar con la tapa ligeramente abierta durante la noche a 33 °C - 37 ° C.

Los cultivos de V. cholerae y V. mimicus tendrán viran el pico del medio (inclinación) a púrpura (reacción alcalina) y un fondo amarillo (ácido), ya que la arginina no se hidroliza. No se produce gas o H2S.

Tolerancia a la sal.

A partir del cultivo de T1N1, inocular ligeramente un tubo de cada uno de los caldos T1N0 y T1N3. Incubar los tubos durante la noche a 35 °C ± 2 ° C.

Los cultivos de V. cholerae y V. mimicus crecerán sin NaCl.

Prueba del hilo.

Emulsionar una colonia grande de un cultivo de agar T1N1 en una pequeña gota de desoxicolato sódico al 0,5% en dH2O estéril. En 60 segundos, las células se lisan (pérdida de turbidez) y las cadenas de ADN cuando se levantan con un asa crean un hilo de hasta 2 a 3 cm.

Todas las cepas de V. cholerae son positivas.

Oxidasa Utilizando un asa de platino (no se debe usar alambre de nicromel) o asa desechable, transferir una colonia fresca, a un papel de filtro saturado con reactivo oxidasa (1% de N, N, N, N'-tetrametil-p-fenilendiamina.2HCl). Alternativamente, agregue una gota de reactivo al crecimiento en un T1N1 inclinado o placa de agar.

Un color morado oscuro que se desarrolla en 10 segundos indica un crecimiento de prueba positivo. V. cholerae y V. mimicus son oxidasa positivos.

19 Según la FDA la identificación con bioquímicas miniaturizadas como API 20 E ha demostrado ser adecuada.


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Confirmación serológica. Las colonias sospechosas se someten a la prueba de aglutinación con antisuero polivalente O1. Los aislamientos que no aglutinan con el antisuero polivalente al serogrupo O1 se probarán con el antisuero O139, si la reacción con el antisuero O1 o O139 es positiva, se identificará como presuntiva V. cholerae O1 u O139. Posteriormente el V. cholerae O1 positivo se someterá a confirmación mediante aglutinación con antisueros monovalentes Ogawa o Inaba. Una reacción positiva con cualquiera de los antisueros Ogawa o Inaba es suficiente para confirmar la identificación de un aislamiento de V. cholerae O1, con frecuencia las cepas de un serotipo producen una aglutinación lenta o débil con el antisuero de otro serotipo. Por tanto se deben analizar paralelamente las reacciones de aglutinación con ambos antisueros de Inaba y Ogawa; debiendo usarse la reacción más fuerte y más rápida para la identificación del serotipo. Las pruebas de aglutinación para V. cholerae pueden realizarse en una placa de Petri o en un portaobjetos limpio: Para cada cultivo dividir el portaobjetos en tres secciones, en la parte inferior de cada sección colocar una gota de solución salina 0.85%, con un asa estéril o un aplicador transferir una porción de una colonia aislada en T1N1, y mezcle completamente con la gota de solución salina fisiológica. A la primera sección agregue una gota del antisuero polivalente O1 y mezcle con la suspensión. A la tercera sección agregue una gota del antisuero O139 y mezcle con la suspensión. Incline el portaobjetos hacia atrás y hacia adelante por 1 min y observe bajo una luz brillante y sobre un fondo negro. Si la reacción es positiva se observa un precipitado. Inspeccione la suspensión de la sección 2 cuidadosamente para asegurarse de su uniformidad y de que no muestra grumos resultantes por auto aglutinación; si esta aparece, el cultivo se caracteriza como “rugoso” y no podrá ser serotipificado.


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Informe de resultados.

Cuando se realice la identificación serológica reportar el serotipo encontrado. Tabla 9. Interpretación.

Cre

cim

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o en

TC

BS

.

