MICROBIOLOGÍA

2019

TRABAJO PRÁCTICO Nº 2

Cultivo de microorganismos

2

INDICE

PARTE I. NUTRICION BACTERIANA ...................................................................................................... 3

1 CONCEPTOS BÁSICOS ......................................................................................................................... 3

2 CLASES DE NUTRIENTES ..................................................................................................................... 4

2.1 NUTRIENTES UNIVERSALES .......................................................................................................... 4

2.2 NUTRIENTES PARTICULARES ........................................................................................................ 6

2.3 FACTORES DE CRECIMIENTO ........................................................................................................ 7

3 MEDIOS DE CULTIVO .......................................................................................................................... 7

3.1 CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A LA COMPOSICIÓN ....................... 8

3.2 CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A LA CONSISTENCIA ....................... 9

3.3 OTRA CLASIFICACIÓN ................................................................................................................... 9

4 PRODUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS ............................................................................. 11

PARTE II. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS .................................................... 15

1 SIEMBRA Y FORMAS PARA REALIZAR LA TRANSFERENCIA .............................................................. 15

1.1 CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO ....................................................................................................... 16

1.2 CULTIVO EN MEDIO SEMISÓLIDO .............................................................................................. 16

1.3 CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO ..................................................................................................... 17

2 TÉCNICAS DE AISLAMIENTO ............................................................................................................. 17

2.1 MÉTODOS GENERALES ............................................................................................................... 18

2.2 MÉTODOS ESPECIALES ............................................................................................................... 19

3 SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS .................................................. 20

TRABAJO EXPERIMENTAL ....................................................................................................................... 21

CUESTIONARIO ...................................................................................................................................... 25

PROBLEMAS ............................................................................................................................................ 26

3

PARTE I. NUTRICION BACTERIANA

1 CONCEPTOS BÁSICOS La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las

sustancias químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y se

requieren para dos objetivos:

• fines energéticos (reacciones de mantenimiento)

• fines biosintéticos (reacciones plásticas o anabolismo)

La biosíntesis de nuevos componentes requiere de energía procedente del medio ambiente.

Todo microorganismo necesita para vivir una fuente de carbono, una fuente de energía y un dador de

electrones. Según de donde obtenga estos requerimientos, los microorganismos pueden clasificarse

en:

FUENTE DENOMINACIÓN POSIBLE FUENTE

FUENTE DE

ENERGIA

Lumínica FOTOSINTETIZANTE

Química QUIMIOSINTETIZANTE

DADOR DE

ELECTRONES

Inorgánico LITOTRÓFICO SH2, NH3, NO2-, Fe

Orgánico ORGANOTRÓFICO Hidratos de carbono, lípidos,

hidrocarburos, proteínas,

alcoholes

FUENTE DE

CARBONO

Inorgánico AUTOTRÓFICO CO2

Orgánico HETEROTRÓFICO Glucosa, Aminoácidos,

Acetato

• Autótrofas estrictas son aquellas bacterias incapaces de crecer usando materia orgánica como

fuente de carbono.

• Mixotrofas son aquellas bacterias con metabolismo energético litótrofo (obtienen energía de

compuestos inorgánicos), pero requieren sustancias orgánicas como nutrientes para su

metabolismo biosintético.

Sean autótrofas o heterótrofas, todas las bacterias necesitan captar una serie de elementos

químicos, que se pueden clasificar (según las cantidades en que son requeridos) como:

• macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg), y

• micronutrientes o elementos traza (Co, Cu, Zn, Mo...)

En la naturaleza, estos elementos se encuentran combinados, formando parte de sustancias

orgánicas y/o inorgánicas. Algunos de los nutrientes serán incorporados para construir

macromoléculas y estructuras celulares; otros solo sirven para la producción de energía, y no se

incorporan directamente como material celular; finalmente, otros pueden ejercer ambos papeles.

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El mundo bacteriano, como conjunto, exhibe una gigantesca versatilidad metabólica de uso de

nutrientes: desde autótrofos que obtienen su carbono por reducción del CO2 y los demás elementos a

partir de fuentes igualmente inorgánicas, hasta heterótrofos capaces de usar amplia gama de fuentes

orgánicas de carbono.

A su vez, dentro de los heterótrofos, podemos encontrar muchos tipos de nutrición distintos,

desde bacterias metilotrofas que sólo usan metano o metanol como fuente de carbono y energía,

hasta los muy versátiles Pseudomonas, que pueden recurrir a degradar más de 100 tipos de fuentes de

C, incluyendo sustancias tan "exóticas" como hidrocarburos alifáticos y cíclicos. De cualquier modo,

entre los heterótrofos, una de las fuentes más típicas de carbono es la glucosa.

En los heterótrofos-organótrofos, los sustratos carbonados (con un nivel de oxidación no muy

distinto del material celular -CH2O-) entran simultáneamente a:

• metabolismo energético (donde la fuente de C se transforma en CO2, o en CO2 junto con otras

sustancias no totalmente oxidadas);

• metabolismo plástico (anabolismo = biosíntesis de nuevo material celular).

Aunque dentro del mundo de los procariotas se encuentre tanta variedad de nutriciones, las

bacterias que pueden nutrirse solamente de sustancias inorgánicas sencillas (H2O, CO2, N2, NO3-, NH3,

SO4=, fosfatos, etc.) son minoría, pero sus procesos metabólicos son muy interesantes. De hecho,

existen tipos metabólicos que sólo han evolucionado en procariotas. Como paradigma de esto

citaremos los microorganismos quimioautótrofos (o quimiolitoautótrofos): obtienen su energía de la

oxidación de sustancias inorgánicas sencillas, el carbono procede del CO2, y el resto de elementos a

partir de sales inorgánicas, por lo que pueden vivir en soluciones de sales minerales. Lo habitual, sin

embargo, es que muchas bacterias recurran, siempre que puedan, a tomar del medio ciertos

compuestos más complejos, ya que carecen de ciertas rutas biosintéticas.

2 CLASES DE NUTRIENTES Podemos clasificar los nutrientes en las siguientes categorías:

• universales: agua, CO2, fosfatos y sales minerales;

• particulares;

• factores de crecimiento.

2.1 NUTRIENTES UNIVERSALES Agua: Las bacterias necesitan grandes cantidades de agua. De hecho, salvo excepciones, se pueden

considerar como organismos acuáticos. Requieren cierto grado de humedad para crecer. Desde el

punto de vista de sus posibles papeles, el agua es:

• el principal constituyente del protoplasto bacteriano;

• el medio universal donde ocurren las reacciones biológicas;

• un reactante en exceso (es decir, un producto resultante de algunas reacciones bioquímicas).

Las fuentes de agua pueden ser:

• endógena: procedente de procesos de óxido-reducción;

• exógena (la más importante): procedente del medio, y que difunde a través de las

membranas.

Ahora bien, no toda el agua de un ambiente está disponible para la bacteria:

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• Existen determinadas sustancias y superficies que absorben y adsorben (respectivamente),

de modo más o menos intenso, moléculas de agua, dejándolas inasequibles a la bacteria.

• Los solutos disueltos en agua (p. ej., sales, azúcares) tienen afinidad por las moléculas de

H2O que los rodean, por lo que éstas tampoco estarán a disposición del microorganismo.

CO2: El anhídrido carbónico es requerido por todo tipo de bacterias:

• Las autótrofas lo requieren como fuente de carbono, y lo reducen usando como fuente de

energía la luz (en el caso de las fotoautótrofas) u oxidaciones de determinadas sustancias

inorgánicas (los quimioautolitótrofos).

