MICROBIOLOGÍA ESTRUCTURAL EN LA INTERFASE PATÓGENO - HOSPEDADOR

MICROBIOLOGÍA ESTRUCTURAL EN LA INTERFASE PATÓGENO - HOSPEDADOR

Índice

Introducción

Resumen

Secreción y traslocación

Evolución de la traslocación de proteínas efectoras

Sistema de secreción de tipo III Chaperonas de secreción bacteriana

Aparatos TTSS TTSS sustratos

Toxinas y receptores

Conclusión

Webgrafía

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Introducción

La interacción patógeno-hospedador es una frase utilizada que alberga bajo su sombra un amplio número de interacciones entre los patógenos microbianos y su hospedador. Muchas investigaciones en esta área tienden a discernir entre una de estas dos perspectivas: primero la respuesta inmunológica del hospedador hacia la infección y segundo, los productos microbianos o factores de virulencia que atacan el hospedador en los procesos de enfermedades. Mientras esté claro que nada es demasiado discreto y fácilmente dividido en tales complicadas interacciones entre los organismos, ambos por históricas razones y retos técnicos, esta división ha persistido y ha ofrecido tanto ventajas como desventajas.

Los últimos 10 años han sido testigos de una explosión en nuestro conocimiento sobre los factores de virulencia bacteriana. Pensado por mucho tiempo ser el reino de pocas toxinas especializadas y adhesiones, la reunión de la biología celular y la microbiología ha revelado un amplio escenario de sofisticadas y diversos sistemas de virulencia en bacterias. Ahora no solo es claro que la bacteria puede escoger precisamente actividades específicas en la célula hospedadora como organización de citoesqueleto, progresión del ciclo celular y apoptosis- pero los factores patogénicos responsables de estos efectos han comenzado a ser caracterizados genéticamente, bioquímicamente y, más reciente, a un nivel estructural. Aquí serán examinadas algunas de las contribuciones de la microbiología estructural para nuestro entendimiento de los sistemas de virulencia bacterianos.

MICROBIOLOGÍA ESTRUCTURAL EN LA INTERFASE PATÓGENO-HOSPEDADOR

Resumen

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Los patógenos bacterianos lograron la internalización de un conjunto de factores virulentos dentro de las células eucariotas. Algunas toxinas extracelulares secretadas que logran entrar dentro de la célula, usualmente por la captura de los receptores de membrana y vías endocíticas. Otros poseen sistemas especializados de traslocación y secreción para inyectar directamente proteínas bacterianas dentro del citosol del hospedador. Avances recientes en la estructura biológica de estos factores de virulencia han comenzado a revelar a un nivel molecular como estas proteínas bacterianas han modulado y controlado las actividades del hospedador, que van desde la estructura del citoesqueleto a la progresión del ciclo celular.

Secreción y traslocación

La clave de la colonización y persistencia exitosa en muchas plantas y hospederos animales, tan bien para la formación de muchas relaciones simbióticas productivas, son la dependencia de contacto o los sistemas de secreción tipo III (TTSS) de la bacteria. Estas son proteínas transportadoras y sistemas de distribución que están evolutivamente relacionados al sistema de secreción flagelar y que han sido especializadas para la traslocación de proteínas bacterianas directamente dentro de la célula hospedera. Más de 20 proteínas son conocidas como componente del TTSS, sin embargo solo un pequeño número comprende la organela macromolecular llamada “jeringa molecular” que funciona como un canal donde los factores de virulencia atraviesan. Las estructuras oligoméricas en forma de anillo atraviesan las membranas interna y externa de las bacterias gramnegativas que poseen TTSS, y estas estructuras son ancladas extracelularmente con una “jeringa” filamentosa con un diámetro de aproximadamente 25 Å.

En el lado bacteriano hay un requerimiento conocido para una bien conservada familia F0F1 ATPasa que ha sido hipotetizada de usar la energía de la hidrólisis del ATP para dominar la traslocación a través del complejo jeringa. También ha sido postulado que esta dependencia de energía es utilizada para transportar a través del sistema los factores de virulencia no globulares. Este tema del angosto diámetro del canal del TTSS es observado por los estudios en microscopía electrónica así como el hecho que exista evidencia significativa indirecta de que los sustratos del TTSS son mantenidos parcialmente en forma no globular y parcialmente plegado en un estado de secreción competente que es básico para el movimiento a través del sistema. Esta última observación es el hecho básico para el interesante trabajo estructural discutido a continuación.

