Enfasis Alimentacion 2005, Año XI, Nº 1:64 -71 (Feb-Mar).

Métodos alternativos, precisos y rápidos para el control microbiológico de alimentos

Silvia Michanie1

silvia@michanie.com.ar

1. Consultora en Seguridad Sanitaria de Alimentos, y Prof. Universidad de Belgrano y de la UTN, Buenos Aires.

Este articulo es un extracto de la conferencia presentada en el Congreso de Ciencia y Tecnología de los Alimentos realizado en Córdoba, Argentina del 24 al 26 del 2004. El constante crecimiento en el desarrollo de los métodos alternativos usados para el control microbiológico de los alimentos merece una somera revisión con el objeto de informar al usuario aquello que esta disponible para su uso. Un método alternativo es aquel que demuestra o estima el mismo analito tal cual se mide usando el método de referencia correspondiente para una categoría de alimentos. En este contexto analito es el componente medido por el método; es decir, un microorganismo usualmente patógeno, ó un recuento o numeración de algún grupo microbiano, taxonómico o no. En nuestros días, hay en el mercado kits de métodos alternativos para detectar bacterias y sus toxinas, parásitos, virus, priones, micotoxinas, biotoxinas, alergenos, numerosas sustancias químicas, metales pesados, antibióticos y la especie animal. Los métodos de referencia son aquellos que son reconocidos y ampliamente aceptados

internacionalmente. Algunos ejemplos de estos métodos son los publicados en:

Standard Methods for the Examination of Dairy Products (métodos oficiales en los EE.UU.) publicados por American Public Health Association (APHA)

Environmental Protection Agency de los EE.UU. Food Safety Inspection Service, Departamento de Agricultura de los EE.UU. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, (APHA) International Commission of Microbiological Specification of Foods (ICMSF) Association of Official Analytical Chemist International –AOAC- sus Métodos Oficiales de

Análisis- Bacteriological Analytical Manual de la Food & Drug Administration de los EE.UU. –no

oficiales- publicados por AOAC. American Association of Cereal Chemists (AACC)

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Obviamente, también son métodos de referencia los publicados por la Organización Internacional de Normalización (ISO), como también los métodos de la Federación Internacional de Lechería, hoy en ISO como FIL/ISO. En los últimos años ISO y la Comisión Europea de Normalización realizaron estudios Interlaboratorios de los métodos tradicionales que detectan los principales microorganismos patógenos y así, las actuales normas para patógenos y recuentos presentan datos de precisión. La lista no es exhaustiva y seguramente existe alguna otra asociación que propone sus métodos. Razones o atributos que poseen los métodos alternativos

Liberar lotes rápidamente

Ahorrar costo financiero

Ahorrar trabajo manual

Racionalizar el recurso humano

Usar equipos semi ó totalmente automáticos

Facilitar la ejecución de los ensayos

Analizar cantidades importantes de Alimentos (por ej., 200.000 muestras / año)

Contribuir en momentos de crisis

Ahorrar espacio en depósitos

Facilitar la eliminación de residuos biológicos

Aumentar la velocidad de los análisis y/o su respuesta

Disponer de kits sensibles, precisos con buen limite de detección

Ahorrar por miniaturización La mayoría de los kits pueden ser usados en:

Laboratorios de baja complejidad

La mayoría de los kit o equipos requieren personal con adiestramiento mínimo

Útiles en la verificación del sistema HACCP

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Útiles para el monitoreo de la higiene en tiempo real

Realizar el control rápido de proveedores

Y muy pronto …..realizar controles en fronteras Los biochips o microarrays están en pleno desarrollo y ensayo, y permitirán realizar controles en fronteras. Desventajas Entre las desventajas actuales la determinación de la Presencia / Ausencia (P / A) de un microorganismo patógeno por un método alternativo es que aun es considerado un ensayo de screening o prueba tamiz. Es decir, aun se requiere ó exige la confirmación de los positivos por un método tradicional. Sin embargo, estimo que en muy poco tiempo este impedimento desaparecerá para aquellos métodos que han sido validados bajo un protocolo armonizado. Los resultados negativos son considerados definitivos.

