Métodos diagnósticos usados en inmunología

Introducción

Las pruebas serológicas son las que estudian los anticuerpos en el suero.Dentro de los procedimientos inmunológicos, los más útiles y prácticos son los que se basan en la especificidad de la unión Ag-An o sea los métodos inmunoquímicos.Recordemos que los Ag-An interactúan por complementariedad espacial y que ambos se asocian por puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, fuerzas electrostáticas y fuerzas de van der walls todas estas uniones son no covalentes.Las uniones Ag-An son reversibles.

Introducción (2)

La especificidad de esa unión y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenómenos de precipitación, aglutinación y otros mecanismos indirectos hacen que estos métodos se empleen ampliamente.Además de estos métodos basados en la unión Ag- An existen otros basados en la respuesta inmunitaria.

Introducción (3)

Criterios que determinan cuál es la mejor prueba diagnóstica:a) Costob) Sensibilidad: Habilidad de una prueba para detectar

todos los verdaderos positivos.c) Especificidad: Habilidad de una prueba para detectar

solo a los verdaderos positivos.Tanto la especificidad como la sensibilidad van de la mano y cuando se afecta una también lo hace la otra.Cuando aumenta una la otra disminuye y viceversa.

Introducción (4)

d) Rapidez.e) Disponibilidad.Principales métodos inmunoquimicos:1. Técnicas de precipitación.2. Técnicas de aglutinación.3. Técnicas de inmunofluorescencia.4. Técnicas de RIA.5. Técnicas de enzimoinmunoanálisis.6. Técnicas nefelométricas.7. Cromatografía de afinidad.8. Inmunoprecipitación e inmunoblotting

Técnicas de precipitación

En estas técnicas se requiere que tanto el Ag como el An estén en un medio fluído en el que sea posible la precipitación del complejo antígeno anticuerpo.Son fáciles de realizar y en general son cuantitativas.Requieren de grandes cantidades de Ag y An para medir el precipitado formado por lo que no son muy usadas.

Técnicas de precipitación (2)

Entre ellas tenemos;a) Inmunoprecipitación simple.b) Doble precipitación u Ouchterlony.c) Inmunoelectroforesis.d) Inmunodifusión radial simple o de Manzini.

Inmunoelectroforesis

Usos:a) Discrasias de células plasmáticas.b) Hipo e hipergammaglobulinemiac) Trastornos autoinmunes.d) Enfermedades neurológicas que cursan con

aumento de proteínas en el LCR.

Inmunodifusión radial simple o de Manzini

Usos:a) Identificación y cuantificación de las Igs.b) Identificación de factores del complemento.c) Identificación y cuantificación de transferrina, proteína

c reactiva y alfa feto proteína.Es un método rápido y práctico pero no tiene una elevada sensibilidad.Es una técnica cuantitativa.Ella permite cuantificar Ag porque la concentración de Ag es proporcional a el área del círculo de precipitación.

Técnicas de aglutinación

Son semicuantitativas y más difíciles de realizar que las de precipitación pero más sensibles.En ellas el Ag se encuentra formando parte o unido a células , bacterias o partículas y la reacción Ag-An se puede detectar por el aglutinado celular o bacteriano formado.Generalmente las partículas que se usan son partículas de látex.Usos:a) Tipificar glóbulos rojos.b) Identificar bacterias.Clasificación:c) Directad) Indirecta.

Técnicas de aglutinación (2)

Usos de la hemaglutinación directa:a) Tipificación de GR y Rh.Usos de la hemaglutinación indirecta:b) Medida de la gonadotropina coriónica en el

embarazo .c) Detección del ag de la hepatitis B.d) Detección del factor 8 de la coagulación para

el diagnóstico de hemofilia.

Técnica de aglutinación (3)

Pruebas de aplicación clínica que emplean reacciones de aglutinación.1. Prueba de Coombs o de antiglobulina se usa en el

diagnóstico de anemias hemolíticas.2. Prueba de floculación de bentonita, se usa para detectar

An contra trichinella y contra DNA.3. Prueba de fijación del látex se usa para la detección del

factor reumatoideo.4. Prueba de Roose – Waaler también para detectar factor

reumatoideo es menos sensible y más específica que la anterior.

Técnicas de inmunofluorescencia

La IF es la propiedad de ciertas moléculas que al ser irradiadas con energía electromagnética adecuada emiten radiación de longitud de onda característica permitiendo su identificación y cuantificación.La molécula que fluoresce se fija al anticuerpo y se incuba el tejido o célula con el An marcado y es detectada usando luz UVLos fluorocromos utilizados son; fluoresceína, rodamina, texas red, Cy3, Cy5.