• Las arqueobacterias metanogénicas pueden usar el CO2 como aceptor de los electrones

procedentes de la oxidación del H2, proceso por el que obtienen su energía:

CO2 + 4H2 ---------> CH4 + 2H2O (ΔG'0<0)

• Los heterótrofos, aunque no usan el CO2 como fuente de C ni como aceptor de electrones,

necesitan pequeñas cantidades para las carboxilaciones en determinadas rutas anabólicas y

catabólicas.

El origen del CO2 puede ser:

• endógeno: procedente de descarboxilaciones que ocurren al degradar la fuente orgánica de

carbono;

• exógeno: el CO2 de la atmósfera o disuelto en las soluciones acuosas.

Normalmente, las bacterias crecen a la concentración de CO2 atmosférico (0.03%), pero algunas

bacterias (Neisseria, Brucella), cuando se aislan por primera vez, requieren atmósferas enriquecidas,

con 5-10% de CO2. Ello parece deberse a que poseen alguna enzima con baja afinidad hacia el

carbónico; sin embargo, tras varios subcultivos, suelen adaptarse a crecer a tensiones normales.

Fósforo: Suele requerirse en forma de fosfatos, sea orgánicos o inorgánicos. Las bacterias que pueden

usar los fosfatos orgánicos (merced a la posesión de fosfatasas) no dependen absolutamente de ellos,

ya que pueden recurrir igualmente a los fosfatos inorgánicos. Los fosfatos orgánicos son hidrolizados

por fosfatasas extracelulares o (en las Gram-negativas) periplásmicas (p.ej., la fosfatasa alcalina). El

fósforo se usa principalmente para la síntesis de los ácidos nucleicos y los fosfolípidos, pero aparece

también en coenzimas y en proteínas.

Sales minerales: Las sales minerales son la fuente de aniones (p. ej. el Cl-) y de cationes para la célula.

Los siguientes cationes, concretamente, se necesitan en cantidades relativamente grandes: K+, Mg++,

Ca++, Fe++.

Ión potasio (K+):

• interviene en la activación de una variedad de enzimas, incluyendo las que participan en la

síntesis de proteínas.

• en Gram-positivas está asociado con los ácidos teicoicos de la pared.

Ión magnesio (Mg++):

• estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucleicos;

• como cofactor en muchas reacciones, especialmente las que implican transferencia de grupos

fosfato. Por ejemplo, en las reacciones que requieren ATP, el Mg++ puede unir la enzima al

sustrato durante el mecanismo de acción de la primera.

• Participa de las clorofilas y bacterioclorofilas de bacterias fotosintéticas.

Ión calcio (Ca++):

• es un cofactor de ciertas enzimas, como proteinasas.

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Hierro

Principalmente como ión ferroso, Fe++, suele estar complejado en la naturaleza, formando sales

insolubles. Las bacterias disponen de una serie de moléculas, denominadas sideróforos, capaces de

captar ese hierro (p.ej., hidroxamtas y enterobactina). El hierro:

• participa en muchas moléculas implicadas en procesos de respiración, como citocromos y

ferroproteínas no hémicas (proteínas con Fe-S);

• interviene como cofactor en ciertas enzimas.

Aparte de estos iones que se requieren en cantidades relativamente grandes, las bacterias necesitan

minúsculas cantidades de otros elementos (oligoelementos), a los que también se denomina como

micronutrientes o elementos traza.

• El manganeso (Mn++) es un cofactor de ciertas enzimas, y a veces puede sustituir al Mg++.

• El cobalto (Co++) se requiere casi exclusivamente para la vitamina B12 (de hecho, si

suministramos esta vitamina al medio, la bacteria se vuelve independiente del Co++ libre).

• El zinc interviene en la estabilización de complejos enzimáticos como las ADN- y ARN-

polimerasas.

• El molibdeno participa en las llamadas molibdoflavoproteínas, implicadas en la asimilación de

nitratos. Por otro lado, participa como cofactor, junto con el Fe, en el complejo nitrogenasa de

las bacterias fijadoras de N2 atmosférico.

• El níquel participa en hidrogenasas, enzimas que captan o liberan H2.

2.2 NUTRIENTES PARTICULARES Se trata de elementos que pueden ser cubiertos de modo muy distinto, dependiendo del tipo

de bacteria que consideremos. Concretamente, los elementos N y S (que requieren todos los seres

vivos) pueden ser captados por las bacterias de modos muy distintos, dependiendo de sus capacidades

biosintéticas.

Tanto el N como el S se encuentran en la célula en estado reducido:

• el radical -NH2 forma parte de los aminoácidos (que a su vez son los sillares de las proteínas) y

de las bases nitrogenadas (que participan en los ácidos nucléicos y en algunas coenzimas);

• el radical -SH interviene en determinados aminoácidos y en coenzimas como la CoA.

La mayoría de las bacterias fotosintéticas y muchas heterótrofas asimilan estos elementos en forma

combinada inorgánica oxidada:

• • como NO3-, merced a la actuación secuencial de nitrato-reductasas y nitrito-reductasas

asimilatorias.

• • como SO4=. Este sulfato se activa con ATP, y luego se reduce hasta sulfito y finalmente

sulfhídrico, que ya tiene el estado de reducción adecuado para la incorporación del S.

Muchas bacterias heterótrofas pueden usar alguna forma reducida:

• de N inorgánico: amonio (NH4+)

• de S inorgánico: sulfuros (S=, SH-)

• de N orgánico: aminoácidos, péptidos

• de S orgánico: cisteína.

Muchas de las bacterias que pueden usar amonio como única fuente de nitrógeno también pueden

usar nitratos.

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2.3 FACTORES DE CRECIMIENTO Los factores de crecimiento son moléculas orgánicas específicas que, en muy pequeña

cantidad, algunas bacterias necesitan para crecer. Salvo excepciones no tienen función plástica (no son

sillares de macromoléculas) ni sirven como fuente de energía. Suelen ser coenzimas o sus precursores,

vitaminas, que determinadas bacterias no pueden fabricar por sí mismas, al carecer de parte o de toda

de una ruta biosintética.

Ejemplos:

• las bacterias del género Brucella requieren como factores de crecimiento en sus medios de

cultivo la biotina, niacina, tiamina y ácido pantoténico.

• Haemophilus necesita suplementos de grupos hemo y piridín-nucleótidos.

En la siguiente tabla se muestran algunas de las vitaminas y cofactores requeridos por algunas

bacterias:

Factor o vitamina Funciones principales

p-aminobenzoico (PABA) Precursor del ácido fólico

Ácido fólico Metabolismo de compuestos C1, transferencia de

grupos metilo.

Biotina Biosíntesis de ácidos grasos; fijación de CO2

Cobalamina (vitamina B12) Reducción y transferencia de compuestos C1; síntesis

de desoxirribosa

Niacina (ácido nicotínico) Precursor del NAD; transferencia de electrones en

reacciones redox

Riboflavina Precursor de FAD y FMN

Ácido pantoténico Precursor de la CoA

Tiamina (vitamina B1) Descarboxilaciones; transcetolasas.

Complejo B6 (piridoxal, piridoxamina) Transformaciones de aminoácidos y cetoácidos

Grupo Vitamina K, quinonas Transportadores de electrones (ubiquinonas,

menaquinonas, etc.)

3 MEDIOS DE CULTIVO El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el

laboratorio. Como acabamos de ver, en general, todos los microorganismos tienen parecidos

requerimientos de macro- y micronutrientes, aunque ha quedado claro que la forma en que cada

nutriente es captado puede variar mucho entre unas bacterias y otras, así como la cantidad relativa de

cada nutriente. Los microbiólogos, en su trabajo cotidiano, están acostumbrados a manejar multitud

de "recetas" o fórmulas correspondientes a muchos tipos de medios de cultivo. Un medio de cultivo es

una solución acuosa (bien como tal, o bien incorporada a un coloide en estado de gel) en la que están

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presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un(os) determinado(s)

microorganismo(s).

