INSTITUTO TECNOLGICO DE BOCA DEL RO INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

MATERIA: MICROBIOLOGA GENERAL CATEDRATICO: M.C. BLANCA E. SANCHEZ GARCIA INTEGRANTES: ACOSTA RODRIGUEZ MARINA EDITH HERNANDEZ CEDILLO LUIS ANGEL ZAPATA SANTOS NOEMI GISELA TAREA: INVESTIGACION DE MICROSCOPA

FECHA SOLICITUD: 03/SEP/2010 FECHA ENTREGA: 17/SEP/2010

BOCA DEL RIO VER A 17 DE SEPTIEMBRE DEL 2010

INDICE1

Resumen..04 Objetivos generales y especficos05 Introduccin..05 Antecedentes06 Tipos de microscopios y microscopia Microscopio compuesto...0 Microscopio ptico compuesto de campo luminoso...1 Microscopio invertido1 Microscopio de campo oscuro.....1 Microscopio de luz ultravioleta1 Microscopio de fluorescencia..1 Microscopio de contraste de fases..2 Tinciones utilizadas en los diferentes tipos de microscopios pticos Frotes fijos y teidos..2 Coloraciones microbiolgicas..2 Coloracin simple. .....2 Coloracin diferencial2 Tincin de Gram..2 Tincin de cido resistencia..2 Mtodo de Giemsa.2 Coloraciones para descubrir estructuras celulares

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Tincin de los flagelos..2 Tincin de la cpsula....2 Tincin del ncleo.2 Tincin de las esporas..2 Tincin negativa.3 Microscopios electrnicos Microscopio electrnico.3 Microscopio electrnico de transmisin.3 Microscopio electrnico de barrido..3 Tinciones utilizadas en microscopios electrnicos Tcnica del sombreado..3 Cortes ultrafinos..3 Tincin negativa..3 Tcnica de criofractura...3 Localizacin de constituyentes celulares3 Localizacin de enzimas de cortes finos.3 Autorradiografa...3 Conclusin.3 Bibliografa..3 RESUMEN:

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OBJETIVOS GENERALES Y ESPECFICOS IDENTIFICAR LOS DIFERENTES LOS TIPOS DE MICROSCOPIOS QUE SE UTILIZAN EN EL LABORATORIO, CONOCER SUS CARACTERISTICAS PRINCIPALES Y LAS PARTES QUE LO CONFORMAN EN EL ESTUDIO DE LA MICROBIOLOGIA CONOCER A FONDO LAS TECNICAS DE TINCION TANTO SIMPLES COMO COMPUESTAS E IDENTIFICAR LAS MAS USADAS EN EL LABORATORIO.4

EL ALUMNO DEBE SABER CUALES SON LAS FUNCIONES EN LAS QUE PARTICIPAN LOS MICROSCOPIOS ELECTRONICOS Y DE BARRIDO, PROMOBIENDO SU APRENDIZAJE EN ELLOS.

INTRODUCCION La Microbiologa, es la biologa de los microorganismos o Ciencia que estudia los microorganismos de acuerdo a su

composicin, estructura y funcin de microorganismos componentes celulares: Morfologa y Citologa.

y

sus

Crecimiento, reproduccin y actividades metablicas: Fisiologa y Bioqumica. Relaciones filogenticas y taxonoma: Sistemtica. Mecanismos genticos: Gentica. Distribucin, cambios en el medio ambiente y relaciones con otros seres vivos: Ecologa. Tambin estudia: Patogeneidad e Inmunologa (Quimioterapia, antibioterapia, Microbiologa industrial y biotecnologa).

Un microscopio es un instrumento ptico compuesto de varias lentes que sirve para observar objetos muy pequeos. En el microscopio electrnico, los rayos luminosos del microscopio convencional son reemplazados por un haz de electrones (el aumento puede alcanzar en este caso hasta 100 veces el del microscopio convencional). Aunque la existencia de criaturas demasiado pequeas para ser vistas con el ojo haba sido sospechada desde tiempo atrs, su descubrimiento real est ligado a la invencin del microscopio. Los microscopios pticos emplean lentes de vidrio para desviar y enfocar los rayos de luz, produciendo imgenes aumentadas de objetos pequeos. La resolucin es la capacidad de una lente para separar o distinguir entre objetos pequeos que estn muy prximos y se determina por la apertura numrica de su sistema de lentes y la longitud e honda de la luz empleada, la resolucin mxima es de aproximadamente 0.2 m. Los tipos mas comunes de microscopios pticos son los de campo claro o luminoso, campo oscuro, contraste de fases y de fluorescencia.

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ANTECEDENTES Microscopio, del griego: "mikro" = pequeo y "scope" = mirar (para mirar cosas pequeas) El ser humano posee el sentido de la vista desarrollado. Sin embargo, no se pueden ver a simple vista cosas que midan menos de una dcima de milmetro. Y muchos de los avances en qumica, biologa y medicina no se hubieran logrado si antes no se hubiera inventado el microscopio. El primer microscopio fue inventado, por una casualidad en experimentos con lentes, lo que sucedi de similar manera pocos aos despus con el telescopio de Hans Lippershey (1608). Entre 1590 y 1600, el ptico holands Zacharas Janssen (1580-1638) invent un microscopio con una especie de tubo con lentes en sus extremos, de 8 cm de largo soportado por tres delfines de bronce; pero se obtenan imgenes borrosas a causa de las lentes de mala calidad. Estos primeros microscopios aumentaban la imagen 200 veces. Estos microscopios pticos no permiten agrandar la imagen ms de 2000 veces. En la actualidad los de efecto tnel los amplan 100 millones de veces. Galileo hizo un microscopio en el Siglo XVII. Durante el siglo XVII muchos estudiosos de las lentes y los microscopios hicieron toda clase de pruebas y ensayos para lograr un resultado de mayor precisin. Entre los intentos fue el del italiano Marcello Malpighi (1628-1694) que en 1660 logr ver los vasos capilares de un ala de murcilago. El ingls Robert Hooke (1635-1701) hizo mltiples experiencias que public en el libro "Micrographia"(1665) con dibujos de sus observaciones. Sus aparatos usaban lentes relativamente grandes. El holands Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723), perfeccion el microscopio usando lentes pequeas, potentes, de calidad, y su artefacto era de menor tamao. Alrededor del 1676 logr observar la cantidad de microorganismos que contena el agua estancada. Tambin descubri los espermatozoides del semen humano; y ms adelante, en 1683, las bacterias. Durante las siguientes dcadas los microscopios fueron creciendo en precisin y complejidad y fueron la base de numerosos adelantos cientficos. Pero recin en el Siglo XX lleg el gran cambio, con el microscopio electrnico, que sustituy la luz por electrones; y las lentes por campos magnticos. El primer microscopio electrnico lo construy el fsico canadiense James Hillier en 1937 y poda ampliar las imgenes hasta 7000 veces. Se continu perfeccionando hasta llegar a aumentar unos dos millones de veces.