Con

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ació

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Bio

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Agl

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Agl

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SS

0.85

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Tox

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posi

tiva

Informe

Si Si Si nr nr No Si V. cholerae O1 enterotoxigenico Presencia en: ver tabla 10

Si Si Si Si No No Si V. cholerae O1 Ogawa enterotoxigenico Presencia en: ver tabla 10

Si Si Si No Si No Si V. cholerae O1 Inaba enterotoxigenico Presencia en: ver tabla 10

Si Si Si Si Si No Si V. cholerae O1 Hikojima enterotoxigenico Presencia en: ver tabla 10

Si Si Si nr nr No No V. cholerae O1 no enterotoxigenico Presencia en: ver tabla 10

Si Si Si Si No No No V. cholerae O1 Ogawa no enterotoxigenico Presencia en ver tabla 10

Si Si Si No Si No No V. cholerae O1 Inaba no enterotoxigenico Presencia en: ver tabla 10

Si Si Si Si Si No No V. cholerae O1 Hikojima no enterotoxigenico Presencia: en ver tabla 10

Si Si No nr nr Si No Si V. cholerae O139 enterotoxigenico Presencia en: ver tabla 10

Si Si No nr nr Si No No V. cholerae O139 no enterotoxigenico Presencia en: ver tabla 10

Si Si No No No V. cholerae no O1/ no O139 Presencia en: ver tabla 10

Si Si Si Si Si Si V. cholerae cepa auto-aglutínate enterotoxigenica en: ver tabla 10

Si Si Si Si Si no V. cholerae cepa auto-aglutinante no enterotoxigenica en: ver tabla 10

Si No No No No V. cholerae Ausencia en: ver tabla 10

No o At

V. cholerae Ausencia en: ver tabla 10

Sí = prueba positiva No = prueba negativa nr = prueba no realizada. At=colonias atípicas

Tabla 10. Criterios para el reporte de resultados por tipo de matriz analizada.

Matriz Reporte de resultado.

Alimentos y superficies Reportar como presencia o ausencia de V. cholerae en la cantidad de masa, pieza o superficie analizada.

Agua y hielo para uso y consumo humano

Reportar como presencia o ausencia de V. cholerae en el volumen o masa analizado.

Hisopo de Moore Reportar como presencia o ausencia de V. cholerae en un hisopo de Moore expuesto “determinado tiempo”.

Hispo de Spira Reportar como presencia o ausencia de V. cholerae en un hisopo de Spira expuesto “determinado tiempo” o filtrando “determinado volumen”.

Ultrafiltración Reportar como presencia o ausencia de V. cholerae por ultrafiltración de “determinado volumen filtrado”.


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Anexo A. Medios de cultivo. Tabla.11.Composición y preparación de los medios de cultivo.

Medio de cultivo Formula tipica Preparación.

Agua Peptonada Alcalina (APA).

Peptona 10 g, cloruro de sodio 10 g, Agua destilada 1000 mL

Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que después de esterilizar éste sea de 8.5± 0.2. Esterilizar en autoclave 10 minutos a 121 °C.

Agua Peptonada Alcalina doble concentración (APA 2X)

Peptona 10.0 g, cloruro de sodio (NaCl) 10.0 g, Agua destilada 500 mL

Mezclar 10 g de peptona y 10g de NaCl en un frasco de 1L. Adicione 500mL de agua destilada y mezcle hasta disolver. Ajuste pH a 8.5 usando NaOH. Esterilice en autoclave a 121 °C / 15 lb / 20 min. Almacene en refrigeración a 4°C.

Agua Peptonada Alcalina deca-concentrado (APA 10x).

Peptona 100 g, cloruro de sodio 100 g, Agua destilada 1000 mL

Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que después de esterilizar éste sea de 8.5± 0.2. Esterilizar en autoclave 121 °C / 15 lb /15 min.

Agar Tiosulfato, citrato, Sales Biliares y Sacarosa (TCBS).

