METODOLOGIAS UTILIZADAS EN LA DETERMINACION DE LA PIGMENTACION Y PIGMENTOS EN TEJIDOS

PELLETS

Por:Emilio Castro C.M.Sc.

César Sepúlveda S. Bq. Fundación Chile

26.1. INTRODUCCIÓN

El color de la carne de los salmónidos anádromos se debe a la absorción y fijación de pigmentos carotenoides oxigenados en su carne. Entre ellos, el pigmento llamado astaxantina es el que se encuentra en mayor abundancia en el salmón silvestre, mientras que en las especies cultivadas es posible encontrar una mayor variedad como resultado de la inclusión de una gama de ingredientes y fuentes de pigmentación en las dietas artificiales. Es así que en especies cultivadas se encuentran básicamente astaxantina y cantaxantina y en concentraciones tisulares mucho menores, adenorrubina, zeaxantina, luteina y otros.

Figura 26.1. Estructura de algunos carotenoides (Torrisen, O. J.; Hardy R. W. y Shearer D. K., 1989)

26.2. LOS PIGMENTOS Y LA PIGMENTACIÓN DE SALMÓNIDOS

26.2.1 Propiedades químicas

Los pigmentos presentes en los salmónidos:

i. Pertenecen a los carotenoides al igual que los carotenos. Sin embargo, se diferencian de éstos por contener oxígeno en su molécula y consecuentemente presentar una mayor polaridad.

ii. Corresponden a derivados terpénicos caracterizados por poseer una cadena alifática que presenta, un sistema de dobles enlaces conjugados,

grupos metílicos insertados y grupos hidroxílicos y cetónicos que les permiten diferenciarse de otros carotenoides.

iii. La presencia de los dobles enlaces les confieren las siguientes propiedades:

a. Presentan una gran capacidad de absorvancia entre los 400 y 500 nm del espectro electromagnético y de absorber energía luminosa.

b. Tienen la posibilidad de formar esterioisomeros cis y trans y por lo tanto, de poder reorganizarse molecularmente formando innumerables derivados con diferentes valores pigmentantes.

iv. Son solubles en aceites y presentan una adecuada solubilidad en acetona, dimetil sulfóxido, metanol, etc, dado su carácter polar.

26.2.2 Isomería

a) Geométrica

Los esteroisómeros trans y cis de los pigmentos carotenoides de los salmónidos presentan diferentes valores pigmentantes.

Se ha asignado un 100% de biodisponibilidad para la forma trans y cero para la forma cis (Medina, J.C. 1992).

b) Optica

La molécula de astaxantina tiene 2 átomos de carbono asimétricos equivalentes en las posiciones 3 y 3', pudiendo formar 3 isómeros ópticos diferentes: (3R, 3'R), (3R, 3'S)= (3S, 3'S).

Los isómeros ópticos tienen propiedades químicas iguales y coinciden en la mayoría de las propiedades físicas, diferenciándose en su rotación específica, es decir, la dirección en que desvían el plano de la luz polarizada.

Se cree que sólo los enantiómeros (3R, 3'R) y (3S, 3'S) de la astaxantina son producidos naturalmente (Schiedt, K. et al, 1991).

Se ha demostrado que la astaxantina sintética corresponde a una mezcla racémica en la siguiente proporción: (3R, 3'R): (3R, 3'S): (3S, 3'S) = 25:50:25 (Vecchi and Muller, 1979; Storebakken et al., 1985).

Existen evidencias experimentales que el 100% de la astaxantina de la Phaffia rhodozyma corresponde a la forma (3R, 3'R).

26.3. ANÁLISIS Y EVALUACIÓN DE LOS PIGMENTOS Y PIGMENTACIÓN DE LOS SALMÓNIDOS

La evaluación del color de la carne de los salmones se puede realizar por medio de métodos de análisis sensorial con panelistas entrenados en tests descriptivos o comparativos, a través de la comparación del color de muestras de peces con colores estandarizados, por medio del análisis instrumental basado en la luz refractada de muestras de peces, o por el análisis cuantitativo de los pigmentos por HPLC.

