Metodos de identificacion_bacteriana

Métodos de identificación bacteriana

María Belén Huertas Chacó[email protected]

http://paratecnicosdelaboratorio.blogspot.com.es/



Identificación bacteriana

• Labor principal laboratorio de microbiología: o Identificación de los microorganismos implicados

en procesos clínicos asociados a infecciones.o Conocer las implicaciones patológicas y la

evolución clínica.o Aplicar una terapia antimicrobiana eficazo Asignar una especie al aislamiento

microbiano.

APLICACIÓN DE TÉCNICAS FENOTÍPICAS

María Belén Huetas Chacón 2

• Métodos fenotípicos o "tradicionales"

• Métodos moleculares• Métodos basados en proteómica




• Características fenotípicas:o Morfología en la tinción de Gramo Cto. en los distintos medios de cultivoo Cto. en diferentes atmósferaso Oxidasao Catalasa



• Identificación del géneroo Características del cultivo

Atmósfera de incubacióno Pruebas primarias

Tinción de Gram Morfología colonias Catalasa Oxidasa Oxidación-fermentación Fermentación de la glucosa Producción de esporas



• Conclusión: (Identificación de la especie)Estas pruebas deben ser suficientes para

identificar labacteria causante de la infección, pero si con esta batería de pruebas no

identificaramos la bacteria siempre podríamos recurrir a los sistemas comerciales.


Identificación fenotípica

• Característias microscópicas• Características macroscópicas• Cultivo• Pruebas bioquímicas• Pruebas basadas en la resistencia a ciertas

substancias• Sistemas comerciales



• Característias microscópicaso Examen en frescoo Tinciones

• Características macroscópicaso Morfologíao Hemólisis

• Cultivoo Medios de cultivoo Requisitos de crecimiento

Atmósfera Temperatura Nutrición



• Pruebas bioquímicaso Pruebas con lectura inmediatao Pruebas rápidas (con lecturas en menos de 6

horas)o Pruebas lentas (con lectura de 18 a 48 horas)

• Pruebas basadas en la resistencia a ciertas substanciaso Optoquinao Bacitracinao Solubiliad en bilis

• Sistemas comercialeso Sistemas manualeso Sistemas automáticos


Identificación fenotípica• Característias microscópicas

o El estudio microscópico en fresco y tras tinción revela la forma y manerade agruparse, la estructura de las celulas y su tamaño.

o La tinción es el primer paso (el único algunas veces) para la identificación bacteriana.

Las tinciones más utilizadas son: Azul de Metileno Gram

La tinción de Gram es la tinción más importante, y en algunas ocasiones (LCR) la Primera y/o única herramienta para un diagnóstico


Identificación fenotípica• Características macroscópicas

o La morfología de las colonias: Fundamental para la identificación preliminar así como la diferenciación de microorganismos (colonias de cultivo fresco, medios no selectivos y preferiblemente aislamiento de la bacteria en cultivo puro) Tamaño Forma Textura Color



o Hemólisis: Agunas bacterias producen hemolisínas que

causan la lisis de los hematíes en medios que contienen sangreBeta. Zona clara alrededor de la coloniaAlfa. Halo verdoso alrededor de la colonia


Identificación fenotípica • Cultivo

o Medios de cultivo: En los medios de cultivo las bacterias se multiplican

pero se necesita esperar entre 18 y 24 horas. Para ello las bacterias necesitan una fuente de energía, una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, algunas sales, oligoelementos y agua. Líquidos. Las substancias nutritivas se

encuentran disueltas. E. crecimieneto sueleser mayor

Sólidos. Consisten en una base de agar. Permite disponer de las colonias bacterianas

Capacidad para permitir crecimiento bacterias



Medios básicos. Ricos en nutrientes que permiten que permiten el crecimiento de la mayoría de las bacterias

Medios de enriquecimiento. Están desarrollados para recuperar bacterias exigentes (requisitos nutricionales. Suelen ser medios líquidos

Medios selectivos. Fomentan el cto. de algunas bacterias e impoden el de otras



Medios diferenciales. Se utilizan para poner de manifiesto características distintivas de las colonias. Distinguen entre los distintos grupos bacterianos casi siempre por el color de las colonias

Medios cromogénicos. Incorporan substancias cromogénicas para detectar distintas enzimas producidas por los microorganismos. Cuando la bacteria produce la enzima hidroliza el sustrato liberando el compuesto cromogénico que adquiere un color intenso dando color a la colonia.


Identificación fenotípica o Requisitos de crecimiento

Atmósfera: Aerobias estrictas: crecen sólo en presencia

de oxígeno. Anaerobias estrictas: Crecen sólo en ausencia

de oxígeno. Facultativas: Crecen tanto en aerobiosis

como en anaerobiosis. Microaerófilas: crecen mejor en una

atmósfera reducida de oxígeno. Capnofílicas: requieren CO2 adicional para

crecer.