Técnicas de inmunofluorescencia (2)

Estas técnicas se usan cuando los anticuerpos no pueden ser puestos en evidencia por las técnicas de precipitación, aglutinación o fijación del complemento.Se usan en el estudio de las subpoblaciones linfocitarias.Esta técnica es más sensible que la fijación del complemento y menos que la hemaglutinación.Ella puede ser: a) Directab) Indirecta

Técnicas de inmunofluorescencia (3)

Desventaja de la IFD;Es necesario marcar cada An necesario para la sustancia a investigar.Usos de la IFD:a) Identificación de Ag virales ( virus respiratoris,

herpes virus, etc).b) Identificación de otros microorganismos

( Bordetella pertussis, legionella, estreptococos pyogenes, Clamidia trachomatis, giardia lamblia).

Técnicas de inmunofluorescencia (4)

Desventajas de la IFI:Es un procedimiento más largo que la directa y existe por lo tanto mayor riesgo de error.Usos de la IFI:a) Mayor sensibilidad que la directa.b) Posibilidad de usar An secundario para detectar An primarios.c) Poder cambiar la especificidad del An secundario para detectar la clase de An presente en la muestra.

Técnicas de inmunofluorescencia (5)

• Usos clínicos de estas técnicas;1. Identificación de LB y T en sangre.2. Detección de anticuerpo antinucleares.3. Detección de Ig en tejidos.4. Deptección de componentes del complemento en tejidos.5. Detección de An específicos fijados a tejidos.6. Identificación rápida de microorganismos en tejidos o

cultivos.7. Identificación de Ag especifícos de tumores en tejidos

neoplásicos.

Técnicas de inmunofluorescencia (6)

Citometría de flujo; Es una técnica de inmunofluorescencia, a través de ella se hace el análisis de una suspensión de células vivas marcadas con un fluorocromo y se mide la cantidad de fluorescencia emitida por las células.La suspensión celular se hace circular en forma de gotas microscópicas y se pasan por un campo de detección atravesado por un potente rayo láser el cual activa la fluorescencia. Mediante sensores específicos se analizan y cuantifican las poblaciones en estudio.No es útil para evaluar funcionalidad de LT.

Técnicas de inmunofluorescencia (7)

Usos de la citometría de flujo:a) Análisis fenotípico y funcional de LB y T y de

todas aquellas células que tengan un An que las identifique

A través de ella se identifica estirpe celular, estadio de maduración o estado de activación.Para cuantificar Lb se usa el CD19 y para los LT el CD3,CD4, CD8

Técnicas de inmunoensayo

1. Radioinmunoanálisis (RIA).Aquí el An se une a un isotópo radioactivo generalmente Yodo 125 ó 132.Se establece una competencia para unirse a An específicos entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma sustancia marcada con el isótopo, por lo que a mayor cantidad de sustancia a cuantificar menor será la sustancia radioactiva que se una al An y viceversa.

Técnicas de inmunoensayo(2)

Existen varios tipos de RIA:a) Directob) Inhibición.c) Sandwich ( más usada)Desventajas:d) Peligroso.e) Necesidad de instalaciones adecuadas para su

realización.f) Caducidad rápida de los isótopos.

Técnicas de inmunoensayo (3)

2. Dentro de estas técnicas tenemos el RAST que es un radioinmunoensayo para IgE específica de antígeno.3. ELISA ( enzimoinmunoanálisis).Esta técnica tiene como objeto incrementar la especificidad del inmunoensayo.En ella la identificación de complejos inmunes se hace igual que en el RIA pero usando enzimas unidas al An o al Ag en vez de radioisotópos.Las enzimas más usasdas son: peroxidasa, galactosidasa o glucosa oxidasa.

Técnicas de inmunoensayo (4)

Aquí el Ag inmovilizado se detecta mediante el An unido a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color u otro tipo.Se usa en muchos laboratorios para ver si un An particular está presente en la sangre de un paciente.Esta técnica puede dar lugar a falsos positivos y negativos.

Técnicas de inmunoensayo (5)

Tipos de ELISA:a) Directo o competitivo.b) Indirecto o no competititvo.c) Sandwich ( m’s usada).Usos:1. Dosificación de hormonas.2. Detección de Ag de la hepatitis.3. Sustancias que se encuentran en baja

concentración.

Técnicas nefelométricas

En estas técnicas los complejos Ag-An crean una mezcla de nubosidad o turbidez que se determina por la refracción de dichos complejos al pasar rayos de luz por el tubo donde ellos se encuentran, usualmente usamos rayos láser.Detecta An no precipitantes, pero se usa más en la detección de Ag que de An.Es posible analizar por este método muestras de volumen muy pequeños.Es un procedimiento rápido y sensible.Se usa para cuantificar Igs y complemento.

