Manual Microbiologia FINAL

Instituto Tecnolgico de Mrida Manual de Prcticas de Microbiologia 2009

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I. Objetivo general del manual

Proporcionar al alumno las tcnicas y entrenamiento para adquirir la capacidad para

el manejo y control de los microorganismos, que permita su uso en procesos

sustentables.


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II. Nmero, Nombre y Objetivos especficos de cada prctica

Prctica 1. Clasificacin, preparacin, esterilizacin y manejo del material utilizando

en el laboratorio.

Diferenciar y aplicar los mtodos de esterilizacin adecuada para los diferentes

materiales, usando los diferentes equipos del laboratorio.

Prctica 2. Diferenciacin. Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo.

Aplicar la metodologa de preparacin y esterilizacin de diferentes medios de

cultivo.

Prctica 3. Determinacin de los parmetros de letalidad trmica: valores D-Z.

Aplicar las tcnicas para determinar los valores de D y Z de los microorganismos.

Prctica 4. Obtencin de cultivos puros, utilizando las diversas tcnicas de

aislamiento.

Aplicar las tcnicas de varilla acodada y estra cruzada para la purificacin de

cultivos bacterianos.

Prctica 5. Observacin colonial y microscpica de cultivos bacterianos.

Obtendr cultivos bacterianos puros y describir su morfologa colonial y aplicar las

tcnicas de tincin para su observacin de la morfologa microscpica.


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Prctica 6. Aplicacin de los mtodos de preservacin de microorganismos y diseo

de un cepario.

Aplicar diferentes tcnicas para la conservacin de cepas microbianas.

Prctica 7. Cultivos de microorganismos en anaerobiosis.

Aplicar las tcnicas de cultivos anaerobios.

Prctica 8. Identificacin de bioqumica de enterobacterias.

Aplicar las tcnicas y medios de cultivo para la identificacin a travs de pruebas

bioqumicas del grupo de enterobacterias.

Prctica 9. Aislamiento, cultivo y observacin colonial y microscpica de hongos

filamentosos y levaduriformes.

Aplicar las tcnicas de aislamiento y purificacin de hongos y levaduras para su

observacin de la morfologa colonial y tinciones para la observacin de su

morfologa microscpica.

Prctica 10. Produccin de cidos orgnicos por hongos.

Aplicar tcnicas de cultivo sumergido para la produccin de cidos orgnicos y

evaluar su rendimiento.

Prctica 11. Pruebas de identificacin para levaduras.

Aplicar las tcnicas de observacin microscpica y pruebas bioqumicas para la

identificacin de levaduras.


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Prctica 12. Recuento en placa.

Aplicar las tcnicas de diluciones decimales y tcnicas de cultivo para el recuento

en placa.

Prctica 13. Tcnica del nmero ms probable (NMP).

Aplicar la tcnica del nmero ms probable (NMP), y evaluar con sus resultados

aplicando las tablas aceptadas por la NOM.

Prctica 14. Curva de crecimiento poblacional en cultivo sumergido.

Aplicar tcnicas de cultivo sumergido y conteo microbiano, durante el desarrollo

poblacional para observar el modelo de crecimiento.

Prctica 15. Efecto de los agentes fsicos y qumicos sobre el crecimiento

microbiano.

Probar el efecto de diferentes agentes fsicos y agentes qumicos a diferentes

grupos microbianos, evaluar el efecto de los agentes sobre el crecimiento

microbiano.

Prctica 16. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).

Utilizar la tcnica de PCR para la amplificacin de molculas de ADN, y evaluar el

resultado de la amplificacin.


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III. Prcticas de Microbiologa

Prctica 1. Clasificacin, preparacin, esterilizacin y manejo del

material utilizado en el laboratorio.

1. OBJETIVO

Diferenciar y aplicar los mtodos de esterilizacin adecuada para los diversos

materiales, usando los equipos del laboratorio.

2. INTRODUCCION

El conocimiento de las reas, materiales, equipos, as como el entrenamiento del uso

de los mismos en un laboratorio de microbiologa permite aplicarlos en cualquier

mbito de trabajo como son el industrial, alimentario, ambiental, investigacin, etc.

Los procesos que permiten el manejo seguro de reas libres de microorganismos y

poder transferir microorganismos ubicados de un ambiente natural a condiciones

controlables de un ambiente artificial, sin contaminacin ha permitido el avance de la

microbiologa como ciencia.

La esterilizacin es un mtodo de eliminacin total de todo tipo de organismos y que

asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras que la

desinfeccin es un proceso que solo elimina formas vegetativas de los

microorganismos, los procedimientos que impiden la llegada de microorganismos a

un medio dejndolo libre de contaminacin o asepsia permite manipularlos.

Los procedimientos de mayor utilizacin en los laboratorios de microbiologa para la

esterilizacin son los mtodos de calor seco, calor hmedo y filtracin. La

esterilizacin por calor seco produce la destruccin de los microorganismos por

oxidacin de sus componentes celulares. ste es un proceso menos eficiente que la

esterilizacin por calor hmedo, porque los microorganismos mueren con mayor


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rapidez cuando se encuentran en presencia de agua, ya que ste permite que se

altere con mayor facilidad la configuracin de sus protenas y proporciona un medio

para distribuir el calor uniformemente en toda la cmara interna del equipo de

esterilizacin. Por esta razn, para lograr la esterilizacin del material empleando el

calor seco, se deben aplicar temperaturas ms altas durante mayor tiempo, como

son desde 150 a 180C, en un horno durante 2 horas.

Para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos, el ms

recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presin de 1

atmosfera, para alcanzar la temperatura de 121C, el material se deja a esta

temperatura por 15 minutos para asegurarse de la destruccin de endosporas, que

son las estructuras bacterianas ms resistentes al calor.

Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor como las

soluciones de vitaminas, aminocidos, etc., se esterilizan por filtracin de

membranas estriles de 0.2 micras de dimetro y para el caso de materiales de

plstico es recomendable el uso de gases con oxido de etileno o con radiaciones

gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones u.v o

compuestos qumicos en forma lquida como: fenoles, compuestos cuaternarios de

amonio (alquil dimetil bencilamonio), formaldehdo, alcoholes, halgenos y

detergentes.

3. CORRELACION CON EL PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA (ING.

BIOQUIMICA BQO-0525)

Tema. Mtodos y tcnicas microbiolgicas bsicas.

Subtema. Esterilizacin y asepsia.

El manejo de las reas estriles en forma asptica para la aplicacin de tcnicas

microbiolgicas demanda que el material y los medios de cultivo empleados estn

estriles, esto se logra con la seleccin y aplicacin de la tcnica de esterilizacin

como son: esterilizacin con calor seco, con calor hmedo, filtracin, etc.


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4. MATERIAL Y EQUIPO

Descripcin del material Cantidad Equipo

Tubos de ensaye de 18 x 150 mm 10 Autoclave

Cajas de petri 10 Estufa incubadora

Pipetas de 1 ml 10 Horno

Pipeta de 10 ml 1 Mechero Fisher

Probeta de 50 100 ml 1 Campana de flujo laminar

Matraz Erlenmeyer de 250 ml 1


Vaso de precipitados de 250 ml 1

Pinza de diseccin de acero inoxidable

de 18 cm

1

Gradilla 1

Tijera

Algodn, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva y cinta testigo.

5. METODOLOGIA

Preparacin del material de vidrio

1.-Lavar perfectamente las cajas de petri, pipetas con escobilln y detergente.

2.- Enjuagar con abundante agua corriente.

3.-Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una

pizeta, por las paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel

de envoltura. No debe secar el material por ningn otro medio.


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4.-Una vez seco el material, se proceder a envolver las cajas de petri y pipetas con

papel estraza. Para los tubos y matraces se elaboraran tapones de algodn y gasa

procurando que ajuste con holgura, sobre los que finalmente se les colocara un gorro

de papel.

Elaboracin de gorros

Para tener una base para la elaboracin de gorros, se toma como medida,

aproximadamente, el tamao carta; es adecuada para el gorro de un matraz de

500ml.

1.-Se corta papel dextrasa en forma de rectngulo, del tamao segn se necesita.

2.-Se dobla el papel a la mitad con respecto a la parte larga del mismo.

3.- se doblan las puntas superiores, unindolas en el centro.

4.-De la parte inferior se dobla hacia arriba al borde de la hoja que queda encima,

hasta la altura de las puntas unidas en el paso tres.

5.-Se le da la media vuelta al papel.

6.-Se doblan las puntas de los lados, hasta la altura de donde sobresale el doblez

del paso nmero cuatro.

7.-De la parte interior se dobla hacia arriba, el borde interior sobresaliente de la hoja

hasta el doblez anterior.

8.- Se le da la media vuelta al pape obtenindose de esta manera el gorro.

Elaboracin de tapones de algodn

En la elaboracin de tapones de algodn, como en el caso de los gorros es

importante tener idea del tamao del algodn a utilizar para obtener un tapn

adecuado a las necesidades requeridas.

