EFECTO DE LAS AUXINAS Y CITOQUININAS EN LA CALLÓGENESIS SOBRE EXPLANTES NODALES E INTERNODALES DE Tropaeolum

tuberosum (R. and P. ) mashua

Sánchez, D.¹²; Huamaní, K.¹; Pascual, E.¹; Sánchez, H.¹; Estrada, R.¹ ¹Laboratorio de Recursos Genéticos y Biotecnología-UNMSM ²Centro Internacional de la Papa INTRODUCCION La mashua es una planta perenne herbácea (National Research Council, 1989; Flores et al., 2003) perteneciente a la familia Tropaeolaceae, crece en las zonas altoandinas del Perú. Esta planta tiene propiedades medicinales, son resistentes a las bajas temperaturas, pestes y enfermedades, los tubérculos son usados como antibacteriales, insecticidas y nematicidas, estas propiedades se deben a la presencia de glucosinolatos, especialmente los itiocianatos (Flores et al., 2003; King, S.R., 1987; Nacional Research Council, 1989, Watanabe, K., 2002). El cultivo de mashua tiene una alta producción, con respecto a los tubérculos presenta un alto valor nutricional, contiene todos los aminoácidos esenciales, excepto histidina (Fandiño et al., 1987), es rica en vitamina C (Fandiño et al., 1987; Flores et al., 2003; National Research Council, 1989), siendo importante en la alimentación de los pobladores altoandinos. El cultivo de mashua presenta dos importantes limitaciones, una a nivel alimenticio, presenta un sabor amargo, algo picante debido a la presencia de itiocianatos (glucosinolatos), siendo marginado de la alimentación, limitándose el consumo a ciertas poblaciones altoandinas, a pesar de tener un buen valor nutricional. La otra limitación se da en que la planta de mashua es susceptible al ataque de virus, disminuyendo así su producción. La técnica de cultivo de tejidos vegetales aparece como una opción para vencer estos dos inconvenientes, podemos obtener plántulas con características deseables utilizando para ello protocolos de regeneración in vitro vía la inducción de callos y a través de la variación somaclonal para la obtención de nuevas líneas de plántulas. La importancia del cultivo de callos radica en que son usualmente el material a partir del cual se realizan cultivos de suspensión celular (Dixon, R.A., 1983) y se pueden realizar estudios fisiológicos, bioquímicos, producción de metabolitos secundarios, etc. Para realizar este tipo de cultivo es necesario lograr una buena inducción de callos, esto se logra optimizando diferentes factores (físicos, químicos) que influyen en dicha inducción, como por ejemplo los reguladores del crecimiento.

OBJETIVOS El objetivo principal de este trabajo es evaluar el efecto de diferentes reguladores del crecimiento de forma individual o combinatoria sobre explantes de mashua a fin de obtener una buena inducción de callos en una sola etapa y en el menor tiempo posible, a fin de que sirva como una etapa previa para futuros trabajos de selección y mejoramiento genético no convencional en cultivos in vitro de plántulas de mashua. METODOLOGIA

• Micropropagación

Plántulas in vitro de mashua (figura 1) fueron propagados en medio liquido a fin de obtener una mayor cantidad de explantes. El medio utilizado fue el medio básico MS (Murashige and Skoog, 1962), suplementado con sucrosa (2 %), pantotenato de calcio (2 ml), mioinositol (100 mg) y el pH fue ajustado a 5.6. Se sembraron 2 segmentos nodales por frasco, incubándose en agitación continua (80 r.p.m), con un fotoperíodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad a 18 ºC ± 2, por un periodo de 6 semanas.