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En 1981 surgi el microscopio de efecto tnel (MET), que surgi aplicando la mecnica cuntica, y logrando atrapar a los electrones que escapan en ese efecto tnel, para lograr una imagen ultradetallada de la estructura atmica de la materia con una espectacular resolucin, en la que cada tomo se puede distinguir de otro, y que ha sido esencial para el avance -a su vez- de la microelectrnica moderna.

ACONTECIMIENTOS IMPORTANTES CON RELACION CON EL MICROSCOPIO1590-1608 Jennsen desarrolla el primer microscopio til compuesto 1665 Hooke utiliza un microscopio compuesto para estudiar cortes de corcho y describe los pequeos poros en forma de caja a los que l llam "clulas". Publica su libro Micrographia 1674 Leeuwenhoek informa su descubrimiento de protozoarios. Observar bacterias por primera vez 9 aos despus. 1676 Leeuwenhoeck descubre los animlculos. 1828 W. Nicol desarrolla la microscopa con luz polarizada. 1876 Abb analiza los efectos de la difraccin en la formacin de la imagen en el microscopio y muestra cmo perfeccionar el diseo del microscopio. 1879 Flemming describe con gran claridad el comportamiento de los cromosomas durante la mitosis en clulas animales. 1881 Retzius describe gran nmero de tejidos animales con un detalle que no ha sido superado por ningn otro microscopista de luz. En las siguientes dos dcadas l, Cajal y otros histlogos desarrollan nuevos mtodos de tincin y ponen los fundamentos de la anatoma microscpica. 1882 Koch usa tinte de anilina para teir microorganismos e identifica las bacterias que causan la tuberculosis y el clera. En las siguientes dos dcadas, otros bacterilogos, como Klebs y Pasteur identificarn a los agentes causativos de muchas otras enfermedades examinando preparaciones teidas bajo el microscopio. 1898 Golgi ve y describe por primera vez el aparato de Golgi tiendo clulas con nitrato de plata. 1908 Khler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia.

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1930 Lebedeff disea y construye el primer microscopio de interferencia. 1932 Zernike inventa el microscopio de contraste de fases. 1937 Ernst Ruska y Max Knoll, fsicos alemanes, construyen el primer microscopio electrnico. 1952 Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste de interferencia diferencial para el microscopio de luz. 1981 Aparece el microscopio de efecto tnel (MET).

TIPOS DE MICROSCOPIOS Y MICROSCOPIAMICROSCOPIO COMPUESTO El microscopio compuesto, que se ha hecho de uso general a partir de mediados del siglo XIX y que fue de importancia crucial para la evolucin de la microbiologa como ciencia, es todava, con ciertas variaciones, el principal apoyo de la investigacin microbiolgica rutinaria. Este tipo de microscopio est formado bsicamente por una parte mecnica y una parte ptica y es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente. Este ltimo, llamado microscopio simple, se usa principalmente en el formato de lupa. Los elementos mecnicos bsicos son el pie (7), que es el soporte del microscopio, la columna (3), en la que se apoyan las restantes piezas, el tubo, que es el elemento de unin entre el ocular y el8

revlver (pieza giratoria que soporta los objetivos), la platina, sobre la que se apoya la preparacin a observar, y los tornillos Micromtrico y Macromtrico que se utilizan para enfocar la preparacin (el primero es de pequeo recorrido, para movimientos de pequea amplitud, y el segundo de largo recorrido, para movimientos de gran amplitud. En cuanto a la parte ptica, un microscopio compuesto tiene dos lentes o sistemas de lentes: el objetivo (4), situado cerca del objeto que se observa, proyecta una imagen ampliada del objeto observado en direccin al ocular (1), que est colocado cerca del ojo y acta, a modo de lupa, ampliando la imagen que produce el objetivo, y el condensador (5), cuya misin es concentrar la luz sobre la preparacin y permitir manipular su intensidad. La ampliacin total aportada por el conjunto objetivo-ocular es igual al producto de multiplicar la capacidad de aumento del objetivo por la del ocular; as: la mayor parte de los microscopios usados en microbiologa tienen oculares de diez aumentos (abreviadamente, x10) y objetivos de aumentos diversos, habitualmente x10 (aumento total, x100), x40 (total, x400), y x90 x100 (objetivos de inmersin en aceite; x900 x1000 total). El sistema de iluminacin de un microscopio es tambin de considerable importancia, especialmente cuando se utilizan grandes aumentos. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparacin para que la imagen se traslade de forma adecuada al objetivo y llegue con la mayor calidad posible al ojo del observador a travs del ocular. El condensador tiene tambin un diafragma iris, que controla el dimetro del crculo de luz que pasa por el sistema. Lo que se busca con este diafragma iris no es controlar la intensidad de la luz que alcanza el objeto, sino asegurar que la luz que pasa por el sistema condensador ocupe justamente el objetivo. Si el diafragma iris es demasiado grande, parte de la luz pasar no slo al objetivo sino tambin alrededor de l, y no se utilizar. Si la luz es demasiado brillante, no deber reducirse alterando la posicin del condensador o del diafragma iris sino usando filtros de neutralizacin, o disminuyendo el voltaje de la lmpara. Nunca se insistir lo suficiente en que el ajuste apropiado de la luz es crucial para la buena microscopa, especialmente a los mayores aumentos. Los tornillos macro/micromtrico (2) estn engarzados con la platina que soporta las muestras por medio de un mecanismo de cremallera y se utilizan para subir y bajar dicha platina (acercarla o alejarla del objetivo) con el fin de enfocar la imagen que se forma en el ocular. El tornillo macromtrico maneja un engranaje de paso largo, diseado para efectuar movimientos de gran amplitud y largo recorrido, mientras el tornillo micromtrico controla un engranaje de paso corto, especial para movimientos de pequea amplitud y pequeo recorrido y se utiliza para el enfoque fino de la imagen.

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Microscopio ptico compuesto de campo luminosoEs el microscopio ordinario y se llama as porque forma una imagen oscura frente a un fondo claro. Est formado por un cuerpo o soporte de metal compacto, formado por una base y un brazo donde se fija el resto de las partes. En la base hay una fuente de luz. En el brazo, hay dos dispositivos giratorios para enfocar, de ajuste fino y ajuste grueso, que pueden mover la platina y el portaobjetos para enfocar la imagen. La platina est situada hacia la mitad del brazo, donde se colocan los portaobjetos, sujetados con pinzas sencillas o con pinzas sobre la platina mecnica. Una platina mecnica permite al especialista mover un portaobjetos lentamente durante su observacin, utilizando los dispositivos de control de la platina. El condensador se monta dentro o por debajo de la platina, y enfoca un cono de luz sobre el portaobjetos. La parte curvada superior del brazo soporta el conjunto del cuerpo del microscopio, al que se ajustan un portaobjetos y uno o ms oculares. El cuerpo contiene una serie de espejos y prismas de manera que la parte que contiene al ocular pueda inclinarse para conseguir una mejor observacin. El portaobjetivos sostiene de tres a cinco objetivos con lentes de diferentes poder de aumento, que pueden girarse. Idealmente, un microscopio debe ser parafocal, es decir, que mantenga la imagen enfocada aunque se cambie el objetivo.