26.3.1 Tabla de colores

El método más utilizado hasta la fecha por la industria salmonera chilena es la evaluación por medio de Tabla de Colores que corresponde a una comparación visual de esta tabla con la muestra respectiva. Esta tabla fue desarrollada especialmente para salmón Atlántico pigmentado con astaxantina y se usa tanto para filetes como para secciones de salmón. La utilización de dicha tabla dobiera efectuarse bajo condiciones específicas de luminosidad, lugar de evaluación en el pez y de contraste. Su principal limitante es que se trata de un método subjetivo, que depende de la apreciación visual del observador y no cuantitativo. Este método se recomienda para evaluar el nivel de pigmentación en muestras de 10 a 15 peces y no en peces individuales. Las publicaciones de Torrisen señalan que el método presenta una alta correlación (R2 = 0.99) con la concentración de pigmentos determinados a nivel tisular en una población.

a) Descripción

Compara visualmente el color de la carne del pez con colores estandarizados en una tabla: secciones (1–8) y filetes (11–18).

b) Limitaciones

Constituye un método subjetivo. Obliga a disponer de una tabla de colores. Fue desarrollado especialmente para salmón atlántico pigmentado con

astaxantina.

26.3.2 Colorimetría por reflactancia

Este otro método basado en la luz refractada se considera más objetivo y preciso que el anterior, dado su carácter instrumental. En él se utiliza un colorímetro de refractancia, el cual entrega información basada en un sistema de valores definido para este efecto por la Comisión Internacional de Iluminación (CIE) Los valores entregados se basan en un espacio cromático en coordenadas rectangulares (L*a*b) junto con otro en coordenadas cilíndricas (L*H*C), dichos valores representan a la luminosidad o claridad, el tono y la cromaticidad respecto a los colores componentes rojo, amarillo y azul. Diversos

investigadores han trabajado en tratar de definir la correlación de estos valores con el grado de pigmentación y con la Tabla de Colores, describiendo distintas correlaciones.

El análisis instrumental mediante colorimetría de refractancia presenta las siguientes limitaciones y ventajas:

a) Limitaciones

Evalúa solo la coloración superficial. No cuantifica el contenido de carotenoides. La presencia de grasa intramuscular, sequedad o película brillante

pueden alterar las lecturas.

b) Ventajas

Comprende una metodología sencilla. No requiere de preparación previa de la muestra. Elimina la subjetividad de la lectura. Puede utilizarse en interiores como en exteriores. Tiene estándares de referencia. Evita el tedio del analista. Por pequeñas que sean las diferencias, estas son registradas por el

instrumento dado su alta resolución.

26.3.3 Análisis por cromatografía de alta resolución

Un logro particularmente importante a partir de 1975 en el análisis químico instrumental lo constituyó el uso común de la cromatografía líquida de alta resolución en la industria de alimentos. La cromatografía permite separar, aislar e identificar los componentes de una mezcla de compuestos químicos en la medida que son solubles o reaccionan con algún compuesto. Los pigmentos carotenoides de los salmónidos tienen propiedades de este tipo que hacen aplicable este método.

Cabe señalar que la cromatografía líquida de alta resolución conocida como HPLC, difiere sólo en detalles de la clásica.

El procedimiento general de un análisis cualquiera dentro de la cromatografía líquida incluye tres etapas fundamentales:

a) Preparación de estándares y curva de calibración

En nuestro caso particular, dado que comercialmente no existen estándares tanto para astaxantina como para cantaxantina, es necesario hacer una

preparación de los estándares a partir de los productos comerciales Carophyll Pink (astaxantina 8%) y Carophyll Red (Cantaxantina 10%) y una calibración espectrofotométrica para conocer su concentración real (Gross, 1992)

Las etapas de esta calibración son:

Pesar muestra de Carophyll Pink o Carophyll Red. Disolver la muestra en agua destilada tibia hasta lograr una suspensión

homogénea. Dejar enfriar a temperatura ambiente y aforar a volumen conocido. Dejar

reposando por una hora a lo menos (o toda la noche) para que decante el almidón que recubre a los pigmentos.

Tomar una alicuota de cada suspensión. Diluir con n-hexano y leer la absorbancia de las soluciones a 470 nm con

n-hexano como blanco. El coeficiente de extinción para la astaxantina es de 1,910 (Gross, 1992) y para la cantaxantina es de 2,200 (Gross, 1992)

Una vez completa la etapa de calibración se calcula la concentración real de cada pigmento y se preparan las concentraciones adecuadas y diluidas en una mezcla metanol/agua para inyectar en el cromatógrafo. El rango aconsejable de estudio deberá ser entre 0.1 a 4.0 μg/ml.

b) Preparación de las muestras

(i) Harinas de pescado y/o pellets

Este procedimiento es válido para muestras de pellet o harina de pescado que contengan Carophyll (Red o Pink), con Phaffia rhodozyma o la levadura simplemente (Sedmark y cols., 1990).