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

a) de acuerdo a su composición :

• Complejos o indefinidos

• Sintéticos o definidos

b) de acuerdo a su consistencia :

• Sólidos

• Semisólidos

• Líquidos

Otra clasificación adicional permite caracterizarlos como:

• Selectivos

• Diferenciales

A continuación se detallan las características que permiten la clasificación de los medios de cultivo:

3.1 CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A LA COMPOSICIÓN

MEDIOS COMPLEJOS O INDEFINIDOS

Su composición química exacta se desconoce, ya que son el producto de realizar infusiones y

extractos de materiales naturales complejos: Ejemplos:

Extracto de carne: resulta de la extracción de los productos solubles de la carne hervida o macerada y

luego concentrado hasta la consistencia de una pasta o polvo. Su composición es compleja, contiene

proteínas, muy pocos aminoácidos libres, bases nitrogenadas y glúcidos.

Extractos de levadura: resulta del líquido que contiene el protoplasma de las células lisadas. Se lo seca

y concentra a consistencia de polvo. Contiene gran cantidad de vitaminas.

Peptonas: se denominan peptonas a productos sin identidad química definida, obtenidos a partir de la

hidrólisis parcial de proteínas. Sometiendo las proteínas a hidrólisis se llega a las metaproteínas,

proteosas, peptonas, polipéptidos y finalmente a los aminoácidos. Entre estos distintos compuestos no

existe una línea neta de demarcación pasándose de unos a otros en forma gradual con la extensión del

proceso hidrolítico. No todos los productos de hidrólisis son iguales ni utilizados de la misma forma por

las bacterias. Para algunas bacterias la fuente de obtención de Nitrógeno pueden ser proteínas

parcialmente hidrolizadas, pero para otras el crecimiento depende o al menos es favorecido por la

presencia de aminoácidos libres que, por otra parte, si se encuentran en gran cantidad pueden actuar

como inhibidores del desarrollo. Las peptonas utilizadas normalmente contienen la misma

composición química puesto que se preparan a partir de la misma materia prima y los mismos

métodos de digestión para elaborarlas. Las peptonas usadas comúnmente son las preparadas por las

firmas: White, Parke-Davis, Merck, Difco y Microquim. Las más comunes son peptonas a partir de

carne o de caseína (de la leche).

Con ellos se logra un tipo de medio rico nutricionalmente, aunque indefinido químicamente. Si

lo que pretendemos simplemente es obtener un buen crecimiento bacteriano, este tipo de medios es

ideal, ya que su confección es fácil y rápida (basta pesar una cierta cantidad del extracto desecado,

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suministrado por casas comerciales, disolverlo en agua y esterilizar en autoclave, antes de inocular e

incubar la bacteria con la que queramos trabajar). Estos medios contienen fuentes variadas de C y N

orgánicos, sales minerales y micronutrientes. Sin embargo, con ellos no podemos tener un control

nutricional preciso, ya que desconocemos la composición química y proporción exacta de los distintos

nutrientes.

MEDIOS SINTÉTICOS O DEFINIDOS

Se obtienen disolviendo en agua destilada cantidades concretas de distintas sustancias

químicas puras, orgánicas y/o inorgánicas. La composición concreta de un medio sintético dependerá

de la bacteria que queramos cultivar: lógicamente, un medio definido para una bacteria con grandes

capacidades biosintéticas será más sencillo que el medio definido de otra bacteria con menores

posibilidades biosintéticas.

3.2 CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A LA CONSISTENCIA

Cualquiera que sea el tipo de medio podemos elaborar tres tipos de "versiones", según su

estado físico o consistencia:

• medios líquidos: sin gelificante

• medios sólidos: derivan de los líquidos simplemente añadiendo a la solución nutritiva un coloide en

estado de gel que solidifica (da consistencia) a esta solución.

• medios semisólidos: si se agrega una cantidad de coloide en estado de gel menor que la adicionada a

los medios sólidos.

El gelificante más usado es el agar-agar, extraído de algas rojas (p. ej. Gelidium), del cual

existen versiones más o menos purificadas (las más puras están más enriquecidas en el polisacárido

agarosa; son las que se emplean para los medios definidos, con objeto de evitar la introducción de

sustancias "contaminantes" inadvertidas que falseen las interpretaciones sobre el comportamiento

nutricional de la bacteria). El agar presenta la gran ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta

cerca de los 100°C, lo que permite su uso para la inmensa mayoría de bacterias estudiadas, que son

mesófilas. En general se usa una concentración mayor a 1% p/v a los medios sólidos y menor a esa

cantidad (habitualmente 0,3-0,6% p/v) a los medios semisólidos.

Para cultivar ciertas bacterias (sobre todo los quimioautótrofos) se suele recurrir a un

gelificante inorgánico, el silicagel o gel de sílice.

3.3 OTRA CLASIFICACIÓN

MEDIOS SELECTIVOS

Son aquellos que permiten seleccionar un tipo (o unos pocos tipos) de microorganismos. En el

laboratorio se emplean frecuentemente medios selectivos sólidos que incorporan ciertas sustancias

que inhiben el crecimiento de ciertas bacterias, pero permiten el crecimiento de otras. Medios que

llevan violeta cristal, por ejemplo, inhiben el crecimiento de bacterias Gram-positivas.

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MEDIOS DIFERENCIALES

Son aquellos que permiten distinguir a simple vista dos o más tipos de bacterias en función de

su distinto comportamiento respecto de algún nutriente del medio. Ese comportamiento diferencial se

traduce normalmente en un viraje de color de una sustancia indicadora presente en el medio.

Ejemplos:

• en el medio EMB (eosina-azul de metileno) ciertos tipos metabólicos de bacterias producen

cambios de color y precipitación de sales cuando producen ácidos por fermentación de la fuente de

carbono.

• el medio llamado agar-sangre lleva un 5% de sangre de caballo o carnero, lo cual revela la

capacidad (y el tipo) de hemólisis de ciertas bacterias.

• el medio de Kempler & McKay permite identificar aquellas bacterias capaces de metabolizar

citrato. Entre sus componentes posee ferricianuro de potasio y citrato férrico. Cuando las bacterias

consumen el citrato, el hierro que queda libre reacciona con el ferricianuro dando el complejo azul

de Prusia; luego de 24 o 48 hs de incubación a 30°C las colonias que metabolizan citrato adquieren

color azul.

• el medio llamado caldo tioglicolato permite diferenciar microorganismos en base a su

requerimiento de oxígeno. Es el medio de enriquecimiento más utilizado en Microbiología.

Contiene 0,075 % de agar para evitar que las corrientes de convección transporten el oxígeno de

la superficie a toda la masa del caldo. El ácido tioglicólico actúa como agente reductor,

disminuyendo aún más el potencial de óxido-reducción del medio. La presencia de una

importante variedad de nutrientes (caseína, extractos de levadura y carne, vitaminas, etc.) en el

medio permite el desarrollo de la mayor parte de las bacterias. Hay distintas fórmulas

modificadas en las que se han incluido otros componentes: un indicador de óxido-reducción

(Resazurina) el cual vira a rojo ante el eventual aumento del contenido en oxígeno, Glucosa,

Vitamina K1 y Hemina. El crecimiento en los tubos se distingue por la presencia de turbidez a

distintas profundidades: se observa que las bacterias estrictamente aerobias, crecen en la parte

superior, mientras que las anaerobias facultativas o anaerobias estrictas crecen en las

profundidades del medio.