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Su ampliacin mxima til son 1000-2000. La muestra, aparece teida o no del color del colorante utilizado. Se usa generalmente para ver caractersticas morfolgicas de bacterias, hongos, algas y protozoos.

MICROSCOPIO INVERTIDOComo su nombre lo dice un microscopio invertido est al revs comparado con un microscopio convencional. La fuente de luz y el condensador estn sobre la plataforma apuntando hacia abajo. Los objetivos y la torrecilla estn debajo de la plataforma apuntando hacia arriba. Las nicas cosas que estn en disposicin corriente son el tubo binocular o trinocular, as mismo la muestra es colocada sobre la plataforma o platina mecnica. Aunque un microscopio electrnico tiene gran significado en la magnificacin y resolucin de la muestra, ste requiere que el especmen sea completamente preparado, conduciendo a que cualquier tipo de vida en la muestra no sobreviva. Por otra parte, el microscopio de luz concede una observacin temporal de muestras vivas, sin embargo, stas requieren una hidratacin constante que las somete a estres permanente, imposibilitando de tal manera su supervivencia. A diferencia de estos microscopios, el microscopio invertido permite observar organismos o tejidos en cultivo sin una preparacin previa, favoreciendo el monitoreo del estado de crecimiento,11

comportamiento y dems parmetros involucrados en el desarrollo del cultivo. Con un microscopio invertido se pueden observar cultivos enteros o grandes muestras bajo estados ms naturales y con disminuidas condiciones de estres. La observacin se realiza a travs de las bases de diferentes recipientes con espesores y caractersticas pticas variables, tales como placas de Terasaki, frascos Corning, frascos Roux, cajas de Petri plsticas y de vidrio. El material plstico es pticamente superior que el de vidrio debido que son ms delgados y uniformes. Una desventaja del microscopio invertido es su limitada magnificacin, debido a que los objetivos ms potentes son de 40X y de 60X, aunque ste ltimo eventualmente se encuentra en el mercado y es de muy alto costo. Si embargo estos objetivos tienen la ventaja de sobrepasar el lmite del grosor del recipiente y observar la imagen con fineza.

Algunas ventajas y desventajas del microscopio invertido. Una gran ventaja del microscopio de luz sobre el microscopio electrnico es la habilidad para observar organismos vivos y tejidos. Varios tipos de microscopios electrnicos requieren que el espcimen altamente preparado (lo cual incluye recubrimientos con oro) y vaco para la observacin. En los microscopios de luz se pueden observar temporalmente organismos vivos, lo cual permite determinar algunas funciones vitales, sin embargo las muestras se preparan con soluciones de alcohol o formaldehido, componentes que denaturan las protenas y los cidos nucleicos(5). Mientras un microscopio electrnico tiene una alta magnificacin y resolucin que un microscopio de luz (algunos producen espectaculares imgenes tridimensionales), slo produce imgenes de muestras muertas(4). A diferencia de estos microscopios, en el invertido los cultivos o muestras se pueden colocar en diferentes recipientes con espesores y caractersticas pticas variables, se utilizan entonces, placas de Terasaki, frascos Corning, frascos Roux, cajas de Petri plsticas y de vidrio, lo cual permite observar organismos o tejidos en cultivo sin una preparacin previa, se pueden adems observar grandes cultivos o muestras bajo estados muy naturales, lo cual permite disminuir las condiciones de estrs(4). La primer desventaja es el costo. Los microscopios invertidos no estn en cualquier lugar, como si lo est un microscopio con una configuracin estndar por eso es poco competitivo para los fabricantes (4). Otra desventaja es su limitada magnificacin, pues el objetivo ms potente es de 60X, siendo poco frecuente en el mercado y de muy alto costo. Actualmente se estn comenzando a fabricar objetivos de 100X que se utilizan en aceite de inmersin, sin embargo son bastante costosos y escasos.

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MICROSCOPIO DE CAMPO OSCUROLas clulas vivas no pigmentadas no son claramente visibles con un microscopio de campo claro ya que hay poca diferencia entre las clulas y el agua. Por ello los microorganismos a menudo se fijan y tien antes de su observacin para aumentar el contraste y crear variaciones de color entre las estructuras bsicas. Las clulas y organismos vivos no coloreados pueden observarse simplemente cambiando la forma en que se iluminan. Se enfoca un cono hueco de luz sobre la muestra, de manera que no penetren en el objetivo rayos no reflejados y no refractados. Solamente la luz haya sido reflejada o refractada por la muestra puede formar una imagen. De esta forma, el campo que rodea la muestra aparecer negro, mientras que el objeto quedar iluminado intensamente; como el fondo es oscuro se denomina microscopio de campo oscuro. Muchas estructuras internas pueden verse en microorganismos eucariotas grandes.

MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO.El microscopio de campo oscuro se encuentra catalogado entre los microscopios pticos. Desde muchos aos atrs el microscopio ptico posibilito el descubrimiento de las clulas y la elaboracin de la teora de que todos los seres vivos estn constituidos por clulas (1). El microscopio ptico se compone de dos partes principalmente:

1. Parte Mecnica: Sirve de soporte. 2. Parte ptica: constituida por tres sistemas de lentes. * Condensador. * Objetivo. * Ocular.

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El

condensador

del

microscopio

ptico

convencional

tiene

como

finalidad

proyectar un cono de luz sobre los elementos que estn siendo analizados en el microscopio. Despus de atravesar el elemento, ese haz luminoso en forma de cono penetra en el objetivo, proyectando una imagen aumentada en el plano focal del ocular , que nuevamente la amplia y es recibida por la retina como una imagen situada a 25 cm de la lente ocular (1). El microscopio de campo oscuro est constituido por un microscopio ptico al cual se le acondiciona un condensador especial, este tiene como fin producir una disfracen de los rayos luminosos envindolos lateralmente sobre el objeto en forma de un cono luminosos, y de esta forma tampoco penetran directamente al objetivo (2). Existen dos clases de condensador de campo oscuro: * Cardiode * Paraboloide. Ambos son utilizados con el mismo fin, pero el cardiode tiene mayor aplicabilidad en la investigacin con Treponemas (2). Para que el efecto de campo oscuro se logre , la apertura numrica del condensador debe ser mayor que la de el objetivo, lo cual ocurre con los objetivos de pequeo y gran aumento no as con los de inmersin los cuales debern adicionarse de un diagrama de suspensin para la reducir la apertura numrica (2). RESOLUCIN DE MICROSCOPIA EN CAMPO OSCURO Se llama poder de resolucin de un sistema ptico a la capacidad de separar detalles y es expresado por el lmite de resolucin que es la menor distancia que existe entre dos puntos para que estos aparezcan individualizados.14