Extracto de levadura 5 g, Proteosa peptona 10 g, Sacarosa 20 g, Tiosulfato de sodio.5H2O 10 g, citrato de sodio.2H2O 10 g, Colato de sodio (sales biliares) 3 g, Bilis de buey (Oxgall) 5 g, citrato férrico 1 g, Azul de bromotimol 0.04 g, Azul de timol 0.04 g, Agar 15 g, Agua destilada 1000 mL.

Preparar en un matraz por lo menos tres veces más grande que el volumen requerido de medio. Adicionar los ingredientes en agua destilada tibia y calentar con agitación constante hasta ebullición e inmediatamente retirar del calor. No esterilizar. Enfriar a 50°C y colocar en cajas de Petri. Dejar secar las placas de 37-45°C antes de usar.

Agar T1N1 (Agar triptona y Sal).

Triptona o tripticasa 10 g, cloruro de sodio 10 g, Agar 20 g, Agua destilada 1000 mL.

Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución del agar, si lo desea inclinado, distribuya en tubos. Esterilice en autoclave 15 minutos a 121 °C. Deje solidificar los tubos inclinados, para placas enfríe el medio de 45-50°C y distribuya en cajas Petri estériles.

Agar Gelatina. Peptona 4 g, Extracto de levadura 1 g, Gelatina 15 g, Agar 15 g, Agua destilada 1000 mL.

Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolución de la gelatina y el agar, ajuste el pH a 7.2 ± 0.2. Esterilice en autoclave 15 minutos a 121 °C. Enfríe de 45-50°C y distribuya en cajas Petri estériles.

Agar Gelatina con Sal Peptona 4 g, Extracto de levadura 1 g, Gelatina 15 g, Agar 15 g, cloruro de sodio 30g, Agua destilada 1 000 mL

Preparar agar gelatina, pero adicionando 30 g de NaCl/L. Suspenda los ingredientes y hierva hasta disolver la gelatina y el agar. Ajuste el pH de 7.2 ± 0.2. Esterilice en autoclave 15 minutos a 121 °C. Enfríe de 45-50°C, y coloque en cajas Petri. Si es necesario para inhibir la diseminación de Vibrio spp., tal como V. alginolyticus, use de 25-30 g de agar /L.

Medio base de descarboxilasa (Arginina, Lisina y Ornitina).

Peptona 5 g, Extracto de levadura 3 g, Dextrosa (D-glucosa) 1 g, Púrpura de Bromocresol 0.02 g, Agua destilada 1000 mL.

Para caldo de arginina, lisina y ornitina, adicione 5 g de L-aminoácido a 1 L de base. Como control, use base sin suplemento (aminoácido). Para Vibrio spp. Halofílicos, adicionar 15 g NaCl / L. Ajuste el pH de tal manera que después de la esterilización sea de 6.5 ± 0.2. Distribuya en tubos y esterilice en autoclave 10 minutos a 121 °C.


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Caldo triptona y Caldos triptona Sal T1N0, T1N1, T1N3 y T1N6, T1N8 y T1N10 FÓRMULA.

Triptona o tripticasa 10 g, cloruro de sodio 0, 10, 30, 60,80, o 100 g, agua destilada 1000 mL.

Disuelva los ingredientes en agua destilada, para T1N0 no agregue NaCl, para T1N1 use 10 g de NaCl (1% w/v concentración de cloruro de sodio); así respectivamente. Para T1N3 usar 30 g de NaCl por litro (3% p/v concentración de cloruro de sodio). Ajuste el pH a 7.2 ± 0.2. Distribuya en tubos de tapón de rosca de 16 x 150 mm, tape los tubos. Esterilice en autoclave a 121 °C / 15 lb / 15 min.

Caldo Soya Tripticasa (CST).

Peptona de tripticasa (triptona) 17 g, peptona de fitona (Soytona) 3 g, cloruro de sodio 5 g, Fosfato dipotásico 2.5 g, dextrosa 2.5 g, agua destilada 1000 mL.