A continuación, puede observarse el comportamiento de los distintos microorganismos con distinta

tolerancia o dependencia del oxígeno.

1. Aerobios estrictos

2. Anaerobios estrictos

3. Facultativos

4. Anaerobios aerotolerantes

5. Microaerófilos

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Algunos medios son simultáneamente selectivos y diferenciales, por ej., el agar de MacConkey.

Se trata de un medio de color rosado y transparente, que posee, entre otras sustancias, lactosa, peptonas,

el colorante vital rojo neutro, sales biliares y violeta cristal.

Este medio es selectivo contra muchas bacterias Gram-positivas debido al violeta cristal y

también contra selecciona muchas Gram-negativas que podrían crecer debido a las sales biliares (que son

agentes tensioactivos que desorganizan membranas). En cambio, las Enterobacterias están

evolutivamente adaptadas a soportar sales biliares en su hábitat natural (el intestino de vertebrados

superiores) y pueden crecer en este medio.

En su faceta de medio diferencial, el agar MacConkey permite visualizar dos tipos de

Enterobacterias según que puedan o no fermentar la lactosa, con producción de ácidos. Las bacterias

fermentadoras de lactosa (Lac+), excretan al medio gran cantidad de ácidos orgánicos, lo que provoca que

sus colonias y sus alrededores aparezcan de color rojo intenso, debido al viraje del rojo neutro; además,

se forma un halo turbio a cierta distancia de estas colonias, fenómeno ocasionado por la precipitación de

las sales biliares inducida por la acidez. En cambio, las bacterias Lac-, al no poder usar la lactosa, recurren

como fuente de C a las peptonas, a las que desaminan: incorporan el esqueleto carbonado, excretando

iones NH4+, que alcalinizan el medio de cultivo, lo cual se traduce en que el indicador rojo neutro vira a

amarillo.

4 PRODUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS

Algunas especies bacterianas son capaces de producir metabolitos secundarios. Estos compuestos

poseen un amplio rango de estructuras químicas y actividades biológicas, aunque no son esenciales para

el crecimiento. Las funciones biológicas que pueden cumplir son: agentes de defensa competitiva contra

otras bacterias, hongos, insectos y animales superiores, agentes de transporte de metales, hormonas

sexuales y efectoras de diferenciación, entre otras. Algunos de estos compuestos son coloreados y se

pueden distinguir fácilmente en el medio de cultivo. Serratia marcescens es una bacteria Gram negativa,

anaerobia facultativa, baciliforme, de la familia Enterobacteriaceae, que produce un metabolito

secundario característico de color rojo, la prodigiosina. El género Gram positivo Streptomyces también es

un gran productor de metabolitos secundarios. Dentro de este género la especie bacteriana S. coelicolor

produce dos compuestos coloreados característicos que presentan actividad antibiótica, la actinorhodina,

que es de color azul y se libera al medio extracelular y la undecilprodigiosina, que es rojo y permanece

anclado a la membrana celular.

12

Tabla 1. Ejemplos de medios de cultivo usados para el cultivo de bacterias MEDIO TIPO INDICADOR/REACTIVO INHIBIDOR TEORIA EJEMPLOS

SS

Diferencial - Selectivo.

Aislamiento de bacilos

Gram negativos y en

particular patógenos

entéricos (Salmonella y

Shigella) a partir de

heces, alimentos y

otros materiales en los

cuales se sospeche su

presencia.

Permite distinguir

fermentadores de

lactosa y productores

de H2S.

1. Rojo Neutral absorbido

por sales biliares

precipitadas, indicando

fermentación de lactosa.

Acido=Rojo

Alkali=Ambar

rango de pH: 6,8 – 8,0

2. Citrato férrico - indica

producción de H2S a

partir de tiosulfato-

precipitado negro de FeS.

Sales biliares y verde

brillante-inhiben a Gram

(+), la mayoría de las

coliformes y Proteus spp.

Fermentadores de lactosa: producen

ácidos - el pH ácido hace cambiar el

color del indicador y provoca la

precipitación de las sales biliares que

absorben el rojo neutro - las colonias

crecen rojas.

No fermentadores de lactosa: no

cambia el pH del medio - sin cambios

en el indicador - las colonias no se

colorean.

Salmonella, Shigella: colonias transparentes

Lac-.

Proteus y Salmonella thyphimurium: colonias

transparentes con centro negro (productora

de SH2 - formación FeS).

E. coli: colonias pequeñas, rojas o rosadas si

fermentan lactosa (Lac+).

Mac Conkey

Diferencial – Selectivo Aislamiento de bacilos

Gram negativos y en

particular patógenos

entéricos a partir de

muestras clínicas, agua

o alimentos.

Permite diferenciar

fermentadores de

lactosa

Rojo Neutral absorbido

por sales biliares

precipitadas, indicando

fermentación de lactosa.

Acido=Rojo

Alkali=Ambar

rango de pH: 6,8 – 8,0

1. Cristal Violeta contra

Gram (+)

2. Sales biliares contra

Gram (+) y algunos Gram (-

), permite aislar

enterobacterias.

Igual que SS, excepto coliformes que

no son inhibidas y muestran buen

crecimiento.

E. coli: rojas o rosas con halo turbio (Lac+) o

transparentes (Lac-).

Enterobacter aerogenes: rosas (Lac+) y

mucosas.

Staphylococcus aureus: muy inhibidas.

Salmonella, Shigella, Pseudomonas: colonias

transparentes (Lac-).

Mitis-

Salivarus

Agar

Diferencial – Selectivo para el aislamiento de

estreptococos y

enterococos de la

cavidad oral o

intestinal u otras

Azul Tripan es adsorbido

por las colonias

produciendo color azul.

Violeta Cristal inhibe Gram

(+) excepto streptococos y

enterococos.

Telurito contra Gram (-)

Violeta cristal y telurito inhiben la

mayoría de los organismos presentes

en materia fecal, para el aislamiento

y testeo de streptococos y

enterococos.

Streptococcus mitis: colonias azules y

pequeña (0,2 mm).

S. salivaris: colonias azules de mayor tamaño

(1-5 mm)

Enterococcus: Colonias brillantes azul oscuro

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muestras o negras, 1-2 mm de diámetro.

Baird-Parker

Agar

Selectivo-Diferencial para el aislamiento de

estafilococos coagulasa

(+) en alimentos,

muestras ambientales

y clínicas

Yema de huevo-actividad

lecitinasa y lipasa

Telurito contra Gram(-)

Glicina: selectivo para cepas

coagulasas (+) de S. aureus.

Cloruro de Litio contra

Gram (-)

El Piruvato estimula el crecimiento S.

aureus y la yema de huevo sirve para

indicar la producción de lecitinasas y

lipasas. Estas actividades generan un

halo transparente o ligeramente

opaco alrededor de la colonia.

Staphylococcus: colonias negras, brillantes y

pequeñas debido a la reducción del telurito.

Halo transparente alrededor si son coagulasa

(+)

Cualquier otro organismo tienen su

crecimiento inhibido o no crecen.

Mannitol

Salt Agar

Diferencial-Selectivo

para el aislamiento de

estafilococos a partir

de muestras clínicas o

muestras sospechosas

de contaminación

Rojo Fenol usado para la

indicacion de

Fermentación de

Manitol.

Acido=Amarillo

Alkali=Rojo

rango de pH: 6,8 – 8,4

7,5 % de NaCl inhibición

parcial o completa de otros

microorganismos,

especialmente Gram (-)

Fermentadores de Manitol: producen

ácido de modo que el indicador

cambia a Amarillo.

No Fermentadores de Manitol: no

producen ácido, no produciéndose

cambio de color en el indicador.

