Validación Validación de de

Métodos Métodos MicrobiológicosMicrobiológicos

Validar métodos microbiológicos requiere:

1.Comparar con un METODO DE REFERENCIA2.Usar cepas de referencia certificadas ATCC 3.La evaluación sistemática de los factores que

afectan la medición4.Ensayos interlaboratorios5.Estimación de la Incertidumbre

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Que son cepas ATCCQue son cepas ATCCCepas Certificadas: es un material biológico de referencia certificado.La colección certifica que se suministra una determinada cepa, que es un cultivo puro, y que se han observado las convenientes pruebas morfológicas, bioquímicas y moleculares correspondient

ATCC: American Type Culture Collectiones.

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PRINCIPIO DEL SISTEMA DE PRINCIPIO DEL SISTEMA DE

LIOFILIZACIÓNLIOFILIZACIÓNGelatina: medio transporte Leche descremada,acido ascórbico, dextrosa y carbón activado: Agentes Crioprotectores (preservan pared celular, evitan deshidratación por congelación). Carbón Vegetal: Neutraliza sustancias toxicas generadas por la liofilización

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CLASIFICACION CEPAS ATCCCLASIFICACION CEPAS ATCC

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Definiciones:Definiciones:

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FILTRACIÓN POR FILTRACIÓN POR MEMBRANAMEMBRANA

Introducción•La técnica de filtración, en comparación a la de Número Más Probable (NMP), tiene la ventaja de requerir menor cantidad de medios de cultivo y optimizar el espacio en las estufas de incubación. •La utilización de las placas Petrifilm agrega a estas, las ventajas de no requerir la preparación de medios, de reducir los tiempos de incubación y el espacio en estufas. Además no es necesaria la confirmación de colonias y permite la posibilidad de informar un recuento de Escherichia coli.

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FILTRACIÓN POR FILTRACIÓN POR MEMBRANAMEMBRANA

• Es adaptable para muestras de agua natural, agua residual y agua de consumo con rango <2 ufc/100ml.

• Interferencias Aguas con gran turbidez y baja densidad

bacteriana; con tóxicos orgánicos como los fenoles, detergentes, cloro y metales pesados.

 

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Macfarland 0,5 Macfarland 0,5 equivalente a 1x108 equivalente a 1x108

col/mlcol/ml

Número de la turbidez estándar

Cloruro de Bario di-hidratado

(1.175%)

Acido sulfúrico

(1%)

Densidad Bacteriana aproximada

correspondiente

0,5 0,5 ml 99,5 ml 1 x 108

1 0,1 ml 9,9 ml 3 x 108

2 0,2 ml 9,8 ml 6 x 108

3 0,3 ml 9,7 ml 9 x 108

4 0,4 ml 9,6 ml 12 x 108

5 0,5 ml 9,5 ml 15 x 108

6 0,6 ml 9,4 ml 18 x 108

7 0,7 ml 9,3 ml 21 x 108

8 0,8 ml 9,2 ml 24 x 108

9 0,9 ml 9,1 ml 27 x 108

10 1,0 ml 9,0 ml 30 x 108QUITO JULIO 2014

Inoculación de Inoculación de MuestrasMuestras

• Se prepararon repiques de las cepas utilizadas en caldo BHI (infusión cerebro corazón), que fueron incubados a 35 ± 0,5°C durante 18 ± 2 horas.

• Se preparan diluciones decimales en agua peptonada al 0,1 % ( recomendable agua peptona bufferada) y de acuerdo al inóculo que se deseaba utilizar se elige la dilución y el volumen a sembrar.

• Para evaluar el efecto matriz se utiliza agua de red inactivada con tiosulfato de sodio (0,1 mL de una solución 3% por cada 120 mL). Para conocer el inóculo teórico se siembra un volumen inoculado en una placa y se incuba

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• Método APHA 9222 B• Se filtraron 100 mL de cada muestra a través de una membrana de 0,45 μm de poro

utilizando un equipo Microfil de Millipore. La membrana fue colocada sobre una placa con agar LES Endo. Las placas fueron incubadas invertidas a 35 ± 0,5°C durante 22-24 horas.

