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METODOS DE ESTUDIO Y DIAGNOSTICO VIRAL

María Daniela Sandin

I. INTRODUCCIONLos métodos utilizados para reconocer las infeccionespor virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS eINDIRECTOS, según persigan demostrar la presenciadel virus o de alguno de sus constituyentes (antígeno ogenoma viral) o bien la respuesta de anticuerposespecíficos por parte del huésped en el curso de lainfección.Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnósticoclínico se basan en pruebas serológicas que identificananticuerpos específicos frente a diversas proteínasantigénicas. Sin embargo, existen circunstancias en lascuales son necesarias pruebas que detecten precozmentela infección viral (tratamientos específicos, medidasprofilácticas, etc.).En algunas infecciones virales es posible detectar lapresencia de antígenos virales previamente al desarrollode la seroconversión, siendo esta prueba la únicaevidencia de la exposición al virus cuando no existeaumento de los niveles de anticuerpos circulantes(pacientes inmunodeprimidos).Igualmente la detección del genoma viral puedefavorecer la precocidad del diagnóstico viral y suconfirmación. En la última década se han desarrolladouna serie de técnicas para el diagnóstico viral basadas enla detección de ácidos nucleicos. De ellas la Reacción en

cadena de la polimerasa (PCR) es la más utilizada.En el momento actual, la tendencia en el diagnósticovirológico consiste en emplear nuevas y más sensiblestecnologías de detección de antígenos y de investigaciónde ácidos nucleicos con el propósito de lograr undiagnóstico viral más rápido. El desarrollo dequimioterapia antiviral efectiva es responsable de estatendencia que hace de la identificación rápida, sensible yespecífica de los virus, una necesidad.

II. RECOLECCION, TRANSPORTE YPROCESAMIENTO DE LAS MUESTRASUn elemento crucial para realizar el diagnóstico delaboratorio de un virus, cualquiera sea el métodoempleado, es la toma y el procesamiento de una muestraclínica adecuada.El diagnóstico clínico orientará hacia la pruebaapropiada a realizar, pero además de aquel, se requiereinformación epidemiológica, identificación correcta delpaciente, edad de aquel y la fecha de obtención de lamuestra. También resulta útil averiguar si el paciente harecibido vacunas virales o terapéutica antiviral en unafecha reciente. Dado que los antibióticos no tienen efectosobre los agentes virales se puede obtener una muestrapara cultivo aún cuando la terapéutica contra lasbacterias ya hubiere comenzado.

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Las mejores muestras por lo general son las que seobtienen en un estadio temprano de la enfermedad(dentro de las primeras 72hs), cuando el virus se excretaen concentraciones relativamente elevadas y todavía nose ha unido con anticuerpos. Después de transcurridos 7días habitualmente no vale la pena realizar cultivosvirales cuando se trata de huéspedesinmunocompetentes. No obstante en huéspedesinmunocomprometidos y en las infecciones viralespersistentes o crónicas, el virus puede estar presentedurante períodos prolongados.Las muestras deben obtenerse de forma aséptica si se vaa intentar el aislamiento del virus. El volumen de lamuestra debe ser suficiente como para permitir larealización de los ensayos apropiados y la conservación,por ejemplo: en caso de tener que repetir el ensayo enpruebas adicionales, como PCR.Las muestras pueden obtenerse a partir de :Hisopados: Conjuntivales Genitales Rectales Mucosa oral Lesiones cutáneasSangreAspirado nasofaríngeoLavado bronquioalveolarExpectoraciónOrinaLíquido cefalorraquídeoMateria fecalBiopsias

Dado la gran labilidad de los virus, estos deben sertransportados en un medio de transporte que les proveaestabilidad. Esto se obtiene agregando proteínas comopuede ser la albúmina de bovino o la gelatina. Con elagregado de antibióticos y antifúngicos se logra prevenirel sobredesarrollo de la flora bacteriana y fúngicaresidente del huésped. Además, las muestras debentransportarse a 4ºC (no congelarlas antes del envío,excepto el caso que el traslado implique grandesdistancias), en recipientes estériles adecuados y con tapahermética. Para enviar virus de alta transmisibilidadcomo virus de la Hepatitis B o virus de lainmunodeficiencia humana (VIH), deberá colocarse elrecipiente que contiene la muestra dentro de uncontenedor de preferencia metálico con tapa de rosca yrotularse como peligro biológico. Actualmente sistemasde recolección y transporte de muestras virales se puedenobtener comercialmente.A continuación, detallaremos algunos ejemplos derecolección y transporte de muestras clínicas :Hisopados conjuntivales: Frotar la conjuntiva palpebralcon un hisopo estéril humedecido con solución salinaestéril. Colocar el hisopo en 3-4ml de medio detransporte.Hisopados de lesiones y vesículas cutáneas: Recolectarla muestra dentro de los 3 días de la erupción de la