Evolución de la traslocación de proteínas efectoras

El rasgo patognomónico de las infecciones por EPEC y EHEC es la inducción de lesiones A/E, caracterizadas por la pérdida local de las microvellosidades y la adhesión estrecha de las bacterias a la membrana de las células del huésped. Mientras permanecen en el espacio extracelular, EPEC y EHEC comprometen la funcionalidad de los microtúbulos del citoesqueleto, los filamentos intermedios y las redes de filamentos de actina de las células del hospedador. Además, alteran la función de barrera intestinal con descenso de la resistencia transepitelial, originan la pérdida del potencial de la membrana mitocondrial, inhiben el pasaje del ciclo celular de G2/M e inducen apoptosis celular. Las consecuencias fisiológicas de la infección incluyen, entre otras, la producción de interleuquina 8 por células inflamatorias -en general, neutrófilos- en el sitio de infección y diarrea.

Sistema de secreción de tipo III

Este sistema de transporte engloba dos subtipos: (i) el sistema de biogénesis flagelar y (ii) el sistema de transporte de proteínas bacterianas, denominada efectores, al interior de células eucariotas. El sistema de transporte de efectores fue identificado por primera vez en cepas patógenas de Yersinia spp. y constituye

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una maquinaria de transporte de proteínas bacterianas, frecuentemente implicadas en patogenicidad, al interior de células eucariotas (Fig 1), hecho que implica su transporte tanto a través de las envueltas bacterianas como a través de la membrana plasmática y, en algunos casos, de la pared, de las células eucariotas. El sistema de tipo III no flagelar está formado por tres proteínas: componentes estructurales del sistema de inyección, sustratos de secreción (efectores), y factores reguladores de la expresión de las proteínas estructurales y efectoras.

Figura 1. Sistemas de secreción de tipo III. (a) Sistema de secreción de tipo III no flagelar (TTSS), como ejemplo el sistema Ysc-Yop de Yersinia spp. YscJ LNPRSTUV muestran homología con componentes flagelares. (b) El flagelo bacteriano. La exportación y el ensamblaje del gancho y el filamento se basan en un sistema de secreción de tipo III asociado al cuerpo basal (FTTS). FliFHIKNPQR y FlhAB muestran homología con componentes de TTSS.

El aparato de inyección está formado por aproximadamente 20 proteínas diferentes que se ensamblan entre ellas formando una estructura en forma de aguja que permite la traslocación de efectores, generalmente tras el contacto con la célula huésped. Por este motivo, la secreción de tipo III (TTS) también se conoce como “vía dependiente de contacto”. La similitud del TTSS con una jeringa hipodérmica y su capacidad de inyectar proteínas directamente en el citoplasma de las células huésped han llevado a acuñar el término “inyectisoma” para referirse a este sistema (Fig 1).

Chaperonas de secreción bacteriana

La mayoría de los sustratos patógenos TTSS se encuentran enlazados a un llamado 'secreción de chaperona´ en la bacteria antes de la entrega en el hospedador. Estas proteínas son pequeñas, dímeros ácidos que forman las moléculas que se unen a dominios N-terminal en uno o más factores de virulencia, pero que muestran pequeñas similitudes de secuencias detectables. La ausencia de una secreción chaperona para un factor de virulencia dado, a menudo resulta en la prematura degradación o sobreacumulación masiva en la bacteria con una dramática disminución paralela de la traslocación en el huésped. Recientemente, se demostró en la Salmonella que una de las funciones de estas moléculas está en la focalización del factor de virulencia de los TTSS patógenos y no al TTSS flagelar. Otros roles propuestos para estas moléculas han incluido una función en el mantenimiento de los sustratos de

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los factores de virulencia de la TTSS en una estado de “secreción competente”, y también una función en la prevención de interacciones inapropiadas, y de esta manera conducir a la agregación, en la bacteria. Estas diferentes propuestas de funciones no se excluyen mutuamente.