• Se contaron las colonias típicas y atípicas y se sembraron al menos 5 colonias típicas y 5• atípicas en caldo Brila para confirmar la presencia de coliformes. Los tubos de caldo

Brila• fueron incubados a 35 ± 0,5°C durante 48 ± 3 horas. Para la detección de E. coli los

tubos de caldo Brila con producción de gas fueron sembrados en caldo EC y estos fueron• incubados a 44,5 ± 0,2°C durante 24 ± 2 horas. Los tubos de caldo EC con producción• de gas fueron sembrados en agar EMB, las placas fueron incubadas a 35 ± 0,5°C

durante• 24 ± 2 horas. Al menos una colonia típica fue sembrada en agar nutritivo y este fue

incubado a 35 ± 0,5°C durante 24 ± 2 horas. Se sembraron las pruebas del IMViC en caldo triptona, caldo MR-VP y agar citrato de Simmons.

• Los resultados fueron expresados en ufc en 100 mL de muestra.• Coliformes: Si no se detectan coliformes se informa: < 1 ufc en 100 mL de muestra. Si

no se confirma el total de colonias sospechosas de coliformes se aplica la ecuación correspondiente para calcular el total de colonias de coliformes.

• Escherichia coli: Si no se detecta E. coli se informa “No se detecta en 100 mL de muestra”.

• Si se confirma al menos una colonia sospechosa como E. coli se informa: “Se detecta• en 100 mL de muestra”.

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Los parámetros de validación pueden ser pero no estar limitados a: Los parámetros de validación pueden ser pero no estar limitados a:

Límite de detección (en los métodos microbiológicos cuantitativos).

Límite de cuantificación ( en los métodos microbiológicos cuantitativos).

Repetibilidad Reproducibilidad Recuperabilidad (Cuando se desea determinar

exactitud de un método pero por falta de materiales de referencia se recurre a la adición de un estándar de valor conocido a la muestra).

Criterio de duplicado para control de calidad Para los análisis microbiológicos además se podrá

determinar presencia o ausencia con cepas. Intervalo de trabajo (definido por LC y McF 0,5)

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Para evaluar el Límite de Para evaluar el Límite de Detección y Límite de Detección y Límite de

Cuantificación se debe:Cuantificación se debe:

• Para ensayos microbiológicos: Tomar 10 datos para la mayor dilución posible y calcular la desviación estándar.

LD= 3S LC=10 S (Poco aplicable, muy grande la dispersión)

• NIVEL MAS BAJO aceptado• Uso de algoritmo matemático

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Para evaluar la Para evaluar la repetibilidad se debe:repetibilidad se debe:

 • Para métodos microbiológicos tomar 10 datos en

cada nivel de dilución (muestras), en condiciones de repetibilidad

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ParaPara evaluar la evaluar la reproducibilidad se debe:reproducibilidad se debe:

  Tomar 10 datos en cada nivel (muestra), en

condiciones de reproducibilidad (diferentes condiciones diferentes analistas

(MUESTRAS NO ESTABLE LA REPRODUCIBILIDAD SOLO CAMBIA TECNICO ANALISTA)

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Para evaluar la Para evaluar la exactitud se debe:exactitud se debe:

Realizar el ensayo mínimo diez veces en cada muestra inoculada con cepa, en condiciones de repetibilidad, y evaluar los resultados precisión y recuperación

 RECOMENDADO La exactitud se puede también evaluar por la

participación en un PT, intercomparación

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Para evaluar Para evaluar recuperabilidad se recuperabilidad se

debe:debe: 

• Preparar muestras de concentración conocida para probar la recuperabilidad.

• Tomar mínimo 10 datos

• Inocular en una muestra real para evaluar efecto matriz

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• Realizar un análisis de espina de pescado, o causa efecto, para determinar cuáles son las contribuciones de la incertidumbre.

• Una vez determinadas todas las contribuciones igualar los valores a una misma unidad para que sea comparable.

• La mejor opción es demostrar que la reproducibilidad es el principal aporte de la incertidumbre (recomendado) y que las demás aportaciones están dentro de control

Para evaluar Incertidumbre

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CRITERIOS DE CRITERIOS DE ACEPTACION Y ACEPTACION Y

RECHAZO:RECHAZO:• Los criterios de aceptación pueden ser pero no

estar limitados a:

• Límite de detección y cuantificación• Coeficiente de variación %SDR (30%)• F calculada• T-student• % recuperabilidad (70% al 130%)

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Límite de detección y Límite de detección y cuantificación:cuantificación:

• Se aceptará el valor de los límites si se cumple con las necesidades del ensayo o de la legislación establecida.