vesícula. Primero, se lava suavemente la superficie de lavesícula o la lesión con 70% de etanol, luego se aspira elfluido vesicular con una jeringa de tuberculina y secoloca el fluido aspirado en 3-4ml de medio detransporte. Frotar las lesiones cutáneas o vesículasabiertas con un hisopo y colocarlo en 3-4ml de medio detransporte. El hisopado de las vesículas puede sercolocado en el medio de transporte que ya tiene el fluidovesicular.Aspirado nasofaríngeo: Es la muestra de elección paravirus respiratorios. Se introduce una sonda nasogástrica(SNG) por las fosas nasales hasta la rinofaringe y seaspira el mucus en un tubo colector especial. Elcontenido de la SNG se lava con medio de transportepara virus, que se recoge en el tubo colector.Hisopados nasales: Introducir un hisopo de algodón,seco, suavemente en la nariz. Dejar el hisopo en la narizdurante algunos segundos para que las secreciones seanabsorbidas. Colocar el hisopo dentro de 3-4ml de mediode transporte.Hisopados faríngeos : Frotar las amígdalas y faringecon un hisopo de algodón seco. Colocar el hisopo en 3-4ml de medio de transporte.Hisopados rectales: Introducir un hisopo de algodónhumedecido 2-3cm dentro del canal anal realizandomovimientos rotatorios. Colocar el hisopo dentro de 3-4ml de medio de transporte.Heces: Recolectar 2-4g de la muestra en un recipienteestéril.Orina: Recolectar un total de 10-15ml de orinarecientemente emitida en un recipiente estéril y enviarladirectamente al laboratorio.Líquido cefalo raquídeo (LCR): Recolectar al menos0,1ml de LCR (2-3ml preferentemente). Transportarlo allaboratorio inmediatamente.Sangre con anticoagulante (para cultivo viral oinmunofluorescencia): Recolectar sangre entera en untubo que contenga heparina, citrato o EDTA. Enviar lasangre directamente al laboratorio. La rápida entrega (2-6hs) al laboratorio es esencial.Suero (para pruebas serológicas): Recolectar la muestrade sangre en un tubo estéril que no contengaanticoagulantes. Enviar la muestra al laboratorio (nocongelar). De acuerdo al origen de la muestra, esta requerirádiferentes tratamientos previos a ser inoculada. Si lo quese quiere es inocular la muestra en cultivos celulares loque se recomienda es hacerlo inmediatamente después deobtenida.Si el método de estudio a aplicar es unainmunofluorescencia, se confeccionan frotis y se fijan alportaobjeto con acetona, luego pueden ser conservados a-20º o -70º hasta su tinción.En el cuadro 1 se exponen las muestras sugeridas paraser utilizadas en el diagnóstico viral.

III. PRINCIPALES TECNICAS

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IIIa. METODOS DIRECTOSSon aquellos que detectan:1. El virus como agente infeccioso (aislamiento viral).2. La presencia de antígenos virales (técnicasinmunológicas): Inmunofluorescencia (IF),Enzimoinmunoanálisis (EIA), Test de Aglutinación.3.La presencia de ácidos nucleicos virales (PCR, etc.).4.El virus como partícula viral (microscopía electrónica).