La caracterización de las estructuras de estas chaperonas y sus complejos con factores de virulencia ha revelado dos conceptos importantes : (i) que las chaperonas de secreción comparten tanto pliegues muy similares como el modo general de enlazarse de los factores de virulencia, y por lo tanto constituyen una familia diversificada pero altamente relacionada, y (ii) que las chaperonas de secreción enlazan sus factores de virulencia afines al interactuar con un extenso, no globular péptido N-terminal que se envuelve alrededor del dímero de la chaperona (Fig. 2A). Los detalles de esta interacción incluye la unión de las grandes superficies hidrofóbicas en la chaperona por los péptidos extensos de los factores de virulencia tan bien como la interesante observación de los espacios de las tres dimensiones de los péptido-no globulares son generalmente similares (Fig. 2B). Estas estructuras han brindado apoyo para tres modelos de función de la chaperona. El primero es el de la competencia de secreción, ya que el estado no-globular de la molécula de la chaperona es muy consistente con cebar los factores de virulencia para la secreción a través del estrecho canal de la TTS. El segundo es una señal para orientar los factores de virulencia a la TTSS. Que como señal, al menos para ciertos factores de virulencia en Salmonella, es necesaria para prevenir la secreción a través de la TTSS flagelar esta ahora establecida. También se ha propuesto que la conservación del espacio tridimensional del polipéptido en los complejos SicP-SptP y SycE -YopE pueden ser un señal conformacional universal de reconocimiento por el TTSS. El tercer papel funcional de las chaperonas TTSS es que la ayuda que aporta es el de la prevención de interacciones inapropiadas. Aunque hay dos ejemplos más conocidos de factores de virulencia con dominios de unión a chaperonas que se pliegan en dominios estables y solubles en ausencia de la chaperona, YopH y SipA, hay varios ejemplos de dominios enlazados de chaperonas de unión masivamente agregados o se proteolizan sin su acompañante afín. Debido a las grandes interacciones hidrofóbicas proteína-proteína se encuentran en todos los conocidos complejos factores de virulencia-chaperona hasta la fecha, si el propio péptido no se puede doblar en una molécula globular y enterrar sus residuos hidrofóbicos, la ausencia de la chaperona puede conducir a la formación de agregados de proteínas. A pesar que se ha demostrado in vitro que los dominios C-terminal logran plegarse, incluso cuando el dominio de N-terminal está enlazada por la chaperona en un estado no-globular, la alta solubilidad de estos dominios no es suficiente en muchos casos para salvar la proteína en ausencia de la chaperona.

Las chaperonas de secreción se han dividido en dos clases basadas en sus propiedades en la unión de un solo o múltiples factores de virulencia. Estudios estructurales han apoyado esta subdivisión. En la actualidad, las dos chaperonas de secreción examinadas que se sabe que se unen a múltiples sustratos, Spa15 de Shigella y InvB de Salmonella (ver figura), poseen el mismo monómero plegado como las otras chaperonas, pero se ensamblan en un dímero diferente que se caracteriza por una rotación relativa entre las dos proteínas.

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Más sorprendentemente, el complejo de InvB con uno de sus asociados factores de virulencia, SipA, muestra que la interfaz proteína-proteína entre la chaperona y el sustrato es diferente en esta subclase, así. La interacción no globular se conserva, pero no se extendió en todo el dímero chaperona (Fig. 2B). En su lugar, el péptido no globular de SipA se une a una sola proteína InvB en el homodímero chaperona, dejando a las otras superficies hidrofóbicas expuestas. Un análisis de modelos indica que la gran región globular del dominio N-terminal de SipA, lo que hace significativa las interacciones proteína-proteína con el InvB, se opone a la unión de una segunda molécula SipA, debido a un choque estérico.

Figura 2. Chaperonas en la secreción tipo IIIA. Tres diferentes clases de chaperonas están asociadas con el TTSS. El complejo SicP-SptP representa un ejemplo en las

chaperonas de secreción patogénica que enlazan a factores de virulencia translocadas y ayudan en su adecuada secreción. CesA-EspA representa otra categoría, en donde la chaperona CesA evita la polimerización de EspA filamentosos dentro de la bacteria. Similarmente, pero en el contexto de la secreción flagelar tipo III, la chaperona FlisS interviene como un factor antipolimerizante para la flagelina (FliC)

B. El modo de interacción de factores de virulencia translocados de TTSS con sus afines chaperonas de secreción. Los dimeros de chaperonas son mostradas como las superficies moleculares coloreadas de naranja y gris por regiones con

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carácter hidrofóbico y polar, respectivamente. Los círculos coloreados representan regiones desordenadas en los dominios de enlace de las chaperonas.

