Técnicas básicas en microbiología de alimentos

Nancy Johanna Pino Rodríguez

MÉTODOS ANÁLISISLos resultados del análisis microbiológico deben ser confiables y válidos.

La elección adecuada del método de ensayo a aplicar es de

fundamental importancia.

Para evaluar si un método es apropiado se debe tener en cuenta:

si es aplicable al alimento,

la cantidad de muestra que se analiza

el límite de detección del método (si es cuantitativo) y la especificidad (Si es cualitativo)

Usar la última versión de métodos oficiales, métodos normalizados

nacionales e internacionales, o métodos internos desarrollados por el laboratorio.

MÉTODOS ANÁLISIS Codex Alimentarius

“En la medida de lo posible, deberán aplicarse solamente métodos cuya fiabilidad (precisión, reproducibilidad, variación entre laboratorios y dentro de ellos) se haya establecido estadísticamente en base a estudios comparativos o realizados en colaboración entre varios laboratorios. Además, deberá darse preferencia a los métodos que se hayan validado para el producto en cuestión, preferentemente con relación a los métodos de referencia elaborados por organismos internacionales.”

“Los métodos que se aplican para determinar la idoneidad para el consumo de alimentos altamente perecederos, o de alimentos con una breve duración en almacén, deberán elegirse, en lo posible, de tal forma que los resultados de los exámenes microbiológicos puedan obtenerse antes de que los alimentos se consuman o lleguen a superar su duración en almacén.”

“Los métodos microbiológicos especificados deberán ser razonables en lo que atañe a la complejidad, disponibilidad de medios, equipo, etc., facilidad de interpretación, tiempo requerido y costos.”

MÉTODOS DE ANÁLISIS

La mayoría de los métodos microbiológicos para alimentos son o están basados en:

– AOAC: International Official Methods of Analysis.

– ISO: International Standard Organization.

– ICMSF: International Commission for Microbiological Specification of Foods.

– FDA ‐BAM: Food and Drug Administration‐Bacteriological Analytical Manual.

– USDA‐FSIS: United States Department of Agriculture‐Food Safety and Inspection Service.

ICONTEC: NTC

MÉTODOS DE ANÁLISIS

Métodos para controles oficiales: usados para demostrar cumplimiento con legislación.

Método de referencia: métodos reconocidos internacionalmente y ampliamente aceptados. Describe condiciones de operación y procedimientos. Generalmente es un método estándar que se toma como referencia.

Método alternativo: para detección o estimación del mismo analito que generalmente es medido con el correspondiente método de referencia, para un determinado tipo de producto. Puede ser propio de una firma comercial o no comercial y presenta atributos como: rapidez del análisis, fácil ejecución, propiedades analíticas (precisión, exactitud, límite de detección, etc.), miniaturización y reducción de costos.

• Método de propiedad: método con marca registrada, propiedad de una firma comercial.

• Método cualitativo: detecta la presencia/ausencia de una analito, directa o indirectamente, en una determinada cantidad de muestra.

• Método cuantitativo: determina la cantidad del analito determinado directamente (enumeración en una masa o volumen) o indirectamente(absorbancia, impedancia, etc.) en una cierta cantidad de muestra

MÉTODOS DE ANÁLISIS

Los análisis microbiológicos se encuadran en la categoría de los ensayos que no permiten realizar un cálculo riguroso, metrológica y estadísticamente válido de la incertidumbre de medida. En general, puede ser apropiado basar la estimación de la incertidumbre en datos sobre la repetibilidad y la reproducibilidad exclusivamente, aunque lo ideal es incluir los sesgos (p. Ej., los sesgos detectados como resultado de la participación en ensayos de aptitud). Los distintos componentes individuales de la incertidumbre deben identificarse y demostrar que están bajo control y evaluar su contribución a la variabilidad de los resultados. Algunos componentes como los efectos del pipeteado, el pesado y las diluciones, pueden medirse directamente y evaluarse fácilmente para demostrar que realizan una contribución insignificante a la incertidumbre global. Otros componentes, como la estabilidad y preparación de las muestras, no pueden medirse directamente y su contribución tampoco puede evaluarse por métodos estadísticos, pero debe considerarse también su importancia en la variabilidad de los resultados.