Cromatografía de afinidad

Se usa para obtener un Ag o un An puro a partir de una solución.En esta técnica el Ag o el An está unido por sus grupos aminos libres a las partículas de Sepharose activadas con bromuro de cianógeno.

Inmunoprecipitación e inmunoblotting

Es una técnica muy útil cuando se asocia a electroforesis en gel SDS-poliacrilamida.Se usa para purificar proteínasEn la mayoría de los casos el Ag se marca incubándolo con unprecursor radioactivo aunque muchos ag pueden detectarse por medios que no requieren marcaje directo.Los inmunocomplejos se analizan genralmente por electroforesis en gel aunque pueden usarse otras técnicas como: estudios enzimáticos, unión a ligandos, inmunizaciones, inmunoblotting, etc.

Inmunoblotting (2)Consiste en la transferencia de proteínas o blotting sobre memebranas sintéticas seguido de su detección empleando sistemas diseñados para la tinción de blot.Ejemplos de estas técnicas;a) Western Blot.Se usa para determinar presencia y cantidad de Ag y An específicos.Se asocia con electroforesis en gel SDS-poliacrilamida.Es el estudio confirmatorio más empleado en el diagnóstico de VIH.b) Dot Blot.Aquí se transfiere la muestra en forma de una pequeña gota circular de una solución concentrada a la membrana.La absorción de la gota provoca la adhesión de la proteína a la membrana quedando en forma de mancha o blot.

Inmunoblotting (3)

c) Slot Blot.Es igual a la anterior pero aquí la proteína se aplica en forma de línea.Ventajas de trabajar con proteínas fijadas a membrana:1. Son más rápidas de teñir y desteñir.2. Detecta cantidades menores de proteínas.3. El blot es un registro cómodo y conveniente de

manipular el gel.4. Las memebranas son más fáciles de manipular que el

gel.

Otras técnicas basadas en la unión Ag -An

1. Marcaje de An con ferritina u oro coloidal.Tanto el hierro como el oro coloidal son opacos a los electrones y se ven por microscopía electrónica.Tanto el hierro como el oro coloidal se unen al An mediante ligandos bivalentes.Se usan en inmunohistología, inmunocitología animal humana o vegetal aplicado directamente sobre células o secciones de tejidos.

Otras técnicas basadas en la unión Ag – An (2)

2. Técnicas quimioluminiscentes.Los marcadores quimioluminiscentes son sustancias capaz de emitir luz cuando al absorber la energía de una reacción química oxidativa son colocadas en estado de excitación electrónica.Estos marcadores son de gran estabilidad y pueden almacenarse durante mucho tiempo por lo que constituyen una alternativa al uso de isotópos en el inmunoanálisis.

Prueba de fijación del complemento

Esta prueba a diferencia de las anteriores está basada en la respuesta inmunitaria.Existen muchas reacciones Aan que activan el complemento lo que produce lesión y destrucción de la célula, cuando ocurren in vitro pueden no dar ninguna manifestación visible por lo que se hace necesario usar un sistema indicador que generalmente va a ser glóbulos rojos de carnero y An contra ellos.

Prueba de fijación del complemento (2)

Cuando examino una muestra frente a este sistema indicador puede ocurrir;a) No haya lisis en el sistema indicador.Esto indica que en la muestra analizada existen Ag y An que van a activar el complemento y este va a ser consumido por esta reacción.b) Haya lisis en el sistema indicador.Significa que en la muestra analizada no existen Ag ni An que activen el complemento el cual que da disponible para el sistema indicador.Una prueba de aplicación clínica que usa esto es la prueba de Wassermann para el diagnóstico de la sífilis.

Técnicas de biología molecular útiles en inmunología

1. Southern Blot.Se usa para identificar DNA.2. Northern Blot.Se usa para identificar RNA.3. Hibridación fluorescente in situ (FISH).Usa moléculas fluorescentes para localizar genes o fragmentos de DNA.Puede hacerse en células que no se encuentren en división no activa.

Técnicas de biología molecular útiles en inmunología (2)

Se usa para mapear gnes y localizar anormalidades cromosómicas.Clases de FISH:a) FISH de metafase.b) FISH de interfase.4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).Método rápido y simple para copiar y amplificar secuencias específicas de DNA de hasta 1 kilobase de longitud.

Técnicas de biología molecular útiles en inmunología (3)

La enzima más usada en este estudio es la taq-polimerasa.Usos:a) Clonación de genes conocidos o genes relacionados

con genes conocidos.b) Detectar e incluso cuantificar la presencia de

determinadas secuencias de DNA en una muestra.c) Cuantificar los niveles de RNAm usando la

transcriptasa inversa.d) Análisis de reordenamiento genéticos específicos.