Suspenda los ingredientes en agua destilada y caliente hasta disolución. Distribuya 225 mL en matraces de 500 mL o tubos. Esterilice en autoclave a 121 °C / 15 lb / 15 min. El pH final debe ser de 7.2 ± 0.2.

Agar Soya Tripticasa (AST).

Peptona de tripticasa (triptona) 15 g, peptona de fitona (Soytona) 5 g, cloruro de sodio 5 g, agar 15 g, agua destilada 1000 mL.

Suspenda los ingredientes en agua destilada y hierva durante un minuto hasta disolución del agar. Para Vibrio spp halofílicos, agregar 15 g de NaCl. Distribuya dentro de tubos o matraces. Esterilice en autoclave a 121 °C / 15 lb / 15 min. Deje solidificar los tubos inclinados o deje enfriar de 45-50°C y distribuya en cajas Petri. El pH final debe ser de 7.3 ± 0.2.

Agar de Hierro Kligler (KIA).

Peptona polipeptona 20 g, lactosa 20 g, dextrosa 1 g, cloruro de sodio 5 g, citrato férrico amoniacal 0.5 g, tiosulfato de sodio 0.5 g, rojo de fenol 0.025 g, agar 15.0 g, agua destilada 1000 mL.

Suspender los ingredientes y hervir hasta disolución del agar. Distribuir en tubos de tapón de rosca. Esterilizar en autoclave a 121 °C / 15 lb / 15 min. Deja solidificar los tubos inclinados. Ajustar el pH de 7.4 ± 0.2.

Agar Arginina glucosa Inclinado.

Peptona 5 g, extracto de levadura 3 g, triptona 10 g, cloruro de sodio 20 g, glucosa 1 g, L-arginina (hidrocloruro) 5 g, citrato férrico amónico 0.5 g, tiosulfato de sodio 0.3 g, púrpura de bromocresol 0.2 g, agar 13.5 g, agua destilada 1000 mL.

Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir hasta disolución del agar, y distribuir en cantidades de 5 mL a tubos de 13 x 100 mm. Ajustar el pH de 6.8 a 7.0. Esterilizar en autoclave a 121 °C / 15 lb / 10-15 min y deje solidificar el medio inclinado.

Agar Triple Azúcar y Hierro (TSI).

Polipeptona 20 g, cloruro de sodio 5 g, Lactosa 10 g, Sacarosa 10 g, glucosa 1 g, Sulfato ferroso amónico 0.2 g, Tiosulfato de Sodio 0.2 g, Rojo de fenol 0.025 g, Agar 13 g, Agua destilada 1 000 mL.

Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullición, agitando ocasionalmente hasta completa disolución, enfriar a 60°C y ajuste el pH de 7.3 ± 0.1.

Agar de Hierro y Lisina (LIA).

Peptona 5.0 g, extracto de levadura 3.0 g, glucosa 1.0 g, L-lisina 10.0 g, citrato férrico amónico 0.5 g, tiosulfato de sodio 0.04 g, púrpura de bromocresol 0.02 g, agar 15.0 g, agua destilada 1000 g

Disolver los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien; calentar hasta ebullición con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa. Esterilizar en autoclave a 121 °C / 15 lb / 12 min. Enfriar de 50-60°C y ajustar el pH de 6.7 ± 0.1. Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se enfrían en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada de 2 cm.


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Solución salina reguladora de fosfatos.

Cloruro de sodio 7.65 g, fosfato de sodio dibásico 0.724 g, Fosfato monobásico de potasio 0.21 g, agua destilada 1000 mL.

Disolver todos los ingredientes en agua destilada. Ajustar el pH a 7.4 con NaOH y esterilice en autoclave a 121 °C/ 15 lb / 15 min.

Medio AKI. Peptona 15 g, extracto de levadura 4 g, cloruro de sodio 5 g, agua destilada 970 mL, bicarbonato de sodio al 10% esterilizado por filtración 30 mL.