Ejemplo: T5 RAOHE1215, INEN 1108

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Para la repetibilidad y Para la repetibilidad y

reproducibilidad:reproducibilidad:

• Se determina el %SDR como método para evaluar la dispersión de la serie de datos de una muestra, se aceptará si el valor es menor al 30% para ensayos microbiológicos,

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TALLER

PRUEBA tPRUEBA t

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Se realiza una prueba de ADEVA en donde se analiza el criterio F, la F calculada debe ser menor que la F tabulada, lo que permite evaluar si existe o no diferencia significativa entre los datos obtenidos.

Si el valor de F que se obtiene es menor al F tabulado, indica que no existe diferencia significativa entre los datos y hay un solo rango de trabajo.

Si el valor de F es mayor al tabulado, indica que si existe diferencia significativa entre los datos y se deberá tomar las acciones correctivas que se estimen necesarias o establecer rangos

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Para la Exactitud:Para la Exactitud:• Se realiza una prueba de Z-score, los valores

considerados como satisfactorios serán los comprendidos entre -2 y 2. De no ser satisfactorios se debe realizar una acción correctiva para determinar las causas del desvío.

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Para la Para la Recuperabilidad:Recuperabilidad:

• En métodos microbiológicos: Se acepta el resultado si su valor se encuentra entre en 70 y 130%

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TALLER

Incertidumbre (de Incertidumbre (de Medida):Medida):

• Es el parámetro asociado con el resultado de una medida, que caracteriza la dispersión de los valores que se pueden atribuir razonablemente al mensurando.

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Incertidumbre tipo A

• Esta se determina por métodos estadísticos y es la incertidumbre de una magnitud de entrada Xi obtenida a partir de observaciones repetidas bajo condiciones de repetibilidad, se estima con base en la dispersión de los resultados individuales. Se denomina también incertidumbre estándar.

Incertidumbre tipo B• Esta se determina por cálculos de ingeniería. Las fuentes de

incertidumbre tipo B son cuantificadas usando información externa u obtenida por experiencia. Estas fuentes de información pueden ser:

• Certificados de calibración.• Manuales del instrumento de medición, especificaciones del

instrumento.• Normas o literatura.

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IncertidumbreIncertidumbre• Para el cálculo de la incertidumbre del ensayo deben identificarse

todos los componentes de la incertidumbre, entre ellas pueden encontrarse:

• Preparación de muestras (diluciones)• Condiciones ambientales• Desviaciones personales en la lectura de instrumentos analógicos • Límites en la discriminación o resolución del instrumento (lecturas

de placas) recuentos en placa• Valores inexactos de los patrones y materiales de referencia

utilizados• Incertidumbres de Balanza, material volumétrico

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Si se esta utilizando la variable temperatura se utiliza:

21

KU

U cionodecalibraCertificadb

; Donde Ucertificado de calibración

Por resolución

32

2

uU B ; Donde d es la división de escala del equipo.

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Incertidumbre expandida La forma de expresar la incertidumbre como parte de los resultados de la medición depende de la conveniencia del usuario. A veces se comunica como la incertidumbre estándar combinada:

2

22

12

BBAC UUUU En algunos casos requieren que se exprese en términos del nivel de confianza dado. En cualquier caso, es indispensable comunicar sin ambigüedades la manera en que la incertidumbre este expresada. De manera rigurosa la incertidumbre expandida se calcula de acuerdo a la ecuación:

CUkU , donde K es igual a 2 (dos) con 95% de confianza

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Para la Incertidumbre Para la Incertidumbre Expandida:Expandida:

• Se acepta el resultado si el valor obtenido, es menor al 30% del valor más bajo del rango de trabajo evaluado.

