MEDIOS DE CULTIVO BACTERIANO

OBJETIVOS CONCRETOS DE LA PRCTICA1.Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de los microorganismosin vitro.2.Manejar los instrumentos de uso rutinario, a la vez que imprescindibles, en el laboratorio de microbiologa.3.Hacer un primer acercamiento a la manipulacin de microorganismos. Adquirir la idea de la importancia deltrabajo en condiciones de esterilidady las tcnicas ms comunes para realizarlo.

FUNDAMENTO

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos.La composicin precisa depender de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varan considerablemente.Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normalesy microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.

Existen medios cuya composicin permite el crecimiento de:1.un gran nmero de especies (agar nutritivo, caldo ordinario, agar de Sabouraud),2.determinados microorganismos (impidiendo el desarrollo de otros), son los denominadosmedios selectivos.3.Otros en cambio, se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas fisiolgicas o test bioqumicos (utilizacin de citratos, acidificacin a partir de azcares, etc.).Los medios de cultivo poseen una serie de componentes:1.Indispensables: Entre los primeros se incluye elagua, nutrientes orgnicos (hidratos de carbono, aminocidos, vitaminas, etc) y nutrientes inorgnicos (P, Fe, N, Mg, S, etc)2.Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl),agente solidificante (agar-agar), tampones, indicador de pH, etc.

Durante las prcticas se van a manejar medios de cultivo de composicin muy variada y de tres tipos diferentes en cuanto a consistencia: medios slidos, semislidos y lquidos. Este ltimo aspecto es importante a la hora de la preparacin de los mismos.Aunque los medios artificiales o sintticosse pueden preparar a partir de sus componentes individuales, se pueden adquirir comercialmente como medios deshidratados a los que solamente hay que aadir la cantidad de agua necesaria. El fabricante indica la composicin, la caducidad,y la cantidad que debe pesarse por cada litro a preparar e incluso como debe esterilizarse.

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVOUno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de estractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes.El gar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l.La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin.En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).

CONDICIONES PARA EL MEJOR FUNCIONAMIENTO DEL MEDIO DE CULTIVOEl desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.1- disponibilidad de nutrientes adecuados2- consistencia adecuada del medio3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases4- condiciones adecuadas de humedad5- Luz ambiental6- pH7- Temperatura8- Esterilidad del medio

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVOAtendiendo a su estado fsico: Lquidos Semislidos SlidosAtendiendo a su utilidad prctica: Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc) Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia aadidas, se vara el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina) Enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K). Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos especficos de bacterias, ayudando a su identificacin (Lowenstein). Diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiolgicas (nutricin y respiracin sobre todo) especficas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificacin de casi cualquier bacteria (Oxidacin-Fermentacin)

MEDIOS DE CULTIVO DE USO HABITUAL AGAR SANGRE : Medio enriquecido, estndar AGAR POLIVITEX (chocolate) : Medio enriquecido, para bacterias que no crecen en medios habituales y para atmsfera de CO2 MAC CONKEY : Selectivo para BGN. Lactosa+indicador MULLER-HINTON : medio slido estndar para antibiogramas con discos y por difusin MULLER-HINTON/SANGRE: ATB bacterias que requieran sangre (Neumo. Strepto) MULLER-HINTON/CHOCO : ATB microorganismos que requieran Factores (Haemophilus) THAYER-MARTIN: selectivo Neisserias patg. (N. lactamica, Gono/Meningo) para atmsfera de CO2 OXIDACION/FERMENTACION (GLUCOSA) : Estudio de utilizacin de Glucosa por los BGN TREE SUGAR-IRON : tubo en pico flauta (base larga, pico corto), para estudiar Oxid/Ferm de Gluc-Lact-Sac, produccin gas y SH2 TIOGLICOLATO : Medio lquido SCHAEDLER: medio bsico enriquecido con sangre. Para ANA KANA-VANCO: Con Kanamicina y Vancomicina. Selectivo para Bacteorides y otros BGN anaerobios. Para atmsfera ANA BBE: Bacteroides Bilis Esculina. Selectivo para Bacteorides. Para atmsfera ANA SABOURAUD : Cultivo de hongos (incubar a T ambiente y a 37 gC) SAB + Cloranfenicol y Actidione : Selectivo hongos patgenos CZAPEK: Medio para Hongos. Identificacin de Aspergillus SALMONELLA-SHIGELLA : medio altamente selectivo para Salmonella y Shigella XLD : Selectivo Salmonella y Shigella SELENITO : Medio lquido de enriquecimiento selectivo para Salmonella-Shigella CIN : Selectivo Yersinia CLED: Medio de recuento urinario. Indicador de fermentacin de Lactosa GARDNERELLA: Selectivo Gardnerella vaginalis. Contiene sangre humana para valorar hemlisis CAMPY : Cultivo de Campylobacter

PREPARACION DEL AGAR AGAR

1. Calculamos la cantidad requerida a travs de una regla de 3 simple usando el equivalente dado en las instrucciones del frasco

