REACCIONES SEROLGICASAglutinacin, Precipitacin en Agar, Inmunodifusin, ELISABacteriologa 2012 Ing. Agro. Jos Torrealba

IntroduccinLas tcnicas serolgicas ms utilizadas en la deteccin e identificacin bacterias fitopatgenas son:Aglutinacin, inmunodifusin doble, tcnicas que utilizan conjugados (especialmente inmunofluerescencia y diferentes variantes de ELISA) y algunas tcnicas mixtas (Hampton et al; 1990).

AglutinacinSe emplean suspensiones celulares visibles o ligeramente turbias. Al desarrollarse la aglutinacin desaparece la turbidez, obtenindose un medio perfectamente translucido con grnulos distribuidos en el lquido o precipitados en el fondo del tubo.

Aglutinacin en porta objetos. Aglutinacin en tubos.

Aglutinacin en porta objetos. Las pruebas cualitativas de aglutinacin determinan la presencia o ausencia de un determinado anticuerpo (Ab) o antgeno (Ag) en una muestra problema. Si se produce la aglutinacin, la mezcla de la muestra con el reactivo dar lugar a la formacin de cogulos, siendo la prueba positiva. La prueba es negativa si no se produce aglutinacin.

Aglutinacin en porta objetos.

Aglutinacin en tubos.Pruebas cuantitativas de aglutinacin para determinar el ttulo de anticuerpos. Cada uno de los tubos contiene la misma cantidad de un cierto tipo de antgeno microbiano ligado a una partcula transportadora, en solucin salina. Se preparan diluciones seriadas de una muestra del suero proveniente de un hospedante, que se sospecha que est siendo infectado por ese microorganismo en particular, y se aaden a cada uno de los tubos que contienen el antgeno.

Si se produce una unin antgeno-anticuerpo, se formarn en el tubo unos cogulos constituidos por el antgeno, el anticuerpo y las partculas portadoras, anotndose el tubo en el que se ha producido este resultado positivo.

Si no se observan los cogulos, se supone que no se ha producido la aglutinacin y la prueba se considera negativa. (Se incluye un tubo control, tubo C, en el que no se ha aadido la muestra; es un tubo para el control negativo de la prueba.) El ttulo de anticuerpos, o medida cuantitativa de la concentracin del anticuerpo, es la mayor dilucin que ha dado un resultado positivo para dicha prueba. La intensidad de la reaccin en cada tubo se mide por los signos ms y menos: +++, muy fuerte; ++, fuerte; +, dbil; +-, probablemente positiva; -, negativa. En este caso, el ttulo de anticuerpos es de 1:160.

Aglutinacin en tubos.

PrecipitacinLas sustancias empleadas en reacciones de precipitacin deben ser completamente traslucidas. Si se encuentran partculas presentes, estas se deben separar por centrifugacin a 2000 a 5000 x G. el pH debera ser cercado a la neutralidad. Al disear un experimento de esta naturaleza y al interpretar los resultados, se debe recordar que el exceso de antgeno inhibe la precipitacin.Prueba de precipitacin anillada.Prueba de la precipitina

Prueba de precipitacin anillada.La reaccin de precipitacin se produce cuando las molculas de antgeno y de anticuerpo se unen formando agregados visibles que precipitan. Las concentraciones relativas del antgeno y del anticuerpo son cruciales para que puedan formarse los precipitados. (a) Si el anticuerpo y el antgeno se encuentran en proporciones ptimas -en concentraciones aproximadamente equivalentes- se forma una red, que precipita. Pero si se encuentra en exceso el antgeno (b) o el anticuerpo (c), es probable que no se forme un agregado visible.

Prueba de precipitacin anillada.

Prueba de la precipitina Prueba de la precipitina. En esta prueba, se mezclan dos soluciones que contienen los antgenos y los anticuerpos en un tubo de ensayo. Si la muestra clnica problema contiene un antgeno o un anticuerpo que se une con el anticuerpo o el antgeno complementario en el reactivo de la prueba, los agregados antgenos-anticuerpos darn lugar a la formacin de un anillo visible en la zona en la que el antgeno y el anticuerpo se encuentren en proporciones ptimas. Despus de dejar reposar el tubo una noche, el precipitado se deposita en el fondo del tubo.

Prueba de la precipitina

InmunodifusinUna variacin interesante de las pruebas de precipitacin consiste en permitir la difusin de los reactivos en geles de agar. Los antgenos y los anticuerpos frecuentemente tienen diferentes tasas de difusin, por esta razn pueden precipitar en diferentes posiciones.

Inmunodfusin simpleInmunodfusin doble.

Inmunodfusin simpleEl gel de prueba contiene un solo tipo de anticuerpos y las muestras clnicas sospechosas de contener un antgeno especfico se enfrentan a dicho anticuerpo. Se forman lneas curvas o arcos radiales (no un circulo completo) de precipitado, alrededor de los pocillos que contienen los antgenos complementarios.

Inmunodfusin simple

Inmunodfusin dobleEn esta prueba se colocan distintas combinaciones de antgenos y anticuerpos en pocillos separados, formndose las lneas de precipitacin en aquellas zonas en las que se encuentran el antgeno y el anticuerpo.

Inmunodfusin doble

Enzimoinmunoanlisis(Prueba de ELISA)

HISTORIA1959 Yalowy Berson, precursor de los ensayos inmunoenzimticos que fueron descritos originalmente en 1971 por Engvall y Perlmann, y Van Wemeny y Schuurs.El uso de material radiactivo ha limitado el uso del radioinmunoensayo, y a la ves a popularizado el empleo del inmunoensayo enzimtico (EIA).

(Prueba de ELISA)La prueba de ELISA se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser de reactividad conocida. El color se genera por la interaccin de un sustrato cromognico y una enzima que ha sido acoplada al anticuerpo detector. Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el antgeno en la fase slida, como una capa de captura.

(Prueba de ELISA)Los mtodos de ELISA dependiendo de la actividad enzimtica se dividen en dos tipos: Competitivos No competitivos

(Prueba de ELISA)

ELISA COMPETITIVO: En este mtodo, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un nmero limitado de sitios de unin del antgeno. Habr ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrar a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.

ELISA Competitivo: Fases de la Tcnica Elisa de competicin. (1) Se incuba el suero problema con el antgeno. (2) La mezcla anterior se deposita sobre los pocillos donde previamente se ha fijado un suero anti antgeno (3) se aade el conjugado. (4) despus, el sustrato. En este caso la ausencia de color sera positivo.

(Prueba de ELISA)

ELISA NO COMPETITIVO: Consiste en enfrentar la muestra con el antgeno o anticuerpo que est en la fase slida. Si una muestra es positiva se formar el complejo antgeno-anticuerpo y al agregar el conjugado reaccionar con el respectivo sustrato desarrollando color

(Prueba de ELISA)

Dentro de los no competitivos tenemos:Los directos que detectan antgenos Los indirectos que detectan anticuerpos.

Deteccin de antgenosFases de la tcnica Elisa Sandwich. (1) Un anticuerpo monoclonal o policlonal anti antgeno suele estar ya unido a la placa. (2) se incuba con la muestra problema. (3) se aade el conjugado. (4) por ltimo el sustrato. Todos los pasos van precedidos de incubaciones y lavados.

Deteccin de anticuerposFase de la tcnica Elisa indirecto. (1) El antgeno se pega a la placa (2) Se aade el suero problema. (3) posteriormente, el conjugado. (4) y por ltimo, el sustrato.

(Prueba de ELISA)

Pasos generales de un ELISATapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpoAdicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerposUnin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado en el posillo.Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o antgeno no unidoAdicin del anticuerpo secundario marcado con la enzimaUnin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpoLavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unidaAdicin del sustratoUnin del sustrato a la enzimaDesarrollo del color

(Prueba de ELISA)Los anticuerpos indicadores se unen a una enzima. Las enzimas sirven como marcadores debido a que cuando se combinan con su sustrato producen un cambio de color que se puede observar. Las pruebas que utilizan enzimas son preferibles a las que utilizan istopos radiactivos, ya que se pueden detectar a simple vista y no requieren instrumentos sofisticados, como los que se necesitan para el recuento de emisiones radiactivas. Generalmente, los reactivos de la prueba de ELISA se fijan a una superficie y se combinan mediante una tcnica de "sandwich". La prueba directa de ELISA se emplea para la deteccin de antgenos, mientras que la indirecta detecta los anticuerpos. El fundamento de ambas pruebas es el mismo.

Las 4 fases de un ensayo ELISA sonConjugacin del anticuerpo o del antgeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...).

Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos.

Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos.

Revelado de la reaccin enzimtica.

Trabajos realizados..\61224207-1.pdfRelaciones serolgicas entre aislamientos bacterianos de los gneros Erwinia, Pectobacterium Y Pantoea. Yonis Hernndez y Gustavo Trujillo.

MUCHAS GRACIAS!