Generalmente Manitol (+) son

fermentadores y Manitol (-) son no

fermentadores.

S. aureus: colonias amarillas y anillo amarillo

alrededor de la colonia (fermentadores de

manitol)

S. epidermis: ningún cambio en el medio. Las

colonias se observan rojas.

Eosin-

Methylene

Blue (EMB)

Diferencial-Selectivo

para la detección y

aislamiento de

enterobacterias,

particularmente

patógenos intestinales.

1. Azul de Metileno

2. Eosina

Ambos indicadores de

fermentación de la

lactosa y/o sacarosa.

Azul de Metileno y eosina

inhiben desarrollo de Gram

(+).

Fermentadores de lactosa: producen

ácido y cambia el indicador.

No Fermentadores de lactosa: no

producen ácido.

Se agrega Sacarosa para detectar

fermentadores de Lactosa lentos.

E. coli: colonias negro azuladas con brillo

metálico

E. aerógenes: colonias mucoides con centro

oscuro.

Salmonella, Shigella y otros Lac-, producen

colonias no coloreadas.

14

SIM

Diferencial para la identificación de enterobacterias (Salmonella y Shigella). Permite ver movilidad y evidenciar producción de sulfuro e indol.

1. Citrato férrico - indica

producción de H2S a

partir de tiosulfato.-

precipitado negro de FeS.

2. Reactivo de Kovac o de

Ehrlich-se agrega para

detectar producción de

Indol a partir de

triptofano.

3. Bajo contenido de

agar-movilidad

Los ensayos se realizan en tubo.

Semi-solido para motilidad.

H2S + Fe = FeS (ppdo negro)

Indol + p-dimetilamino-benzaldehido

(Kovac´s) = Compuesto Rojo

Salmonella Shigella E. coli

Motilid. (+) (-) (+)

H2S (+) (-) (-)

Indol (-) (-) (+)

Triple Sugar

Iron (TSI)

Diferencial para identificación de enterobacterias patógenas en base a la capacidad de fermentar glucosa, lactosa y/o sacarosa y de producir H2S y gas

1. Fenol rojo indica

fermentación de

azúcares. Amarillo =

Acida Rojo = Alcali

2. Sulfato de hierro y

amonio- indica

producción de H2S a

partir de tiosulfato.

Los ensayos en general se realizan en

tubos en pico de flauta. Organismos

capaces de fermentar glucosa

acidifican el medio en el fondo del

tubo (amarillo, A). El medio

permanece rojo si no hay

fermentación (alcalino, K). La

fermentación de lactosa o sacarosa

en mayor cantidad acidifica el medio

en toda la superficie. Si aparece

rotura o desplazamiento del medio,

la bacteria produce gas.

La producción de H2S se produce a

pH neutro o alcalino, ya que el pH

ácido inhibe la reacción:

H2S + FeSO4 = FeS (ppdo negro)

pico/fondo – Gas – H2S

E. coli A/A (+) (-)

P. mirabilis K/A (-) (+)

S. flexneri K/A (-) (-)

P. auriginosa K/K (-) (-)

S. typhimurium K/A (-) (+)

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PARTE II. SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS INTRODUCCIÓN

En la naturaleza, la mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axénicos o puros. Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene un sólo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola célula; el crecimiento de ésta origina, en medio sólido, una masa de células fácilmente visible que recibe el nombre de colonia.

Para obtener cultivos puros a partir de una población microbiana mixta, se utilizan las denominadas técnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister utilizó diluciones seriadas en medio líquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminación, es decir, de microorganismos no deseados, dificultó el aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los medios sólidos, complementados con agar, y las placas de Petri en Bacteriología, permitiendo así la separación física de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas.

1 SIEMBRA Y FORMAS PARA REALIZAR LA TRANSFERENCIA Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio

adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Para sembrar en microbiología es necesario mantener la habitación sin corrientes de aire y estar al lado de la llama de un mechero (no más de 15 cm. de distancia). También se puede trabajar bajo campana, o en flujo laminar, previa esterilización con luz UV.

La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando ansa, hilo, o bien hisopo o pipeta estéril. Se debe esterilizar en la llama (hasta que todo el filamento se haya puesto al rojo vivo) el ansa o el hilo y enfriar, antes y después de realizada la siembra. Para transferir los microorganismos, se recomienda:

a) Medio líquido a medio líquido: utilizar pipeta Pasteur o graduada, ansa o hilo.

b) Medio líquido a medio sólido: utilizar pipeta Pasteur o graduada, ansa o hilo, e hisopo.

El ansa se toma delmango como sifuera un lápiz

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c) Medio sólido a medio sólido: utilizar ansa o hilo.

d) Medio sólido a medio líquido: ansa o hilo.

Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.

1.1 CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO

1.1.1 Tubos con agar inclinado Previo a la siembra y con posterioridad a ésta es importante pasar la boca del tubo (sin la tapa)

por la llama del mechero (flameado). Esta operación genera corrientes de convección que previenen que los contaminantes del aire caigan dentro de los recipientes. El calentamiento puede también matar los microorganismos que se encuentren en la boca de los recipientes. Para realizar la siembra se puede utilizar el ansa, realizando un movimiento suave sobre la superficie del agar en forma de zigzag, desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no dañar el agar. También se puede utilizar el hilo. En este caso, se realiza la punción y luego se siembra en la superficie de manera similar a lo descripto, pero extremando los cuidados para no romper la superficie. Luego de la incubación, se observará el aspecto general del medio y la aparición de crecimiento sobre su superficie. Este tipo de siembra permite el cultivo de microorganismos aerobios o anaerobios facultativos y además se utiliza para almacenar cultivos durante cortos períodos de tiempo a temperaturas de 4°C, o para la amplificación de un inóculo pequeño.

1.1.2 Siembra en placas Puede ser en superficie (utilizando espátula de Drigalski, ansa o hisopo) o por mezcla (el inóculo

con el medio de cultivo agarizado aún fundido, a temperatura de unos 45°C, se mezclan y se vierte en la placa de Petri, como se explica en detalle más adelante).

Las placas se incuban invertidas, ya que la alta concentración de agua en el medio puede provocar condensación durante la incubación y si cae sobre la superficie del agar, se extiende dando un crecimiento confluente. En medio sólido cada célula viable dará origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas se puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino además para contar y aislar. En general cuando se quieren tener colonias aisladas a partir de un material determinado, es necesario diluir la muestra en tubos con suero fisiológico estéril.

1.2 CULTIVO EN MEDIO SEMISÓLIDO Se utilizan tubos sin inclinar. Se siembra por picadura o punción

utilizando un hilo. Este tipo de medio contiene una proporción menor de agar que los medios sólidos. El medio queda inoculado al introducir el hilo en profundidad, pero sin tocar el fondo del tubo, retirándolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar la picadura.

En medio semisólido se podrá comprobar si el microorganismo es o no móvil, ya que en el primer caso se observará que el crecimiento difunde alrededor de la zona donde se hizo la picadura, detectándose turbidez (ver ejemplo tubo 1 de la figura). Los microorganismos inmóviles crecerán únicamente a lo largo de la picadura (ver ejemplo tubo 2 de la

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figura). Una siembra con ansa o con un cierto movimiento de vaivén podría originar un patrón de crecimiento que se interpretaría erróneamente como movilidad bacteriana.

Este tipo de siembra en picadura sirve, también, como otro método de conservación de microorganismos anaerobios facultativos.