Lo que determina la riqueza del detalle de la imagen provista por un sistema ptico es su lmite de resolucin y no su poder de aumentar el tamao de los objetos (1). El lmite de resolucin depende de la apertura numrica (AN) del objetivo y de la longitud de onda de la luz utilizada (1). En la microscopia de campo oscuro la AN no debe ser superior a 1.0 ya que el condensador debe tener siempre una apertura numrica superior a este valor. El lmite de resolucin del objetivo est dado por la siguiente frmula: (1) LR = k x Long. Onda AN * k = Constante (0.61) * Log. onda = 0.55 Se toma la longitud de onda de la franja verde amarilla por ser el ojo humano ms sensible a estos colores que a otros. * AN = Apertura numrica no superior a 1.0 MTODOS PARA OBSERVACIN EN FONDO OSCURO Existen diferentes mtodos para observar un objeto sobre un fondo oscuro es decir, utilizando nicamente la luz difractada por l. OBSERVACIN INCIDENTE O POR REFLEXIN La observacin por reflexin con iluminacin oblicua o anular es la ms frecuentemente utilizada con los microscopios estereoscopios o lupas binoculares. Generalmente no nos damos cuenta de que observamos en fondo oscuro cuando el material ocupa todo el campo visual (3).

OBSERVACIN POR TRANSMISIN (Fondo Negro Central) La observacin por transmisin con una pantalla central necesita la utilizacin de un objetivo con pantalla interna de Spierer; con una pantalla anular, la de Wilska: anoptral, versin original y no la fabricada industrialmente que es un contraste de fase negativa a fuerte absorcin (3). OBSERVACIN POR TRANSMISIN (Fondo negro Anular) La observacin con iluminacin anular de abertura superior a la del objetivo, es la nica que, en la prctica corriente, se denomina campo oscuro. Debe indicarse que difcilmente puede utilizarse objetivos de gran aumento, de apertura numrica superior a 1.0. Dado que el15

condensador debe presentar una abertura superior a esta. Debe entonces practicarse la inmersin, evitando las burbujas de aire (3). OBSERVACIN BIRREFRINGENTE (Polarizacin) La observacin de un objeto birrefringente entre nicoles cruzados da una imagen sobre fondo negro de naturaleza muy particular (3). OBSERVACIN HAZ PERPENDICULAR (Fondo Negro ultramicrosopico) La observacin con un haz perpendicular a la direccin de la observacin segn Ziedentopf y Szimondy da informaciones sobre la orientacin de las partculas observadas (3).

Accesorios de campo oscuro.

NATURALEZA Y ESTRUCTURA DE LA IMAGEN EN FONDO OSCURO Las imgenes en autentico fondo negro son remarcables por un efecto de borde, con numerosas franjas de difraccin muy brillantes si le objeto es refringente. Los planos, en el centro de una estructura parecen pticamente vacos. Es por ello que deben adoptarse grandes precauciones en el momento de interpretar las imgenes. Dado que la imagen solo se forma con las luz difractada, siempre ms dbil que la luz directa deben formarse fuentes lumnicas muy intensas, lo que no siempre es fcil sobre todo cuando los objetos son vivos y, por consiguiente, sensibles a fuertes iluminaciones (3). PREPARACIN DE LA MUESTRA Y PROCEDIMIENTO DE LECTURA. El material a estudio se emulsiona sobre un porta-objetos sobre el cual se coloca una gota de solucin salina, se cubre con una laminilla y se monta sobre la platina, se baja el condensador de campo oscuro y se corre con el carro de la platina la preparacin de forma tal que al subir completamente el condensador la cara superior de su lente quede cubierta por su preparacin solamente en su mitad posterior.(2) Sobre la parte descubierta del lente se coloca aceite de inmersin en cantidad adecuada; este por capilaridad se extiende entre la cara inferior del portaobjetos y la superior del lente del condensador. Se centra la preparacin y se observa con objetivo de pequeo aumento16

colocando el foco luminoso en la mitad del campo mediante los tornillos de centraje del condensador, luego se observa el campo microscpico con el objetivo de gran aumento, esto permite conocer el estado del microscopio al observar los treponemas bucales (2). VENTAJAS Permite ver partculas dispersas en un medio homogneo. * Hace posible la observacin del movimiento Browniano de las partculas. * Se puede utilizar para la observacin de preparaciones sin colorear. * Visualiza los bordes destacados de las muestras. * Tcnica valiosa para observar microorganismos de tipo Treponema pallidum, espiroquetas con dimetros superior a 0.2 um.

DESVENTAJAS Inadecuada preparacin de la muestra. * Difcil acceso al microscopio que posea el condensador especial por su alto costo. * No deja visualizar estructuras celulares especificas, solo bordes de clulas o partculas.

El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen. El campo de visin del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y slo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del espcimen aparecen como un fondo oscuro y los objetos minsculos que se estn analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminacin normal.

MICROSCOPIO DE LUZ ULTRAVIOLETALa imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorcin de esa luz por las molculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una resolucin de 100 nm. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento de un espectrofotmetro pero sus resultados son registrados en fotografas. La muestra no se puede observar directamente a travs del ocular porque la luz ultravioleta puede daar la retina. El mtodo sirve para detectar cidos nucleicos, protenas que contienen determinados aminocidos. Mediante longitudes de ondas especficas para la iluminacin se puede obtener mediciones espectrofotomtricas para cuantificar el DNA y el RNA de cada clula.17

El microscopio de luz ultravioleta utiliza el rango ultravioleta del espectro luminoso en lugar del rango visible, bien para aumentar la resolucin con una longitud de onda menor o para mejorar el detalle absorbiendo selectivamente distintas longitudes de onda de la banda ultravioleta. Dado que el vidrio no transmite las longitudes de onda ms cortas de la luz ultravioleta, los elementos pticos de estos microscopios estn hechos con cuarzo, fluorita o sistemas de espejos aluminizados. Adems, dado que la radiacin ultravioleta es invisible, la imagen se muestra con fosforescencia, en fotografa o con un escner electrnico. El microscopio de luz ultravioleta se utiliza en la investigacin cientfica

MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIAUn objeto puede verse tambin porque emite realmente luz; esta es la base del microscopio de fluorescencia. Cuando algunas molculas absorben energa radiante, quedan excitadas y posteriormente liberan la energa atrapada en forma de luz, se denomina luz fluorescente. Cualquier luz emitida por una molcula excitada tendr una longitud de onda superior a la radiacin original absorbida. La luz fluorescente es emitida muy rpidamente por una molcula excitada, ya que esta tiende a recuperar un estado ms estable liberando la energa atrapada. Normalmente, las muestras se tien con molculas coloreadas, denominadas fluorocromos, que brillan intensamente sobre la exposicin de la luz de una longitud de onda especfica, pero algunos microorganismos ya contienen dichas molculas por lo que son autofluorescentes. El microscopio forma una imagen de los microorganismos marcados a partir de la luz que emiten cuando brillan. Un filtro de barrera colocado despus del objeto de la lente elimina cualquier luz ultravioleta parsita sobrante, que podra daar los ojos del observador, o la azul y la violeta, que podran reducir el contraste de la imagen. La lente, que habitualmente es de vidrio es sustituida por lentes de cuarzo y la iluminacin se produce por unas lmparas de mercurio. No usa filtros y se observa en placas fotogrficas. La variedad de fluorescencia, si usa filtros, y la observacin es directa.