En síntesis considera las siguientes etapas:

Moler en molino si la muestra es pellet. Pesar exactamente la muestra de la harina o Phaffia. Hidratar, en el caso de la phaffia, para facilitar su disgregación. Agregar el dimetilsulfóxido previamente calentado. Agitar vigorosamente, incubar en calor y centrifugar. Tomar una alicuota del sobrenadante y diluir en volumen conocido con

mezcla MeOH/H2O. Volver a centrifugar e inyectar en el cromatógrafo del sobrenadante.

(ii) Tejido muscular de salmón o trucha

Este método también es posible de utilizar sobre muestras de harina de krill (y otros crustáceos), paprika y otros vegetales en polvo. En general, la metodología se resume en los siguientes pasos:

Moler y homogenizar la muestra de tejido en un picadora de cocina cuando sea pertinente.

Pesar en un tubo exactamente la muestra. Extraer con pequeños volúmenes de acetona por agitación vigorosa en

un vórtex o por ultrasonido (hacer tantas extracciones como sea necesario).

El sobrenadante llevarlo a un segundo tubo donde se juntan los extractos.

Llevar a volumen conocido una mezcla de MeOH/H2O. Centrifugar e inyectar el sobrenadante directamente en el cromatógrafo.

La fase de extracción puede ser optimizada utilizando un sistema de extracción en fase sólida acoplada a vacío.

(iii) La determinación cromatográfica considera las siguientes condiciones generales

Fase móvil: mezcla MeOH/H2OFase estacionaria: columna C-8 4 × 250 mmVol. inyección: 20 μlTemperatura: ambienteDetector: isible, 470 nm

La técnica cromotográfica anteriormente descrita utiliza una fase móvil relativamente polar constituida por una gradiente de metanol y una fase estacionaria apolar consistente en una columna en fase inversa C8. No se describen limitaciones para ella, si las siguientes ventajas:

1. Eluye el β-caroteno en un tiempo razonable, separándolo de los oxicarotenoides del salmón.

2. Permite separar los isómeros cis y trans tanto de la astaxantina como cantaxantina.

Otros investigadores han propuesto otras modalidades cromatográficas algo distintas con el fin de evaluar otros aspectos de la pigmentación de los salmónidos. Es así como:

Vecchi M. y Muller R.K. (1979) desarrollaron un método HPLC diferente a los modos de separación normal y reversa. Esta técnica permite separar los isómeros configuracionales de la astaxantina previo a sus

esterificación con ácido campanico y posterior separación de los correspondientes diésteres en una columna de nitrilo (CN) por HPLC.

Makoa et al. (1985) por su parte propusieron un método HPLC que permite la separación directa de los carotenoides diasteroméricos de la astaxantina utilizando la columna Sumipax OA — 2000 chiral.

Estos métodos presentan las siguientes limitaciones: no se recomiendan como técnicas de rutina ya que, en el primer caso, los pasos adicionales que involucra la preparación de los esteres del ácido campánico pueden afectar su exactitud y, en el segundo caso, el tiempo del análisis es demasiado largo (90 minutos).

26.4. CONSIDERACIONES FINALES

La importancia que tiene la pigmentación de los salmónidos tanto por su costo como por ser un factor clave de comercialización determina la imperiosa necesidad de conocer la concentración de los pigmentos carotenoides presentes en las distintas fuentes de pigmentación, alimentos balanceados y tejidos de los peces.

Las metodologías analíticas utilizadas para este propósito presentan diversas limitaciones y desventajas. Sin embargo, el desarrollo reciente de técnicas cromatográficas de, alta resolución, velocidad, sensitividad, reproducibilidad y operación, nos permite ofrecer actualmente métodos válidos de evaluación y certificación de pigmentación para la Industria Salmonera.

26.5. BIBLIOGRAFÍA

Buchwald, M. y Jencks, W.P. Optical properties of astaxanthin and aggregates. Biochemistry Vol. 7, No2, February 1968.

Fisher, C. and Kocis, J.A. Separation of Paprika pigments by HPLC. J. Agric. Food Chem. 35:57–59, 1987

Gross, R.W. Comunicación personal, 1992.