Disuelva la peptona, extracto de levadura y el cloruro de sodio en agua destilada. Esterilizar a 121 °C / 15 lb / 15 min. Enfríe y adicione 30 mL de bicarbonato de sodio al 10% recién preparado y filtrado y mezcle. pH final 7.4. Deposite en condiciones asépticas en tubos con tapón de rosca (15 mL de 16 x 125 mm).

Caldo Rojo de Metilo y Voges Proskauer (RM-VP).

Peptona 7 g, glucosa 5 g, fosfato dipotásico 5 g, 15 g de Cloruro de sodio, agua destilada 1000 mL.

Disolver los ingredientes en 800 mL de agua tibia. Filtrar, enfriar a 20 °C y diluir a 1 L. Distribuya en tubos. Esterilizar en autoclaves a 121 °C / 15 lb / 12 - 15 min. Ajustar el pH de 6.9 ± 0,2.

Medio para prueba de movilidad (Semisólida).

Peptona 10 g, extracto de carne 3 g, cloruro de sodio 20 g, agar 4 g, agua destilada 1000 mL

Disolver los ingredientes mediante calentamiento con agitación y hervir de 1 a 2 minutos hasta disolución del agar. Distribuir en tubos con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave a 121 °C / 15 lb / 15 min. Ajustar el pH de 7.4 ± 0,2.

Agar modificado de celobiosa, Polimixina, B- colistina (mCPC).

Solución 1 Peptona 10 g, extracto de carne 5 g, cloruro de sodio 20 g, solución de colorantes 1000x 1 mL, agar 15 g, agua destilada 900 mL.

Disolver los ingredientes mediante ebullición hasta su completa disolución. Ajustar el pH a 7,6. Esterilizar por autoclave a 121 °C /15 lb / 15 min. Enfríe de 48-55 °C. Nota: Este medio debe ser almacenado por 2 semanas en refrigeración.

Solución de colorantes 1000x: Azul de bromotimol 4 g, rojo de cresol 4 g, Etanol al 95% 100 mL.

Para obtener un color firme del medio usar una solución colorante stock en lugar de estar pesando repetidamente los colores en polvo. Disuelva el colorante en etanol hasta obtener una solución al 4% (p/v). Agregue 1 mL de esta solución a cada litro de agar mCPC, la cual tendrá al final 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo cresol / L.

Solución 2. Celobiosa 10 g, Colistina 400 000 Ul, Polimixina B 100 000 UI, agua destilada 100 mL.

Disuelva la celobiosa por calentamiento en agua destilada. Enfríe y agregue los antibióticos. Esterilice por filtración, agregue la solución 2 a la solución 1 mezcle y distribuya en cajas Petri.

Solución salina 0.85% en agua destilada.

Cloruro de sodio 8.5g, agua 1L

Disolver 8.5 g de cloruro de sodio en agua y esterilizar a 121 °C / 15 lb / 15 min. Enfríe a temperatura ambiente.


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Reactivo de desoxicolato de sodio (0.5%) para la prueba del hilo.

Desoxicolato de sodio 5 g, Agua destilada estéril 1000 mL.

Añada el agua destilada estéril al desoxicolato de sodio y mezcle perfectamente, y guarde a temperatura ambiente esta puede ser útil hasta por 6 meses. Control de calidad: Antes de utilizar cada nuevo lote de desoxicolato de sodio, debe hacerse un control de calidad.

● Use una cepa de V. cholerae O1 como un control positivo.

● E. coli puede utilizarse como un control negativo.


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Anexo B. Pruebas Bioquímicas. Tabla 12. Pruebas bioquímicas.

Prueba bioquímica Formulación. Preparación e interpretación.

Prueba de rojo de metilo.

Rojo de metilo 0.1 g, alcohol etílico 300 mL, agua destilada 200 mL.