1. Aislamiento Viral - Cultivos CelularesLa base del diagnóstico viral es la detección del virus ode sus componentes. El aislamiento del virus era latécnica standard de oro sobre la cual se medían todas lasotras pruebas de diagnóstico viral, pero hoy en día con eldesarrollo de las nuevas técnicas de Biología Molecularya no es la más sensible. De igual forma el aislamientode virus tiene una sensibilidad y una especificidad muyalta. Debido a que sólo se amplifica el virus, se aumentala sensibilidad sin disminuir la especificidad. Sinembargo, existen algunas desventajas en el aislamientodel virus: El proceso suele ser lento, ya que demandadías a semanas para la identificación, y en consecuenciapuede no estar disponible a tiempo para influir en laatención del paciente. Además, es un proceso laborioso ycaro. Por otra parte requiere el uso de sistemas decultivos adecuados, por ejemplo, se necesitan variaslíneas celulares para la detección óptima de virus.Los cultivos celulares son, pues, los biosubstratos máscorrientemente empleados para la propagación de losvirus.Un cultivo celular es obtenido, de explantes de órganos ode embriones de animales.Estas células obtenidas asépticamente se disociantratándolas con una enzima (tripsina) que rompe elcemento intercelular. La suspención de celulas libres asíobtenidas se coloca en la superficie plana de unrecipiente de vidrio o plástico en donde las células seadhieren y multiplican formando una fina capa de célulasque se llama MONOCAPA CELULAR.Esta monocapa de células crece en un medio de cultivocomplejo que contiene albúmina, vitaminas, sales,glucosa, etc., en un sistema buffer. Se previene lacontaminación bacteriana adicionándole al medioantibióticos adecuados.Los cultivos celulares en monocapa son los más usados,aunque hay otros sistemas (cultivos en suspensión,explantos, cultivos de órganos, cultivos en microcarriers,etc.).

Los cultivos celulares se dividen en:Cultivos Primarios: Se obtienen a partir de células,tejidos u órganos tomados directamente del organismo ypueden subcultivarse una o dos veces.Líneas Celulares Diploides: Son aquellas que crecen enpasajes sucesivos hasta aproximadamente 50 subcultivosy que conservan por lo menos en un 75% el cariotipocorrespondiente a la especie de que provienen.Líneas Celulares Continuas: Permite un número finito

de subcultivos y son heteroploides. Para considerar quese ha logrado establecer una línea continua, esta debe dehaber sido subcultivada por lo menos 70 veces.

Las líneas celulares continuas ofrecen las siguientesventajas:• Disponibilidad para todos los investigadores de

stocks de células idénticas, ya sea congeladas enampollas o en monocapa de botella de cultivos, conla posibilidad de reconstituirlas cuando seanecesario.

• Facilidad relativa del pasaje y mantenimiento entodos los laboratorios.

• Libre de contaminación con agentes extraños.

Los distintos cultivos celulares varían en cuanto a sususceptibilidad a los diferentes virus, ya que existe unarelación específica huésped-virus, y es en función de losdatos clínicos y del tipo de muestra que se elige elcultivo para inocular el material. Así por ejemplo la líneacelular HEP-2, son células heteroploides humanasderivadas de carcinoma laríngeo y se recomiendan paravirus respiratorio sincicial (VRS) y Adenovirus.La MRC5, es una línea diploide fibroblástica de pulmónembrionario humano, que se utiliza para el aislamientode Citomegalovirus (CMV), VRS, Herpes, Echo virus,etc. La MDCK, es una línea celular diploide de riñóncanino que se recomienda para el aislamiento del virusInfluenzaLuego de inoculado el cultivo celular, se incuba a 35-37ºC por un período de hasta 14 días promedio, esperandola aparición de efecto citopático, toxicidad odegeneración celular, observando el cultivo almicroscopio a las 24, 48, 72hs y luego 2 veces porsemana. Se usan cultivos celulares no inoculados paracontrol y comparación con cualquier cambiomorfológico observado en los cultivos inoculados. Elefecto citopático es la visualización de cambiosmorfológicos más o menos característicos en las célulasinoculadas producidas por la acción del virus sobre elcultivo celular. Así, por ejemplo, el VRS forma sincicioso células gigantes en HEP-2. Los Adenovirus, célulasredondeadas en HEP-2, con formación de racimosdejando áreas sin células.Cuando los virus no producen efecto citopático, se puederecurrir a técnicas que ponen en evidencia la presenciade aquel en el cultivo. Las más usadas son:hemadsorción, hemaglutinación y tinciones conanticuerpos monoclonales. (Ver 2)Hemadsorción: Hay virus que durante su multiplicaciónintracelular, expresan en la membrana de la célulahuésped elementos estructurales virales llamadoshemaglutininas, glicoproteínas capaces de unirse areceptores específicos en la membrana de glóbulos rojosde diferentes especies animales. De modo que si seagregan glóbulos rojos a un cultivo inoculado, se puedeponer en evidencia la infección de esas células a travésde la unión de los glóbulos rojos a la superficie celular.

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Hemaglutinación: Las hemaglutininas pueden ponerseen evidencia en el sobrenadante de los cultivos utilizandoel mismo fundamento que para la hemadsorción.

