Microscopía de imágenes FTIR en Investigación Clínica. · Medida de la concentración Análisis...
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Microscopía de imágenes FTIR en Investigación Clínica.
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Microscopía de imágenes FTIR en
Investigación Clínica.
Agenda
Introducción
- Fundamentos FTIR y Microscopía IR
- Soluciones Instrumentales de Agilent
Ejemplos de Aplicación en Área Clínica
Io I
H
O
H
H
O
H
H
O
H
H
O
H
Introducción. Espectroscopía IR
La energía IR produce vibraciones moleculares
Cada tipo de enlace químico, vibra a una frecuencia específica
de manera natural
Cuando la frecuencia de la luz IR alcanza la frecuencia de
vibración del enlace, se produce la absorción
La cantidad de energía absorbida es proporcional a la fortaleza
del enlace
En conjunto de absorbancias IR para una muestra, está referida
como su espectro IR
El espectro IR de una muestra es una gráfica de la cantidad de
energía IR (eje y) que es absorbida a determinadas frecuencias
(eje x) en la región IR del espectro electromagnético.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Wavenumber (cm-1)
Ab
so
rba
nc
e
1500 2000 2500 3000 3500 4000
Wavenumbers (cm-1)
1000
Cada muestra tiene un espectro IR único; de manera
que un espectro IR puede servir como una huella
dactilar de un compuesto.
Introducción. Espectro Infrarrojo
4000 3000 2000 1000
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
Wavenumber (cm-1)
Ab
so
rban
ce
3300 cm-1
N-H Stretch 2900 cm-1
C-H Stretch
1750 cm-1
C=O Stretch
1540 cm-1
N-H Bending
Interpretación de espectros IR
La frecuencia que absorben los grupos fucionales corresponden a la fortaleza del enlace, cuanto más fuerte es el enlace, absorbe a frecuencias más altas, y viceversa.
Cada grupo funcional absorbe a una determinada frecuencia, de manera que es posible elucidar la estructura química del material con su espectro IR.
Interpretación de espectros IR
Información cualitativa y cuantitativa
• Búsqueda en librerías
Identificación de muestras
desconocidas
Control de calidad de producto
terminado, materia prima, etc
Identificación Estructural
Un compuesto químico puede ser identificado mediante la
búsqueda en librerías comerciales o generadas por el usuario
La calibración permite predecir la
concentración mediante espectros IR
IR spectral overlay of turbine oil 5-4300ppm
3900 3700 3500 3300 3100
0.24
0.16
0.08
0.00
-0.08
Wavenumber
Ab
so
rban
ce
Concentración por
FTIR • Cuantificación
Medida de la concentración
Análisis de aceites, fuel, etc.
Portafolio Agilent en FTIR.
Exoscan/Flexscan 4500/5500t FTIR FTIR 630
FTIR 660 / 670/ 680 Microscopio 610/620
Microscopía Infrarroja - Introducción
Para qué utilizamos la Microscopía Infrarroja:
• Permite al usuario ver muestras muy pequeñas (tamaño de micras)
• Obtener espectros infrarrojos muy precisos en esas muestras
pequeñas
Modos de Medida
1. Single point – Análisis Puntual
2. Mapping
• Single point
• Linear Array
3. 2-D Focal Plane Array (FPA) Imaging
Modos de Medida
1. Single point – Análisis Puntual
2. Mapping
• Single point
• Linear Array
3. 2-D Focal Plane Array (FPA) Imaging
Single Point - Análisis puntual (I)
Muestra Grande – 250x250 um
Se recoge 1 espectro de la zona de la muestra visualizada
Area total medida en rojo.
El espectro resultante es una media
de la composición de esa zona (hasta 250x250 um)
Apertura
250 um
Se recoge 1 espectro de la zona de la muestra visualizada
Cerramos la ventana de apertura al máximo para evitar interferencia de otras zonas, obtenemos el espectro de la zona roja
La resolución espacial típica es 10-20 micras, afecta el límite de difracción espacial.
50 um
Single Point - Análisis puntual (II)
Area pequeña – 50 x 50 um
Single Point – Análisis Puntual (III)
Ejemplo – Polímero laminado de 3 capas
Modos de Medida
1. Single point – Análisis Puntual
2. Mapping
• Single point
• Linear Array
3. 2-D Focal Plane Array
(FPA) Imaging
Mappping (I)
1: Mapping Single Point Adquisición automatizada de espectros
(uno a uno) definida con un grid a una
resolución espacial definida por una
máscara. Unos cientos de puntos
pueden llevar horas.