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CRITERIOS ACEPTACION DE LA CRITERIOS ACEPTACION DE LA

VALIDACIONVALIDACION

CRITERIOS DE ACEPTACIÓN DE LA VALIDACIÓN:

CRITERIO VALOR%SDR ≤ 30%

VALOR F ≤ F TABVALOR T ≤ T TABVALOR F ≤ F TABZ-SCORE ≥ -2 Z ≤ 2

% Recuperabilidad 70-130%u ≤ 30% RANGO BAJ O

REPETIBILIDAD ACEPTAT-STUDENT ACEPTAREPRODUCIBILIDAD ACEPTAEXACTITUD ACEPTA

INCERTIDUMBRE ACEPTARECUPERABILIDAD ACEPTA

SERIE DE REPETICIONES ACEPTAEVALUACIÓN

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TALLER

HAP POR HPLC/DETECTOR DE FLUORESCENCIA

Calibración

Función Respuesta

RepetibilidadResolución

Material Volumétrico

RepetibilidadReproducibilidad

Calibración

Material de Referencia

Material Volumétrico

Concentración

Volumen

r

RCalibración

Medida

Desviación Estándar R

CVR

Método de Análisis

Analista

IDENTIFICACION FUENTES DE INCERTIDUMBRE

QUITO AGOSTO 2014

PRINCIPAL APORTE DE PRINCIPAL APORTE DE UU

APORTES PIPETEO, DILUCIÓN Y PREPARACIÓN DE AGUA PEPTONADA

EQUIPO MATERIALincertidumbres

EXPAND INCERT EN %Incert balanza (Calibracion) 0,00033 0,00017 0,085%

Resolucion balanza 0,00001 0,00000 0,001%Deriva de Balanza 0,00001 0,00001 0,003%

Pipeta 1 ml(tolerancia) de clase 0,01 0,00462 2,375%

Pipeta 10 ml(tolerancia) de clase 0,02 0,00115 0,594%

probeta 100 ml(tolerancia) de clase 1,00 0,00577 2,969%

INCERTIDUMBRE DE REPRODUCIBILIDAD SR 0,18272 93,972%

total 0,19445 100%

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DECLARACIÓN DE LA DECLARACIÓN DE LA VALIDACIÓN:VALIDACIÓN:

• El método se aceptará como validado si se ha cumplido con todos los criterios de aceptación de la validación.

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DECLARACIÓN DE LA DECLARACIÓN DE LA VALIDACIÓN:VALIDACIÓN:

CRITERIO VALOR%SDR ≤ 30%

VALOR F ≤ F TABVALOR T ≤ T TABVALOR F ≤ F TABZ-SCORE ≥ -2 Z ≤ 2

% Recuperabilidad 70-130%u ≤ 30% RANGO BAJ O

REPETIBILIDAD ACEPTAT-STUDENT ACEPTAREPRODUCIBILIDAD ACEPTAEXACTITUD ACEPTA

INCERTIDUMBRE ACEPTA

Habiendo cumplido satisfactoriamente con los criterios de aceptación, se declara como validado el método de aerobios totales en alimentos.

RECUPERABILIDAD ACEPTA

SERIE DE REPETICIONES ACEPTAEVALUACIÓN

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ASEGURAMIENTO DE ASEGURAMIENTO DE RESULTADOSRESULTADOS

• Describe las actividades a cumplirse en un período de tiempo para verificar el desempeño adecuado de un método declarado como validado.

VERIFICACION DE MEDIOS, MATERIALES Y RVOS ANTES DE SU USO

QUITO JULIO 2014

CONTROL DE CALIDADCONTROL DE CALIDAD

GRACIAS

QUITO AGOSTO 2014

REPETIC DUPLICADOS1 23 342 12 333 54 65. 123 111. 65 78

Estimación del Criterio de Presición Coliformes Fecales

log A log BRango de

logaritmos1 1,36 1,53 0,16982 1,08 1,52 0,43933 1,73 1,81 0,08054 2,09 2,05 0,04465 1,81 1,89 0,0792

Sumatoria de Rango de log 0,8134n 5,0000

Rango medio 0,1627Criterio de Aceptacion = 3,27*Rango(med) 0,5319

PARA VERIFICAR DUPLICADOS

UFC/100 ML UFC/100 ML LogA LogB

Rango de logaritmos

100 223 2,0000 2,3483 0,3483 CUMPLE

33 43 1,5185 1,6335 0,1150 CUMPLE

120 55 2,0792 1,7404 0,3388 CUMPLE

42 99 1,6232 1,9956 0,3724 CUMPLE

34 98 1,5315 1,9912 0,4597 CUMPLE

TALLER