Disolver el rojo de metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada, para llevar a cabo la prueba, añadir 5 gotas de la solución a 5 mL del cultivo problema. Resultado: Un color rojo demuestra un pH menor a 4.5 y la prueba es (+). Un color amarillo se reporta como prueba negativa.

Prueba de Voges-Proskauer.

Alfa naftol 5 g, alcohol etílico absoluto 100 mL.

Añadir 0.6 mL de la solución de alfa naftol y 0.2 mL de una solución acuosa al 40% de hidróxido de potasio a 1 mL de cultivo. Resultado: El desarrollo de una coloración roja en 15 minutos constituye una reacción positiva.

Prueba de Oxidasa.

N,N,N,N-tetrametil-p-fenilendiamino 1.0 g, agua destilada 100 mL.

Conservar en frasco oscuro a 5-10 °C. El reactivo se conserva durante 7 d. Sembrar en un tubo de base de gelosa para sangre. Incubar 18 h a 35 °C. Agregar 0.3 mL de reactivo. Resultado: La reacción positiva se observa por la producción de un color azul en un minuto.


Desoxicolato de sodio 5 g, Agua destilada estéril 1000 mL.

Añada el agua destilada estéril al desoxicolato de sodio y mezcle perfectamente, y guarde a temperatura ambiente esta puede ser útil hasta por 6 meses. Control de calidad: Antes de utilizar cada nuevo lote de desoxicolato de sodio, debe hacerse un control de calidad.

● Use una cepa de V. cholerae O1 como un control positivo.

● E. coli puede utilizarse como un control negativo.


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Anexo C. Diagrama de flujo. Diagrama 1.


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Diagrama 1 continuación


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Anexo D. Característica bioquímicas comunes. TABLA 13. Características bioquímicas de Vibrionaceae patógenos comunes a humanos encontrados en productos marinos20.

V. alginolyticus V. cholerae V. fluvialis V. furnissii V. hollisae V. metschnikovii V. mimicus V. parahaemolyticus V. vulnificus A. hydrophilia** P. shigelloides**

Agar TCBS A A A A SD A V V V A V

Agar mCPC SD P SD SD SD SD SD SD A SD SD

Agar CC SD P SD SD SD SD SD SD A SD SD

AGS K/A K/a K/K K/K K/a K/K K/A K/A K/A K/K nd

Oxidasa + + + + + - + + + + +

Arginina dihidrolasa - - + + - + - - - + +

Ornithina descarboxilasa + + - - - - + + + - +

Lisina descarboxilasa + + - - - + + + + V +

Crecimiento en: 0% NaCl - + - - - - + - - + +

3% NaCl + + + + + + + + + + +

6% NaCl + - + + + + - + + + -

8% NaCl + - V + - V - + - - -

10% NaCl + - - - - - - - - - -

Crecimiento a 42°C + + V - nd V + + + V +

Ácido de:

Sacarosa + + + + - + - - - V -

D-Cellobiosa - - + - - - - V + + -

Lactosa - - - - - - - - + V -

Arabinosa - - + + + - - + - V -

D-Manosa + + + + + + + + + V -

D-Manitol + + + + - + + + V + -

ONPG - + + + - + + - + + -

Voges-Proskauer + V - - - + - - - + -

Sensibilidad a: 10 µg O/129 R S R R nd S S R S R S

150 µg O/129 S S S S nd S S S S R S

Gelatinase + + + + - + + + + + -

Urease - - - - - - - V - - -

Abreviaturas: TCBS = thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose; agar mCPC = modified cellobiose-polymyxin B-colistin; AGS= agar arginina glucosa inclinado; A = Amarillo SD = sin o pobre desarrollo S = susceptible nd = no determinado V = verde V = variable entre cepas R = resistente P = púrpura V = variable K/K = estría alcalina/picadura alcalina K/A = estría alcalina/picadura ácida K/A = estría alcalina/picadura ligeramente ácido.

20 Adaptado de Elliot et al. (29)


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Bibliografía.

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