Estos tapones son utilizados en los diferentes tamaos de tubos y matraces.


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Una base para la elaboracin: con una tira de algodn de 15-20cm de largo, 3cm de

ancho y un grosor de 0.5 cm, y con una gasa de 10x10cm, se obtiene un tapn

adecuado para un matraz de 500ml.

1.- Se corta una tira de algodn, de largo adecuado a las necesidades.

2.-Con una pinza de diseccin se prensa uno de los extremos del algodn.

3.-Se enrolla el algodn en la pinza de manera que quede firme el enrollado.

4.-Seguidamente se corta el cuadro de gasa adecuado a tamao requerido y se

coloca en la boca del matraz, procurando centrarlo.

5.- Con la pinza y el algodn enrollado en ella, la gasa se presiona hasta adentro del

matraz, de manera que entre uniformemente por todos lados a la boca de este,

dejando a flote la punta superior del algodn. La pinza es sacada del algodn dando

una vuelta en sentido contrario al enrollado para a que afloje, y jalando hacia arriba

presionando el algodn, con la mano, para que no salga de la boca del matraz.

6.-Hasta este paso deben quedar las cuatro puntas de la gasa colgando de los lados

de la boca del, matraz: dos de las puntas que se encuentran opuestamente, se

amarran entre si formando un lazo.

7.-Luego se amarran las otras dos puntas restantes, obtenindose de este modo el

tapn de algodn.

Cuando se esterilizan los matraces o tubos, estos deben contener lquido, para evitar

que se deterioren por resecamiento del vidrio al calentarse a temperaturas muy

elevadas.

Si se utilizan tubos con tapas de rosca, cuando se esterilizan lquidos, estos debern

estar solo semicerrados.

Preparacin y envoltura de pipetas

La preparacin de las pipetas para su esterilizacin es muy sencilla, se lavan

perfectamente con agua y jabn y se secan por 1 minuto en la estufa a 100C.


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Con un clip se le introduce en la boquilla de succin un filtro de algodn, de tal forma

que el algodn entre suavemente y sin romperse sin la presin de la punta del clip,

este tapn tiene una doble funcin; una es para evitar que en un descuido de succin

forzosa, por obstruccin de la pipeta, se ingiera el producto succionado al des

taparse bruscamente; y la segunda razn es para evitar que por la boquilla de

succin entren microorganismos que alteren los resultados del trabajo realizado.

1.-Se corta una tira de papel aproximadamente 5 cm de ancho y 30cm de largo.

2.-Se doble el extremo interior de aproximadamente 2cm.

3.- Se coloca la pipeta con la punta a la mitad del doblez anterior, y con un ngulo de

aproximadamente 20-30 grados de inclinacin con respecto a la posicin del papel

estraza.

4.-Se hace un segundo doblez, tapando la punta de la pipeta con la porcin del

papel que sobresale a la punta de la pipeta.

5.- Se le hace un tercer doblez a la punta del papel que queda en el ngulo de

inclinacin, de manera que cubra completamente la punta de la pipeta.

6.- Se da vuelta a la pipeta procurando que el papel vaya envolvindola en forma de

espiral, hasta cubrirla por completo y doblar el papel sobrante dejando este paralelo

a la pipeta.

7.-Verificar que el enrollado no quede flojo, en caso de estarlo, reafirmar el papel con

respecto a la forma de la pipeta.

8.-Cubrir con cinta adhesiva el ltimo doblez.

Preparacin y envoltura de cajas de petri

Al utilizar cajas petri en los cultivos microbianos tienen que ser esterilizados para

poder vaciar dichos medios de cultivo que servirn de nutriente a los

microorganismos tratados. Estas cajas se pueden esterilizar por calor hmedo o


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calor seco, siendo ms recomendable el calor seco, por ser ms confiable su

efectividad.

Es necesario envolver las cajas petri antes de esterilizarlas para evitar que al trmino

de la esterilizacin estn expuestas al medio ambiente y se contaminen de nuevo.

Para esterilizarlas se puede utilizar un recipiente cilndrico de metal o envolvindola

en papel estraza.

1.- Se corta papel estraza del tamao adecuado para el nmero de cajas que se

desee envolver y se colocan las cajas en el centro del papel.

2.-Los bordes de los costados se unen al centro cubriendo las cajas que se

envuelven.

3.-En la parte superior se unen los bordes de ambos lados y esta unin se dobla a la

mitad, creando una cierre plegado.

4.-Al papel se le presiona a los costados quedando al relieve el volumen de las cajas

envueltas en el papel.

5.-Se doblan las puntas del papel de cada una de las esquinas del centro.

6.-Las puntas salientes del papel en los lados de las cajas se doblan hacia arriba y al

centro de las cajas y se les asegura con cinta adhesiva.

Esterilizacin por aire caliente

La esterilizacin por calor seco se puede realizar por varios mtodos:

Aire caliente

Flama directa

Incineracin

Aire caliente.- El aire caliente es uno de los mtodos de esterilizacin por calor seco

ms utilizados. Este proceso se lleva a cabo en hornos especiales que permiten la

distribucin uniforme del calor en su interior, donde el material se expone a

temperaturas de aproximadamente 170C durante 2 horas. El tiempo de


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esterilizacin se debe determinar para cada tipo de material, por ejemplo en el caso

de materiales muy resistentes al calor, se pueden usar temperaturas ms altas por

tiempos ms cortos. Entre las ventajas de este mtodo de esterilizacin estn que no

deja residuos, y es un mtodo rpido y econmico. Adems permite la esterilizacin

de materiales no miscibles con el agua como es el caso de polvos, aceites y grasas.

Su principal desventaja es que slo debe emplearse para esterilizar materiales

termoestables. Para controlar este proceso de esterilizacin se utilizan indicadores

fsicos tales como los termmetros, los cuales permiten medir la uniformidad de la

temperatura de la cmara interna del horno, indicadores qumicos como las cintas

testigo.

El material de vidrio moderno permite la carga y descarga en caliente sin que se

rompa, pero hay siempre un ligero riesgo de que el aire no estril puede ser

succionado hasta el interior de las cajas petri no envueltas mientras se enfran.

Cuando se cargan debe dejarse espacio entre cada artculo, puesto que la carga

excesiva impide la circulacin de aire y determina puntos calientes y fros.

La esterilizacin por aire caliente se utiliza principalmente para el material de vidrio

como son: Cajas petri, tubos de ensaye, pipetas, sin lquidos en su interior, material

de vidrio, instrumentos quirrgicos, material y utensilios de metal.

Flama directa.- Consiste en colocar el material directamente al fuego hasta que ste

se ponga al rojo vivo. De esta forma se queman los contaminantes hasta reducirlos a

cenizas. Su eficacia depende de la calidad de la llama. Es un procedimiento muy

sencillo que se realiza de rutina en los laboratorios de microbiologa para esterilizar el

asa o el filamento con la llama del mechero. Cuando se realiza este procedimiento se

debe evitar la formacin de aerosoles (pequeas gotas liberadas al aire) que podran

contaminar el ambiente.

6. SUGERENCIAS DIDACTICAS

1. Fomentar la investigacin a travs de observar el efecto de las condiciones de

asepsia y su relacin con el control de contaminacin microbiana en el


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laboratorio y generar criterios de seleccin de los mtodos ms adecuado para

los distintos tipos de materiales que se manejen en el laboratorio.

2. Vincular los resultados obtenidos mediante experimentos de esterilizacin de

diferentes materiales y medios de cultivo en el laboratorio con los conocimientos

tericos y su experiencia con el entorno a travs de la discusin en grupo.

7. REPORTE DEL ALUMNO

1. Escribir las diferencias entre esterilizacin y asepsia.

2. Escriba la finalidad de manejar un rea estril si el material a usar y los medios

fueron esterilizados previamente.

3. Describa a travs de una tabla los siguientes resultados:

Descripcin del

material

Mtodo de

esterilizacin

Indicador de

esterilizacin

Resultado Observaciones

Pipeta Mtodo y parmetros

de control

etc

4. Compare sus resultados con los resultados de sus compaeros y presente un

resumen.

5. Escriba sus conclusiones.

8. BIBLIOGRAFIA

1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual Moderno, S.A.

2. Carpenter P., 1969, Microbiologa. Editorial Interamericana.


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3. Pelczar M., 1984,Microbiologa. Editorial McGraw Hill.

4. www.danival.org/notasmicro/medioscult/madre_medios.html


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Prctica 2. Diferenciacin, preparacin y esterilizacin de medios de

cultivo.

1. OBJETIVO

Aplicar la metodologa de preparacin y esterilizacin de diferentes medios de

cultivo.

2. INTRODUCCION

La ubicuidad de los microorganismos se relaciona con las capacidades de cada uno

de estos y sus especificidades en adaptarse a las condiciones medioambientales con

sus mecanismos enzimticos y sus relaciones poblacionales en un ecosistema.