Por último, las estructuras de un complejo de chaperona de secreción heterodimérica , la de SycN-YscB con la translocada Yersinia factor YopN, así como el complejo del regulador negativo YscM2 con SycH , han sido determinados recientemente. Debido a las divergencias en el pliegue conservado entre SycN y YscB, este complejo heterodimérica muestra una asimetría en su superficie molecular, que crea varios aspectos novedosos de su interacción con YopN. En común con otros complejos chaperona TTSS, es una larga, región no globular de YopN que interactúa con el heterodímero (Fig. 2B). Grandes temas hidrofóbicos también sirven como un componente significativo de la interacción, aunque hay más polares contactos que han sido observados en los demás complejos. A diferencia de InvB-Sipa, sin embargo, y como el resto de chaperonas, YopN interactúa con ambas chaperonas , envolviendo alrededor de la interfaz del dímero (Fig. 2B). El complejo de YscM2 y SycH también confirma que la interacción no globular es un rasgo característico de este interacción.

Otras proteínas que interaccionan con las moléculas que son sustratos para TTSS han sido denominadas chaperonas, y hasta hace poco no estaba claro desde el análisis de la secuencia si pertenecían a las familias descritas. Un ejemplo de ello es CesA de Escherichia coli, que se une a EspA y evita su polimerización antes de la secreción a través de los TTSS. Una vez extracelular, EspA polimeriza en un apéndice de gran tamaño filamentoso asociado con la E. coli complejo aguja. EspA es por lo tanto no una proteína traslocada que funciona dentro de la célula huésped, pero es parte del sistema de secreción de sí mismo (a la vez que un sustrato para ello). La estructura cristalina de un complejo de CesA-EspA revela que es claramente de una familia diferente de chaperona (fig. 2A). Se trata de una estructura helicoidal alargada que forma extensivas interacciones de bobina espiral con EspA, probablemente enterrar las regiones de Espa que se asocian para formar el polímero. Del mismo modo, el TTSS flagelar segrega flagelina (FliC) para formar los flagelos. FliC también impide la polimerización dentro de la bacteria por una chaperona, FliS. La estructura de este complejo revela otra familia de la secreción de TTSS chaperona que, al igual que el CesA, probablemente funciona principalmente a prevenir la polimerización prematura, aunque curiosamente el péptido FliC unido a FliS se encuentra en una conformación no globular que recuerdan a las de los patógenos chaperonas TTSS dominios de unión (Fig. 2A). FliS, sin embargo, poseen muy diferentes plegamientos de estas chaperonas, y ambos FliS y CesA previenen en la polimerización de sus respectivos socios mediante la unión como monómeros.

Aparatos TTSS

Entendiendo el enfoque estructural y funcional de la jeringa molecular (TTSS), se está en la vanguardia de la ME (Microscopía electrónica) y la cristalografía de rayos-X. El tamaño del complejo de aguja, así como su clara heterogeneidad en los preparativos de las bacterias, nos indica que es ámbito de la técnica mencionada. De hecho, el trabajo impresionante con la crio-ME (Criomicroscopía electrónica) nos permite apreciar la secreción de orgánulos de 17 Armstrong, revelando aspectos de la estructura interna nunca antes vislumbrado.

