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MetabolmicaQuimica de los productos naturales

Carmen baezFrancisco ferreira

Qu veremos? Bases de la Metabolomica. Limitaciones de Metablomica. Puntos a considerar cuando usemos metabolomica para nuestra investigacin. Definiciones y Antecedentes.Metaboloma = pool total de los metabolitos. Todas las moleculas organicas que tengan bajo peso molecular (< 2000 Da) en una muestra como hojas, semillas, frutas, etc. AzcaresNuclesidosAc. OrgnicosCetonasAldehidosAminas

Aminoacidos Peptidos LipidosEsteroidesTerpenosAlcaloides

Metabolmica: anlisis de alto rendimiento de los metabolitos.

DefinicionesEs el estudio cientfico sistemtico de molculas pequeas, llamadasmetabolitos, y queson el producto del metabolismo de seres. Este estudio deja seales de los procesos celulares especficos en su paso (metabolitos)

MetabolitoExcepciones:Pueden detectarse con confianza en estudios metabolmicos de plasma a travs de la espectroscopa RMN.

Elmetaboloma forma una gran red de reacciones metablicasdonde las salidas de una reaccin qumica enzimticason entradas para otras reacciones del mismo tipo.

1 kDalton de tamao.

Tipos de MetabolitosEn la metabolmica de plantas, es comn referirse a los metabolitos como metabolitos "primarios" y "secundarios".

SECUNDARIOS

PRIMARIOSHistoria Perfilado de metabolitos utilizando muestras de sangre y orina para la deteccin clnica de las enfermedades humanas se ha llevado a cabo durante siglos.

1506 por Ullrich Pinder, en su libro Epiphanie Medicorum. Nicholson, J. K. & Lindon, J. C. Nature 455, 10541056 (2008).Antecedentes.

En China se empleaba a las hormigas como sistema de deteccin de niveles de azucarHistoriaAntecedentes.

Tamao del Metaboloma en las Plantas. Se estima que todas las especies vegetales contienen 90.000 - 200.000 compuestos. Cada especie de planta contiene alrededor de 5.000 - 30.000 compuestos.Ejemplo ~ 5,000 en ArabidopsisAntecedentes.~ 90% de las mutaciones knockout en Arabidopsis son silenciosas- es decir, no tienen fenotipo visible y as no ofrece ninguna pista a la funcin del gen.Lo central es que ya no se aslan compuestos individuales, sino que se realiza un anlisis ms o menos completo de un organismo.

PODER DE LA METABOLMICALimitaciones de la metabolmicaDefiniciones y Antecedentes.

MetabolomicaPasosPreparacin de la muestra.ExtraccinCromatografa.DeteccinAnlisis de Datos

Preparacin de la muestraTamao de muestraEn general, se necesitan seis repeticiones para cada tratamiento (debido a la alta variabilidad biolgica)12Coleccin de la muestra. Tamaos de muestra uniforme (por ejemplo, hojas perforadoras/daadas) Sea consistente - tejido parecidoLa hora del da

Preparacin de la muestra

Congelar rpidamente la muestra en nitrgeno lquido y almacenarlo a -80CExtraccin de la MuestraEleccin del metodo de extraccin. No existe un mtodo universal de extraccin

Algunos disolventes pueden degradar ciertos compuestos. Es bueno tener una idea de lo metabolitos que desea extraer. El mtodo debe ser consistente y reproducible.

Una extraccin adicional puede ser necesaria (por ejemplo, la extraccin en fase slida)

SPEX SamplePrep GrinderExtraccin de la MuestraYCromatografaIntroduccin Inventado en 1900 por Mijail Tsvet (utilizado para separar pigmentos de las plantas)

Hay varios tipos de cromatografa, pero todos consisten en una fase estacionaria y una fase mvil. Los compuestos se separan sobre la base de particin diferencial entre las dos fases. Los tipos incluyen:- TLC (cromatografa en capa fina)- GC (cromatografa de gases)- LC (cromatografa lquida)GC y LC se utilizan habitualmente en la metabolmica16CromatografaCromatografa Gaseosa

GC = good chromatographylimitaciones:- Altas temperaturas pueden destruir compuestos lbiles- Compuestos polares no pueden "volar" en las columnas de GC y primero deben ser derivados.181) metoximacin de grupos aldehdo y cetona (principalmente para la apertura de anillo de azcares reductores)2) La sililacin de hidroxi polar, tiol, grupos carboxi y amino con el agente de sililacin MSTFAUn compuesto nico con mltiples grupos activos dar lugar a mltiples picos (1TMS, 2TMS, 3TMS)