Para crecer, los microorganismos deben tomar del ambiente todas las sustancias

necesarias para la sntesis de sus componentes celulares y para la generacin de

energa. Estas sustancias se denominan nutrientes. Un medio de cultivo artificial

deber contener todos los nutrientes y las cantidades necesarias a los

requerimientos especficos para el microorganismo que quiere ser aislado.

La formulacin de un medio de cultivo est basada en los principios de la nutricin y

la composicin qumica de las clulas, como ejemplo el agua es el componente

principal que se encuentra entre un 80 y 90% del peso total de la clula, por lo cual

es el componente y nutriente principal y esencial, en trminos cuantitativos. Los

componentes slidos en la clula son constituidos hasta en un 95% por las

sustancias en las cuales sus componentes elementales son el carbono, nitrgeno,

fsforo y azufre, ordenados en forma decreciente con relacin a su abundancia.

El carbono es el componente principal del peso seco de una clula, participando

comnmente con un 50%, los microorganismos fotosintticos toman esencialmente

del CO2 su fuente de carbono y toman de los compuestos inorgnicos oxidndolos y


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de la luz su energa. Todos los dems organismos toman su fuente de carbono de

sustancias orgnicas adems de utilizarla como principal fuente de energa.

Los microorganismos son extraordinariamente diversos tanto a la clase como al

nmero de compuestos orgnicos que pueden usar como fuente principal de carbono

y energa. Esta diversidad se manifiesta en el hecho de que no hay en la naturaleza

ningn compuesto orgnico que no pueda ser utilizado como fuente de carbono y

energa por algn microorganismo, por lo que algunos muestran una gran

versatilidad y otros extremadamente especializados en el uso de la fuente de

carbono orgnico, estas caractersticas permiten disear diferentes tipos de medios

de cultivo como son: Por su contenido de agua el medio lquido, semislido y slido;

Por su composicin cualitativa y cuantitativa de su componentes, medio complejo,

semisinttico y sinttico; Por su capacidad de soportar microorganismos, medio

general, selectivo; diferenciales, ricos, etc.

En la actualidad los medios de cultivo comnmente empleados, se encuentran en el

comercio bajo la forma de productos deshidratados, presentado ventajas como son:

estabilidad, fciles de usar, una pequea cantidad del polvo basta para preparar una

cantidad de medio de cultivo, necesitan poco espacio para almacenarse y de alguna

manera son econmicos.




Subtema. Medios de cultivo.

El cultivo de los microorganismos en condiciones artificiales se logra reproduciendo

las condiciones medioambientales, adicionando los nutrientes semejantes de donde

fue extrado.


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Agar nutritivo (g/l) 23 Autoclave

Caldo nutritivo (g/l) 8 Estufa incubadora

Cajas petri 10 Horno

Tubos de 18 x 150 mm con tapn de

rosca

10 Mechero Fisher

Probeta de 100 ml 1 Campana de flujo laminar

Matraz Erlenmeyer de 250 ml 1 Potencimetro

matraz Erlenmeyer de 500 ml 1

gradilla 1

Asa de nicromo 1

Asa varilla de vidrio 1

Algodn, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo, muestra de tierra

y agua fresca.

5. METODOLOGIA

Preparacin:

1. Pesar la cantidad indicada en el frasco de medio de cultivo. (Caldo nutritivo 0.8 g

para 100 ml y agar nutritivo 4.6 g para 200 ml).

2. Disolver al inicio en una cantidad de la fraccin del volumen total de agua.

3. Mezclar bien y agregar el resto de agua necesaria enjuagando con el agua las

paredes del recipiente.

4. Calentar suavemente entre 50 y 60C, agitando constante el recipiente hasta su

incorporacin del medio al agua o clarificar, en caso de un medio contenga agar,


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espere 5 minutos agitando antes de llevarlo a ebullicin. (Nunca sobrecaliente,

uno o dos minutos de ebullicin es suficiente).

5. Revise el valor indicado en la etiqueta del pH y de ser necesario ajstelo

utilizando soluciones cidas o bases con concentraciones de 0.1 M.

6. Antes de su esterilizacin vierta en cada tubo 9 ml de caldo nutritivo y cierre

suavemente el tubo con el tapn de rosca.

7. El agar nutritivo se esteriliza en el matraz Erlenmeyer y las cajas de petri debern

esterilizarse previamente por separado.

8. Los medios deshidratados son altamente higroscpicos, por lo que es necesario

mantenerlos convenientemente cerrados los frascos despus de utilizarlos y

mantenerlos en un lugar fresco, seco y protegidos de la luz.

9. La esterilizacin, en todos los casos es conveniente seguir las instrucciones

indicadas en las etiquetas de los frascos y nunca deber exceder la temperatura

de esterilizacin. (Caldo y agar nutritivo se esteriliza a 121C a 1 atm de presin

manteniendo estas condiciones durante 15 minutos, cortar un segmento de cinta

testigo para cada lote).

10. Los tubos con el caldo nutritivo se cierran despus de su esterilizacin y que

estos estn a una temperatura entre 50 y 60C.

11. El agar nutritivo estril se vaca a las cajas petri cuando ste alcance una

temperatura entre 45 y 50C.

12. Los medios preparados es recomendable utilizarlos el mismo da de su

preparacin, sin embargo es posible mantenerlos por varios das en refrigeracin,

debindose llevar a temperatura ambiente antes de usarse.

13. Inocule el caldo nutritivo y el agar nutritivo con las muestras de los distintas

fuentes de microorganismos.

14. Incube las cajas y tubos inoculados en la estufa de incubacin a 35C.

15. Observe el desarrollo de su crecimiento a las 24 y 48 horas de incubadas.


1. Fomentar la investigacin a travs de observar el efecto de el tipo de medio de

cultivo y la muestra.


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2. Generar una discusin en grupo de los resultados obtenidos con los distintos

medios de cultivo y muestras utilizados.


1. Escribir las diferencias de los desarrollos en los medios de cultivo.


Medio de

cultivo

Fuente del

microorganismo

Forma de

Crecimiento


Lquido Muestra slida

Lquido Muestra lquida

Slidor Muestra slida

Slidor Muestra lquida


resumen.


8. BIBLIOGRAFIA

1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual Moderno,

S.A.



4. Stanier R., Doudoroff M. y Adelberg E. 1981.Microbiologa. Editorial Aguilar.

5. www.danival.org/notasmicro/medioscult/madre_medios.html.


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Prctica 3. Determinacin de los parmetros de letalidad trmica:

valores D-Z.

1. OBJETIVO

Aplicar las tcnicas para determinar los valores de D y Z de los microorganismos.

2. INTRODUCCION

La tecnologa microbiana y alimentaria requiere que sus procesos sean operados sin

contaminacin biolgica. En general se necesita un alto grado de limpieza y se

procura que las operaciones sean aspticas.

Para mantener un proceso en condiciones aspticas sera necesario contar con un

mtodo cuantitativo seguro y confiable de medir la concentracin de contaminantes

que entran al proceso, adems que cada contaminante en particular varia su efecto

potencial sobre el proceso.

Dentro de los mtodos utilizados por la industria para esterilizar sus procesos el ms

empleado es la destruccin por calor, en el cual el concepto bsico es la mortalidad

trmica, la cual intenta explicar el mecanismo de inactivacin trmica de los

microorganismos, en lo particular en nuestro caso solo se tratar el aspecto cintico.

La destruccin de los microorganismos depende de muchas variables: pH de medio,

estado vegetativo o esporular de las clulas, iones metlicos, etc. La destruccin de

los microorganismos sigue una reaccin de primer orden, es decir la tasa de

mortalidad en cualquier tiempo es proporcional al nmero de clulas vivas a una

temperatura especfica.

dN/dt = -k N

En donde N es el nmero de clulas vivas en cualquier tiempo y k la constante de

velocidad de muerte. La relacin de estas variables se comporta lineal entre el


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logaritmo del nmero de clulas vivas y el tiempo de esterilizacin, esta relacin se

conoce como la Ley logartmica de mortalidad.

Dentro de las expresiones para la taza de esterilizacin, se tienen las siguientes:

PMT.- Punto de muerte trmica es la temperatura mnima requerida para

destruir la totalidad de los microorganismos.

TMT.- Tiempo de muerte trmica es el tiempo requerido para destruir todas las

clulas a una temperatura determinada.

Mtodo del porcentaje.- Porcentaje de clulas sobrevivientes a la exposicin al

calor por unidad de tiempo.

TRD.- Tiempo de reduccin al dcimo es el tiempo que tarda un nmero de

clulas en reducirse al 10% y su valor es D.

Z.- Son los grados de temperatura necesarios para reducir el tiempo de

destruccin trmica diez veces.

Ln 10 = kt t = D = 2.3/k


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Subtema. Muerte trmica y valores D y Z.

Los tratamientos trmicos a los materiales o alimentos permiten mantener

condiciones para poder trabajar libres de contaminacin y dar ms tiempo de

anaquel.


Para cada tratamiento trmico.