MÉTODOS DE ANÁLISIS

ExactitudSe define como muestras conocidas que contienen un analito microbiano que es correctamente identificado por el método ensayado. Pueden utilizarse muestras de referencia inoculadas si están disponibles y son aplicables.

Recuperación

No puede ser estimada para métodos microbiológicos cualitativos a muy bajos niveles, porque la cuantificación a estos niveles no es precisa. Por esto se estima comparando la proporción de recuperación positiva con las obtenidas en paralelo con un método convencional reconocido, normalmente un método ilustrativo de la AOAC o con los esperados de varios niveles de inoculación siguiendo la distribución de la ecuación de Poisson. La homogeneidad de la muestra es crucial para una adecuada estimación de la recuperación.

Curva de CalibraciónEn microbiología cualitativa, la respuesta es típicamente no lineal (sigmoidal) La respuesta de Poisson o alternativamente la respuesta en la referencia opcional del método de cultivo puede usarse para la calibración.

Linealidad

Limites de detección

MÉTODOS DE ANÁLISIS

Un microbiólogo debe tener conocimientos de los microorganismos más importantes en los

productos de consumo, que le permita identificarlos tipos principales que encuentre. De modo que puede usar sus conocimientos sobre las características de los mismos para

poder establecer el riesgo que puede presentar para la salud o producto y poder realizar su

eliminación o control adecuados .

MÉTODOS DE ANÁLISIS

Indicadores de calidad Microbiológica

Los criterios microbiológicos son un buen referente para garantizar el cumplimiento de unas buenas prácticas de fabricación. Se espera que productos producidos y almacenados con tales prácticas, presentes un perfil bastante distinto a los producidos y conservados en condiciones deficientes

De vida comercial De

inocuidad

MÉTODOS DE ANÁLISIS

Indicador

Su crecimiento no debería verse

afectado adversamente por

el resto de componentes de la

microbiota del producto.

Deberían poder cuantificarse rápidamente

Deben ser fáciles de detectar y

cuantificar y ser distinguibles de

otros microorganismos

Su crecimiento y recuento deben

tener una correlación alta y negativa con la

calidad del producto

MICROBIOLOGÍA ALIMENTOS

Ser fáciles de detectar de forma rápida, directa

Ser fácilmente distinguibles del resto de

la microbiota del producto

Su presencia debe estar siempre asociada a la

presencia del patógeno que se quiera indicar

Estar ausente en los productos en los que no se presente el patógeno

de interés Los indicadores de inocuidad

más frecuentes

Tener una tasa de muerte al menos

paralela la del patógeno de interés y que persista

durante algún tiempo más que el patógeno

Poseer requerimientos metabólicos y tasas de

crecimiento iguales a los del patógeno de interés

Ser un microorganismo cuyo número se

relaciona con la cantidad de patógeno

Indicadores Inocuidad-Patógenos

MÉTODOS DE ANÁLISIS

Recuento de microorganismos

- Se trata de conocer el número de microorganismos presentes en el alimento.

-Dependiendo de las características del medio utilizado (medio rico, medio limitado en nutrientes para medida de la flora no láctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de incubación (mesófilos, psicrófilos) los microorganismos analizados serán miembros de poblaciones diferentes.

1.- Contaje en Placa Standard (Standard Plate Count).

2.- Determinación del número más probable.

3- Filtracion por membrana

4.- Contaje microscópico directo.

FILTRACION POR MEMBRANA

Filtros de membrana: utilizados cuando el número de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado.

NMP

Basado en series de diluciones y cálculo estadístico del número de bacterias presentes en las diluciones más altas. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos. El método es popular aunque poco exacto.