• Inducción de callos

De las plántulas obtenidas en la etapa anterior se procedió a cortar segmentos nodales e internodales con longitudes de 3 mm los cuales fueron colocados en los diferentes medios inductores de callos. El medio utilizado fue el medio básico semisólido MS suplementado con sucrosa (3 %), mioinositol (100 mg) y reguladores del crecimiento (ANA, 2,4-D, BAP, KIN) a diferentes rangos (factorial de 18 tratamientos establecidos), además se adicionó agar (7 g) y el pH se ajustó a 5.8, procediéndose a dispensar en frascos magentas (40 ml/frasco). Se esterilizaron por 20 minutos a 120 libras de presión. Se colocaron 20 explantes por frasco y se incubaron a 18 ± 2, cada tratamiento consistió de 6 réplicas y se hicieron 3 repeticiones por tratamiento. El proceso de inducción se realizó en una sola etapa (tiempo de inducción de 30 días), evaluándose semanalmente con la ayuda de un estereoscopio, a fin de saber cual de los tratamientos establecidos produjo una mayor inducción de callos, se evaluó la sobrevivencia de explantes, la formación de callos por explante, además se observó el tipo y coloración del callo inducido y el tiempo necesario para la inducción. También se evaluó cual de los dos tipos de explantes respondió mejor a los tratamientos inductores.

Tabla de tratamientos utilizados C1 = MS + ANA (0.5 mg/L) C2 = MS + ANA ( 1 mg/L) C3 = MS + ANA ( 2 mg/L) C4 = MS + ANA (0.5 mg/L) + BAP (0.5 mg/L) C5 = MS + ANA ( 1 mg/L) + BAP (0.5 mg/L) C6 = MS + ANA ( 2 mg/L) + BAP (0.5 mg/L)

C7 = MS + 2,4-D (0.5 mg/L) C8 = MS + 2,4-D ( 1 mg/L) C9 = MS + 2,4-D ( 2 mg/L) C10 = MS + 2,4-D (0.5 mg/L) + KIN (0.5 mg/L) C11 = MS + 2,4-D ( 1 mg/L) + KIN (0.5 mg/L) C12 = MS + 2,4-D ( 2 mg/L) + KIN (0.5 mg/L) C13 = MS + 2,4-D (0.5 mg/L) + KIN ( 1 mg/L) C14 = MS + 2,4-D ( 1 mg/L) + KIN ( 1 mg/L) C15 = MS + 2,4-D ( 2 mg/L) + KIN ( 1 mg/L)

C16 = MS + 2,4-D (0.5 mg/L) + BAP (0.5 mg/L) C17 = MS + 2,4-D ( 1 mg/L) + BAP (0.5 mg/L) C18 = MS + 2,4-D ( 2 mg/L) + BAP (0.5 mg/L)

RESULTADOS En trabajos preliminares se observó que la inducción de callos varió con el estado de desarrollo del explante, así para las zonas con mayor tiempo de desarrollo (zonas con coloración verdosa) no hubo una buena inducción de callos, en cambio para las zonas más jóvenes (zonas con coloración marrón) se logró una buena inducción. En base a estas observaciones se procedió a utilizar solamente explantes jóvenes (coloración marrón). Los segmentos nodales e internodales desarrollaron callos en la superficie de los cortes en la segunda semana de sembrados (figura 2), y al término de la tercera semana toda la superficie entera había sido cubierta por callos (figura 3). No hubo formación de callos cuando ambos explantes fueron cultivados en el medio control (sin reguladores de crecimiento), además la presencia sólo de auxinas (ANA o 2,4-D) en los medios de inducción no fueron suficientes para lograr una inducción en los explantes, solo tuvieron efecto con la presencia de una citoquinina (BAP o KIN).