Cajas petri 40 Horno


rosca

25 Bao metablico con

control de temperatura



Matraz Erlenmeyer de 500 ml 2 Mechero Fisher

gradilla 1 Centrifuga

Asa varilla de vidrio 1 Micropipeta de 0.1 a 1 ml

Tubos para centrifuga 10 ml 10 Vortex

Pipetas de 1 ml 10

Puntas para micropipeta de 1 ml 100

Algodn, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo, cepa pura.


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5. METODOLOGIA

Soluciones

1. Solucin salina al 0.85 % .- Colocar 8.5 g de NaCl en un matraz volumtrico de

1000 ml; disolver y llevar a volumen con agua destilada.

2. Hidrxido de sodio 1 N.- En un matraz volumtrico de 100 ml, pesar 4.0 g de

NaOH disolver y aforar con agua destilada.

3. Solucin amortiguadora de fosfatos.- Disolver 34 g de fosfato monobsico de

potasio en 500 ml de agua destilada; ajustar el pH a 7.2 con hidrxido de sodio 1

N. Se requieren aproximadamente 175 ml. Diluir a 1000 ml con agua destilada,

esterilizar durante 20 min a 121C y conservar en refrigeracin hasta su uso.

4. Solucin de trabajo.- A 1000 ml de solucin salina al 0.85 %, adicionar 1.25 ml de

solucin amortiguadora de fosfatos; si es necesario, ajustar el pH a 7.2.

5. Transferir 9 ml de solucin de trabajo en 20 tubos con tapn de rosca y esterilizar.

Paquete Celular

1. Crecer el microorganismo seleccionado durante 24 horas, en un matraz de 500 ml

con un volumen de 200 ml de medio de cultivo.

2. Centrifugar, y resuspender en 20 ml de la solucin de trabajo el paquete celular.

Refrigerar hasta su transferencia.

Sobrevivencia trmica

1. Transferir 1 ml del paquete celular resuspendido en la solucin trabajo a cada uno

de los 20 tubos conteniendo 9 ml de solucin de trabajo estril.

2. Mantener los tubos bajo las condiciones de tratamiento trmico siguientes:

a. 100C

b. 105C

c. 110C

d. 115C

e. 120C

f. 125C


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3. Por cada temperatura, obtener muestras por triplicado a los siguientes tiempos

(minutos): 1, 2, 4, 8, 16, 25. Tomar 2 tubos como muestra control (tiempo 0).

4. Determinar viabilidad celular en cada una de las muestras.

5. Graficar los resultados.

6. Determinar los valores de D y Z.


1. Fomentar la investigacin a travs de observar el efecto del tratamiento trmico y

su influencia en la muerte trmica de los microorganismos.

2. Generar una discusin en grupo de los resultados obtenidos con los tratamientos

y muestras utilizados.


1. Calcule los valores de D y Z.


Tratamiento trmico

(C)

Tiempo

(minutos)

Concentracin celular

(viables)

Observaciones

100 0, 1, 2, 4, etc Nmero/ml, etc

105 0, 1, 2, 4, etc Nmero/ml, etc

etc


resumen.



25

8. BIBLIOGRAFIA


S.A.


3. Frazier W., 1976. Microbiolga de los alimentos. Editorial Acribia.


5. Quintero R., 1981. Ingeniera bioqumica. Teora y aplicaciones. Editorial

Alhambra Mexicana, S:A.



26

Prctica 4. Obtencin de cultivos puros, utilizando las diversas

tcnicas de aislamiento.

1. OBJETIVO

Aplicar las tcnicas de varilla acodada y estra cruzada para la purificacin de

cultivos bacterianos.

2. INTRODUCCION

Un cultivo puro es aquel que se desarrolla a partir de una clula nica y que

pertenece a la misma especie y cepa. Obtener un cultivo puro es uno de los

problemas en la microbiologa, ya que el estudio organizado de cualquier organismo

requiere que se le examine una especie a la vez, el mtodo analtico no se puede

aplicar cuando hay ms de una.

Idealmente, uno debera aislar una sola clula individual y luego transferirla a un

medio estril hasta que se divida para generar una sola poblacin a la cual se le

denomina clona y, en este caso tener un cultivo puro.

Generalmente las bacterias son inoculadas e introducidas en medios lquidos

(caldos) o solidificados con agar para su propagacin y/o conservacin, como para

estudiar sus caractersticas de crecimiento. Es importante recordar que la inoculacin

de los microorganismos en los medios de cultivo, siempre deben realizarse en zona

asptica (cerca del mechero o en campana de flujo laminar), condiciones que limitan

la presencia de microorganismos indeseables o contaminantes.

Los cultivos puros al estar formados por un solo tipo de microorganismos; nos

permite conocer las caractersticas morfolgicas, propiedades de tincin, actividad

qumica, patogenicidad, sensibilidad a antibiticos e identificacin a las especies

microbianas; para todo esto se utilizan las tcnicas de aislamientos quienes permiten

la obtencin de microorganismos a partir de muestras complejas (suelo, agua,


27

alimentos, etc.) en las que hay una gran diversidad microbiana, as como para

comprobar la pureza de los cultivos obtenidos, esto se logra con las tcnicas de

aislamiento y s purificacin.

Una manera para favorecer el aislamiento de cultivos de baja densidad, es aplicar

mtodos de cultivos especiales, en los que se utilizan medios que contienen

nutrientes como: antibiticos, altas concentraciones de sales y/o pH, luz o

temperatura para favorecer el crecimiento del microorganismo de inters.

SIEMBRA.-Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra

(inculo) en un medio adecuado que provee los requerimientos necesarios, con el fin

de iniciar un cultivo microbiano, la creencia de transferir una gran cantidad del

material de cultivo para tener xito es un error. Luego de sembrado, el medio de

cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. La siembra

puede realizar en medio lquido, slido o semislido, utilizando punta, asa, hisopo o

pipeta estril, etc.




Subtema. Mtodos y tcnicas de aislamiento y seleccin.

Tema. Microorganismos procariotas.

Subtema. Morfologa y estructura bacteriana; Reproduccin bacteriana.

El cultivo de los microorganismos en condiciones artificiales se logra reproduciendo

las condiciones medioambientales, adicionando los nutrientes que le den ventajas de

crecer al microorganismo de inters, a travs de tcnicas de siembra que permiten

obtener un cultivo puro.


28




Cajas petri 20 Estufa incubadora


rosca

10 Horno



Matraz Erlenmeyer de 500 ml 1 Mechero Fisher

gradilla 1 Vortex

Asa de platino 1

Asa de varilla acodada 1

Pipetas de 1 (ml) 10

Alcohol 96 (ml) 100

Vaso de precipitado 500 ml 1

Lactosa (g/l) 10

NH4H2PO4 (g/l) 2

K2HPO4 (g/l) 5

MgSO4 (g/l) 1

KCl (g/l) 0.2

Purpura de bromocresol (ml) 1

Agar bacteriolgico (g/l) 15

Algodn, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo, tierra.


29

5. METODOLOGIA

Preparacin del material

1. Pesar la cantidad indicada en el frasco de medio de cultivo. (agar nutritivo 4.6 g

para 200 ml para 10 cajas petri).

2. Pesar las sales y lactosa calculando para la preparacin de 200 ml. (para 10

cajas petri).

3. Disolver al inicio en una cantidad de la fraccin del volumen total con agua.

4. Mezclar bien y agregar el resto de agua necesaria enjuagando con el agua las

paredes del recipiente.

5. Calentar suavemente entre 50 y 60C, agitando constante el recipiente hasta su

incorporacin del medio al agua o clarificar, espere 5 minutos agitando antes de

llevarlo a ebullicin. (Nunca sobrecaliente, uno o dos minutos de ebullicin es

suficiente).

6. Prepare 5 tubos con 9 ml con la solucin de trabajo (solucin salina y

amortiguador de fosfatos) para hacer las diluciones decimales y cierre

suavemente el tubo con el tapn de rosca.

7. El agar nutritivo se esteriliza en el matraz Erlenmeyer y las cajas de petri debern

esterilizarse previamente por separado.

8. La esterilizacin por autoclave a 121C a 1 atm de presin manteniendo estas

condiciones durante 15 minutos, cortar un segmento de cinta testigo para cada

lote).

9. Los tubos con las diluciones decimales se cierran despus de su esterilizacin y

que estos estn a una temperatura entre 50 y 60C.

10. El agar nutritivo estril se vaca a las cajas petri cuando ste alcance una

temperatura entre 45 y 50C.

Aislamiento

1. Cernir la muestra de tierra y pesar 1 g.

2. Transferir la muestra de tierra al primer tubo (1) con la solucin de trabajo estril.

3. Homogenizar con el vortex y esperar que sedimente la tierra.

4. Tomar 1 ml del tubo (1) y transferirlo al siguiente tubo (2) con la solucin de

trabajo estril.


30


6. Tomar 1 ml del tubo (2) y transferirlo al siguiente tubo (3) con la solucin de

trabajo estril.


8. Repetir el procedimiento hasta agotar los tubos con solucin de trabajo estril.

(serie de diluciones decimales de 1/10, 1/100, etc.)