Aun son de “screening” (confirmar los resultados positivos de microbios patógenos)

Algunos métodos necesitan enriquecer el analito que se busca antes de detectarlo

Usualmente, costos algo mas elevados que los métodos tradicionales

El horario del laboratorio podría modificarse según el método

No siempre son flexibles; es decir, el kit no permite mas de un tipo de uso

No siempre hay disponibilidad regular de los kits en el mercado. Tome precauciones al respecto. Por ej., disponga de alternativas que pueda usar rápidamente

Algunos métodos también detectan los microorganismos muertos

Automatización Los métodos alternativos son manuales, semi y totalmente automáticos. Por ej., hay equipos como el Spiral Plater que una vez cargado inocula la placa en forma automática y otros como el MiniVidas que realiza un ensayo ELFA –un tipo de ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) - usado para detectar patógenos que, también, una vez inoculados son totalmente automáticos. Incluso, emite un registro con el resultado del ensayo. Algunos requisitos Entre los requisitos que conviene priorizar al elegir un kit o equipo destacamos que debe ser apropiado al fin que se persigue, validado, disponible con regularidad en el mercado, de precio accesible y sencillo para el personal que lo operara. Además, se debe calcular el

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ahorro de tiempo que significará para la empresa y las posibilidades de contar con el equipo en comodato. En Microbiología de Alimentos ¿qué buscamos?

Recuento de flora normal, de alteradores, de iniciadores, y de mohos y levaduras. Detectamos y/o contamos microorganismos indicadores y patógenos, y/o sus toxinas Caracterizamos microorganismos y sus toxinas Evaluamos o monitoreamos la higiene de superficies, equipos, líquidos de enjuague y

aire. Los microorganismos patógenos al hombre que se transmiten por los alimentos son:

• Salmonella • Listeria monocytogenes • Escherichia coli O157:H7

• Otras serovariedades patógenas de E.coli pertenecientes a los grupos EPEC, ETEC, EHEC, EIEC y EAEC • Campylobacter yeyuni • Staphyloccus aureus • Bacillus cereus • Clostridium perfringens

Los recuentos o numeraciones frecuentemente realizadas son de: • Enterobacteriaceae • Escherichia coli • Coliformes • Coliformes fecales –hoy en desuso- • Coliformes termo tolerantes • Mohos y levaduras • Vibrio cholerae O1 • Cryptosporidium • Giardia • Clostridium botulinum • Vibrio parahaemolyticus • Yersinia enterocolitica • Aeromonas hydrophila • Plesiomonas shigelloides • Enterobacter sakazakii

Con excepción de las serovariedades de E.coli, desde el comienzo de la lista hasta Giardia inclusive hay métodos alternativos disponibles. Sin embargo, la mayoría de los kits o

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equipos disponibles han sido desarrollados para detectar Salmonella, Listeria y E.coli O157:H7, y para los recuentos de indicadores de higiene. Conviene mencionar que desde hace algún tiempo se promueve la determinación y/o el recuento de E.coli en lugar del grupo coliformes o coliformes fecales. Se ha establecido que la presencia de coliformes en frutas y verduras no es necesariamente de origen fecal. Incluso, se ha visto que coliformes psicrótrofos son capaces de multiplicarse entre 2 y 5 ºC en productos cocidos conservados al frío en plantas de carnes. Por lo tanto, el recuento de coliformes ha perdido el significado que tenia como indicador de higiene durante la producción. Para el análisis microbiológico del agua la Organización Mundial de la Salud propuso el cambio de coliformes fecales por coliformes termotolerantes o termo resistentes (capaces de fermentar la lactosa entre 44 – 45 ºC) con géneros como E.coli, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter. Los tres últimos no son necesariamente de origen fecal. En Microbiología de Alimentos, ¿qué tipo de ensayos hacemos usualmente?

Contar o enumerar (patógenos, grupos de microorganismos o grupos taxonómicos)

Detectar (Presencia / Ausencia) patógenos

Caracterizar microorganismos

Detectar y caracterizar toxinas microbianas Recuentos o Numeración ¿Qué hay disponible? Muy someramente mencionamos los siguientes:

1. Varias firmas comerciales reemplazaron la placa de Pétri por membranas rehidratables (Petrifilm de 3M, Sanita Kun, Compact Dry). Estos kits ahorran la preparación del material y permiten, también, hacer ensayos en plantas con laboratorios de muy baja complejidad. Existen membranas rehidratables para recuentos de microorganismos indicadores y de patógenos. Para el uso siempre se deben respetar las indicaciones del fabricante y las posibles limitaciones del sistema.