Recientemente, se ha dado un paso hacia adelante en la personalización de alta resolución de este complejo. Dos grupos han determinado la estructura de la proteína EscJ (20 kDa) del TTSS E. coli - uno por resonancia magnética nuclear (RMN) y uno por cristalografía de rayos X. Este es el principal componente del cuerpo basal del complejo aguja. Strynadka y sus colegas fueron capaces de cristalizar EscJ en una forma muy interesante. La única parte de la estructura cristalina (la unidad asimétrica) contenía un tetrámero de esta proteína (Fig. 3A), pero el aspecto fascinante es el empaque cristalográfico de este tetrámero. Con gran fortuna, se encontró que el tetrámero formado en una red cristalina en la que se enrolla con simetría seis veces alrededor del eje de traducción. Mirando hacia abajo este eje super-helicoidal, y "comprimiendo" la bobina helicoidal en un solo plano, se produce una estructura en forma de anillo, con casi el mismo número de moléculas y dimensiones que se observa en la estructura del anillo basal por EM y otras técnicas (fig. 3B). Los autores plantearon la hipótesis de que las amplias interacciones observadas en este empaque de cristal argumentan que esta proyección de sus cristales puede servir de

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modelo para el anillo real, ofreciendo por primera vez una imagen molecular de una parte del aparato de secreción. El canal central de esta estructura se estrecha como un cono de 120 Å a 73 Å desde la membrana interna hasta la cara periplásmica. La superficie interna del anillo está llena de residuos ácidos, creando un interior muy cargado negativamente.

El aspecto general de la estructura es una reminiscencia del anillo FliF del TTSS flagelar como reflejado por crio-ME. Estas características en conjunto llevaron a la hipótesis de que el anillo basal no forma un poro en la membrana interna, sino que se encuentra sobre la cara periplásmica de esta. La distribución de la forma y la carga del anillo sugieren que estos son elementos claves para el montaje de los elementos de transmembrana y componentes cilíndricos centrales del complejo aguja.

Figura 3. Estructuras del aparato TTSS en alta resolución. A. Diagrama de la cinta del tetrámero de EscJ de E. coli, con cada cadena polipeptídica única de color, que ilustra el cruce de los dos dominios en cada molécula para enhebrar el tetrámero. B. Modelo del anillo basal de la E. coli. Este modelo se extrapola del empaque de cristal supra-helicoidal del tetrámero que se muestra en (A), se puede observar los datos bioquímicos sobre la composición y las dimensiones de este elemento del aparato de secreción. Una superficie molecular se muestra de color por el potencial electrostático, en los que el azul es básico y el rojo es ácido.

TTSS sustratos

El factor de virulencia por sustratos del TTSS posee una gran variedad de actividades bioquímicas, que incluyen proteasas, quinasas, fosfatasas de proteínas y lípidos, factores de intercambio de nucleótidos y la activación de las proteínas GTPasa de la familia Rho, polimerización de la actina y los factores de vinculación, y la tubulina-proteínas de unión, por nombrar unos pocos. Estudios estructurales han puesto de manifiesto a nivel molecular, cómo muchos de estos factores de la función, brillando la luz de la evolución horizontal y convergente de la mímica de acogida, así como los métodos totalmente novedosos para manipular el anfitrión. Una de las primeras ideas de la biología estructural surgió con la determinación de la estructura cristalina del dominio catalítico de la proteína tirosina fosfatasa de Yersinia, YopH. Determinado por el mismo tiempo que la estructura cristalina de los eucariotas PTP1B, estas dos estructuras, que resultó ser homóloga, y el subsecuente trabajo estructural y bioquímico, dilucidó los mecanismos de eliminación de fosfatasa para esta familia de enzimas.

Más tarde, el trabajo estructural con la tirosina fosfatasa Salmonela, SptP, mostró que el plegamiento y el sitio activo de estas fosfatasas bacterianas es altamente conservada, pero que ha habido una considerable divergencia en características de la superficie, en relación con los objetivos y funciones muy distintas a las que estas enzimas son formuladas por diferentes patógenos. Además, los complejos con fosfopéptidos y las pequeñas moléculas inhibidoras han brindado un mayor conocimiento sobre la bioquímica de estas enzimas, y también han abierto la puerta para el diseño racional de inhibidores de la virulencia. Estos compuestos tienen el potencial para ser utilizados como agentes terapéuticos (Fig. 4A). Curiosamente, el dominio N-terminal de YopH también posee una función

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de la célula huésped, además de su función enlazante de chaperona dentro de la bacteria. Este dominio es capaz de unirse a fosfotirosina sustratos del dominio catalítico C-terminal. La estructura cristalina del dominio YopH N-terminal, y las estructuras de RMN de este dominio enlazado a un fosfopéptido, ha puesto de manifiesto las bases moleculares de esta interacción y confirmó y extendió una gran cantidad de datos genéticos (Fig. 4B). Por último, dos estructuras recientes han demostrado que el dominio catalítico YopH posee un sitio fosfotirosina segundo enlace en la cara de la estructura casi opuesta a la del sitio catalítico, y que este sitio coopera con el dominio N-terminal de YopH para promover el reconocimiento eficaz de su p130CAS sustrato en las células epiteliales.