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASESPermite observar clulas sin colorear y resulta especialmente til para clulas vivas. Este aprovecha las pequeas diferencias de los ndices de refraccin en las distintas partes de una clula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor ndice de refraccin experimenta una deflexin y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos pticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porcin fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste til sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del18

espcimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar clulas vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados. Dos modificaciones del microscopio de fase son el microscopio de interferencia y el microscopio de interferencia diferencial. Principio de la microscopia de contraste

Las clulas vivas son transparentes a la luz visible, por lo tanto los rayos de luz pasan a travs sin sufrir prdidas en intensidad. La luz transmitida a travs de las clulas vivientes, sin embargo, encuentra a su paso, regiones de ndices de refraccin diferentes, y diferentes grosores y/o densidades, lo que es capaz de alterar su velocidad y su direccin. En la Figura 1 se da la representacin esquemtica en donde dos regiones adyacentes de una misma clula, A y B, de un diferente grosor, t1 y t2 y con diferentes ndices de refraccin, n1 y n2, son atravesadas por un rayo luminoso. Las variaciones en grosor e ndices de refraccin son capaces de producir una diferencia en el curso ptico de la luz transmitida por las dos regiones. En este caso especfico, le toma ms tiempo pasar a la luz a travs de la fraccin B, cuyo ndice de refraccin es mayor (n 2) y por lo tanto esta retrasada la onda del rayo en velocidad con respecto al que es capaz de atravesar la porcin A, cuyo ndice de refraccin es ms bajo. Si la diferencia de los ndices de refraccin es pequea, la magnitud del cambio de fase inducido igualmente es muy pequea y se mide en trminos de longitudes de onda ( As, ). en la representacin de la Figura 1, el rayo que pasa a travs de la parte B se muestra retrasado 1/4 de longitud de onda ( /4) y emerge fuera de fase. con respecto a la transmisin que nos muestra la parte A.

TINCIONES UTILIZADAS EN LOS DIFERENTES TIPOS DE MICROSCOPIOS PTICOS19

Las tcnicas de montaje hmedo y de gota pendiente: Las preparaciones de gota pendiente y hmeda hacen posible examinar los microorganismos en condiciones de vida normal suspensos en un lquido. Las preparaciones hmedas se hacen vertiendo una gota del lquido que contienen los organismos en una lmina portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos. La preparacin debe bordearse con parafina una sustancia similar y sellar as el espacio entre el portaobjetos y el cobre objetos. En las preparaciones de gota pendiente se coloca una gota de la suspensin bacteriana en el centro de un portaobjetos excavado. Las preparaciones en gota pendiente son preferibles en las situaciones siguientes. 1. La morfologa de las bacterias en espiral se altera mucho cuando se disecan o se tien; deben, por lo tanto, examinarse en estado vivo. Las preparaciones hmedas se examinan al microscopio en campo oscuro que da un contraste muy definido entre el microorganismo y el campo oscuro. 2. Cuando las bacterias se observan para determinar si son o no mvil es obvio que tienen que estar suspensas en un medio lquido en el que puedan moverse libremente en el caso de ser mvil. 3. Para observar los cambios citolgicos que ocurren durante la divisin hay que observar los microorganismos en estado vivo. 4. Por este mtodo se observan fcilmente algunas inclusiones celulares como vacuolas y materias grasas. Cuando se observan preparaciones hmedas en campo luminoso es de suma importancia gradual debidamente la fuente de la luz. La intensidad de la luz se puede disminuir con filtros de densidad neutra. La microscopia de campo oscuro y de contraste ofrece ventajas, para examinar las preparaciones sin teir. FROTES FIJOS Y TEIDOS: Para observar las caractersticas morfolgicas de las bacterias, las preparaciones fijas y teidas son las que usan con mayor frecuencia. Las ventajas son que: a) las clulas son visibles ms claramente despus de teidas. b) En las preparaciones teidas las diferencias entre clulas de especie se demuestran mediante soluciones colorantes apropiados (tincin diferencial o selectiva). Los pasos esenciales en la preparacin de un frote fijo o teido son : a) hacer el frote o pelcula. b) La fijacin. c) La aplicacin de una o ms soluciones colorantes. COLORACIONES MICROBIOLGICAS: Para teir los microorganismos se dispone de un gran nmero de compuestos orgnicos coloreados (colorantes), estos compuestos son un tanto complejos en cuanto a su estructura20

molecular, se pueden clasificar en grupos como colorantes de trifenil-metano, colorantes de oxacina y colorante de tiacina. Una clasificacin ms prctica para el citlogo es de acuerdo con el comportamiento qumico del colorante, es decir, cido, bsico y neutro. Un colorante cido (o aninico) es aqul donde la balanza de la carga sobre el ion colorante es negativo ; un colorante bsico (o catinico) es aquel donde la carga llevada por ion colorante es positiva. Un colorante neutro es una sal compuesta de un colorante cido y un colorante bsico. En le proceso de la tincin supone una reaccin de intercambio de iones entre el colorante y los sitios activos de la superficie o del interior de la clula. Los iones teidos del colorante reemplazan a otros iones en los componentes celulares. COLORACIN SIMPLE: Esto es utilizando slo un colorante. El valor de esta clase de tincin radica en la simplicidad y facilidad de empleo. El frotis, previamente fijado, se cubre con un colorante durante el tiempo adecuado, se lava el exceso de colorante con agua y se seca el portaobjetos. Los colorantes bsicos como cristal violeta, azul de metileno y carbolfucsina se emplean con frecuencia para determinar el tamao, la forma, y la organizacin de las bacterias. COLORACIN DIFERENCIAL: Clasifica a las bacterias en grupos diferentes segn sus propiedades de tincin. Las tinciones diferenciales son aquellas tinciones que se usan para diferenciar de manera mas explicita los microorganismos. Estas tinciones utilizan los colorantes diferenciales, que se componen de ms de una sustancia tintrea. En algunas tcnicas de coloracin, las tinciones diferenciales ms importantes que se emplean en bacteriologa son las de Gram y la tincin cido-resistente. Ambas tinciones se utilizan para obtener informacin acerca de la composicin de las capas de la pared celular de las clulas bacterianas. TINCIN DE GRAM: Mtodo de identificacin de bacterias mediante una tincin especfica. Desarrollado por el mdico dans Hans Christian Joachim Gram, es un procedimiento utilizado universalmente. En un primer momento las bacterias se tien con violeta de genciana (derivado metilado anilnico) y despus se tratan con la solucin de Gram (1 parte de yodo, 2 partes de yoduro potsico y 300 partes de agua); por ltimo se lavan con alcohol etlico, y unas bacterias retienen el fuerte color azul de la violeta de genciana y otras se decoloran por completo. A veces se aade una contratincin con fucsina o eosina para teir las bacterias decoloradas de color rojo y hacerlas ms visibles. Se denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tincin azul y bacterias Gram negativas a las que quedan decoloradas. Algunas bacterias presentan capacidad variable de tincin de Gram y se llaman Gram variables.21