1.3 CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO Habitualmente se realiza en tubos, frascos o erlenmeyers. Antes y después de realizada la

siembra, se debe pasar la boca del recipiente (sin tapa) por la llama del mechero (flameado). En los cultivos líquidos no tiene lugar la formación de colonias, por lo tanto, no sirven como

técnica de aislamiento. La utilización de medios de cultivo líquidos permite la obtención de una población microbiana grande, con un elevado número de microorganismos, para ser utilizados posteriormente. En estos cultivos se examinará la existencia de enturbiamiento más o menos intenso, la formación de una película o velo sobre la superficie, la aparición de sedimento en el fondo del tubo, etc.

2 TÉCNICAS DE AISLAMIENTO

Aislar es separar un tipo de microorganismo a partir de una población heterogénea. En hábitats naturales raramente encontramos un solo tipo de microorganismo en una muestra, por lo tanto, es necesario hacer algún procedimiento de aislamiento para separar e identificar los distintos tipos de microorganismos presentes. El objetivo del aislamiento es obtener colonias bien separadas (las colonias se forman a partir de una sola “unidad formadora de colonias”) de las que se conseguirá un cultivo puro. Una vez obtenidos los cultivos puros se podrán estudiar las características macroscópicas, microscópicas, fisiológicas, etc. de un microorganismo en particular. Hay que tener en cuenta que siempre el aislamiento se da en un medio sólido. El medio líquido sirve para enriquecer, pero no para aislar.

El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los microorganismos están en una proporción adecuada. Cuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporción en la muestra, o interesa un solo tipo de microorganismo, se lleva a cabo un procedimiento que involucra una primera etapa de aumento del número de microorganismos del tipo que se desea aislar en relación al resto de la población (enriquecimiento). Luego se aísla por el método de estrías o por dilución y se identifica.

Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos: A) Métodos generales 1) Por diseminación en superficie (agotamiento de ansa, depósito y posterior quemado y dilución) 2) Por mezcla. B) Métodos especiales (calentamiento, agregado de álcali o ácido, por temperatura de incubación,

cambios en el pH y presencia de sales o colorantes). Estos métodos sirven cuando se desea aislar un microorganismo que posea una característica especial (resistente al calor, anaerobio, etc)

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2.1 MÉTODOS GENERALES 2.1.1 Por diseminación en la superficie de un medio sólido en placa de Petri

Es la técnica más utilizada. Con un ansa de siembra, calentada al rojo vivo en el mechero y enfriada cerca del mismo, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre la superficie de la placa con el medio agarizado, pero sin hacer presión para no dañar el agar. Se lleva la placa a incubar a la temperatura adecuada, siempre en posición invertida lo que evitará que el agua de condensación se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtención de colonias aisladas. Mediante éstas técnicas se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado número de bacterias.

Existen distintos tipos de trazados tendientes a lograr una buena separación entre los gérmenes sembrados. Se puede sembrar por:

i. Agotamiento de ansa: Se flamea el ansa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se realizan estrías en dos placas en forma consecutiva sin recargar el ansa.

ii. Depósito y posterior quemado: Se carga el ansa con la muestra y las estrías se extienden sobre un área pequeña de la superficie de la placa. Se retira el ansa, se quema a la llama, y luego de enfriarla en el interior de la placa se hacen nuevas estrías por otra zona tocando ligeramente la muestra sembrada anteriormente. Este proceso puede repetirse sucesivamente, flameando y enfriando el ansa al comienzo de las sucesivas siembras en estría, de acuerdo a la carga inicial de microorganismos. Tras la incubación, se observarán las colonias aisladas en alguna región de la placa inoculada, donde se puede estudiar la morfología colonial.

iii. Dilución previa en solución fisiológica o caldo: Se toma la muestra para aislar y se la resuspende en solución fisiológica o caldo nutritivo, preparando luego diluciones seriadas decimales en condiciones asépticas. Se toman las diluciones y se estría con ellas una placa para cada una. En la dilución adecuada se obtendrán colonias aisladas.

iv. Extensión en superficie con espátula de Drigalski: Aquí también pueden prepararse diluciones decimales. Se deposita sobre la superficie de la placa una gota ó 0,1 ml de una determinada dilución del cultivo de microorganismos problema y se extiende con ayuda de la espátula, previamente esterilizada por flameado, en todas las direcciones hasta que esté completamente seco.

Depósito y posterior quemado Extensión en superficie con espátula de Drigalski

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Tras el período de incubación las colonias aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente si la siembra se ha realizado de forma correcta. Podrán diferenciarse las colonias de acuerdo a su tamaño, forma, color, textura, etc. Esta técnica de siembra, además de permitir el aislamiento de colonias, permite el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado.

2.1.2 Por mezcla Esta técnica tiene la ventaja de permitir el cálculo del número de bacterias presentes en la

muestra, si se trabaja con exactitud. Se realizan diluciones seriadas de la muestra y se coloca en tubos estériles, por separado, el mismo volumen de cada una. Luego se vierte en el tubo, medio de cultivo fundido y atemperado aproximadamente a 45°C. El contenido se homogeneiza por rotación, y luego se lo vierte sobre la superficie de una placa de Petri. Tras la homogeneización, se dejan enfriar las placas hasta que se solidifique el medio y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada (siempre en posición invertida).

Otra variación de esta técnica consiste en depositar en una placa de Petri vacía un pequeño volumen conocido de muestra y a continuación añadir el medio de cultivo fundido y atemperado, mezclando por rotación suave de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirán homogéneamente en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.

Las colonias aparecen distribuidas por toda la masa del agar. Aquellas que están en la superficie tendrán distintas características, dependiendo del tipo microbiano, mientras que las colonias que se desarrollan en el interior, bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular, aunque los microorganismos que formen las distintas colonias sean de distinto tipo. Por tanto, las colonias que aparecen en la profundidad del agar son siempre biconvexas y no se diferencian unas de otras por su morfología. Aunque con esta técnica se obtienen colonias aisladas, generalmente sólo se utiliza para determinar el número de microorganismos viables en una muestra, cuando éstos son anaerobios facultativos o microaerófilos.

2.2 MÉTODOS ESPECIALES Se basan en las características del germen que se quiere aislar. Hay que tener en cuenta que

puede haber microorganismos que poseen idénticos comportamientos frente a un mismo agente físico o químico.

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i) Calentamiento: se utiliza para el aislamiento de gérmenes esporulados de los no esporulados.

Consiste en calentar la suspensión a 100°C durante 10 min. y 85°C durante 15 o 30 min. Luego se siembra en medios sólidos.

ii) Agregado de álcali o ácido: tratamiento de la muestra con algunos de estos agentes ya que existen microorganismos que los resisten y otros que no.

iii) Variaciones de la temperatura de incubación: incubando a dos temperaturas distintas iv) Cambios en el pH: existen unos pocos gérmenes que pueden crecer en medios con pHs extremos. v) Presencia de sales o colorantes: debido a la capacidad de distintos microorganismos de crecer o

no en medios con sales, sustratos, colorantes o antibióticos, se utilizan distintos medios de cultivo con el fin de lograr su aislamiento.

3 SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS Para aislar microorganismos anaerobios que son rápidamente destruidos por el contacto con el

oxígeno, una vez que la muestra ingresa al laboratorio debe ser procesada evitando su exposición al oxígeno atmosférico. Los medios de cultivo sólidos deben ser preparados inmediatamente antes de ser usados para evitar una posterior difusión de oxígeno al medio. Por el mismo motivo, los medios líquidos deben ser regenerados por calentamiento a baño maría durante 10 min.