2. Detección de Antígenos - Técnicas InmunológicasLas técnicas inmunológicas que desarrollaremos acontinuación, pueden utilizarse tanto para la detección deantígenos (métodos directos), como de anticuerpos(métodos indirectos).En el caso de detección de antígenos, se utiliza unanticuerpo específico antiviral (por lo general IgG) acuya fracción Fc se ha conjugado una molécula marcada,que puede ser isotiocianato de fluoresceína(Inmunofluorecencia), un isótopo radioactivo 125I o131I (RIA), o una enzima: peroxidasa, fosfatasa alcalina,o biotina-avidina (EIA), para objetivar la reacción.Para el procedimiento indirecto (detección deanticuerpos), se emplea un anti-anticuerpo marcado y lareacción se realiza sobre un cultivo celular infectado porel virus en estudio.

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (ID)Es una de las técnicas más antiguas y de uso másdifundido en el laboratorio clínico. El principio básico dela inmunofluorescencia directa se ilustra en la figura 1.Muestras clínicas apropiadas son recolectadas ycolocadas sobre portaobjetos donde se dejan secar yfijar. Luego se agregan anticuerpos especificos marcadoscon isotiocianato de fluoresceína que difunden a travésde la membrana celular y se combinan con los antígenosvíricos en el interior de las células. La reacción antígenoanticuerpo se visualiza con el microscopio defluorescencia, por la aparición de fluorescencia de colorverde manzana. Esta técnica se puede utilizar para una identificaciónrápida del virus directamente sobre la muestra (porejemplo: células eluidas de un lavado nasal, o de unhisopado nasofaríngeo), o se la puede emplear para laconfirmación del efecto citopático observado en cultivoscelulares.Además con el uso de anticuerpos monoclonalesespecíficos para los antígenos tempranos inmediatos delCitomegalovirus (CMV) es posible determinar lapresencia del CMV en cultivos celulares días antes delreconocimiento del efecto citopático. Sin embargo larealización de la reacción es laboriosa, depende muchode la calidad de los reactivos, requiere un microscopio defluorescencia y de una persona con experiencia parallegar a un diagnóstico certero, así como una recoleccióny preparación de la muestra adecuada.Aun así, el método, en manos de una persona conexperiencia resulta útil para la identificación rápida deciertos virus como los virus respiratorios, ya que nosproporciona un diagnóstico etiológico en el curso de unajornada de trabajo. Además puede estudiar variasmuestras simultáneamente.El advenimiento de los anticuerpos monoclonales, haincrementado la especificidad y en algunos casos la

sensibilidad de estos ensayos. Los anticuerposmonoclonales conjugados con isotiocianato defluoresceína pueden utilizarse para identificar el virusRespiratorio Sincicial (VRS), Influenza A y B,Parainfluenza 1,2 y 3 y Adenovirus entre otros, así comopara subtipificar especies virales como, por ejemplo,virus Herpes Simple (HSV) de tipo 1 y 2. Esta técnicarequiere sólo 2-4hs, y se ha reportado una sensibilidaddel 70-80 % comparada con cultivos celulares para laidentificación de virus Herpes Simple, 80-95% para VRSy 71% para Influenza A.La tinción con inmunoperoxidasa es similar a la de lainmunofluorescencia y es la técnica de elección enalgunos laboratorios. El procedimiento implica unospocos pasos adicionales ya que en este caso el anticuerpomonoclonal esta marcado con una enzima que requiere laadición de un substrato para evidenciar la reacción porun cambio de color que es visible micro ymacroscópicamente.

TEST DE AGLUTINACIONEl test de aglutinación es un método simple, de un solopaso, que a veces se usa para la detección de antígenosvirales en muestras clínicas. Los ensayos de aglutinación,dependen de la fijación inicial de anticuerpos antiviralesespecíficos sobre eritrocitos o partículas de látex. Luegoeste reactivo se incuba con la muestra clínica en la cualse investiga el antígeno y las partículas se aglutinan si elantígeno adecuado se encuentra presente. Estas pruebasen general se complementan o se confirman por mediode otros ensayos debido al elevado porcentaje dereacciones inespecíficas.El test de aglutinación ha sido usado para detectarantígeno de Rotavirus en heces (el más importante)mostrando una buena sensibilidad cuando se lo comparacon el EIA para Rotavirus. Además es una técnica rápiday barata. También se la ha usado para detectar antígenosde Adenovirus.