2. Un sistema similar pero automático es el Spiral Plater. Las placas se siembran en

gradiente. No requiere hacer diluciones. La sensibilidad esta acorde al volumen de siembra y diámetro de la placa. Hay varias marcas comerciales. Cuenta también con lector automático de placas.

3. En el sistema Redigel se produce la gelificación en la placa por la presencia de cloruro

de calcio en ésta y la presencia de metoxil pectina en el diluyente. No he observado que se comercialice en Argentina aunque es un producto de 3M.

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4. En el campo de la filtración las Membranas Hidrofóbicas Cuadriculadas (HGMF) combinan el recuento en placa, la membrana filtrante y la técnica del NMP (Número Mas Probable). Es método oficial de Canadá.

5. También existe otro sistema que combina la filtración por membrana con la

bioluminiscencia de ATP. Una vez producido el desarrollo se aplica un spray para liberar el ATP. Permite el recuento por medio de un procesador de imagen.

6. Asimismo, en el área de la filtración el sistema Direct Epifluorescent Filter Technique

(DEFT) es muy útil para detectar mohos y levaduras en bebidas. Consiste en una filtración y la tinción de los ácidos nucleicos con naranja de acridina fluorescente que se observan con un microscopio con luz epifluorescente.

7. El advenimiento de las sustancias cromo y fluorogénicas trajó enormes ventajas frente a

los medios de cultivo tradicionales y son usadas en medios sólidos y líquidos para contar o detectar microorganismos.

8. SimPlate es un sistema de recuento en placas especiales basados en el NMP y con el

uso de sustancias cromo y fluorogénicas.

9. Otros métodos de recuento se basan en la medición de la actividad metabólica de los microorganismos. Con este propósito se usan equipos que miden la impedancia, conductancia o capacitancia de los medios de cultivo, según conveniencia.

10. Otros sistemas miden cambios ópticos del medio de cultivo, químioluminscencia,

fluorescencia, Citometría de flujo, etc.

Detección de microorganismos patógenos Son realmente numerosos los kits comerciales que existen en el mercado como así también los equipos y no es objeto de esta presentación señalar las marcas comerciales ni abarcar todo lo disponible. Solamente presentamos los principios en que se basan. Biosensores. ¿Qué son? Son bio-moléculas inmovilizadas ó superficies bioactivas en las que se produce una interacción entre un analito y una enzima, una célula ó un anticuerpo especifico. Esta reacción bioquímica se convierte en una señal fácil de medir.

1. La mayoría de los kits o equipos disponibles se basan en la interacción antígeno – anticuerpo. Basados en este tipo de reacción hay muy diversos tipos de ensayos como:

1.1 la cromatografía de inmunoafinidad muy útil en la detección de micotoxinas;

1.0 los enzimoinmunoensayos (EIA ó ELISA) son reacciones sustrato enzimáticas que hacen visible o ponen en evidencia la interacción antígeno – anticuerpo.

2.0 la separación inmunomagnética seguida de un ensayo tradicional para poner en evidencia el microorganismo patógeno;

3.0 la inmunocaptura ó inmunoseparación mas un enriquecimiento posterior seguido de un ELISA;

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4.0 la interacción seguida de migración lateral mas una segunda interacción (inmunoprecipitación);

5.0 la aglutinación de partículas de latex muy útil para la caracterización de los microorganismos, y

6.0 la inmúnomovilización de Salmonella utilizada para la detección de salmonelas móviles.

2. Los métodos moleculares realizan por ej., el enriquecimiento del microorganismo

patógeno seguido de hibridación del ADN y luego un EIA, usado este ultimo para poner en evidencia la reacción previa.

3. También está, muy difundida la PCR o Reacción en Cadena de la Polimerasa que

consiste en una amplificación del ADN. Sobre este protocolo hay diversos kits que están en el mercado, incluso, alguno de ellos automático.