Los medios de cultivo que se utilizan contienen agentes reductores (convierten el O2 en H2O) como por ejemplo la cisteína, glutatión, tioglicolato. Algunos son tapados con agentes semisólidos (una capa de vaselina-parafina o agar al 0,5%) para evitar el acceso de aire. Otros medios contienen trozos de tejidos, lo que da una atmósfera reducida. Métodos para incubar en anaerobiosis

Puede recurrirse al uso de tubos con pirogalol o velas, pero más frecuentemente suelen usarse jarras anaerobias de las cuales existen varios tipos (Brewer, Torbal, Gas Pack, etc.). Generalmente todas ellas se basan en el mismo principio que es extraer el oxígeno o, mejor dicho, consumirlo. El material de la jarra suele ser plástico, vidrio o metal. Tiene además una tapa que asegura el cierre hermético.

La generación de hidrógeno permite la reducción del oxígeno y da lugar a la formación de agua. Se utiliza el paladio como catalizador, el cual es inactivado con el ácido sulfhídrico, exceso de humedad y otros productos metabólicos volátiles de las bacterias. Al catalizador se lo puede reactivar en horno de calor seco a 160-170 °C durante dos horas.

Como indicador de óxido-reducción suelen utilizarse tiras de papel embebidas con azul de metileno, las cuales son incoloras en estado reducido o azuladas cuando están oxidadas. Generadores de mezclas gaseosas:

Sobres comerciales de Gas Pack: son de aluminio y contienen dos tabletas: a) Ácido cítrico y bicarbonato de sodio y b) borohidruro de sodio.

Al hidratarse el sobre, la primera tableta libera CO2 y la segunda H2. Si la jarra funciona bien al cabo de una hora existe menos del 1% de O2.

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TRABAJO EXPERIMENTAL

SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Este práctico tiene como objetivo general familiarizarse con los métodos de siembra y aislamiento

de microorganismos en diferentes medios de cultivo.

A) Distribución de los medios de cultivo

Medio sólido y semisólidos en tubos: Es necesario fundir el medio para homogeneizar el agar. Una vez atemperado (45°C), se procede

a colocar el medio (por volcado y en condiciones de esterilidad) dentro de tubos estériles. Se debe colocar la cantidad de medio requerida según el tipo de ensayo que se quiera realizar (IMPORTANTE: prestar atención a las indicaciones del docente). Inmediatamente después de dispensar el medio de cultivo, se debe tapar el tubo con su tapa plástica.

Los medios sólidos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar en posición vertical (si van a ser inoculados en profundidad) o bien pueden inclinarse para que al solidificarse en esa posición, adoptando una forma inclinada que proporciona una mayor superficie de siembra (tubo con agar inclinado o también llamado pico de flauta).

Los medios semisólidos contenidos en tubos deben dejarse enfriar en posición vertical para ser inoculados en profundidad. Medio sólido en placas:

Fundir el medio de cultivo que ha sido esterilizado en un frasco y, una vez atemperado (aproximadamente 45°C), se verterá en placas vacías estériles en un ambiente aséptico, como el que proporciona la proximidad de la llama de un mechero o una campana de flujo laminar. Si se han de incorporar al medio compuestos termolábiles, como vitaminas o antibióticos, se esterilizarán éstos por filtración y se añadirán al medio de cultivo previamente esterilizado en autoclave y una vez que éste se haya atemperado. Práctica 1- Preparar una placa con el medio LBA por alumno. Fundir en microondas el LBA esterilizado previamente. Cuando se atempere (45°C aproximadamente) el medio, volcarlo en condiciones de esterilidad sobre una placa de Petri vacía (hasta cubrir la base de la placa y alcanzar un tercio de la altura). Tapar y dejar solidificar sobre la mesada. Antes de sembrar, se debe poner a secar con la tapa entreabierta en el flujo laminar o cerca de un mechero.

2- De manera similar, preparar una placa con el medio MacConkey fundido por grupo. Dejar solidificar y secar las placas

3- Colocar 4 ml aproximadamente de medio LBA fundido a un tubo de hemolisis estéril por grupo. Tapar y dejar inclinado (pico de flauta).

4- Colocar 3 ml aproximadamente de medio SIM fundido a un tubo de hemolisis estéril por grupo. Tapar y dejar en posición vertical.

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4- Fundir en microondas el medio Tioglicolato (corroborar que el color del medio vire del rojo al amarillo, esto nos garantizará que se haya eliminado todo el oxígeno inicialmente presente en el medio). Rápidamente colocar aproximadamente 10 ml de medio Tioglicolato fundido a un tubo de ensayo estéril por grupo. Tapar rápidamente tanto el tubo como el frasco con el medio de cultivo remanente. Dejar el tubo en posición vertical.

B) Práctica de siembra y aislamiento Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio

adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento del o los microorganismos de interés. La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, ansa, espátula de Drigalski, hisopo o pipeta estéril.

Cultivo en medio líquido: Habitualmente se realiza en tubos o erlenmeyers. El crecimiento se puede manifestar por enturbiamiento, por formación de velo o película, o por sedimento.

Cultivo en medio sólido: Puede ser en tubos o placas.

Cultivo en medio semisólido: en tubos.

IMPORTANTE: Las placas se incuban invertidas, ya que la alta concentración de agua en el medio puede provocar condensación durante la incubación y si cae sobre la superficie del agar, se extiende dando un crecimiento confluente. En medio sólido cada célula viable dará origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas se puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino además para contar y aislar. En los cultivos líquidos no tiene lugar la formación de colonias, por lo tanto, no sirven como técnica de aislamiento.

Aislar es separar un tipo de microorganismo a partir de una población que lo contiene. En

general cuando se quieren tener colonias aisladas a partir de un material determinado, es necesario diluir la muestra. En la práctica se puede aislar utilizando alguno de los siguientes procedimientos:

A) Aislamiento en placa por estrías

i) Agotamiento de ansa

ii) Depósito y posterior quemado

B) Aislamiento por dilución del medio líquido y posterior sembrado en medio sólido.

Práctica

Obtener colonias aisladas estriando en placa:

1. Observar la dureza del medio agar y la posición del ansa necesaria para no romper la superficie. 2. Esterilizar el ansa (al rojo) y enfriar manteniendo esterilidad. 3. Tomar una colonia aislada de la placa de la mezcla de microorganismos (seleccionar un tipo de

microorganismo de la placa sembrada en el práctico 1) con el ansa en forma estéril.

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4. Aislar en la nueva placa de Petri mediante la técnica de depósito y posterior quemado (ver figura).

5. Volver a esterilizar el ansa al terminar de sembrar para eliminar microorganismos remanentes. 6. Proceder de manera similar sobre la placa de medio MacConkey pero utilizando un tercio de la

placa para cada microorganismos a sembrar. En las secciones restantes se siembran dos bacterias control.

7. Incubar la nueva placa de Petri a 37°C (invertida) hasta aparición de colonias.

Inoculación por punción:

1. Esterilizar el hilo (ansa recta). 2. Una vez frío, tomar una colonia aislada de la placa de los microorganismos incognita (provista

por los docentes) en forma estéril. 3. Punzar cuidadosamente en el centro del tubo conteniendo medio semisólido SIM sin llegar al

fondo y retirar el hilo cuidadosamente tratando de recorrer el mismo camino de la punción (ver Figura).

4. Esterilizar nuevamente el hilo para eliminar microorganismos remanentes. 5. Incubar tapado a 37°C hasta observar desarrollo de los microorganismos.