RADIOINMUNOENSAYO (RIA)Fue originalmente aplicado para identificar el antígenode superficie de la Hepatitis B (HBsAg) y el anticuerpo

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anti-HBsAg. Estos ensayos tienen una buena sensibilidady especificidad, pero la aparición de un método como elensayo inmunoenzimático (EIA) con su mayor tiempo deconservación de los reactivos, su costo relativamentemás bajo y la ausencia de residuos radioactivos, hareemplazado las técnicas de RIA en la mayor parte de loscasos de detección de antígeno viral.

ENZIMOINMUNOANALISIS (EIA)Los EIA para la detección de antígeno se basanhabitualmente en la captura del antígeno por anticuerposespecíficos unidos a una fase sólida, en general el pocillode una microplaca o una pequeña esfera de plástico. Elantígeno viral presente en la muestra clínica se combinacon el anticuerpo fijado a la fase sólida y el antígenoviral se detecta mediante la adición de otro anticuerpoespecífico conjugado a una enzima. La enzimaconjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. Elsubstrato para esas enzimas varía. En la reacción con laperoxidasa el substrato es un peróxido capaz de oxidarun compuesto químico incoloro que en su forma oxidadatiene un color característico.En el caso de la fosfatasa la desfosforilización es laresponsable directa de la aparición del color.Por esta técnica se puede procesar gran número demuestras en forma rápida y automatizada, no requiriendode un observador experimentado para leer los resultados,ya que estos se leen por medio de espectrofotómetrosespecialmente diseñados, siendo entonces una técnicamás objetiva. Fig. 2.

3. Técnicas de Biología MolecularInvestigación de ácidos nucleicos viralesLas técnicas de estudio y diagnóstico que a continuaciónse presentan, constituyen una herramienta ingeniosa

desarrolladas a partir de los estudios de la BiologíaMolecular.

SONDAS DE ACIDOS NUCLEICOSActualmente es posible extraer secuencias específicas deun fragmento de ADN por medio de las endonucleasasde restricción. Luego estas secuencias extraídas, sepueden desnaturalizar y marcar ya sea con una enzima ocon un isótopo radioactivo. A estas cadenas marcadas yque tienen una secuencia conocida se llaman sondas deácidos nucleicos. Hoy en día se están produciendosondas de ácidos nucleicos sintéticas, con lo que seobtiene sondas de oligonucleótidos de muy altaespecificidad que están disponibles comercialmente yson las más usadas en los laboratorios.

DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOSVIRALES POR SONDA SINTETICAEs un ensayo de hibridación molecular con una sondamarcada. Las hibridaciones pueden ser: DNA-DNA,RNA-RNA y RNA-DNA.Primero se trata a muestras con reactivos que solubilizany desnaturalizan los ácidos nucleicos. Posteriormente seañade un DNA marcado, complementario del DNA delvirus y se incuba en condiciones para que se produzca lahibridación. La muestra se pasa entonces por unacolumna que contiene un gel que separa la sonda ligadaal DNA viral hibridado de la no hibridada.Dependiendo de como este marcada la sonda, se detectala hibridación: Si está marcada con un isótopo radiactivose puede hacer una lectura en un contador gamma demanera que la cantidad de radiación medida en lacolumna es directamente proporcional a la cantidad deDNA viral presente en el suero problema o también sepuede realizar la electroforesis del DNA hibridado con lasonda marcada en gel de poliacrilamida y detectar laradioactividad emitida por la sonda mediante laaplicación de una placa de rayos X (Autoradiografía). Siesta marcada con una enzima se detecta por una simpleevaluación colorimétrica. Citomegalovirus, Papilomavirus y Epstein-Barr virushan sido identificados usando sondas de ácidosnucleicos. Fig. 3.

AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOSVIRALES MEDIANTE UNA REACCION ENCADENA DE LA POLIMERASA (PCR)Una nueva técnica, llamada Reacción en Cadena de laPolimerasa (PCR), fue desarrollada por Saiki et al., paraincrementar el número de moléculas de DNA blanco enlas muestras. Tiene una sensibilidad tan alta que puedeamplificar una única molécula de DNA y una sola copiade genes puede ser extraída, de mezclas complejas desecuencias genómicas y visualizada como bandasdiferentes en geles de agarosa.La PCR es, por tanto, una amplificación de secuenciasespecíficas del DNA. Se basa en la utilización desecuencias cortas de nucleótidos sintéticos llamados