Varios factores de virulencia bacteriana elijen como blanco la familia de GTPasas Rho. Estructuras de las proteínas translocantes de Salmonella - SptP y SopE en el complejo con su célula huésped objetivos Rac1 y Cdc42 han sido particularmente informativa para explicar el Yin y el Yang del patógeno efecto que esto del citoesqueleto de la célula huésped. Salmonella utiliza SopE, un factor de intercambio de nucleótidos de guanina, para activar la señalización de Rac1 y Cdc42, lo que contribuye que partes de membrana que interiorice la bacteria. Después de la degradación específica por proteosoma del hospedador, el dominio GAP de SptP funciona como proteína activadora GTPasa para estimular la hidrólisis de GTP, que regula a la baja la señalización de estas moléculas. Las estructuras de cocristal SopE-Cdc42 y Rac1 SptP-han puesto de manifiesto los fascinantes mecanismos para la actividad de estas proteínas. SptP se muestra para recapitular a través de un nuevo andamiaje estructural, la mayor parte de los contactos observados de acogida enzimas GAP, en efecto, simulando su actividad (fig. 4C). En particular, los contactos a los nucleótidos y la inserción de una arginina catalítica de una hélice alfa de los cuatro haz de dominio hélice GAP tienen muchos paralelos en los factores del huésped, al igual que los contactos con el catalizador de residuos GTPasa Glu-61.Las estructuras de dominios homólogos GAP en las proteínas YopE de Yersinia spp. y Exos de Pseudomonas aeruginosa revelan altamente conservados los ensamblajes y la modulación de la Rho-GTPasas. SopE, por el contrario, posee un método único para interrumpir el sitio activo de Cdc42, la inserción de un bucle que ensancha el Switch regulador I y Switch regulador II, regiones de unión de nucleótidos de la GTPasa (Fig. 4D). Estos cambios conformacionales en el sitio activo hace el GDP enlazante desfavorable, pero dejan el bolsillo de unión de nucleótidos abierta para la unión de GTP, mejorando así el intercambio de nucleótidos.

Otro blanco común en las células del huésped son las proteínas del citoesqueleto por sí mismos. La proteína invasión de Salmonella A, o Sipa, es importante para la virulencia completa y rápida entrada de bacterias en las células huésped. El dominio C-terminal de este factor de virulencia tiene una actina enlazante con actividad de unión y polimerización. Una combinación de cristalografía de rayos X y EM ha demostrado que este funciones de dominio C-terminal probablemente como un "alimento básico molecular", en los que un dominio básico globular de Sipa sirve como un centro para dos personas, no globulares "brazos" para llegar en direcciones opuestas y protómeros de actina, estabilizando el filamento (Fig. 4E). Deleciones de los brazos llevó a un menoscabo de la polimerización del G-actina por Sipa y una disminución en la elongación medida de la molécula en una solución, mientras que no tienen ningún impacto sobre la solubilidad de la molécula o su capacidad para unirse a la preformada F-actina.

Una proteína fascinante del patógeno Yersinia es YpkA. YpkA (o YopO) posee un dominio N-terminal con homología de las serina/treonina cinasas del hospedador, y posee actividad quinasa in vitro que depende de la presencia de actina y un dominio putativo de unión a actina en el C- terminal de la proteína. Entre estos dos dominios es un dominio de la familia Rho GTPasa vinculante. Estudios de bioinformática han hecho comparaciones entre esta región y los dominios de los dedos de CAC de proteínas del huésped que se unen a Rho GTPasas. La estructura de un dominio C-terminal de YpkA, que contiene Rho de unión a actina y subdominios de activación, revela un inusual plegamiento. Dos pequeños subdominios están separados por una hélice muy larga, dando la molécula de una forma inusual de pesa.