2: Mapping Linear array Adquisición de espectros a través de
una fila de detectores (1x16). Más
rápido que single point mapping, pero
mucho más lento que los sistemas de
imagen FPA.
Modos de Medida
1. Single point – Análisis Puntual
2. Mapping
• Single point
• Linear Array
3. 2-D Focal Plane Array (FPA) Imaging
¿Qué es Imagen en FTIR?
En cada posición de la imagen hay un espectro
En cada punto del espectro hay una imagen
La imagen en cada punto del espectro está definida por la química de la muestra
Imagen FTIR. 2-D Focal Plane Array (FPA) (I) Progresión de la técnica..
Mapping Single point
• 1 espectro/scan
• Movimiento de la muestra para crear el mapa
Imagen - 2-D Focal Plane Array (FPA)
• La imagen se recoge como una fotografía “snap shot”
• 1 segundo para recoger 4096 espectros (64x64 pixel FPA)
Mayor resolución espacial
Colección de datos mucho más rápida
Mayor sensibilidad
Mapping Linear Array
• 16 espectros/línea scan
• Movimiento de la muestra para crear el mapa
Imagen FTIR. 2-D Focal Plane Array (FPA) (II)
Análisis de muestras grandes
Mapping Linear Array En 20 min hemos analizado un 5% de
la imagen
Cary 620 Imagen Química En 20 min hemos analizado un 100%
de la imagen a una resolución espacial
de 5.5 um
Agilent 610-IR Microscope Single Element & Dual Single Element
Agilent 620-IR Microscope Infrared Imaging & Single Element
Microscopios Agilent 610-IR / 620-IR
Microscopios Agilent 610-IR / 620-IR
Diseñado específicamente para microscopía
IR, amplia gama de aplicaciones
Incorpora 1 o 2 detectores puntuales.
Actualizable a FT-IR Imagen
Compatible con FT-IR Agilent serie 600
Agilent 620-IR: Lo último en microscopía
FT-IR.
Sistema completo de imagen FT-IR con
detector bidimensional (FPA*) .
Un nuevo mundo de prestaciones y
aplicaciones en microscopía IR.
Agilent 610-IR Microscope Single Element & Dual Single Element
Agilent 620-IR Microscope Infrared Imaging & Single Element
APLICACIONES
Estudio de Procesos Biológicos a Tiempo Real
Comportamiento de la B-Lactoglobulina A frente a T
Conformaciones de la Lipogenasa en distintos medios orgánicos
Estudio de Tejidos Biológicos
Distribución celular y subcelular de un tejido de una planta
Estudios de investigación en la enfermedad de Alzheimer
Estudios de investigación en Cáncer
Estudio de Procesos Biológicos a Tiempo Real (I)
Con FTIR de imagen podremos caracterizar procesos biológicos
dinámicos como:
Plegamiento de proteínas
Transiciones de membrana en células
Monitorizar rápidamente cambios conformacionales
Para simular condiciones reales se emplean accesorios que permiten
controlar T, pH, condiciones atmosféricas durante el análisis de la
muestra
Se pueden estudiar procesos cinéticos en la escala de horas, minutos,
segundos, microsegundos o nanosegundos (Software para cinéticas)
Estudio de Procesos Biológicos a Tiempo Real (II) Comportamiento de la b-Lactoglobulina A vs T
- Muestra de β-lactoglobulina A (5% w/v) en un tampón fosfato deuterado a pH 8.6.
-Espectros a diferentes temperaturas enter 40 y 96 ºC.
-Estudio de los cambios en la estructura secundaria de esta proteína que permite investigar la
relación entre la estructura y su función.
Estudio de Procesos Biológicos a Tiempo Real (II) Comportamiento de la b-Lactoglobulina A vs T
El espectro decolvolucionado adquirido a 40 ºC, muestra siete bandas, cada una de ellas asignada a una
estructura secundaria: 1691 (â-type structure), 1677 (â-sheet), 1664 (turns), 1648 (á-helix), 1634 (â-sheet), 1622 (â-
strand), 1614 cm-1 (side-chain vibrations).
El calentamiento por encima de 76 °C resulta en la desaparación de las bandas a 1677, 1648, 1634, and 1614 cm-1
(denaturation) y la aparición de bandas a 1682 y 1617 cm-1 (atribuidas a formación de enlaces intermoleculares)
Estudio de Procesos Biológicos a Tiempo Real (III) Conformaciones de la Lipoxigenasa en diferentes medios
La lipoxigenasa es una enzima que cataliza la oxidación del ácido
linoleico y otros ácidos grasos insaturados a sus
correspondientes peróxidos (precursores de aromas).