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primers o cebadores, que se hibridan de forma especificacon cada una de las cadenas de DNA , previamentedesnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Para quela reacción tenga lugar se usa una enzima, Taq pol (ADNPolimerasa termoestable obtenida de la bacteria Thermusaquaticus) y deoxinucleótidos trifosfatos. La funciónnatural de la DNA polimerasa consiste en reparar yreplicar el DNA. Los deoxinucleótidos trifosfatos senecesitan como ladrillos para la construcción. Elnucleótido al cual se una la polimerasa serácomplementario de la base en la posicióncorrespondiente de la cadena templado. Se sintetiza asíuna cadena simple de DNA, complementaria y alineada acada "primer ".Se realiza una serie repetida de ciclos cada unocompuesto por 3 pasos básicos:

a. Desnaturalización del ADN doble cadena por laelevada temperatura (95ºC).

b. Acoplamiento de los primers, desciende latemperatura (entre 55ºC-72ºC).

c. Elongación del primers, aquí se eleva latemperatura a 72ºC permitiendo laincorporación de los deoxinucleótidos.

Mientras tanto se van deplecionando los primers y losdeoxinucleótidos, y se van sintetizando nuevas cadenasde DNA. Al final se consiguen miles de copias de DNAdel fragmento de DNA limitado por los "primers ".Los fragmentos de DNA así obtenidos se puedenidentificar por varias técnicas: visualización en geles deagarosa o poliacrilamida mediante tinción con bromurode etidio y examen con luz ultravioleta, o hibridacióncon una sonda marcada. La combinación de la PCR y lassondas de ácidos nucleicos marcadas promete ser elmétodo más sensible para la detección e identificaciónde los virus. Fig. 4.

4. Microscopía ElectrónicaMediante el microscopio electrónico es posible observarla morfología de los viriones presentes en muestrasclínicas. La limitación del método además del costo delmicroscopio, es que necesita de una alta concentraciónde viriones (aproximadamente 109 partículas virales/ml,

dependiendo del virus) presentes en la muestra, por elloes poco sensible. Esto hace que sea una técnica pocoutilizada, más aún con el desarrollo de técnicasalternativas de utilidad similar.El microscopio electrónico nos permite, por ejemplo,obtener resultados positivos rápidos de muestras dematerias fecales de pacientes con diarrea, ya que tantolos Rotavirus, como los Adenovirus, Coronavirus yCalcivirus pueden ser visualizados e identificados comocausantes de enfermedad. Por ejemplo, los Rotavirusposeen una forma característica en doble rueda y untamaño distintivo, 70nm de diámetro, y se los encuentraen concentraciones de hasta 1011 partículas virales porgramo de heces. También en otras muestras, comolíquido vesicular, biopsia de tejidos, verrugas, orina osuero es posible obtener resultados positivos, mediantecoloración negativa. Si la concentración de virus en lamuestra clínica es baja, y por tanto no visible

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directamente por microscopio electrónico, se puedenutilizar técnicas que aumenten la visualización, porejemplo, la inmunoelectromicroscopía, que consiste en elagregado de anticuerpos específicos antivirales y laformación de agregados de partículas que son másfácilmente visibles que las partículas solas. Fig. 5.

II.b METODOS INDIRECTOSSon aquellos que reconocen la respuesta inmune(humoral o celular) por parte del huésped: . Detección de anticuerpos específicos antivirales

por técnicas inmunológicas (EIA, IFI,WB,etc.).

. Producción de anticuerpos in vitro.En el curso de una infección varían las poblaciones deanticuerpos frente al agente infectante. En una primerafase la clase predominante suele ser IgM, mientras quecon el transcurso del tiempo las IgM disminuyen hastadesaparecer o quedar a baja concentración residual y, encambio, aumentan las IgG. La búsqueda de anticuerposclase IgM es de utilidad para hacer diagnóstico deinfección reciente en una sola muestra de suero extraídaen el período agudo de la enfermedad. Este método seemplea para el diagnóstico de enfermedades como:Rubéola, Citomegalovirus, Hepatitis a virus A, etc.La búsqueda de anticuerpos clase IgG en una solamuestra se utiliza como técnica de tamizaje, por ejemplo,para el diagnóstico de la infección por el virus de lainmunodeficiencia humana (VIH). Posteriormente loshallazgos positivos son confirmados en la misma muestrade suero por otra metodología.La seroconversión es el aumento del título de anticuerposcuatro veces o más observado en dos muestras pareadasde suero. La primera muestra se obtendrá en el períodoagudo de la enfermedad y la segunda, 15 a 21 díasdespués de la primera, en el período de convalesencia. La seroconversión es útil para establecer el diagnósticoretrospectivo, pero no para el diagnóstico temprano deuna infección, puesto que debemos esperar al período deconvalecencia para obtener la segunda muestra del suero.Este tipo de diagnóstico es útil para estudiosepidemiológicos.Las diferencias de títulos deben ser mayores de cuatroveces para tener valor estadístico y se debería estudiarambas muestras simultáneamente.Las determinaciones serológicas también nos puedeninformar sobre el estado inmune del paciente frente amuchas infecciones virales, como paperas, sarampión yrubéola, donde la presencia de anticuerpos específicosindica que el individuo ha estado expuesto previamenteal virus y que es inmune para una nueva infección.A veces el diagnóstico serológico tiene dificultades, porejemplo: cuando se realiza en recién nacidos paraidentificar la causa de una infección congénita. Laevaluación de los resultados en este caso es difícilporque los ensayos serológicos detectan ante todo IgG, ymucha de la IgG presente en el suero del niño provino de