Identificación fenotípica Temperatura.

Psicrofílicas: Pueden crecer a bajas temperaturas entre 2 - 5ºC (óptima 10 - 30ºC)

Mesofílicas: Requieren para su crecimiento temperatura entre 10 - 45ºC (Tª óptima entre 30 - 40ºC)

Termofílicas: Crecen muy poco a 37ºC (Tª óptima enre 50 - 60ºC)

La mayoría de las bacterias son MESOFÍLICAS



Nutrición Capacidad para crecer en medios ordinarios Capacidad para crecer en medios con adición

de sangre, suero o glucosa Necesidad de factores específicos: Factor X (hemina) Factor V (NAD) Haemophilus spp



• Pruebas bioquímicas Las pruebas bioquímicas nos permiten determinar

las características metabólicas de las bacteriaso Pruebas de lectura inmediatao Pruebas de lectura rápida (menos de 6 horas)o Pruebas de lectura lenta (entre 18 y 48 horas)



o Pruebas de lectura inmediata: Catalasa: Diferenciar Microccocacceae (positivo)

de Streptococcus spp y Enterococcus spp (negativo)

Oxidasa: Determinar la presencia de la enzima oxidasa. Neisserias: Oxidasa positiva Pseudomonas (Oxidasa positiva) de otras

enterobacterias oxidasa negativa



o Pruebas de lecturas rápidas: Lectura de los resultados en menos de 6 horas. Hidrólisis del hipurato: Para la identificación de

Campylobacter jejuni, Listeria monocitogenes, Gardneella vaginalis, y Streptococcus agalactiae

ONPG (Beta-galactosidasa): Con ella demostramos la presencia de la enzima Beta - galactosidasa. Todas las bacterias fermentadoras lentas de la lactosa son Beta-galactosidasa positivas.



PYR: Identificación de Streptococcus pyogenes y Enterococcus spp. También en la diferenciación Staphylococcus lugdunensis de otros estafilococos coagulasa negativos.

LAP: Identificación de cocos grampositivos catalasa negativa

Ureasas: Diferenciar Proteus (positiva) de otras enterobacterias. También se utiliza para la diferenciación entre Physobacter phenylpyruvicus y Moraxella spp Helicobacter pylori y Brucella spp que también hidrolizan la urea.


Identificación fenotípica Indol: Detecta liberación de indol en un

compuesto bacteriano. E coli: Indol positivo Klebsiella spp: indol negativo

o Pruebas lentas: Lectura entre las 18 y 48 horas Oxido-Fermentación: Indica el tipo de

metaboismo energético de la bacteria, respiratorio, es decir, oxidativo (O) o fermentador (F). La bacteria se inocula en el medio y se incuba en aerobiosis y anaerobiosis simultáneamente


Identificación fenotípica Reducción de nitratos:

Asignar bacterias a la familia Enterobacteriaceae

Diferenciar Moraxella catatthalis del género Neisseria

Identificación de bacilos grampositivos aerobios

Rojo de metilo: Identificación a nivel de especie de los bacilos entéricos gramnegativos.

Voges-Proskauer: Identificación a nivel de especie de bacilos entéricos gramnegativos, Aeromonas spp y Vibrio spp



Agar hierro de Kligler: Capacidad de metabolizar un hidrato de

carbono específico (glucosa, lactosa o ambas)

Producción o no de gases CO2 e H2

Producción de ácido sulfhídrico (SH2) Otro medio sería el TSI (Triple Sugar Iron) que contiene un tercer hidrato de carbono: la sacarosa

Fermentación de azúcares Hidrólisis de la esculina Coagulasa: Diferenciar S aureus (positiva) de

otros Staphylococcus María Belén Huetas Chacón 25

Identificación fenotípica Fenilalanina-desaminasa: Diferenciar Proteus,

Providencia y Morganella de otros género de enterobacterias.

ADNasa Hidrólisis de la gelatina Descarboxilasas Lipasa Lecitinasa Utilización de citrato: Entre las enterobacterias,

Enterobacter, Serratia, Klebsiella, Citrobacter y algunas especies de Salmonella.



Utilización de malonato Prueba de CAMP

• Pruebas basadas en la resistencia a ciertas substancias:o Optoquina: Inhibe crecimiento de S pneumniae,

pero no de otros Streptococcus alfa-hemolíticoso Bacitracina: Los streptococcus beta-hemolíticos

del grupo A suelen ser sensibles a bajas concentraciones de bacitracina.



o Solubilidad en bilis: Se basa en la capacidad de determinadas especies bacterianas de lisarse en presencia de sales biliares, el efecto de esta enzima autolítica se pone de manifiesto sobre colonias de S pneumoniae

o Crecimiento en caldo hipersalino• Sistemas comerciales

o Sistemas comerciales manuales o galerías multipruebas

o Sistemas comerciales automatizados


2011María Belén Huetas Chacón 29

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