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http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1462-5822.2005.00564.x/full#f3

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El subdominio plegado C-terminal contiene un péptido de 30 aminoácidos previamente demostró ser fundamental para la actividad de actina-dependiente del dominio quinasa. Este péptido corresponde a varios elementos de estructura secundaria cuya eliminación es probable que desestabilice a todo el dominio C-terminal, todo esto apoyado por experimentos bioquímicos. El subdominio N-terminal parece diferir de la célula huésped dominios del CAC-finger, lo que sugiere que YpkA utiliza un mecanismo diferente para GTPasas pequeñas se unen.

Figura 4. Factores de virulencia de los sistemas de secreción tipo III. A. Superficie molecular de la Yersinia YopH factor de virulencia, de color azul, rojo, cian y amarillo, por, ácidos, polares y no polares carácter de base, respectivamente. El inhibidor de la fosfatasa, PNCS, aparece ligada en el sitio activo como un palo y modelo de pelota. B. El dominio N-terminal de YopH, utilizado en la bacteria en la unión de un acompañante secreción, se utiliza en la célula huésped para obligar a fosfotirosina sustratos de la terminal de dominio fosfatasa-C. La estructura de la terminal de dominio N se muestra como un gris molecular de la superficie transparente de un diagrama de la cinta cian, y el péptido fosfotirosina es de color amarillo y rojo, y los residuos de tirosina están en rojo. C. El factor de cambio SopE (violeta) de Salmonella interrumpe el sitio de unión de nucleótidos de Cdc42 (amarillo) facilitar la unión de GTP. El bucle GAGA Se observa que se inserta en el sitio activo GTPasa D. La enzima GAP de Salmonella (violeta) se muestra la inserción de un residuo de arginina en Rac1 (amarillo) para estimular la hidrólisis de GTP. E. volantes membrana (imagen de fondo) de las células intestinales contienen filamentos de actina (diagrama de cinta roja) 'grapa', junto con la proteína Sipa de Salmonella (verde). La densidad de EM-actina complejos Sipa se muestra en azul. Un primer plano de Sipa con el modelo 'armas' que se extienden a atar protómeros actina juntos. F. La estructura cristalina de la Yersinia YpkA quinasa de color en el espectro del azul (N-terminal) al rojo (C-terminal).

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Toxinas y receptores

Los TTSS de las bacterias gramnegativas han tenido un área reciente de intenso estudio. Sin embargo el entendimiento de toxinas y adhesinas extracelulares, también llamadas invasinas, han sido también beneficiadas recientemente por la biología estructural. Un reciente ejemplo es una toxina llamada “toxina de distensión citoletal”, o CDT, que dentro de la última década fue mostrada de ser una holotoxina tipo AB tripartida, la activa subunidad de donde ingresa al núcleo y daña al ADN. Este daño determina un permanente arresto del ciclo celular, (o apoptosis en linfocitos) y una masiva distensión celular dentro de un periodo de algunos días (Fig 5A). La estructura cristalina de la CDT holotoxina -compuesta de la subunidad activa CDTB unida a CDTA y CDTC- revela que esta tiene una gran parecido a la holotoxina ricina.

Como en la ricina, la subunidad activa CDTB une dos espacios repetitivos de un betatrefoillectina. La subunidad activa tiene muchos objetivos diferentes dentro de la célula hospedadora (el ribosoma por ricina, el DNA del hospedero por CDTB) pero el putativo receptor de unión de las subunidades CDT ocupa una posición similar a los elementos de la ricina. Estos estudios apoyan la idea de que los pliegues de lectina de CDTA y CDTC son los elementos de unión en la superficie celular que logran la internalización de toxinas, la estructura revela que estas dos proteínas presentan una superficie remarcable en un final de la endotoxina. Esta superficie consiste en un profundo y extenso orificio de 20 x 10 Å de largo (y cercano a 8 Å de profundidad), y un largo protector aromático (Fig. 5B). Las estructuras mutantes en este protector hacen la toxina inactiva e incapaz de unirse a la superficie de las células. CDTB es mostrado para ser una estructura homóloga de proteínas en la familia de las DNAasa 1 y algunos residuos con la función de unión en DNAasa 1 ocupa posiciones idénticas en los sitios activos de CDTB, y mutaciones en estos residuos anula la toxicidad.