la madre por vía transplacentaria y no es posiblediferenciar la IgG del niño de la IgG de la madre.Tradicionalmente, el diagnóstico de las enfermedadesvirales congénitas se realiza mediante determinacionesseriadas de IgG en el suero. El descenso del titulo deanticuerpos indica que los anticuerpos eran maternos yque el niño no está infectado. El aumento en el título deanticuerpos indica que el niño esta produciendoanticuerpos y por lo tanto esta infectado. Sin embargo,hoy en día el diagnóstico serológico viral se hasimplificado con las nuevas técnicas que detectan IgM,ya que la detección de IgM específica en el suero delniño confirma que el niño está infectado, porque la IgMno atraviesa la placenta y por tanto no puede ser deorigen materno.

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A continuación, se describirán los métodos serológicosmás comúnmente usados en el diagnóstico viral.Los métodos tradicionales para el diagnóstico serológicode las infecciones virales incluyen: la neutralización, lainhibición de la hemaglutinación (IHA) y lahemaglutinación indirecta (HAI). La confirmaciónserológica de una infección aguda por cualquiera deestas técnicas tradicionales esta dada por un aumento decuatro veces o mayor en el titulo de anticuerpos cuandose emplean diluciones al doble seriadas.En los últimos años se han desarrollado nuevos métodospara la detección de anticuerpos virales, y en muchoscasos han demostrado ser mejores que las pruebastradicionales en términos de economía, sensibilidad,especificidad y rapidez. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)La IFI, es un método rápido y confiable para ladeterminación de anticuerpos antivirales en el suero delpaciente. El principio de la técnica se ilustra en lafigura......Se basa en la unión de anticuerpos antivirales presentesen el suero del paciente a los antígenos viralesexpresados en la superficie y citoplasma de célulasinfectadas, que han sido fijadas a un portaobjeto devidrio. Como control de especificidad se usan células noinfectadas.El procedimiento es el que sigue: Se incuba el suero delpaciente con las células infectadas y no infectadas.Luego se realiza un lavado con PBS y se agregaposteriormente anticuerpo anti IgG humana conjugadacon isotiocianato de fluoresceína. El isotiocianato defluoresceína es una sustancia que se vuelve fluorescentea la exposición de la luz ultravioleta y emite una luzverde característica.El conjugado se unirá a los anticuerpos del paciente si lareacción es positiva, leyéndose la prueba en unmicroscopio de fluorescencia.La presencia de Ac se evidencia por la aparición defluorescencia en el citoplasma y superficie de las célulasinfectadas, mientras que las células control nofluorescen.

ENZIMOINMUNOANALISIS INDIRECTO (EIA)Los EIA indirectos se han aplicado de forma amplia enlos últimos años al diagnóstico de anticuerpos virales.Tiene las ventajas de ser un método versátil,relativamente económico, sensible y de lectura objetiva(instrumental).La metodología es la siguiente: Los antígenos virales seinmovilizan sobre una fase sólida (esferita, policubetaspara microtitulación u otros elementos de plástico) y seagregan los sueros en estudio; se incuban, se lavan y serevela la reacción Ag-Ac por el agregado de unainmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima,seguida por el substrato apropiado para esta. Losresultados se pueden leer con un espectrofotómetro y enalgunos casos de forma visual.

TEST DE AGLUTINACIONEl fundamento y el procedimiento de esta técnica ya fuedescripto para el estudio de Ag viral (método directo).Ahora lo que buscamos es detectar anticuerposantivirales, por eso se usan partículas de látex recubiertascon Ag viral. Fig. 8.