Se logró inducir callos en ambos explantes, encontrándose variación en el porcentaje de inducción de callos, el cual fue dependiente del tipo de explante y del tipo de regulador del crecimiento utilizado. Se observó que los segmentos internodales fueron mejores explantes que los segmentos nodales para la inducción de callos, ya que se logró un mayor porcentaje en los primeros, así mismo los segmentos nodales fueron inducidos a formar raíces en la presencia de ANA o 2,4-D solos o en combinación con una citoquinina (figura 4). Todos los callos inducidos presentaron coloración verdosa tanto clara como oscura, en cuanto a la textura del callo, se observó que fue dependiente del tipo de regulador de crecimiento utilizado, así la combinación de ANA con BAP produjo callos compactos (figura 4), 2,4-D con KIN produjo callos de consistencia compacta y dura (figura 5) y la combinación de 2,4-D con BAP produjo callos suaves, blandos (figura 3), pero todos los tipos de callos fueron no friables. El mayor porcentaje de inducción de callos se observó en los medios de inducción con presencia de la citoquinina BAP en combinación con ANA o 2,4 –D (tabla 1 y 2), así para los segmentos internodales se obtuvo un 48.8 % (ANA 2 mg/L + BAP 0.5 mg/L) y un 46.6 % (2,4-D 2mg/L + BAP 0.5 mg/L) y para los segmentos nodales se obtuvo un 40 % (ANA 2 mg/L + BAP 0.5 mg/L) y un 42.9 % (2,4-D 2mg/L + BAP 0.5 mg/L) TABLAS DE RESULTADOS Tabla1: Resultados mostrados para los segmentos internodales

REGULADORES DEL CRECIMIENTO

(mg/L)

DIAS PARA INICIACION DE CALLOS

% DE FORMACION DE CALLOS

TEXTURA DE CALLOS

COLOR DE CALLOS

GRADO DE INICIACION DE CALLOS

ANA 0.5 0 0 Sin inducción - - ANA 1 0 0 Sin inducción - - ANA 2 0 0 Sin inducción - - ANA 0.5 + BAP 0.5 10-15 40 Compacto NF Verde ++ ANA 1 + BAP 0.5 10-15 46.2 Compacto NF Verde + ANA 2 + BAP 0.5 10-15 48.8 Compacto NF Verde ++ 2,4-D 0.5 0 0 Sin inducción - - 2,4-D 1 0 0 Sin inducción - - 2,4-D 2 0 0 Sin inducción - - 2,4-D 0.5 + KIN 0.5 15 22.7 C D NF Verde ++ 2,4-D 1 + KIN 0.5 15 27.1 C D NF Verde ++ 2,4-D 2 + KIN 0.5 15 32.7 C D NF Verde + 2,4-D 0.5 + KIN 1 15 26.1 C D NF Verde ++ 2,4-D 1 + KIN 1 15 26.5 C D NF Verde + 2,4-D 2 + KIN 1 15 32.4 C D NF Verde + 2,4-D 0.5 + BAP 0.5 2,4-D 1 + BAP 0.5 2,4-D 2 + BAP 0.5

12 12 12

38.8 44.4 46.6

Blando NF Blando NF Blando NF

Verde Verde Verde

++ +++ +++

Tabla 2: Resultados mostrados para los segmentos nodales.

REGULADORES DEL CRECIMIENTO

(mg/L)

DIAS PARA INICIACION DE CALLOS

% DE FORMACION DE CALLOS

TEXTURA DE CALLOS

COLOR DE

CALLOS

GRADO DE INICIACION DE CALLOS

ANA 0.5 0 0 Sin inducción - - ANA 1 0 0 Sin inducción - - ANA 2 0 0 Sin inducción - - ANA 0.5 + BAP 0.5 10-15 33.3 C NF Verde ++ ANA 1 + BAP 0.5 10-15 33.3 C NF Verde + ANA 2 + BAP 0.5 10-15 40 C NF Verde ++ 2,4-D 0.5 0 0 Sin inducción - - 2,4-D 1 0 0 Sin inducción - - 2,4-D 2 0 0 Sin inducción - - 2,4-D 0.5 + KIN 0.5 15 25 C D NF Verde + 2,4-D 1 + KIN 0.5 15 23.8 C D NF Verde + 2,4-D 2 + KIN 0.5 15 24 C D NF Verde + 2,4-D 0.5 + KIN 1 15 27.5 C D NF Verde + 2,4-D 1 + KIN 1 15 25.3 C D NF Verde + 2,4-D 2 + KIN 1 15 32.4 C D NF Verde + 2,4-D 0.5 + BAP 0.5 2,4-D 1 + BAP 0.5 2,4-D 2 + BAP 0.5