Paso 1) metoximacinPaso 2) SililacinLa cromatografa de gases requiere compuestos voltiles (dos derivatizacin paso en vial)

Ismero tienen el mismo espectro de masaspero difieren 2 segundos en el tiempo de retencinAnal Chem. 2009 Dec 15;81(24):10038-48. doi: 10.1021/ac9019522.FiehnLib: mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry.Kind T, Wohlgemuth G, Lee do Y, Lu Y, Palazoglu M, Shahbaz S, Fiehn O.CromatografaDerivatizacin de la muestraCromatografa lquida LC = Lousy chromatographyventajas:- El compuesto se puede recoger despus de la separacin- Lo es necesario la derivatizacin.- Un protocolo de separacin puede ser optimizado para casi cualquier compuesto

CromatografaDeteccinEspectrometra de masas Es una tcnica utilizada para medir la masa de los iones (m/z) Todas los espectrometros de masas realizan tres tareas principales

DeteccinEspectrometra de masas.

Ejemplo del espectro de masas:m/zrelative abundanceTime [min]NormalizedIntensitym/zNormalizedIntensityChromatogram (GC-MS)100050752502.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.00100050752530405060708090100110120130140150160170166971298361473511911270Mass spectrum (EI)Peak selectorDeteccinEspectrometra de masas.

QuadTOFEspectrmetro de masas.Espectrometra de MasasPropiedades de los diversos espectrmetros de masas.TOFQuadIon TrapOrbitrapFT-ICRResolucin Muy buenorazonablerazonableMuy buenoexcelenteRango DinmicoMuy buenoexcelenterazonablerazonablerazonableSensibilidadexcelenteexcelenteexcelenteexcelenteexcelenteVelocidadexcelentebuenoexcelentebuenorazonableCosto 150-300K100K100K500K1MMantenimientoPeriodicoPeriodicoPeriodicoPeriodico Muy alto

Resonancia Magntica NuclearLos ncleos deben tener unmomento magnticodistinto de cero. Esta condicin no la cumplen los ncleos connmero msicoynmero atmicopar (como el12C,16O,32S). Los ncleos ms importantes en qumica orgnica son:1H,13C,31P,19F y15N. Otros ncleos importantes:7Li,11B,27Al,29Si,77Se,117Sn,195Pt,199Hg,203Tl,205Tl,207Pb

Es una tcnica empleada en la elucidacin de estructuras moleculares, aunque tambin se puede emplear con fines cuantitativos y en estudios cinticos y termodinmicosAlgunos ncleos atmicos sometidos a un campo magntico externo absorbenradiacin electromagntica en la regin de las frecuencias de radio. Como la frecuencia exacta de esta absorcin depende del entorno de estos ncleos, se puede emplear para determinar la estructura de la molcula en donde se encuentran stos.

Por eso, uno de los ms tiles en la elucidacin de estructuras es el1H, dando lugar a laEspectroscopia de Resonancia Magntica Nuclear del Protn. Tambin es importante en qumica orgnica el13C, aunque se trata de un ncleo poco abundante y poco sensible.

Anlisis de DatosObjetivos Identificar todos los picosEn la prctica esto es muy difcil, si no imposible. Cuantificacin o Semi-cuantificacin de compuestosA menudo implica la comparacin de muestras o grupos de muestras.Diversas pruebas estadsticas para buscar diferencias en los grupos de tratamientopor ejemplo ACP, ACM, ANOVAAnlisis de DatosIdentificacin de picosTener el dato de la masa precisa puede ayudar a determinar la frmula qumica:Ejemplo: sacarosa (C12H22O11)Masa monoisotpico = 342.116211

http://www.alchemistmatt.com/mwtwin.htmlCalculadora de peso molecularAnlisis de DatosLa identificacin de los picos.Las bibliotecas de EM pueden identificar los picos (en su mayora de GC / MS), especialmente cuando se combina con la informacin RT (GC / MS solamente):Ejemplo: biblioteca de NIST

Anlisis de DatosEjemplo del resultado de un experimento de la metabolmica.

Los estudios fitoqumicos han avanzado mucho en los ltimos aos pero todava la informacin disponible es insuficiente para evaluar la calidad, eficacia y seguridad de la mayora de las plantas medicinales que se utilizan en los sistemas mdicos locales y tradicionales.

Alguna Pregunta?Gracias por su atencin