9. Inocular por duplicado (transferir 0.5 ml de las diluciones decimales 1,3 y 5) a los

medios de agar nutritivo y agar de lactosa.

10. Extender la alcuota con el asa de varilla acodada (previamente esterilizada con

alcohol) en toda la superficie de la caja petri con el medio de cultivo no

presionando el agar.

11. Incubar a 35C y observar cada 24 horas, por 3 das.

12. Escoger 2 colonias aisladas diferentes y marcarlas con un circulo (por fuera de la

caja).

Purificacin

1. Esterilizar el asa de platino en la llama directa del mechero, que est en contacto

con la parte exterior de llama en posicin vertical hacia abajo (20-30).

2. Transfiera la colonia seleccionada a una caja de petri estril con medio fresco,

tocando sobre la colonia y sembrar con la tcnica de estra cruzada.

3. Incubar a 35C, durante 24 horas, observar colonias separadas y que solo exista

un solo tipo de colonia.

4. Repetir la siembra en medio fresco hasta obtener el cultivo puro.


31


1. Fomentar la investigacin a travs de observar el efecto de los diferentes medios

de cultivo en los microorganismos.

2. Generar una discusin en grupo de los resultados obtenidos con los tratamientos

y muestras utilizados.



Medio de

cultivo

Dilucin decimal Colonias

diferentes

Observaciones

Agar nutritivo 1, 3, 5 Nmero/caracterstica

Agar de lactosa 1, 3, 5 Nmero/caracterstica


resumen.


8. BIBLIOGRAFIA


S.A.





32





33

Prctica 5. Observacin colonial y microscpica de cultivos

bacterianos.

1. OBJETIVO

Obtendr cultivos bacterianos puros y describir su morfologa colonial y aplicar las

tcnicas de tincin para su observacin de la morfologa microscpica.

2. INTRODUCCION

Una bacteria simple esta formada por tres capas externas que envuelven las

estructura internas; la capa pegajosa protege la pared celular rgida, que a su vez

cubre la membrana celular semipermeable.

El flagelo es un medio de locomocin y los pelos que se extienden por fuera de la

cpsula, ayudan la bacteria a sujetarse de las superficies.

Hay dos grupos principales de bacterias: las saprofitas, que viven sobre los cuerpos

muertos de animales y vegetales, y los simbiontes, que viven en animales o plantas

vivas. Las saprofitas son importante s por que descomponen los cuerpos de

plantas o animales muertos en sus componentes esenciales, haciendo se

accesibles para ser utilizados como alimento por las plantas. Muchas bacterias

simbiontes se encuentran en condiciones normales, en los tejidos humanos, incluso

en el tubo digestivo y la piel, donde pueden resultar indispensables para los procesos

fisiolgicos este tipo de relacin recibe el nombre de mutualismo. En el

comensalismo, las bacterias simbiontes obtienen los nutrientes de sus huspedes

vivos causndoles un dao considerable. El tercer tipo los parsitos, pueden

provocar la destruccin de las plantas o los animales en los que viven.

Cada bacteria es una porcin microscpica de materia viva sin un ncleo bien

definido. En su mayora las bacterias son incoloras, aun que algunas tienen

sustancias y colorantes. Por trmino medio miden una micra (0.001mm) de dimetro.


34

En cuanto as tipo de agrupacin pueden ser, respecto a los cocos: Diplococos, se

agrupan de dos en dos; estreptococos, si se agrupan en fila, tetra cocos, si se

agrupan en cuatro; sarcinas, si forman cubos; estafilococos si lo hacen en racimos.

Tambin se caracterizan algunas bacterias por la facultad que tienen de producir

cuerpos ovales de pared gruesa (una por clula) que es una clula de alta resistencia

llamada endospora o ms comnmente espora. Todos los organismos del gnero

Bacillus y Clostridium se caracterizan por su capacidad de producir esporas.



Tema. Mtodos y tcnicas microbiolgicas bsicas

Subtema. Aislamiento de microorganismos; Cultivo de microorganismos; Criterios

utilizados en la identificacin de microorganismos



La observacin de la morfologa colonial y microscpica de las bacterias, permite

determinar el tamao, forma, agrupacin, caractersticas de sus estructuras como la

membrana, pared celular, esporas, etc., lo cual ayuda para su clasificacin.



Cajas petri 2 Microscopio

Portaobjetos (caja por equipo) 1 Mechero bunsen

Cubreobjetos (caja por equipo) 1

Cultivo bacteriano 1

Aceite de inmersin 1

Safranina 1


35

Asa de Platino 1

Alcohol 96 (frasco de 500 ml, por

equipo)

1

Algodn, cinta adhesiva, papel absorbente, cultivo puro (joven).

5 METODOLOGIA

Para las observaciones de las caractersticas macroscpicas se estudia el tiempo de

colonia formada por cepa.

Procedimiento

1.-Del cultivo puro de la cepa se toma una asada y empleando la tcnica de estra

cruzada se inocula una caja petri con agar nutritivo.

2.-Se incuba durante 24-48 horas, despus de la caja se escoge para la observacin

una colonia aislada.

3.-Se hace la observacin de la colonia.

Observacin de morfologa colonial

a) Edad: tiempo transcurrido a partir e la inoculacin

b) Tamao de la colonia: Dimetro de la colonia.

c) Color: se compara con un catalogo de colores.

d) Consistencia: suave, dura, cremosa, otras (especificar)

e) Luz translcida, puede ser: transparente, translcida u opaca.

f) Borde: entero, ondulado, gastado, filamentoso, arborescente, ensortijado.

g) Elevacin: esparcida, plana, elevada, convexa, encazoleta, umbilicada.

h) Estructura interna: Homognea, granulosa y rizada.


36

i) superficie. Pudiendo ser; lisa, rugosa, anular.

Observacin morfologa microscpica

Para las observaciones microscpicas se procede de la siguiente manera:

De la caja de cultivo puro se toma una azada.

Se hace un frotis fijo.

Preparacin de frotis fijo

Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material

que se va a teir (si es lquido) o se hace rodar el hisopo con que se tom la

muestra.

Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no est

estril, ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede

usarse una aguja estril para transferir una pequea cantidad de un cultivo

bacteriano a la superficie del portaobjetos.

Este material es suspendido en una gota de agua o solucin salina

previamente colocada sobre el portaobjetos.

Cuando se trata de colonias muy pequeas que pueden perderse en una gota

de lquido se emplea una varilla delgada de madera estril con la cual se toca

la colonia obtenindose as una fraccin apreciable del desarrollo.

El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede

visualizarse con facilidad.

El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa

varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que

el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero no queme y se coloca el

portaobjetos sobre un vaso de precipitados.

A continuacin se tie la muestra:

Se le adiciona cristal violeta por un minuto,

Se le agrega lugol por un minuto, despus se lava suavemente con un chorro

de agua


37

Se le agrega alcohol-cetona durante 10 o 15 segundos,

Se le agrega safranina por un minuto, despus se lava suavemente con un

chorro de agua hasta que el agua salga sin colorante.

Una vez que la preparacin est totalmente seca, observar en los objetivos de

10, 45, y 100x, poniendo en este ltimo el aceite de inmersin.

6 SUGERENCIAS DIDACTICAS

1 Fomentar la investigacin a travs de observar las tinciones y el tipo de

microorganismo aislado en el cultivo puro.

2 Generar una discusin en grupo de los resultados obtenidos con los distintos

cepas puras y su morfologa colonial y microscpica.


38

7 REPORTE DEL ALUMNO

1. Describir en una tabla y figura la morfologa colonia y microscpica de cada cepa

pura observada.

Morfologa colonial

Forma Elevacin Borde

Forma de Crecimiento

Estra en agar Picadura en gelatina Crecimiento en caldo

Forma Lnea Licuefaccin Medio Superficie

Puntiforme Plana Entero Filiforme Filiforme Crateriforme Floculenta Peliculada

Circular Elevada Ondulado etc etc Etc etc etc

Filamentosa Convexa etc

Amiboide etc

etc

Morfologa microscpica

Edad del cultivo Tincin Forma unicelular Modo de agrupacin

(hrs) Gram ( ) Bacilo Clulas sueltas

Acidorresistente Coco Diplos

etc etc etc

8 BIBLIOGRAFIA


S.A.





39




7. www.escuelasecundariaanexa.com.mx


40

Prctica 6. Aplicacin de los mtodos de preservacin de

microorganismos y diseo de un cepario.

1. OBJETIVO

Aplicar diferentes tcnicas para la conservacin de cepas microbianas.

2. INTRODUCCION

Desde tiempos remotos los microorganismos han sido empleados como materiales

esenciales de trabajo en la obtencin de medicamentos (antibiticos, vitaminas y

aminocidos), elaboracin de alimentos (pan, queso, leche, bebidas y licores) y

fabricacin de solventes y reactivos, entre otras aplicaciones. El creciente uso de

estos materiales biolgicos en la biotecnologa y la proteccin medioambiental han

fortalecido la necesidad de mantener los cultivos microbianos de manera que las

propiedades que los hacen importantes permanezcan estables.