12 12 12

38.1 39.9 42.9

Blando NF Blando NF Blando NF

Verde Verde Verde

++ +++ +++

NF: CALLOS NO FRIABLES C: CALLOS COMPACTOS D: CALLOS DUROS CONCLUSIONES

• La inducción de callos es dependiente tanto de auxina como de citoquinina, ya que no se logró inducción en los tratamientos sin citoquininas y en los tratamientos control.

• Ambos explantes son inducibles de formar callos, siendo los segmentos

internodales los mejores para lograr la inducción.

• Los tipos de callos observados fueron dependientes de la acción combinada de auxinas y citoquininas.

• Todos los callos obtenidos no presentaron friabilidad, es decir no se

pueden disgregar, se presentaron en forma compacta, dura, y blandas.

• Todos los callos inducidos presentaron coloración verdosa, tanta clara como oscura.

• Los mayores porcentajes de callos inducidos se lograron en los medios

con la presencia de BAP en combinación con ANA o 2,4-D.

• Se determinó que el medio MS + 2 mg/l (ANA o 2,4-D) + 0.5 mg/L (BAP) fue el mas efectivo para lograr una buena inducción de callos.

REFERENCIAS

1. Dixon, R.A., 1985. Isolation and maintenance of callus and cell suspension cultures. Pp 1-20 in Plant cell culture (R.A. Dixon, ed.). IRL Press, Oxford, UK.

2. Fandiño, T., Torres, O. y Perea, M., 1987. Morfogénesis y

micropropagación de Tropaeolum tuberosum (Ruiz y Pavón). Aceviv, boletín cientifico 2: 29-35.

3. Flores, H.E., Walter, T., Guimaraes, R., Palbais, H., Vivanco, J., 2003.

Andean Root and Tuber Crops: Underground Rainbows. HortScience 38 (2): 161-167.

4. King, S.R., 1987. Four endemic Andean tuber crops: Promising food

resources for agricultural diversification. Mountain Research and Development 7 (1): 43-52.

5. Murashige, T and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and

bioassays of tobaccos culture. Physiological Plantarum 15: 473-497.

6. Watanabe, K., 2002. Challenges in biotechnology for abiotic stress tolerance on roots and tubers. JIRCAS Working Report. Pp 75-83.

Figura 1: A y B: Plántulas de mashua crecidas in vitro. C: Las flechas indican explantes nodales e internodales.

Figura 2: Inducción de callos blandos a partir de la segunda semana de siembra en segmentos internodales cultivados en medio MS + 2,4-D (2 mg/L) y BAP (0.5 mg/L). Las flechas indican las zonas de crecimiento de los callos.

Figura 3: Inducción de callos a partir de segmentos internodales en medio MS + 2,4-D (2 mg/L) y BAP (0.5 mg/L). A la tercera semana los callos empezaron a cubrir casi todo la superficie de los explantes.

Figura 4: Inducción de callos a partir de segmentos internodales y nodales en medio MS +ANA (2 mg/L) y BAP (0.5 mg/L). A y B: Presencia de callos compactos de coloración verdosa en segmentos internodales. C: Además de la presencia de callos compactos, se observó inducción de raíces y crecimiento de plántulas a partir de los segmentos nodales.

Figura 5: Inducción de callos a partir de segmentos internodales A: En medio MS + 2,4-D (2 mg/L) y KIN (1 mg/L). B: En medio MS + 2,4-D (2 mg/L) y KIN (0.5 mg/L). En ambos se observa la presencia de callos compactos.