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Inoculación por punción y estría en tubo:

1. Flamear un hilo (ansa recta). 2. Una vez frío, tomar una colonia aislada de la placa del microorganismo seleccionado (provista

por los docentes) en forma estéril. 3. Punzar cuidadosamente en el centro del tubo conteniendo medio sólido LBA en forma de pico

de flauta sin llegar al fondo (ver Figura A) y retirar el hilo cuidadosamente tratando de recorrer el mismo camino de la punción. Terminar realizando un estriado sobre la superficie de agar de la porción del pico de flauta (ver Figura B)

4. Flamear el hilo. 5. Incubar tapado a 37°C hasta evidenciar crecimiento.

Inoculación del tubo conteniendo medio tioglicolato:

1. Flamear un hilo (ansa recta). 2. Una vez frío, tomar una colonia aislada de la placa del mismo microorganismo

(provista por los docentes) en forma estéril. 3. Punzar cuidadosamente en el centro del tubo conteniendo medio tioglicolato sin

llegar al fondo y retirar el hilo cuidadosamente tratando de recorrer el mismo camino de la punción (ver figura).

4. Flamear el hilo. 5. Incubar tapado a 37°C hasta observar desarrollo de los microorganismos.

Inoculación del tubo conteniendo medio LB líquido:

1. Flamear el ansa. 2. Una vez fría, tomar una colonia aislada de la placa de los microorganismos (provista por los

docentes) en forma estéril. 3. Introducir la punta en el medio cultivo y mover hasta observar el desprendimiento de los

microorganismos. 4. Flamear el ansa. 5. Incubar tapado a 37°C hasta observar desarrollo de los microorganismos.

A B

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CUESTIONARIO 1. ¿Qué es un medio de cultivo? ¿Para qué sirve? ¿Qué componentes debe contener?

2. ¿Qué es el agar y para qué sirve?

3. ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo? Fundamente en cada caso.

4. ¿Qué sustancias suelen utilizarse en los medios de cultivo sintéticos como fuentes de: C, N, P y S? ¿y en el caso de que los medios de cultivo complejos?

5. Además del medio de cultivo, ¿qué más se debe aportar a un microorganismo para lograr su desarrollo en condiciones de laboratorio?

6. Describa diferentes modos de aislar un microorganismo.

7. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la utilización de medios sólidos y líquidos?

8. Cite cuatro características específicas de los microorganismos que permiten su separación de otros.

9. ¿Para qué es necesario obtener colonias aisladas?

10. ¿Para qué se utiliza el caldo tioglicolato?

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PROBLEMAS 1. El cloruro de sodio en concentración mayor de 6 g/l inhibe la mayoría de los gérmenes

permitiendo el crecimiento de Estafilococos. Dado el siguiente medio de cultivo: Extracto de carne 1 g/l Peptona 10 g/l NaCl 75 g/l D-Manitol 10 g/l Agar 10 g/l Rojo de fenol 25 mg/l pH 7,4

A- ¿Cómo clasificaría este medio? B- ¿Si hubiera fermentación de azúcar, se produciría algún cambio en el medio?

2. Dados los siguientes medios cuya composición se detalla a continuación:

Medio 1 Medio 2 Lactosa 5 g/l Triptona 5 g/l Sacarosa 5 g/l Extracto de levadura 25 g/l K2HPO4 2 g/l Glucosa 10 g/l Eosina 0,4 g/l Agar 15 g/l Azul de metileno 0,065 g/l pH 7 Agar 15 g/l pH 7,4 A- Qué medio usaría para realizar un recuento de microorganismos totales de un lote de pastillas? B- ¿Qué razones tiene para haber hecho esa elección?

3. Sabiendo que el citrato de sodio y el desoxicolato de sodio inhiben el crecimiento de bacterias Gram (+) y algunos otros microorganismos y permite el crecimiento de Salmonella y Shigella. Dado el siguiente medio de cultivo:

Peptona 20 g/l Glucosa 1 g/l D-Manitol 2 g/l Citrato de sodio 5 g/l Desoxicolato de sodio 0,5 g/l K2HPO4 4 g/l KH2PO4 1,5 g/l NaCl 5 g/l pH 7,4 ¿Cómo clasificaría a este medio de cultivo? Fundamente su respuesta.

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4. Se toma un inóculo de uno de los cultivos puros y se siembra por punción en un tubo que

contiene medio SIM, cuya composición es: Peptona de caseína 20,0 g/l Peptona de carne 6,6 g/l Citrato de amonio y Fe(III) 0,2 g/l Tiosulfato de sodio 0,2 g/l Agar 3,0 g/l

El medio SIM es: a- Sólido y complejo b- Líquido y sintético c- Semisólido y complejo d- Semisólido y sintético e- Todo lo anterior es cierto f- Nada de lo anterior es cierto

Luego de incubar a 37°C durante 12 horas se observa que el crecimiento se extiende sobre toda la superficie del medio, pero no hay crecimiento en la punción. De los resultados obtenidos usted puede deducir que se trata de un microorganismo:

a- Anaerobio estricto (movilidad +) b- Anaerobio facultativo (movilidad -) c- Aerobio (movilidad +) d- Todo lo anterior es cierto e- Nada de lo anterior es cierto

5. El agar TCBS (agar-tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa) se utiliza para el aislamiento de Vibrio cholerae. Las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato inhiben el crecimiento de enterobacterias, mientras que la bilis y el colato inhiben a enterococos. a- Dada la composición del medio, indique como lo clasificaría de una manera más completa, y

justifique. Peptona de caseína 5 g/l Peptona de carne 5 g/l Extracto de levadura 5 g/l Citrato de sodio 10 g/l Tiosulfato de sodio 10 g/l Bilis desecada 5 g/l Colato de sodio 3 g/l Sacarosa 20 g/l Cloruro de sodio 10 g/l Hierro (III) citrato 1 g/l Azul de bromotimol 0,04 g/l Azul de timol 0,04 g/l Agar-agar 14 g/l

b- De acuerdo a los requerimientos de fuente de carbono y energía, señale qué clase de microorganismos podrían cultivarse en el medio TCBS.

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1- Quimioorganoheterótrofo 2- Quimiolitoheterótrofo 3- Fotoautótrofo 4- Fotoheterótrofo 5- Todo lo anterior es cierto 6- Nada de lo anterior es cierto

6. Señale con una cruz qué tipo de medio de cultivo, de acuerdo a su consistencia utilizaría para los

siguientes ensayos: Líquido Semisólido Sólido

- Movilidad determinada macroscópicamente ........... .............. ........... - Obtener cultivos puros ........... .............. ........... - Movilidad determinada microscópicamente ........... .............. ........... - Recuento de células viables ........... .............. ........... - Realizar una curva de crecimiento ........... .............. ........... por medida de densidad óptica (D.O.) 7. Si una cepa de Escherichia coli posee un genotipo met- trp-, dicha cepa:

a- Es auxótrofa para metionina y triptofano b- Puede cultivarse en un medio de cultivo mínimo al cual se le adicionó metionina y triptofano. c- Puede cultivarse en medio de cultivo complejo. d- Es incapaz de sintetizar metionina y triptofano. e- Todo lo anterior es cierto. f- Nada de lo anterior es cierto.

8. Se desea obtener un cultivo puro de la bacteria Gram positiva Bacillus subtilis a partir de una

mezcla de microorganismos. ¿Cuál de los siguientes medios utilizaría? Medio 1 Medio 2

Peptona 20 g/l extracto de levadura 5 g/l NaCl 5 g/l triptona 10 g/l Lactosa 10 g/l NaCl 5 g/l Sales biliares 1,5 g/l agar 20 g/l Rojo neutro 0,03 g/l Violeta cristal 0,001 g/l Agar 20 g/l Justifique su respuesta. Clasifique ambos medios de cultivo.

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9. Ud. crece una bacteria en caldo peptonado en el cual la relación con el oxígeno es desconocida. Luego de 24 hs a 37 oC, saca el cultivo de la estufa sin agitación y observa que el microorganismo creció a todo lo largo del tubo. Ud. concluye que es: a- un aerobio obligado b- un microaerófilo c- un anaerobio facultativo d- un anaerobio obligado.