1000mL ---------- 17.5g72mL ---------- Xg

X= (17.5*72) / 1000X= 1.26g

2. En la balanza calcular el peso de un trozo de papel aluminio, posteriormente sumarle a su peso 1.26g del Agar Agar y volver a pesar

3. Medir 72mL de agua destilada en una probeta

4. Verter el agar agar en un matraz y agregar el agua destilada de a poco para disolver el agar agar mientras calentamos la solucin

5. Colocar un tampn de algodn al matraz y cubrir con papel

6. Llevar la solucin sellada y cubierta al autoclave para su esterilizacin

CUESTIONARIO Qu es agar? De donde se extrae?Es unagelatinavegetalde origenmarino. Es unpolisacridosin ramificaciones obtenido de lapared celularde varias especies dealgas Qu es gelatina? De donde se extrae?La gelatina es unaprotenacompleja que al estar en estado puro posee la propiedad nutritiva: protena (84-90%), sales minerales (1-2%) y agua (el resto); se obtiene a partir delcolgeno procedente deltejido conectivodeanimaleshervidos conagua. Porque se utiliza agua destilada en la preparacin de los medios de cultivo?Para evitar la contaminacin por otras bacterias o iones no deseados

Elabora una tabla indicando el medio de cultivo, tipo de medio, azcar fermentable, sistema indicador

MedioSustancias selectivasSistema diferencialUtilizacin

Medio con cisteina y lactosa, deficiente en electrolitos (CLED)NingunaLactosa Azul de bromotimolMedio diferencial sin actividad selectiva. Permite el crecimiento de todas las enterobacterias. Proteus no invade. Se utiliza para aislamiento general de enterobacterias (orinas y otros productos).

Agar eosina-azul de metileno (EMB)Eosina Azul de metilenoLactosa Sacarosa Los colorantes son reveladores del sistema diferencialPoco inhibidor. Permite el crecimiento de enterobacterias y enterococos. Diferencia E. coli de otras lactosa positivas. Posee gran carcter diferencial para Candida y actinomicetales aerobios.

Agar Mac ConkeySales biliares Cristal violetaLactosa Rojo neutroPoco inhibidor. Permite el crecimiento de enterobacterias y enterococo.

Agar xilosa-lisina desoxicolato (XLD)Desoxicolato sdicTiosufalto sdico Citrato frrico amnico Lisina Xilosa, lactosa, sacarosaSe utiliza para el aislamiento de shigelas y samonelas. Posee buen carcter diferencial para estas enterobacterias.

Medio de HektoenSales biliares Desoxicolato sdicoCitrato frrico amnico Tiosulfato sdico Lactosa, sacarosa, salicina Azul de bromotimol Indicador de AndradePermite el crecimiento de salmonelas y shigelas.

Agar salmonela-shigela (SS)Sales biliares Verde brillante Citrato sdicoTiosulfato sdico Citrato frrico Lactosa, rojo neutroPermite el crecimiento selectivo de salmonelas, shigelas y yersinias

Agar Verde BrillanteVerde brillanteLactosa, sacarosa Rojo fenolPermite el crecimiento de salmonelas.

Medio de Wilson BlairVerde brillante Sulfito de bismutoSulfito ferrosoEst indicado para el aislamiento de S. typhi

Agar cefsulodin-irgasan Novobiocina (CIN)Desoxicolato Cefsulodin Irgasan Novobiocina Cristal violetaManitol Rojo neutroEs altamente selectivo para Yersinia yAeromonas.

Caldo selenito (Medio de enriquecimiento)Selenito sdicoEnriquecimiento de salmonelas.

Caldo tetrationato (Medio de enriquecimiento) Sales biliares Tetrationato sdicoEnriquecimiento de salmonelas.

Medio de cultivoTipo de medioAgente bacteriostticoAzcar fermentableSistema Indicador

ALRF (agar lactosa rojo fenol)diferencial (no selectivo)-----lactosarojo fenol

Agar Cetrimideselectivobromuro de cetiltrimetil amonio----------

Agar Mac Conkeyselectivo y diferencialcristal violeta, sales biliareslactosarojo neutro

VRBA (violeta rojo bilis agar)selectivo y diferencialcristal violeta, sales biliareslactosarojo neutro

Manitol Salt Agar (Chapman)selectivo y diferencialcloruro de sodiomanitolrojo fenol

XLD agar (xilosa lisina desoxicolato)selectivo y diferencialdesoxicolato de sodiolactosa, xilosa, sacarosarojo fenol, citrato frrico amnico y tiosulfato de sodio

BiS agar (bismuto sulfito)selectivo y diferencialverde brillante, sulfito de bismutoglucosaindicador de sulfito de Bi y sulfato ferroso

Baird Parker agarselectivo y diferencialCloruro de litio y telurito de potasio------yema de huevo, telurito de potasio

TSB + 10% NaClenriquecimiento selectivocloruro de sodio------------

Caldo Tetrationatoenriquecimiento selectivoTetrationato, sales biliares------------

CLBVB (caldo lactosa bilis verde brillante)enriquecimiento selectivoverde brillante, sales biliareslactosaproduccin de gas