Lambertsen, G. and Braekkan, O.R. Method of analysis of astaxanthin and its occurrence in some marine products. J.Sci. Fd. Agric. 22: 99–102, febrero 1971.

Sedmak, J.J., Weerasinghe, D.K. and Jolly, S.O. Extraction and quantitation of astaxanthin from Phaffia rhodozyma. Biotechnology Techiques Vol. 4(2): 107–112, 1990.

Aislamiento y propiedades químicas de la hemoglobina

 

Antecedentes

La hemoglobina es una proteína conjugada, cuyo peso molecular es de 64,458 la cual contiene cuatro grupos hem y globina.  Esta última consiste en dos pares ( y ) de cadenas polipeptídicas.  Las diversas cadenas se mantienen unidas por acción de fuerzas no colanetes, formando una proteína globulas tridimensional.  Es probable que en estas fuerzas intervengan puentes de hidrógeno, uniones salinas e interacciones hidrófobas.  La hemoglobina puede considerarse como una enzima que tienen al oxígeno como uno de sus sustratos.  Su reacción con el oxígenos e acompaña de la modificación estructural.  (Wintrobe 1969)

La hemoglobina es un tetrámero compuesto por dos cadenas de cada tipo de bloina alfa de 141 y beta de 146 aminoácidos.  La cadena alfa interactúa con la cadena beta.  La función de la hemoglobina está relacionada con su afinidad por el oxígeno. 

La hemoglobina desoxigenada, que se denomina desoxihemoglobina, tiene una afinidad más bien baja por el oxígeno debido a que los enlaces entrecruzados de los pares de iones de las subunidades de hemoglobina estabilizan las estructuras de las cadenas individuales de modo que la proteína se resite a la fijación al oxígeno.  A medida que el oxígeno se fija a la hemoglobina ocurre un cambio de conformación significativo que desorganiza los enlaces entrecruzados entre las subunidades  e inbremetna en esta forma la afinidad de la proteína por el oxígeno.  Cuando el oxígeno se fija a un sitio de hemo dentro de cada dímero alfa-beta, una subunidad alfa-beta de la hemoglobina gira unos 15° con respecto al otro par alfa-beta.  En la desoxihemoglobina, el hierro está ligeramente fuera del plano del anillo y los seis electrones del orbital del hierro

están acomodados como cuatro electrones desapareados y un par de electrones acomodándose los cinco ligandos.  Cuando se fija el oxígeno la estructura del hierro cambia y en enlace hierro-histidina se hace más corto, los cuatro enlaces a los átomos de nitrógeno son estirados y el hierro se mueve alrededor acercándose al plano.  Una vez que el oxígeno se fija a un hemo, la desorganización de los pares iónicos lleva a un cambio en la estructura cuaternaria, que hace los demás sitios hemo más afines al oxígeno. 

El hem, que constituye alrededor del 4% del peso de la molécula, es un complejo metálico consistente en un átomo de hierro situado en el centro de una estructura porfirínica.  El hem confiere a la hemoglobina su color rojo característico.  El contenido de hierro en la hemoglobina es de 0.3466%. el hierro tiene una valencia de coordinación de seis.  El hierro tiene una valencia de coordinación de seis.  De ellas, cuatro están en un plano y unen al hierro con los átomos de nitrógeno de los anillos pirrólicos del hemo, pero se cree que las dos valencias restantes, están unidas a grupos imadizólicos de dos residuos histidínicos de la globina.  La combinación de la hemoglobina con el oxígeno entraña el desplazamiento del imidazol y conduce a un enlace hierro-oxígeno.   (Wintrobe 1969)

La metahemoglobina se forma cuando la hemoglobina es oxidada a una velocidad que excede a la capacidad enzimática normal de reducir la hemoglobina. Ciertos individuos con daño en la capacidad enzimática para reducir la hemoglobina pueden ser susceptible a cambios oxidativos leves. Existen numerosos agentes que pueden ser responsables de la oxidación. Los mas frecuentes son:

Anilina Benzocaina Cloratos Cloroquina Dapsona Agua contaminada con nitratos Nitratos

Nitritos Nitrofenol Fenazopiridina Primaquina Nitroprusiato de sodio 4-dimetilamino fenol