Bacterias Gram positivas tpicas son los estafilococos que producen fornculos; Gram negativas representativas son la Escherichia coli de la flora intestinal o los bacilos de la tos ferina; Gram variables son los bacilos de Koch de la tuberculosis. Hay muchas modificaciones de ella.la siguiente es la versin de Jensen: 1.- Se disuelve 0.5 de violeta de metilo en 100ml de agua destilada. 2.-se disuelven 2g de yoduro potsico y 1g de yodo (triturados conjuntamente en mortero hasta polvo fino) en no ms de 20ml de agua destilada. una vez disuelta en 100ml.fuchina bsica 0.1% (preparada como se ha indicado anteriormente) o solucin acuosa de safranina al 1%. Se tie con la solucin de violeta de metilo durante 20 segundos. Se lava y se sustituye por la solucin yodurada. Se deja 1 minuto. Se lava la solucin yodurada arrastrndola con alcohol de 95 % o acetona, dejando que acten solamente unos segundos. Lavar en agua. Teir de contraste con fuchina o safranina. Se requiere una prctica con el mtodo para obtener el grado correcto de decoloracin. La acetona decolora ms rpidamente que el alcohol. Soluciones aplicadas por su orden Cristal violeta Solucin yodo yodurada Gram positivas Gram negativas

Las bacterias se tien en Las bacterias se tien en violeta violeta Complejo CV-1 se forma dentro de las bacterias, las bacterias permanecen violeta. Las paredes celulares de deshidratan, hay retraccin de los poros, la permeabilidad disminuye, el CV-i no puede salir y queda violeta. Complejo CV-i se forma dentro de las bacterias, las bacterias permanecen violeta. Extraccin de lpidos de las paredes celulares, aumento de porosidad, CV-I sale de la bacteria.

Alcohol

Safranina

Las bacterias no Las bacterias toman este afectadas permanecen colorante y se tien de violeta. rojo.

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BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS

TINCIN ACIDORRESISTENCIA: El mtodo de ziehl-neelzen emplea fuchina, alcohol cido y una tincin de contraste en azul o verde. Los tcnicos daltnicos deben utilizar como colorante de contraste el cido pcrico.(1)

fuchina bsica

5g 25g 50 ml 500 ml

cido fenico cristalizado Alcohol de 95% Agua destilada

Se disuelven la fuchina y el cido fnico en el alcohol al bao mara templado, aadiendo despus del agua. Filtrar antes de su empleo. Una vez que la fucsina bsica penetra la clula con la ayuda del fenol y el calor, las clulas cido-alcohol resistentes no se decoloran fcilmente con una solucin cido alcohlica, permaneciendo de color rojo por el gran contenidos de lpidos en las paredes de estas clulas. Las bacterias no cido-alcohol se decoloran con la solucin acidoalcohlica, por lo que se tien de color azul con azul de metileno MTODO GIEMSA: La tincin de Giemsa es un mtodo habitual para el examen de frotis sanguneos, cortes histolgicos y otro tipo de muestras biolgicas. Este mtodo tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las ricketsias

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localizadas dentro de la clula huspedes. La coloracin de giemsa se emplea tambin para teir frotis de sangre en el examen para protozoos. Se puede emplear, como variaciones, otras coloraciones como es la tcnica de citoconcentracin para parsitos sanguneos, la cual tiene un bajo coste y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el mismo sedimento el parsito principal, con excepcin de los trofozoitos jvenes y el plasmodium falciparum. Tambin se emplea la modificacin de Wright. Este mtodo de tincin permite tambin la tincin diferencial de zonas con un alto contenido de ADN, y concretamente de uniones A-T. Esto permite distinguir perfectamente en microscopio ptico el ncleo celular, los cromosomas durante la mitosis, y en algunos casos, incluso el ADN mitocondrial (kinetoplasto de algunos protozoos, como Trypanosoma). Los cromosomas pueden ser tratados con varios compuestos qumicos que producen la alternancia de bandas claras y oscuras a lo largo de los cromosomas. Cada cromosoma tiene un patrn de bandas caracterstico, permitiendo que aberraciones estructurales como borrados, duplicaciones o sutiles translocaciones sean detectadas, al igual que permite la identificacin de cromosomas marcadores. Estos organismos adquieren una coloracin diferencial y se ven dentro del citoplasma de la clula husped. La tcnica de Giemsa est formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte bsico y la eosina como tinte cido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromtico, de ah que muchas estructuras se tian de prpura y no de azul. El pH de la solucin de coloracin es crtico y se debe ajustar idealmente segn diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9. Preparacin de la muestra Para muestras histolgicas, los mejores resultados se obtienen en muestras fijadas con formol, incluidas en parafina y cortadas entre 3 y 6 micras. Metodologa Fijamos las clulas en metanol 95%, 2 minutos o no fijamos. Si hemos fijado, hidratamos en agua destilada, 5 minutos May-Grumwald, 1 minuto Lavamos en agua destilada y secamos Giemsa, 20 minutos Lavamos en agua destilada y dejamos secar 7. Montamos en DPX1. 2. 3. 4. 5. 6.

Resultados 1. Citoplasma: rosa 2. Ncleos: azul24

3. 4. 5. 6. 7.