La preservacin de cepas microbianas no es tarea fcil y debe garantizar la

viabilidad, pureza y estabilidad gentica de los cultivos, caractersticas que coinciden

con los objetivos de un buen mtodo de conservacin. El conocimiento de las

peculiaridades de las dismiles tcnicas de preservacin existentes para su correcta

aplicacin, as como el seguimiento continuo de las propiedades de las cepas,

propician su empleo como inculo confiable en la industria, la docencia y la

investigacin.

Con frecuencia la eleccin de la tcnica ms adecuada para conservar cultivos

microbianos resulta difcil, pues deben tomarse en consideracin los criterios de

viabilidad y pureza de las cepas, cambios poblacionales y genticos, nmero y valor

de los cultivos, costo, suministro y transporte de cepas, as como la frecuencia del

uso de los cultivos.

Los procedimientos de conservacin utilizados para estos microorganismos son:


41

Subcultivos:

Alta probabilidad de que se produzcan mutaciones, alto riesgo de contaminacin,

escasa vialibidad a largo plazo.

Conservacin a bajas temperaturas:

En placas de agar

Conservacin de las esporas en agua

Conservacin en congelacin

Se requiere el uso de crioprotectores (DMSO, glicerol, trehalosa), las temperaturas

ms utilizadas son 80C y mediante nitrgeno lquido entre 150 y 196C, se

recomienda una congelacin lenta y una descongelacin rpida, buena estabilidad

gentica, suele ser caro mantener temperaturas tan bajas.

Conservacin en forma deshidratada:

Cultivos con aceite mineral

Liofilizacin

Es un mtodo muy utilizado, tiene buena estabilidad gentica, es una tcnica

sofisticada.









42

La conservacin de microorganismos en los laboratorios y la industria permite poder

disponer de los microorganismos en el momento que se requiera, adems de poder

realizar todos los trabajos necesarios para su clasificacin y determinar sus

caractersticas de inters.




Caldo nutritivo 8 Horno

Cajas petri 4 Estufa incubadora


rosca

30 Campana de flujo laminar

Tubos de 2 ml para microcentrifuga 20 Refrigerador

Probeta de 100 ml 1 Mechero Fisher

Matraz Erlenmeyer de 250 ml 2 Vortex

Matraz Erlenmeyer de 125 ml 5 Microcentrifuga

gradilla 1

Asa de platino 1

Algodn, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo

5. METODOLOGIA

Preparacin de la muestra

1. Incubar de 24 a 48 horas en medio lquido un cultivo puro hasta alcanzar

concentraciones de 107 a 108 clulas/ml, para poder obtener un paquete celular.

2. Centrifugar y obtener el paquete celular resuspender las clulas con la menor

cantidad de solucin de trabajo estril.


43

3. Incubar de 24 a 48 horas en cultivo slido un cultivo puro, aplicando la tcnica de

estra cruzada, seleccionar las colonias separadas.

4. Preparar tubos de 18x150 mm con tapn de rosca con 10 ml de agar nutritivo,

esterilizar y al sacar los tubos de la autoclave inclinar hasta que el menisco del

agar este a 2 cm del cuello de la rosca del tubo, esperar hasta que gelifique.

(tubos con agar inclinado).

5. Esterilizar 100 ml de aceite mineral en un matraz de 250 ml.

6. Esterilizar por calor seco tubos de 18x150 mm con tapn de rosca conteniendo 2

gramos de slica gel.

7. Esterilizar por calor seco tubos de 18x150 mm con tapn de rosca conteniendo 2

gramos de tierra cernida.

Aplicacin de la tcnica de conservacin

Resiembra peridica:

1. Transferir por triplicado las colonias seleccionadas del cultivo puro joven al tubo

de agar inclinado, aplicando la siembra de estra a todo lo largo del medio

inclinado.

2. Incubar los tubos sembrados utilizando las mismas condiciones ambientales de

donde proviene, esperar hasta tener un buen crecimiento del cultivo puro.

3. Refrigerar los tubos con las cepas ya crecidas, hasta la fecha de su resiembra.

(repetir los pasos 3 y 4 del paso de preparacin de la muestra y todos de la

resiembra peridica).

4. Los tubos con las cepas crecidas podrn aadirles el aceite mineral hasta cubrir

todo el agar inclinado, refrigerar hasta la fecha de su resiembra. (repetir los pasos

3, 4 y 5 del paso de preparacin de la muestra y todos de la resiembra peridica).

5. Etiquetar todos tubos de conservacin antes de refrigerar, con la siguiente

informacin: cepa, clave de identificacin, medio de cultivo utilizado, fecha de

siembra, fecha de resiembra, nmero de resiembra, nombre del alumno,

institucin, carrera, asignatura.

Deshidratacin:

1. Transferir por triplicado el paquete celular resuspendido al tubo con slica gel,

cerrar y dejar reposar 12 horas permitiendo que se efectu la deshidratacin.

(usado principalmente para cepas productoras de esporas).


44

2. Refrigerar los tubos con las cepas, hasta la fecha de su resiembra. (repetir los

pasos 1, 2 y 6 del paso de preparacin de la muestra y todos de la

deshidratacin).

Limitacin de nutrientes:

1. Transferir por triplicado el paquete celular resuspendido al tubo con suelo estril,

cerrar y dejar reposar por 12 horas y refrigerar posteriormente. (el suelo est

limitado en nutrientes y por estar seco atrapa la humedad de las clulas

secndolas, esta tcnica es muy econmica emplendose principalmente para

cepas que esporulan).

2. Refrigerar los tubos con las cepas ya crecidas, hasta la fecha de su resiembra.

(repetir los pasos 1, 2 y 7 del paso de preparacin de la muestra y todos de la

limitacin de nutrientes).


1. Fomentar la investigacin a travs de observar el efecto de los mtodos de

conservacin sobre la sobrevivencia de las cepas.




1. Escribir las diferencias de las tcnicas de conservacin.


Tcnica de

conservacin

Costos de

conservacin

Dificultad de la

tcnica



45


resumen.


8. BIBLIOGRAFIA


S.A.





46

Prctica 7. Cultivos de microorganismos en anaerobiosis.

1. OBJETIVO

Aplicar las tcnicas de cultivos anaerobios.

2. INTRODUCCION

La presencia de una atmsfera terrestre rica en oxgeno permiti a los seres vivos

evolucionar desarrollando un metabolismo aerbico, el cual se caracteriza por ser

una forma muy eficiente de obtencin de energa. Las bacterias anaerobias

precedieron largamente a las aerbicas y sin duda, predominaron largamente en un

mundo vivo que comenzaba a desarrollarse.

El reconocimiento de la naturaleza anaerobia de determinados microorganismos se

acredita a Pasteur, quien en 1863 observ que la motilidad de ciertas bacterias

desapareca con la exposicin al aire.

El conocimiento sobre las bacterias anaerobias es poco y relativamente reciente, ya

que para poder lograr condiciones de anaerobiosis en el laboratorio se necesitaban,

hasta los aos 60, equipos costosos y tcnicas bacteriolgicas muy dificultosas. A

partir de la introduccin de sistemas simples para producir anaerobiosis con equipos

y reactivos de bajo costo, el conocimiento de los anaerobios se desarrolla

intensamente. Aun as, no hay un gran nmero de microbilogos que se dediquen al

tema, la taxonoma est en permanente revisin e infinidad de aspectos se

mantienen oscuros.

Anaerobios son aquellos grmenes que slo pueden desarro llarse en ausencia de

cantidades significativas de oxgeno (O2) y bajo condiciones de potenciales redox

(Eh) muy reducidos, por tanto son estrictos en cuanto a sus exigencias de medio

ambiente. Las formas vegetativas mueren cuando son expuestos al oxgeno

molecular libre en la atmsfera, aunque el grado de resistencia bajo estas

condiciones es variable (aerotolerancia). Los esporos bacterianos no son afectados


47

por tratarse de formas biolgicas metablicamente inertes y con muy escasa

proporcin de agua en su composicin.

Si bien se considera bacteria anaerobia aquel germen que puede crecer slo en

ausencia de oxgeno, la sensibilidad frente al oxgeno vara ampliamente de una

especie a otra. As, distinguimos bacterias microaerfilas, aerotolerantes y

anaerobios estrictos u obligados. Las bacterias microaerfilas resultan daadas por

niveles altos de oxgeno como el atmosfrico (21%) y requieren niveles bajos de O2

para crecer, en el rango de 2 a 10%. Anaerobios aerotolerantes son aquellos

microorganismos que toleran exposiciones breves al oxgeno atmosfrico

desarrollando ptimamente en condiciones anaerobias. Los anaerobios estrictos no

toleran el oxgeno y mueren en su presencia, por tanto slo desarrollan en

condiciones anaerobias; (de aqu en adelante los denominaremos simplemente

anaerobios).