El hierro contenido en el grupo hem es susceptible a la oxidación química, cambia su valencia de forma ferrosa a férrica.  A pesar de que la oxidación espontánea de la Hb ocurre ininterrumpidamente, el organismo cuenta con mecanismos que le permiten mantener los niveles de metaHb por debajo de 2%.  El principal sistema reductor de la metaHeb es la metahemoglobina reductasa NADH dependiente o diaforasa A, el dinucleótido de adenina niacina proviene de la glicólisis aeróbica.  La enzima cataliza más del 95% de la metaHb producida en el organismo, el resto es catalizado por la metahemoglobina reductasa NADPH dependiente.  El ciclo de las pentosas suministra el NADPH que actúa como cofactor del sistema, su disminución limita la actividad de la enzima. (Martínez y Velásquez 1998)

 

Varios compuestos oxidantes provocan la conversión de HbFe a metaHb Fe  y reducen así la oxigenación hística por 2 mecanismos:

        La metaHb no puede transportar oxígeno (O2) ni dióxido de carbono (CO2), por lo tanto su presencia reduce la capacidad transportadora de la sangre.

        La presencia de Fe3+ cambia la configuración tetramérica del grupo hemo y reduce la liberación de O2 a los tejidos, pues la HbFe3+ tiene mayor afinidad por el O2 ; desplaza la curva de disociación de la Hb a la izquierda.

 

En presencia de hipoxia, secundaria a la metaHb, los eritrocitos se encuentran incapacitados de obtener energía de la glicólisis aerobia, del ciclo de Krebbs y de la cadena respiratoria. La producción de NADPH por el ciclo de las pentosas suple este déficit. El azul de metileno actúa como un importante cofactor del ciclo de las pentosas. (Martínez y Velásquez 1998)

 

Con independencia de otros factores agudos producidos por el agente oxidante (hipotensión y taquicardia, en el caso de los nitritos) las manifestaciones clínicas en los pacientes con metahemoglobinemia dependen de la magnitud de la metaHb y

la susceptibilidad del  paciente a la hipoxia.  La cianosis puede aparecer en pacientes asintomáticos, dada la pigmentación oscura de la metaHb.  La cianosis de los labios y las mucosas requieren de niveles de metaHb superiores al 10 %.  La aparición de otros síntomas y su correlación con los niveles de metaHb depende de la presencia de enfermedades de base. En personas  sanas, valores de metaHb por debajo del 30 % no producen síntomas o provocan manifestaciones mínimas como fatiga y cefalea, entre 30 y 50 % producen depresión moderada del sistema nervioso central (SNC) y el aparato cardiovascular, entre 50 y 70% aparece estupor, bradicardia, depresión respiratoria, convulsiones, arritmias cardíacas y acidosis metabólica y niveles por encima del 70 %, por lo general, no son compatibles con la vida. (Martínez y Velásquez 1998)

 

La carboxihemoglobina es la unión de hemoglobina y monóxido de carbono que tiene una afinidad mucho más alta con la hemoglobina que la que tiene el oxígeno (210 veces mayor ). Este se adhiere a la hemoglobina formando un nuevo compuesto: la carboxihemoglobina. Las grandes cantidades de monóxido de carbono en la sangre ocasionan intoxicación por esta misma sustancia, es decir, las cantidades excesivas de carboxihemoglobina en la sangre impiden el transporte de oxígeno, tomando su lugar en los glóbulos rojos.  Las reacciones tóxicas que ocasiona la inhalación de óxido de carbono se deben en forma exclusiva a la anoxia de los tejidos, pero esto genera alteraciones texturales como edema, pequeñas hemorragias e infiltración perivascular con necrosis focal.  Este gas puede ocasionar daños permantentes en el corazón y el sistema nervioso central. Si la carboxihemoglobina se detecta oportunamente, puede ser efectivo tratarla con 100% de oxígeno para intentar reemplazar el monóxido de carbono por oxígeno.  (Wintrobe 1969)

 

La sulfohemoglobina es un compuesto que se forma por la reacción de la hemoglobina con sulfuros inorgánicos solubles y peróxido de hidrógeno.  Se cree que la formación de sufohamoglobina entraña la introducción de un átomo de

azufre algo lábil en la molécula de hemoblobina y también un cambio en el modo de enlace entre la globina y el hem.  A diferencia de la carboxihemoglobina y la metahoemoglobina, la sulfohemoglobina no puede convertirse en hemoglobina sin que la molécula escinda en sus grupos constituyentes.  Por consiguiente, el tratamiento sólo consiste en evitar el agente causal.  Se observo que la sulfohemoglobinemia sobreviene por lo común a raíz del  consumo crónico de acetanilida o a la feacetina. (Wintrobe 1969)