Eritrocitos: rojo Grnulos de las clulas cebadas: prpura Bacterias: azul Parsitos: azul

COLORACIONES PARA DESCUBRIR ESTRUCTURAS CELULARESPara observar estructuras dentro o en el exterior de la pared celular bacteriana se dispone de mtodos especiales de tincin. El principio en que se basa estos mtodos de coloracin diferencial es en gran medida el mismo que el de las tinciones de gram y de Ziehl-Neelsen; se trata de manifestar un grado de afinidad para el colorante diferente al resto de la clula. TINCIN DE LOS FLAGELOS: Ofrece una informacin taxonmica importante acerca de su presencia y el modelo de su distribucin. Permite teir flagelos usando un mordiente para incrementar su grosor y hacerlos visibles al microscopio ptico. Para esta tincin a las clulas previamente fijadas, se le aade una mezcla de cido tnico (mordiente) y del colorante rosanilina. El mordiente engruesa los flagelos y el colorante los fine. Da buenos resultados el mtodo de Walc-Pokrzywnicki. Fijador: Etanol Formo comercial cido tnico al 20% 6 partes 1 parte 3 partes Cloroformo Mordiente: Cloruro frrico al 5% 1 parte 3 partes

TINCIN DE LA CPSULA: Se pone una pequea gota de tinta china sobre un portaobjetos. Se mezcla con ella un asa pequea de cultivo o suspensin bacteriana. Se pone un cubreobjetos, evitando se formen burbujas de aire y se oprime con fuerza entre papel chupn. Se examina a pequeos aumentos.

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Para soluciones en seco, se mezcla un asa de tinta china con un asa de suspensin de germen en solucin de glucosa al 5% en un extremo del portaobjetos. Se extiende la mezcla con el extremo de otro portaobjetos, se deja secar y se vierten sobre la extensin algunas gotas de alcohol metlico para fijarlas. Se tie durante algunos segundos con violeta de metilo.los grmenes aparecen tenidos de color azul con cpsulas como halos. El mtodo de Churchman utiliza el colorante Writht( se usa para la tincin de sangre). Se deja que el colorante casi se seque sobre el portaobjetos y se lava intensamente con agua. Las cpsulas se tinen en rosa, las bacterias en azul.

TINCION DEL NUCLEO: Los ncleos se pueden teir por la tincin de Feulgen la cual es especfica para el ADN. La tincin de Feulgen permite observar la distribucin del ADN en los cromosomas de los ncleos de clulas en proceso de divisin. Tincin de feungen: El material es sometido a una hidrlisis con cido clorhdrico a 60 C, y luego al reactivo de Schiff.

TINCION DE LAS ESORAS :Su objetivo es observar las endosporas y su disposicin en las formas vegetativas. Comparar las distintas morfologas y disposiciones que adoptan las endosporas en las especies empleadas. Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas. Esta tincin es delicada en su realizacin y para poder obtener unos resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones. Coloracin de esporas Algunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas esporas como mecanismo de defensa a agresiones ambientales. Son estructuras de pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las condiciones desfavorables de calor, desecacin, acidez, etc. Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables las esporas \"germinan\" y vuelven a generarse formas vegetativas. Por ese motivo, las endosporas son impermeables a los colorantes, por lo que cuando se hace una tincin, se observan al microscopio como cuerpos altamente refringentes y sin teir. Sin embargo, las endosporas se pueden teir aplicando calor a la preparacin previamente cubierta con una solucin de colorante que en26

la tcnica de Shaeffer y Fulton es el verde de malaquita. El lavado con agua elimina este colorante de las clulas vegetativas y la aplicacin de un colorante de contraste permitir distinguir claramente a las esporas de color verde. http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/SeminarioTinciones.htm Se hace una extensin gruesa, se tie durante 3 minutos con fucsina fenicada caliente. Se lava, se cubre con solucin acuosa de cloruro frrico al 30 % durante 2 minutos se decolora una solucin de sulfito sdico al 5%. Se lava y se tie de contraste con verde de malaquita al 1%. La tcnica de Flemming sustituye por nigrosina el colorante de contraste. Se difunde la nigrosina sobre la extensin con el borde de otro portaobjetos. Los esporos se tien de rojo.las bacterias son verdes o con el mtodo d Flemming, trasparentes sobre un fondo gris.

TINCIN NEGATIVA: Tcnica revela la presencia de cpsulas difusas alrededor de muchas bacterias. Se mezclan las bacterias con tinta china o colorante de nigrosina y se extiende en una capa fina sobre un portaobjetos.Despus de secarlos al aire, las bacterias aparecen como cuerpos ms claros en medio de un fondo azul oscuro, por que la tinta y las partculas del colorante no pueden penetrar ni la clula bacteriana ni su cpsula. Es una tcnica por el cual las clulas sin teir se hacen visibles en una pelcula oscura es la llamada tincin negativa. En la prctica, la suspensin bacteriana se mezcla con una tinta china o con nigrisina y despus se extiende como una pelcula delgada a lo largo de una lmina portaobjetos y se deja secar.

MICROSCOPIOS ELECTRNICOSEL MICROSCOPIO ELECTRNICOEs el ms sofisticado de los microscopios conocidos en la ciencia. El microscopio electrnico utiliza lentes electrostticos y electromagnticos y a travs de los electrones ilumina un objeto, magnificando una imagen hasta 2 millones de veces mientras que la luz del microscopio lo hace solo 2 mil veces. El microscopio electrnico utiliza una onda larga de un electrn llamado Broglie wavelength. Al controlar el rayo de la radiacin electromagntica el microscopio electrn hace posible focalizarse, produciendo una imagen de gran escala.

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Un microscopio electrnico es aqul que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imgenes de objetos diminutos. Los microscopios electrnicos permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales (hasta 500.000 aumentos comparados con los 1000 de los mejores microscopios pticos) debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones. El primer microscopio electrnico fue diseado por Ernst Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1930, quines se basaron en los estudios de Louis-Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones. Un microscopio electrnico funciona con un haz de electrones generados por un can electrnico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnticas (todo ello al alto vaco ya que los electrones son absorbidos por el aire). Los electrones atraviesan la muestra (debidamente deshidratada) y la amplificacin se produce por un conjunto de lentes magnticas que forman una imagen sobre una placa fotogrfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la pantalla de un ordenador. Los microscpios electrnicos slo se pueden ver en blanco y negro, puesto que no utilizan la luz, pero se le pueden dar colores en el ordenador. Como se puede apreciar, su funcionamiento es semejante a un monitor monocromtico.

MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISINEl primer microscopio electrnico de transmisin fue desarrollado entre 1931 y 1933 por Ernst Ruska y sus colaboradores. La ptica bsica de ese primer microscopio electrnico se mantiene hasta nuestros das; los cambios en los microscopios modernos consisten en adicionar ms lentes para incrementar el mbito de aumentos y darle mayor versatilidad. El primer microscopio electrnico de transmisin comercial lo construy Siemens en 1939. Los haces de electrones actan como una fuente de variacin que pueden enfocarse el igual que la luz en un microscopio ptico. Si los electrones iluminan el espcimen, la resolucin del microscopio aumenta considerablemente porque la longitud de onda de la radiacin es de aproximadamente 0.005nm, aproximadamente 100000 veces menor que la luz visible. El microscopio electrnico de transmisin tiene una resolucin practica de aproximadamente 1000 veces superior a la del microscopio ptico. Un microscopio electrnico de transmisin moderno es complejo y sofisticado, pero los principios bsicos de sus funcionamientos pueden comprenderse fcilmente. Un filamento28

de tungsteno calentado en un generador de electrones libera un haz de electrones que se enfoca a continuacin sobre la muestra mediante el condensador. Como los electrones no pueden atravesar una lente de vidrio, se emplean electroimanes denominados lentes magnticos, para enfocar el haz. La columna que contiene las lentes y la muestra deben estar en condiciones de vacio pero tambin una imagen clara `porque los electrones se desvan al chocar con las molculas de aire. La muestra dispersa los electrones que pasan atreves, y este haz se enfoca con lentes magnticas para formar una imagen aumentada y visible sobre una pantalla fluorescente. Aquella zona de la muestra que sea ms densa, dispersara mas electrones, por ello aparecer ms oscura la imagen, pues inciden menos electrones en esa rea de la pantalla. Las partes principales de un microscopio electrnico son: Can de electrones, que emite los electrones que chocan contra el espcimen, creando una imagen aumentada. Lentes magnticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios pticos no funcionan con los electrones. Sistema de vaco es una parte muy importante del microscopio electrnico. Debido a que los electrones pueden ser desviados por las molculas del aire, se debe hacer un vaco casi total en el interior de un microscopio de estas caractersticas. Placa fotogrfica o pantalla fluorescente que se coloca detrs del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada. Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser una computadora.

El microscopio electrnico de transmisin emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrnico de transmisin debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ngstroms. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces. El primer microscopio electrnico de transmisin fue desarrollado entre 1931 y 1933 por Ernst Ruska y sus colaboradores. La ptica bsica de ese primer microscopio electrnico se mantiene hasta nuestros das; los cambios en los microscopios modernos29

consisten en adicionar ms lentes para incrementar el mbito de aumentos y darle mayor versatilidad. El primer microscopio electrnico de transmisin comercial lo construy Siemens en 1939. El (MET) tiene una resolucin practica de aproximadamente 1000 veces superior a la del microscopio ptico. Caractersticas del microscopio electrnico de transmisin:

Aumento prctico ms elevado; ms de 100000. Resolucin mxima; 0.5 manmetros. Fuente de radiacin; haz de electrones. Medio de desplazamiento; alto vaco. Tipo de lente; electroimn. Fuente de contraste; dispersin de electrones. Mecanismo de enfoque; se ajusta la corriente la lente magntica. Mtodo de modificacin de los aumentos; se ajusta la corriente la lente magntica. Montaje de la muestra; rejilla de metal (normalmente de cobre).

MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDOEl Microscopio Electrnico de Barrido permite obtener imgenes de gran resolucin en materiales ptreos, metlicos y orgnicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie. El microscopio electrnico de barrido produce una imagen a partir de electrones emitidos por la superficie de un objeto, en lugar de a partir de electrones transmitidos. Antes de la observacin, se montan las muestras secas y se cubren con una capa fina de metal para evitar la formacin de carga elctrica superficial, formndose una imagen de mejor calidad. Se ha empleado el MEB para estudiar superficies de microorganismos con mayor detalle; tiene una resolucin de 7 manmetros o inferior. El MEB se diferencia de otros microscopios porque produce una imagen a partir de los electrones emitidos por la superficie de un objeto. Se puede examinar directamente material secado al aire.

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Los microorganismos deben primero fijarse deshidratarse y secarse para conservar la estructura de superficie y evitar el colapso de las clulas cuando se exponen al alto vaco en el MEB. El MEB realiza un escner con un estrecho haz de electrones en forma de prisma, de adelante hacia atrs sobre la muestra. El microscopio electrnico de barrido realiza un escner con un estrecho haz de electrones en forma de prisma, de delante hacia atrs sobre la muestra. Cuando el haz incide sobre una forma concreta de la muestra, los tomos de la superficie emiten una nube tenue de electrones denominados electrones secundarios, que son atrapados por un detector especial. Los electrones secundarios que entran en el detector inciden sobre un centellador, causando la emisin por este de centelleos de luz que un fotomultiplicador transforma en una corriente elctrica y la ejemplifica. La seal se enva a un tubo de rayos catdicos y se produce una imagen como en la pantalla de TV que puede verse y fotografiarse. Se produce una imagen tridimensional realista de la superficie de un microorganismo con una gran profundidad de campo.

TINCIONES USADAS EN MICROSCOPIOS ELECTRNICOS TCNICA DEL SOMBREADO: esta tcnica consiste en colocar una capa de metal sumamente delgada, en un ngulo oblicuo sobre el organismo, as que este adquiera una sombra en el lado no cubierto. La tcnica del sombreado produce una representacin topogrfica d3e la superficie del espcimen). El microorganismo se cubre con una pelcula fina de platino u otro metal pesado por evaporacin en un ngulo de 45 respecto de la horizontal, de manera que el metal incide sobre el microorganismo slo desde un lado. El rea cubierta con metal dispersa electrones y aparece brillante en las fotografas, mientras que el lado sin cubrir y la regin sombreada creada por el objeto aparece oscura. La muestra aparece como si la luz brillase sobre sta, proyectando una sombra. Esta tcnica es particularmente eficaz para estudiar la morfologa de un virus, flagelos bacterianos y plsmidos.

CORTES ULTRAFINOS: Al hacer observaciones a nivel macromolecular, el material para examen debe ser delgado en grado sumo. Se disponen de tcnicas para cortar (rebanar) una clula bacteriana; una clula aislada incluida en material plstico puede cortarse en rebanadas ultrafinas mediante un micrtomo. El

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uso de colorantes especiales para microscopia electrnica, acenta el contraste de las estructuras..

TINCIN NEGATIVA: Tcnica revela la presencia de cpsulas difusas alrededor de muchas bacterias. Se mezclan las bacterias con tinta china o colorante de nigrosina y se extiende en una capa fina sobre un portaobjetos. Despus de secarlos al aire, las bacterias aparecen como cuerpos ms claros en medio de un fondo azul oscuro, porque la tinta y las partculas del colorante no pueden penetrar ni la clula bacteriana ni su cpsula. El uso de material denso en electrones, actan como un colorante que delimita el objeto de la misma manera que el del microscopio de luz. El fosfotungstato, no penetra en las estructuras sino que forma depsitos espesos en las hendiduras. Es una forma excelente de estudiar la estructura de un virus, vesculas de gas bacterianas y otros materiales similares.

TCNICA DE CRIOFRACTURA: esta tcnica se ha ideado para preparar cortes del espcimen sin recurrir al tratamiento qumico del proceso de fijacin, que se tema pudieran producir los artefactos. La muestra se corta mientras est contenida en un bloque de hielo, se preparan rplicas en carbn de estas superficies expuestas, las cuales revelan estructuras de la muestra. Permite visualizar mediante el MET la presencia y forma de orgnulos en el interior de microorganismos. