BIO 368

ANALISIS INSTRUMENTAL

Métodos electroforéticos

ELECTROFORESIS

Se basa en la migración diferencial de partículas cargadas sometidasa un campo eléctrico. Método muy útil en la separación de biomolé-culas cargadas (aminoácidos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos).Método esencialmente analítico.

Las moléculas migrarán hacia el polo positivo (ánodo) o negativo(cátodo) dependiendo de su carga eléctrica.

El equipo básico consta de una FUENTE DE PODER y de unaUNIDAD ELECTROFORETICA.

Las unidades electroforéticas pueden ser horizontales o verticales, y las separaciones pueden hacerse en medios líquidos o sólidos (geles).

Son sistemasde aplicaciónlimitada

Los sistemas más usados emplean soportes sólidos y las muestrasson aplicadas como manchas o bandas (de allí el nombre de "electroforesis en zona“).

TIPOS DE SOPORTE UTILIZADOS EN LA ELECTROFORESISEN ZONA

Papel filtro: poco usado hoy; baja resolución

Acetato de celulosa: empleado preferentemente en laboratoriosclínicos para el análisis de proteínas plasmáticas.

Poliacrilamida: muy utilizado en la separación de proteínas yácidos nucleicos (p. ej. secuenciación de DNA).

Agarosa: empleado en la separación de ácidos nucleicos.

(NH4) S2O8

PERSULFATO DE AMONIO

REACCIONES INVOLUCRADAS EN LA SINTESIS DEPOLIACRILAMIDA

- El TEMED cataliza la descomposición del ión persulfatocon la generación de radicales libres: S2O8

-2 + e- SO42- + SO4

-.

- A continuación ocurre la polimerización de la acrilamida.Si se representa al radical libre como R. y a la acrilamida comoM, el proceso se puede esquematizar:

R. + M RM. RM. + M RMM. etc.

Se forman así largas cadenas de poliacrilamida. La introducciónde bisacrilamida le da el carácter de red tridimensional.

acrilamida bis-acrilamida

ELECTROFORESIS DE PROTEINAS

Nativa: las proteínas se separan principalmente de acuerdo a su carga eléctrica. Relativamente poco usada; menos resolutiva.

Desnaturante: se desnaturan las proteínas mediante un detergente(dodecil sulfato de sodio, SDS) y mercaptoetanol (que rompe lospuentes disulfuro).El SDS le aporta muchas cargas negativas a la proteína. La separaciónes por tamaño ya que todas las moléculas tienen carga negativa e igualrazón masa/carga. Los canalículos del gel permiten el paso más rápidode las proteínas más pequeñas.Es un método muy usado por ser económico y muy resolutivo.Aplicaciones: Análisis de mezclas de proteínas (si se observa una bandase presume que la proteína está pura). Determinación del peso molecular de proteínas (subunidad).

Se usan dos tipos de geles: A) gel concentrador; concentra a las proteínas (bajafricción por la baja concentración de acrilamida).B) Gel de resolución; la alta concentración de acrilamida permite separar portamaño.

TINCION DE LOS GELES

El más utilizado es el Azul de Coomassie, que al unirse a las proteínaslas tiñe de color azul.

Si la cantidad de proteína en la muestra es muy pequeña (menos de 100nanogramos por banda) se prefiere utilizar tinción con nitrato de plata.

Ejemplo de electroforesis en gel desnaturante

116

66,2

45

35

25

18,4

Purificación de la enzima arabinofuranosidasa 2 de Penicilliumpurpurogenum

ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS

Como matriz se utiliza agarosa. Al enfriar una solución de agarosase forman puentes de H entre los grupos OH de las unidades depoligalactosa generando un gel rígido con porosidad bastante uniforme.El tamaño de los poros puede controlarse por el porcentaje de agarosautilizada. No se requiere el uso de “geles concentradores” pues los ácidosnucleicos tienen un coeficiente de fricción muy alto y focalizan rápidamente.

Los ácidos nucleicos tienen carga negativa, por lo que migrarán al ánodo,y se separan de acuerdo al tamaño. El uso de estándares de tamaño conocido (número de pares de bases) permite estimar el tamaño de lasmuestras incógnitas. Se utiliza habitualmente bromuro de etidio paravisualizar las bandas, que se reconocen por su fluorescencia en luzultravioleta.

SEPARACION DE DNA MEDIANTE GELES DE AGAROSA

ISOELECTROENFOQUE

Técnica electroforética que separa macromoléculas en base a supunto isoeléctrico (pI).

En un gel de poliacrilamida se establece un gradiente de pH medianteel uso de anfolitos (polímeros pequeños (~5 000 Da) conteniendo gruposácidos y bases débiles distribuidos al azar). Al aplicar un voltaje, el flujo de corriente se debe principalmente a los anfolitos, que migran deacuerdo a su distribución de cargas hasta alcanzar una posición en queel pH corresponde a su punto isoeléctrico. Los anfolitos actuarán comoamortiguadores locales y establecerán así el gradiente de pH. Al introducir proteínas al sistema, ellas migrarán de acuerdo a su carga hasta alcanzar el pHcorrespondiente a su pI y allí se detienen y focalizan.

Se usan geles de poliacrilamida de alta porosidad para permitir el paso libre de las proteínas (evitar su separación por tamaño).

Los anfolitos de pI más alto se desplazan más hacia el cátodo

pH más alto pH más bajoCátodo ánodo

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

Combina dos técnicas:Primera dimensión, isoelectroenfoque; separación por punto

isoeléctrico.Segunda dimensión, electroforesis desnaturante; separa por

tamaño.

Muy utilizado en proteómica (separación analítica de lasproteínas de una célula o tejido). Hasta 5000 proteínas se han separadopor esta técnica. Util en la comparación de tejidos sanos y enfermos,células normales y cancerosas, etc.

Coseta Xilano acetilado 4-------------pH----------------7 4------------pH--------------7

Electroforesis bidimensional de sobrenadantes de cultivo de Penicillium purpurogenum

Tinción con SYPRO Ruby

ELECTROFORESIS CAPILAR

Electroforesis en microescala. Utiliza microlitros de reactivos ynanolitros de muestras, con sensibilidad de detección de hastafemtomoles (10-15 moles).

Se la utiliza en la separación de una gran variedad de sustancias biológicas.

Para obtener una buena separación se utiliza alto voltaje (10-50 kV)y capilares de 50 a 100 cm de largo.El método más usado es el de “solución libre” con detectores UV.La separación es principalmente por “flujo electroosmótico”.

ánodo cátodo

Los capilares tienen grupos silanol ionizables (pI = 1,5) en contacto con elamortiguador, los que atraen cargas positivas. Al aplicar un voltaje, estoscationes migran hacia el cátodo arrastrando agua. A pH neutro o básicoeste flujo electroosmótico es más fuerte que la migración electroforética,por lo que todas las moléculas son arrastradas hacia el cátodo.

APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR

The cause of electroosmotic flow is an electrical double layer that forms at the stationary/solution interface. In capillary electrophoresis, the narrow channels are made up of silica, and silanol groups form the inner surface of the capillary column. These silanol groups are ionized above pH3. Thus, the inner surface of the channel is negatively charged. In solutions containing ions, the cations will migrate to the negatively charged wall. This forms the electric double layer. When an electrical potential is applied to the column, with an anode at one end of the column and a cathode at another, the cations will migrate towards the cathode. Since these cations are solvated and clustered at the walls of the channel, they drag the rest of the solution with them, even the anions. This results in an electroosmotic flow, not to be confused with the electrophoretic migration.

CAUSAS DEL FLUJO ELECTROOSMOTICO

Electroosmotic flow (EOF) is a consequence of the surface charge on the capillary wall. Bare fused silica capillaries have ionizable silanol groups in contact with the separation buffer. As the pH of fused silica is about 1.5, any pH above this will generate measurable EOF. Although EOF may be desirable for mixed analyte separations, for DNA sequencing it works to degrade resolution and the reproducibility of migration time. For this reason it is essential to substantially reduce or eliminate EOF in order to effectively improve separation performance.

Figure 1 illustrates the charged silanol groups which produce electroosmotic flow in bare-fused silica capillaries.