Los anaerobios en general poseen un metabolismo de tipo fermentativo, en el cual

sustancias orgnicas son los aceptores finales de electrones, aunque tambin

pueden obtener energa a partir de la respiracin anaerobia. Otras caractersticas

comunes a los microorganismos anaerobios son sus requerimientos nutricionales

complejos, su lento crecimiento y su labilidad, lo cual, sumado a sus requerimientos

atmosfricos estrictos (de O2 y CO2) hace que su aislamiento sea difcil; adems, al

ser la mayora de las infecciones mixtas (aerobios y anaerobios) otros

microorganismos menos exigentes y de crecimiento ms rpido pueden crecer e

inhibirlos si no se toman las precauciones necesarias.

Otro factor crucial para el xito en el aislamiento de anaerobios es el transporte

adecuado de la muestra. Se debe proteger a los microorganismos de los efectos

nocivos del oxgeno atmosfrico durante el tiempo que transcurre entre la extraccin

y la siembra anaerbica de la muestra. La primera y ms efectiva medida es correr

ya que en ninguna otra ocasin como esta el envo inmediato al laboratorio es tan

fundamental. Las muestras deben ser colocadas en un sistema de transporte que

asegure la anaerobiosis. Existen tubos, comercialmente disponibles en los que se ha

sustituido el aire por otro gas, como CO2 o N2, denominados tubos gaseados y que

contienen un indicador de anaerobiosis. Dichos tubos sirven para el transporte de


48

muestras lquidas que se inyectan a travs de un tapn de goma luego de eliminar

todo el aire de la jeringa y aguja.

Luego de sembrar la muestra en un medio de cultivo adecuado, la incubacin en

anaerobiosis se consigue por medio de alguno de los siguientes sistemas: jarras

anaerbicas, bolsas de anaerobiosis y la cmara de anaerobiosis o cmara de

guantes. El ltimo mtodo es muy caro, requiere equipamiento complejo, es lento y

se usa para estudios de flora normal y en laboratorios altamente especializados.

Desde el punto de vista prctico las jarras y los sobres o bolsas son equiparables en

rendimiento a los sistemas ms sofisticados y son aceptables para el aislamiento de

bacterias anaerobias en el laboratorio clnico. Con estos sistemas son posibles los

cultivos en medios slidos para la obtencin de aislamientos que permitan la

identificacin bacteriana.

Jarras de anaerobiosis

Es el sistema ms utilizado para generar una atmsfera anaerbica. Consiste en una

jarra de plstico con una tapa que cierra hermticamente. La atmsfera anaerobia

puede lograrse por dos mtodos diferentes. El ms sencillo utiliza un sobre comercial

generador de hidrgeno y CO2 que es activado, ya sea mediante la adicin de agua o

por la humedad de las placas de agar. El H2 se combina con el O2 del aire para

formar agua generando la anaerobiosis. Esta reaccin es catalizada por granallas de

zinc recubiertas de paladio que se encuentran depositadas en una canastilla fija a la

tapa de la jarra. El segundo mtodo consiste en la extraccin del aire contenido en la

jarra a travs de la generacin de vaco, sustituyendo el mismo por otro gas libre de

O2 como el nitrgeno. El contenido final de la jarra consiste en una mezcla de gases

conteniendo generalmente 80-90% de nitrgeno, 5-10% de hidrgeno y 5-10% de

CO2. Una tirilla de papel impregnada en azul de metileno (azul en presencia de O2,

incoloro en su ausencia) introducida en la jarra es el indicador de anaerobiosis.





49





El cultivo de los microorganismos anaerobios en condiciones artificiales se logra con

una adecuada toma y manejo de la muestra (condiciones anaerbicas), incubando

para su desarrollo en ambientes anaerbicos.



Caldo tioglicolato (g/l) Autoclave


Agar gelosa sangre Jarra de anaerobiosis

Agar tripticasa sulfato de neomicna y

polimixina TSN (g/l)

Horno

Aceite mineral (ml) 8 Mechero Fisher

Cajas petri 10 Campana de flujo laminar


rosca

20 Vortex

Probeta de 100 ml 1



Vaso de precipitados de 500 ml 1

gradilla 1

Asa de platino 1


50

Algodn, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo.

5. METODOLOGIA

1. Colocar 1 gramo de muestra en solucin de trabajo, homogenizar con el vortex

y dejar sedimentar.

2. Tomar una asada del sobrenadante y sembrar por estra cruzada en una placa

de agar TSN.

3. Incubar a 37C durante 48 horas en una jarra de anaerobiosis conteniendo

slica gel en el fondo, introducir un indicador de oxido-reduccin (papel filtro

impregnado con azul de metileno).

4. Meter el sobre generador de H2 y CO2 (gas pak) y adicionar 10 ml de agua en

el interior de sobre para activarlo.

5. Cerrar inmediatamente la jarra.

6. Homogenizar la muestra en el tubo y calentar a ebullicin durante 10 minutos.

7. Dejar enfriar y esperar que sedimente.

8. Repetir los puntos del 2 al 5.


1. Fomentar la investigacin a travs de observar el cultivo de la muestra.




1. Escribir las diferencias de los desarrollos en los medios de cultivo.



51

Medio de

cultivo

Morfologa de la

colonia

Forma de

Crecimiento


Tincin gram


resumen.


8. BIBLIOGRAFIA


2. Cowan S. y Steel K. 1985. Manual para la Identificacin de bacterias de

importancia mdica. Editorial C.E.C.S.A.

3. Martnez A., 1983. Manual de prcticas de laboratorio. Edito CREGIT, IT

Veracruz.


52

Prctica 8. Identificacin bioqumica de enterobacterias.

1. OBJETIVO

Aplicar las tcnicas y medios de cultivo para la identificacin a travs de pruebas

bioqumicas del grupo de enterobacterias.

2. INTRODUCCION

Enterobacteriaceae es una familia de bacterias Gram negativas que contiene ms

de 40 gneros, ms de 150 especies y 20 especies con patologa humana. Pueden

tener morfologa de bacilos o cocos. Los miembros de esta familia forman parte de la

microbiota del intestino (llamados coliformes) y de otros rganos del ser humano y de

otras especies animales, aerobios o anaerobios facultativos

En la definicin clsica de una Enterobacteriaceae se usan siete criterios bsicos,

adicional a la aparicin de nuevos mtodos taxonmicos para incluir a ciertos

gneros que no cumplen todos los siguientes criterios, pero que forman parte de esta

familia:

1. Son bacterias gram negativas, la mayora bacilos, otros cocobacilos y otros

pleomrficos.

2. No son exigentes, son de fcil cultivo.

3. Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa positivo), es decir,

carecen de la enzima citocromo oxidasa, catalasa positiva

4. Son capaces de reducir nitrato en nitrito.

5. Son anaerbicos facultativos.

6. Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaerbicas con o sin la

produccin de gas (en especial glucosa y lactosa), y oxidadores de una amplia

gama de substratos en condiciones aerbicas.

7. Muchos gneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos

gneros no son mviles.


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Adicional a ello, las Enterobacteriaceae no forman esporas, algunas producen

toxinas y pueden ser encapsuladas y son organismos catalasa positivos. Son

quimiohetertrofos, y necesitan para su crecimiento compuestos simples de carbono

y nitrgeno, generalmente slo con D-glucosa, aunque algunas requieren

aminocidos y vitaminas. La temperatura ptima de crecimiento es de entre 22C y

37C.

En el intestino, representan una fraccin importante de la flora aerbica, se

encuentran en grandes nmeros en el colon (desde el ciego hasta el recto), donde

contribuyen a la degradacin de residuos alimenticios y a la produccin de gas

intestinal como parte de la fermentacin. En ciertas oportunidades, los comensales

del intestino pueden resultar patognicos como oportunistas en infecciones urinarias,

pulmona, septicemia o sobreinfecciones, en especial en inmunosuprimidos, en el

uso de ciertos antibiticos, desnutricin, etc.

La presencia de Enterobacteriaceae dentro del organismo es anormal y determina la

aparicin de infecciones, cuya gravedad depende del punto de entrada. Introducidas

por los alimentos, provocan problemas intestinales al adherirse y atravesar la barrera

de la mucosa gastrointestinal, manifestada por diarreas y deshidratacin. Ciertas

especies provocan patologas especficas:

La especie Salmonella typhi es responsable de la fiebre tifoidea.

La especie Shigella dystenteriae es el agente responsable de la disentera bacilar.

La especie Escherichia coli enterotxica es responsable de la gastroenteritis

infantil.

La especie Yersinia pestis es responsable de la peste.

La especie Serratia marcescens usualmente causa infecciones nosocomiales

como resultado de tratamiento en un hospital.

Para la identificacin completa es necesaria la realizacin de las pruebas

bioqumicas las cuales muestran las diferencias en sus rutas metablicas de cada

especie como parte de la expresin de su informacin gentica.


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El aislamiento de este grupo se realiza con pruebas presuntivas y su posterior

prueba confirmativa, utilizando medios selectivos diferenciales, seguido de pruebas

bioqumicas y por ltimo el uso de pruebas serolgicas.