WESTERN BLOT (WB)Las técnicas inmunológicas de Inmunoblot estánencontrando amplias aplicaciones en el diagnósticovirológico. Son particularmente útiles para el diagnósticodel HIV.La técnica de WB se basa en la separaciónelectroforética de proteínas virales que sonposteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosacon el objeto de determinar la presencia de anticuerposespecíficos contra cada una de esas proteínas.

Esta técnica se realiza esquemáticamente en 3 pasos:

1. Se produce en cultivos celulares grandescantidades de virus que luego son tratadosquímicamente para su disgregación einactivación. Los antígenos resultantes dellisado viral se separan por electroforesis en gelde Poliacrilamida.

2. Se realiza una transferencia (blotting oelectrotransferencia) de los Ag separados amembranas de nitrocelulosa.

3. Se coloca el suero del paciente sobre lamembrana de nitrocelulosa. Posteriormente seañaden anticuerpos anti-inmunoglobulinahumana unida a una enzima (peroxidasa ofosfatasa alcalina) y, por último, se agrega elsubstrato enzimático para la visualización de lasbandas reactivas con un producto finalcoloreado.

La técnica es muy similar a un EIA, menos sensible peromás específica que esta.En la práctica sólo el 3er paso es el que se realiza en loslaboratorios de diagnóstico, ya que los equipos

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comerciales proveen de las tirillas con los antígenos.(Esto facilita la estandarización de las determinaciones).

PRODUCCION DE ANTICUERPOS IN VITROSe trata de una técnica nueva que ha sido aplicada para eldiagnóstico de la infección perinatal. Este procedimientorevela la presencia de anticuerpos antivirales producidosin vitro a partir de los linfocitos B extraídos de sangretotal, lo que indicaría que el sistema inmune del pacienteha sido estimulado por el virus.La producción de Ac antivirales in vitro promete ser degran valor en el diagnóstico temprano de niñosinfectados por VIH.

IV. LA ELECCION DE UNA PRUEBADIAGNOSTICAEn la valoración de los diferentes procedimientos dediagnóstico descriptos, se pueden considerar tresparámetros de importancia fundamental:SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD y VALORPREDICTIVO. Se define cada uno de ellos de lasiguiente manera:SENSIBILIDAD: Proporción de personas con lainfección que reaccionan positivamente en la pruebadiagnóstica realizada. Por ejemplo: Una pruebadiagnóstica será más sensible, cuando detecte un mayornúmero de personas infectadas o enfermas.Se calcula de esta forma:

Reactivos positivos X 100Reactivos positivos + Falsos negativos

ESPECIFICIDAD: Es la proporción de personas sin lainfección o enfermedad que reaccionan como negativos.Por ejemplo: Una prueba es más específica cuando tienemenos reacciones positivas entre las muestras depersonas que no tienen la enfermedad.

Se calcula:No Reactivos X 100

No Reactivos + Falsos positivos

VALOR PREDICTIVO: Es la probabilidad de tener laenfermedad dado el resultado del test.Hay dos tipos:

Valor Predictivo Positivo: Es la probabilidad de tenerla enfermedad si el resultado del test es positivo.

Se calcula:Reactivos positivos X 100

Reactivos positivos + Falsos positivos

Valor Predictivo Negativo: Es la probabilidad de notener la enfermedad si el resultado del test es negativo.

Se calcula:No Reactivos X 100

No Reactivos + Falsos negativos

Los valores predictivos de los test lo determinan lasensibilidad, la especificidad y la prevalencia de laenfermedad en la población a la que se le aplique el test.Un test de alto valor predictivo negativo será aquel quetenga una alta especificidad y no necesariamente una altasensibilidad. Por el contrario, un test de alto valorpredictivo positivo tendrá que tener una granespecificidad ya que debe acertar la positividad de lasmuestras realmente positivas.Un test ideal sería aquel que detectara el 100% de laspersonas con la enfermedad y excluyera el 100% de laspersonas sin la enfermedad, no dando nunca resultadosfalsos positivos o falsos negativos. Desafortunadamente,esto no ocurre con las técnicas disponibles actualmente.En la elección del método diagnóstico además de lasensibilidad y especificidad se debe considerar aspectosoperativos en las técnicas a ser usadas, como ser: costos,complejidad técnica del ensayo, volumen necesario ypreparación de la muestra, tiempo que requiere elproceso, disponibilidad comercial de los kit de calidadreconocida. Además se debe considerar el nivel decomplejidad del laboratorio y la disponibilidadtecnológica y de recursos que requiere cada técnica.

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