Extracelularmente las bacterias tienen envueltas muchas moléculas especializadas en unir las proteínas de las superficies de células hospederas. Una interesante clase de estas molécula son las internalinas de las patógenas grampositivas como la Listeria monocitógenes, específicamente INIA y INIB que son suficientes cuando atacan incluso a gotas de látex para inducir su entrada dentro de estas células. El objetivo de INIA es la proteína E caderina, y la reciente estructura cristalina del complejo del dominio de unión de la E caderina del INIA con el dominio de la E caderina que esta reconoce fue determinada. Esta estructura revela que las zonas repetidas ricas en leucina del INIA conecta dentro del dominio de la E caderina (Fig 5C). PRO 16 un residuo que es responsable para una especie de tropismo en una infección por listeria es descubierto de ser ubicado dentro de una corta zona de unión en INIA, explicando por qué la mutación de glutamato (encontrado en el ratón) causa un choque improductivo y evita la unión. Esto es un magnífico ejemplo de una interacción microscópica de un patógeno y hospedador, encontrando explicación a nivel de átomos individuales a través de estudios estructurales.

Estructuras de INIB han revelado que ésta es una proteína modular que se centra en un dominio LRR en su N terminal. Ésta está conectada a un dominio B repetitivo y 3 repetidas GWC terminales, con la GW repeticiones 40 Å más allá del dominio N terminal. La estructura es de esta manera muy elongada con dimensiones de 60 Å por 165 Å en un plano donde esta forma una forma de L. El dominio GW es conocido por poseer una consistente superficie molecular con una función conocida en unir a la membrana de la célula bacteriana.

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Figura 5. Estructuras recientes de toxinas secretadas y factores de internalización.A. Comparación de CDT con ricina, donde los dominios de lectina están coloreadas de azul y turqueza, y la subunidad

activa enzimática está coloreada de amarillo en ambas holotoxinas. Los dominios de lectina son demarcados por una línea roja.

B. La superficie de la holotoxina CDT está coloreada por tipo de aminoácido: la parte no polar, amarillo; la parte polar, turqueza. Excepto por los residuos tanto ácidos como básicos que se encuentran en rojo y azul respectivamente.

C. El complejo de InlA con el dominio blanco de E-caderina del hospedador se observa en forma de cinta.

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Conclusión

Esta es una edad de oro en la que la patogénesis microbiana y los mecanismos que la bacteria usa para la unión al hospedero están siendo identificados y caracterizados. Proveer una esencial fundación para entender estos patógenos es un conocimiento estructural de los sistemas de virulencia bacterianos, y en particular, cómo ellos interactúan y modulan con los factores de células del hospedador, este conocimiento provee una explicación molecular para la actividad y también para una posible inactivación del sistema de virulencia como clave para objetivos terapéuticos. Como la diversidad de sistemas de virulencia aumenta, nuevos temas en la manipulación bacteriana de la biología celular del hospedador están emergiendo, revelando nuevos método para lograr la modulación bioquímica del hospedador y exquisitos mecanismos para imitar la actividad de factores del hospedador para beneficio del patógeno. Después de todo la microbiología estructural está probando ser un importante complemento para más estudios tradicionales y proveyendo una rica cosecha de biología excitante en la interface patógeno-hospedador.

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Webgrafía

Silvia Vilches Saez. Sistema de secreción de tipo III en Aeromonas mesófilas.Pág. 34, 35.

Aniela Wozniak, Islas de patogenicidad en bacterias patógenas.Pág. 17

Garmendia J, Frankel G y Crepin VF. Infecciones por Escherichia coli Enteropatogénica y Enterohemorrágica. Mayo 2005

C. Erec Stebbins - Cellular Microbiology. Structural microbiology at the pathogen–host interface. Volumen 7, edición 9, setiembre 2005.

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http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/cmi.2005.7.issue-9/issuetoc

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/cmi.2005.7.issue-9/issuetoc

MICROBIOLOGÍA ESTRUCTURAL EN LA INTERFASE PATÓGENO - HOSPEDADOR

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