Las diferencias entre los nombres de los diversos gneros provienen de criterios ms

precisos, como la fermentacin de los diferentes azcares, la produccin o no de

azufre, la presencia de enzimas metablicas (-galactosidasa, desaminasas,

descarboxilasas), etc. Los serotipos de importancia medica y sanitaria pueden

distinguirse entre s por la presencia o ausencia de antgenos en su constitucin

celular, tales como en el lipopolisacrido (antgeno O), el antgeno flagelar (antgeno

H) o el antgeno capsular (antgeno K), etc.




Subtema. Criterios de clasificacin en la identificacin de microorganismos.

La identificacin de las Enterobacteriaceae se realiza a travs de incubar a los

presuntos microorganismo con medios de cultivo selectivos y diferencias y posterior

incubacin con sustratos especficos para determinar su asimilacin y fermentacin

de los mismos, para la identificacin de sus rutas metablicas, como su expresin de

su informacin gentica.



Caldo lactosado (g/l) 12 Autoclave

Caldo verde bilis brillante (g/l) 40 Estufa incubadora

Agar MacConkey (g/l) 51.5 Horno


55

Agar XLD (g/l) 55 Mechero Fisher

Caldo base fermentacin (g/l) 15 Campana de flujo laminar

Glucosa (g/l) 7 Unidad filtracin millipore

Lactosa (g/l) 7

Agar hierro de Kliger (KIA) (g/l) 52.5

Medio de SIM (g/l) 30

Medio de Citrato de Simmons (g/l) 23

Medio TSI (g/l) 63.5

Agar manitol (g/l) 35

KNO3 (g/l) 1

Cajas petri 20

Tubos 18 x 150 mm c/tapn de rosca 30

Probeta de 100 ml 1



gradilla 3

Asa de platino 1

Asa varilla de vidrio 1

Tubitos Durham 40

Tubos 16 x 150 mm c/tapn de rosca 80

Algodn, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo.


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5. METODOLOGIA

Preparacin del material

1. Esterilizar solucin de trabajo en 5 tubos de 18 X 150 conteniendo cada uno 9 ml,

para disolver la muestra en diluciones decimales conocidas.

2. Esterilizar 15 tubos (16 X 150 c tubo de Durham) con caldo lactosado. (Prueba

presuntiva)

3. Esterilizar 10 tubos (16 X 150 c tubo de Durham) con caldo verde bilis verde

brillante. (Prueba confirmativa).

4. Esterilizar 10 tubos (16 X 150 c tubo de Durham) con caldo base para

fermentacin

5. Esterilizar solucin de azucares (glucosa y lactosa) utilizando el filtro millipore.

6. Aadir 1 ml de solucin estril de los azucares en tubos con caldo base por

separado, al momento de aplicar la prueba.

7. Esterilizar los medios agar MAcConkey y XLD y transferir a 5 cajas petri por cada

medio. (seguir indicaciones de etiqueta).

8. Esterilizar 5 tubos (16 x 150) con cada uno de los siguientes medios: agar manitol

(con nitrato de potasio) y SIM. Solidificar el agar en forma vertical. (agar

semislido).

9. Esterilizar 5 tubos (16 x 150) con cada uno de los siguientes medios: agar hierro

de Kliger, citrato de Simmons, TSI. Solidificar los medios inclinndolos hasta que

el medio este entre 2 y 3 cm de la boca del tubo.

Aislar

1. Tomar 1 gramo (o 1ml de muestra) previamente homogenizada y cuarteada y

transferirla al primer tubo de la serie de diluciones decimales, esperar que

sedimente y transferir 1 ml a la siguiente dilucin hasta terminar la serie.

2. Inocular por triplicado, transfiriendo 1 ml de la muestra de cada una de las

dilucin a tubos con caldo lactosado, incubar a 37C por 48 horas observando

cada 24. (prueba presuntiva)

3. Inocular cada 1 ml del caldo incubado que resulto positivo (produccin de gas en

el tubito de Durham) en tubo con medio de caldo verde bilis brillante, incubar a

37C por 48 horas observando cada 24. (prueba confirmativa, reportar).


57

4. Inocular por duplicado, transfiriendo 1ml de la muestra de las primeras 3

diluciones por separado en cajas petri con agar MacConkey. Sembrar por estra

e incubar a 37C por 48 horas observando cada 24. (reportar morfologa colonial).

Purificar

1. Inocular el agar XLD con los tubos positivos de la prueba confirmativa. Sembrar

por estra. Incubar a 37C por 48 horas observando cada 24. (reportar morfologa

colonial).

2. Inocular el agar XLD con las colonias con caractersticas de enterobacterias de

las cajas incubadas de agar MacConkey. Sembrar por estra. Incubar a 37C por

48 horas observando cada 24. (reportar morfologa colonial).

Identificar

1. Inocular al menos tres colonias con caractersticas tpicas de enterobacterias en

cada uno de los siguientes medios: KIA, Citarto de Simmons, TSI, sembrando por

picadura al fondo y estra sobre el agar inclinado; SIM y Manitol, sembrando por

picadura recta en medio del agar semislido. Usar el asa de platino recta.

2. Incubar a 37C por 48 horas observando cada 24. (reportar).


1. Fomentar la investigacin a travs de observar la relacin de los medios de

cultivo diferenciales y selectivos con rutas metablicas como expresin del

genoma de las especies.




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8. BIBLIOGRAFIA

1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual

Moderno,

2. Cowan S. y Steel K. 1985. Manual para la Identificacin de bacterias de

importancia mdica. Editorial C.E.C.S.A.

3. Koneman E., Allen S., Dowell V., Sommers H., 1989. Diagnostico

microbiolgico. Editorial Mdica Panamericana S.A.

4. Martnez A., 1983. Manual de prcticas de laboratorio. Edito CREGIT, IT

Veracruz.

Prueba Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3

Colonias

MAC

HEK

EMB

Coloracin de Gram

Morfologa

Catalasa

Oxidasa

TSI

Lactosa

Glucosa

SH2

SIM

Movilidad

Indol

SH2

RM

VP

Citrato

LIA Lisina

SH2

Identificacin


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Prctica 9. Aislamiento, cultivo y observacin colonial y

microscpica de hongos filamentosos y levaduriformes.

1. OBJETIVO

Aplicar las tcnicas de aislamiento y purificacin de hongos y levaduras para la

observacin de la morfologa colonial y tinciones para la observacin de su

morfologa microscpica.

2. INTRODUCCION

Los hongos son seres microscpicos o macroscpicos que viven sobre diversos

materiales orgnicos, a los cuales descomponen para as alimentarse; gracias a sta

caracterstica son la clave para la reincorporacin de los materiales orgnicos en el

suelo, favoreciendo no solo su formacin sino tambin su enriquecimiento.

Actualmente existen alrededor de 80,000 especies identificadas de hongos, con

diversos hbitats; algunos son acuticos, viviendo fundamentalmente en agua dulce,

pero se sabe tambin de algunos hongos marinos; la gran mayora son de hbitat

terrestre y habitan en los suelos o en la sustancia muerta de las plantas, jugando un

papel preponderante en la mineralizacin del carbono orgnico. Gran cantidad de

hongos son parsitos de plantas terrestres, con esta particularidad los hongos

producen las principales enfermedades econmicamente significativas de los cultivos

agrcolas.(1)

Se identifican dos formas generales de crecimiento de hongos: los mohos y las

levaduras. La estructura vegetativa de los primeros recibe el nombre de talo,

compuesto por filamentos usualmente ramificados. A su vez cada uno de los

filamentos es denominado como hifa y a un conjunto de ellas se les conoce como

micelio. Las levaduras por su parte se diferencian de los mohos en su crecimiento,

pues stas a pesar de ser unicelulares en su mayora, crecen por un proceso de

gemacin en que las clulas hijas se separan de las madres tan pronto han


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madurado y tienen un ciclo sexual en donde la fertilizacin tiene lugar por medio de

fusin de dos clulas vegetativas de ncleos haploides que al fusionarse forman el

ncleo diploide que se mover al brote. As pues la sntesis del DNA y la divisin

nuclear de las levaduras se correlacionan ntimamente con el proceso de gemacin,

a comparacin de los mohos que experimentan un crecimiento filamentoso por una

extensin continua de las puntas de las hifas.

Los hongos se clasifican en cuatro grupos diferentes: Phycomycetes, Ascomycetes,

Basidiomycetes, Deuteromycetes (tambin denominados hongos imperfectos). sta

clasificacin se basa en diversas caractersticas, pero la ms importante es el tipo de

espora reproductiva que se forma, tanto asexual como sexual.

Como organismos sin clorofila, los hongos, a diferencia de las plantas verdes no

poseen la capacidad de fotosntesis, sino que necesitan el suministro de carbono

fijado orgnicamente. La intensidad de crecimiento del hongo depende, entre otras

cosas, de la concentracin de materias nutritivas y ya que el anhdrido carbnico

como fuente nica de carbono no le es suficiente para vivir, la fuente de carbono

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