Las modificaciones en la estructura secundaria y/o terciaria de
una enzima puede ser determinantes de la especificidad que
presenten.
Espectro IR de la Lipoxigenasa en
diferentes medios orgánicos
En cloroformo, metanol y acetonitrilo, muestra una
banda de absorbancia a 1617 cm-1 que indica la
agregación b-lámina de proteínas, lo que no se observa
en hexano ni octano.
Dado que la actividad óptima de la enzima se observa
en medio acuso y en medios poco polares como hexano
y octano, la agregación b se asocia a la inactivación de
la enzima.
Estudio de Procesos Biológicos a Tiempo Real (III) Conformaciones de la Lipoxigenasa en diferentes medios
Imagen Visual Imagen Química
Espectro IR de la reacción
Se emplea FTIR de imagen para estudiar la reacción de la lipoxigenasa con y sin un
sustrato (ac. linoleico) y su bioconversión al peróxido correspondiente.
D2O (Lipoxigenasa)
Interfase
Hexano (Ac linoleico)
Estudio de Tejidos Biológicos (I)
Heterogeneidad de un tejido Las imágenes por FTIR de imagen permiten determinar en este tejido de una planta
la distribución celular y sub-celular.
Para conocer esta distribución se obtienen las
imagenes químicas a :
•1650 cm-1 – distribución de proteínas
•1730 cm-1 – distribución de lípidos
•1050 cm-1 – distribución de carbohidratos
Estudio de Tejidos Biológicos (II)
Investigación de la Enfermedad del Alzheimer
Cerebro sano
Cerebro con Alzheimer
Ejemplo del estudio del tejido cerebral del hipocampo de un ratón. El FTIR de imagen permite detectar las placas (contienen proteinas b-amiloides) y ovillos (contienen
una proteína llamada tau) que parecen ser las responsables de los daños producidos en las neuronas
en el tejido enfermo.
Estudio de Tejidos Biológicos (II)
Investigación de la Enfermedad del Alzheimer Ejemplo del estudio del tejido cerebral del hipocampo de un ratón.
- Se recogen aproximadamente 100.000 espectros a alta resolución espacial (5.5 mm) de
una sección de un tejido de 1.4 mm x 2.2 mm.
En la imagen en 3-D se observan
la distribución en el contenido en
lípidos, basándose en la
absorbancia a 1734 cm-1
(correspondiente a grupos C=O)
En los espectros IR se observa
la diferencia en lípidos que
contiene la materia gris y la
materia blanca basado en los
cambios de los grupos CH2 y
CH3.
Esta tecnología permite estudiar
la composición química de
tejidos cerebrales y el desarrollo
de plaquetas asociadas a la
enfermedad de Alzheimer.
Estudio de Tejidos Biológicos (III)
Investigación de la Enfermedad del Cáncer Detección temprana del cáncer de próstata mediante base de datos espectrales de
tejidos en diferentes estados de la enfermedad.
Secciones de tejidos enfermos
observados al microscopio y
graduados según la escala de
Gleason (escala del 1 al 5 – 1
tumor bien diferenciado y poco
agresivo, 5 tumor escasamente
diferenciado)
Imagénes FTIR de muestras de 7 mm x 7mm
Estudio de Tejidos Biológicos (IV)
Investigación de la Enfermedad del Cáncer
Se emplean espectros representativos de tejidos en diferente estado de la enfermedad para
desarrollar un test sencillo y poder predecir su grado de avance.
Resumen
•La técnica de FTIR es una técnica sencilla, versátil, que no
requiere poca o ninguna preparación de muestra y nos permite
obtener información cualitativa y cuantitativa.
•Agilent ofrece a día de hoy un portafolio muy amplio capaz de
solventar prácticamente cualquier aplicación en FTIR.
•La Microscopía en FTIR nos permite analizar muestras de muy
pequeño tamaño. Con esta técnica podemos conocer por ejemplo
la distribución de diferentes componentes en una muestra
•La Microscopía de Imagen en FTIR con detectores FPA como
el Agilent 620, ofrece múltiples posibilidades en el área de
investigación clínica, como por ejemplo el estudio de patologías
como el Alzheimer o el Cáncer.