4. Algunos ensayos, también moleculares, son sumamente útiles en el campo de la

epidemiología molecular.

5. En este momento se desarrollan y ensayan biochips o microarrays (disposición en cierto orden) que es un micro-ordenamiento de biomoléculas en forma de matriz sobre una pequeña pieza de vidrio u otro material. La superficie contiene varios cientos de spots con biomoléculas ligadas. El ensayo esta basado en la hibridación de cadenas complementarias. Prometen detecciones simultáneas de microorganismos patógenos de interés.

Caracterización de los microorganismos Están disponibles ensayos bioquímicos, serológicos, reacciones de latex, fagotipificación y métodos moleculares útiles en la investigación de brotes de enfermedades de transmisión alimentaria. Los sistema disponibles miniaturizados son domésticos y comerciales; algunos de ellos totalmente automáticos. Conviene recordar que antes de realizar una caracterización debemos asegurar la pureza de la cepa. Detección y caracterización de las toxinas microbianas Hay disponible métodos alternativos para detectar toxinas de Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli O157 y Clostridium botulinum. Existen kits y equipos que caracterizan las toxinas por una reacción de ELISA (TECRA) o por ELFA (MiniVidas). También, existe un kit de inmunoprecipitación que detecta las Verotoxinas de E.coli O157 (Merck) Evaluación de la Higiene de las Superficies Con este propósito existen en el mercado:

Hisopos o esponjas de poliuretano Hygicult ó similares El uso de placas de Replicate Organism Direct Agar Contact (RODAC) o similares

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Bioluminiscencia de ATP -numerosos equipos- Hisopos para detectar presencia de proteínas Hisopos para detectar presencia de azúcares

Los 3 últimos brindan resultados en tiempo real y permiten, de ser necesario, establecer de inmediato acciones correctivas. Salvo los 3 últimos los resultados se expresan por cm2. Evaluación de líquidos de lavado o enjuague Es usual evaluar la calidad higiénica de los líquidos de enjuague por ej., en sistemas CIP –cleaning in place-. Para satisfacer esta necesidad es útil la filtración de un volumen conocido e importante de líquido por membranas tipo manifold o por medio de unidades filtrantes. Igualmente estos sistemas son útiles cuando se necesita evaluar la acción de los bactericidas usados en equipos no cerrados en que podemos recoger líquidos, higiénicamente, para su análisis. Los resultados se expresan por ml o cm3. Evaluación del aire Desde hace tiempo existen en el mercado muestreadores de aire que captan y hacen impactar un importante volumen de aire sobre la superficie de placas de Pétri de tamaño regular o similar a ellas. El tipo de agar de las placas queda a elección del usuario según lo que busque. Los resultados se expresan por m3 de aire. Estos equipos son muy útiles para evaluar el aire de zonas de envasado aséptico, como así también en zonas que no se requiere aire estéril pero deseamos monitorear su calidad. Validación de los métodos alternativos La validación de los métodos alternativos es una necesidad para el usuario del método como así también para la firma que desarrolla el kit o equipo. Si bien recientemente se ha publicado la norma ISO 16140:2003 que presenta un protocolo para validar los métodos microbiológicos alternativos aun nos parece que no se ha alcanzado una armonización global y vemos que existen diferentes protocolos según se trate de la norma ISO, de AOAC International, de NordVal, MicroVal o AFNOR (Organismo Francés de Normalización). La validación es una necesidad para los fabricantes y una garantía y seguridad para el usuario pero la armonización global de la misma es también sumamente necesaria. Conclusiones Algunos estudios estiman un crecimiento del 17 % de las ventas anuales para los métodos alternativos frente a un 8 % de los métodos tradicionales en Latinoamérica. Los métodos inmunológicos son los que muestran un mayor crecimiento. El desarrollo de los métodos alternativos continuará y serán de utilidad para la vigilancia de los alimentos realizada por la autoridad sanitaria y por las empresas incluyendo la pequeña y mediana empresa.

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A ningún proveedor le interesa que Ud. tenga una mala experiencia con sus equipos. Recurra a ellos, plantee sus necesidades y vea que le ofrecen. Agradecimiento Mi gratitud a Mariano Czastkiewicz por la revisión del este manuscrito

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