 

Justificaciones

 

Para extraer la hemoglobina es necesario separar el plasma de la sangre de los glóbulos rojos.  Al centrifugar los 50mL de sangre se separan los eritrocitos del suero que tiene proteínas y otros compuestos disueltos.  Sin embargo, si este proceso se realizara sin un anticoagulante los eritrocitos precipitarían coagulándose y dificultando la extracción de la hemoglobina de ellos.  Luego del decantado se lava con una solución de NaCl al 1.2% para luego de centrifugarlos otra vez y separar bien de los glóbulos rojos todos los solutos del plasma.  Cuando el sobrenadante está claro quiere decir que ya se han eliminado todos los solutos separando los eritrocitos. En el lavado se mezcla cuidadosamente para que no se coagulen los glóbulos rojos.

 

El tolueno es un compuesto orgánico no polar en el que los lípidos de la membrana celular de los eritrocitos son solubles.  Con la agitación en el balón de extracción se promueve la lisis de los glóbulos rojos al mezclarse el tolueno con las membranas celulares, liberando de esta manera la hemoglobina. 

 

Para que se separen bien los compuestos no polares de los compuestos polares se deja reposar una hora.  La hemoglobina es soluble en agua, por lo que queda en solución en la fase acuosa.  La capa acuosa se vuelve a centrifugar para eliminar los compuestos polares del plasma que hayan quedado. 

 

La solución clara que queda de la centrifugación es la oxihemoglobina que se diluye para realizar todas las pruebas cuantitativas y de absorbancia de manera que quede una concentración adecuada para que ocurran las reacciones y se pueda leer la absorbancia.  Se diluye con agua destilada para que no haya interferencia en los resultados.  Se prepara un tubo con 4mL de la solución para poder tener un patrón de referencia con el cual se pueden comparar las pruebas.

 

Para la preparación de deoxihemoglobina, se usa el reactivo de Stockes que consiste en sulfato de hierro heptahidratado y ácido tartárico con hidróxido de amonio.  El protón derivado del ácido tartárico se une a lugares específicos de la molécula de hemoglobina donde hayan grupos amino libres disminuyendo así la afinidad de la molécula de hemoglobina por el oxígeno.  De esta manera la oxihemoglobina pierde sus moléculas de oxígeno y da lugar a la deoxihemoglobina.

 

La metahemoglobina se produce por la reacción de la hemoglobina en presencia de ciertos agentes químicos u orgánicos.  El ferricianato de potasio oxida al hierro de la oxihemoglobina cambiando su  valencia de +2 a +3. Así ya no tiene la misma afinidad que tenía por el oxígeno por lo que éste se libera y al inclinar el tubo se observan las burbujitas.

 

La nitrosilhemoglobina se forma por la reacción de la oxihemoglobina con óxido nítrico, producido in vitro con el nitrito de sodio y el ácido ascórbico.

 

Los espectros de absorción son importantes para la determinación de una cantidad mayor de una de metahemoglobina, carboxihemoglobina o nitrosilhemoglobina ya que de esta forma se puede saber si hay más de lo que debe haber en la sangre y confirmar una metahemoglobulemia por ejemplo.  Todas las lecturas de espectros se realizan desde 450 a 600nm para determinar las diferentes absorbancias dependiendo del grupo del que se trate, si todas las moléculas de oxihemoglobina reaccionan o si es una mezcla y para determinar si había contaminaciones.

 

Los blancos de cada lectura dependen del tratamiento que se le ha dado a la muestra.  Para que la absorbancia de los reactivos no afecten los resultados.  

 

 

Bibliografía

 

Wintrobe, M. HEMATOLOGÍA CLÍNICA. 3ed. Editorial Intermédica. Argentina (1969) 976p.p.

 

INTOXICACIÓN POR SUSTANCIAS METAHEMOGLOBINIZANTES. ESTUDIO RETROSPECTIVO DE 39 PACIENTES

Dr. Jesús Martínez Cabrera y Dr. Raúl Velázquez Ogando

Revista Cubana Med 1998 37(2) paginas 77-82

Centro Nacional de Toxicología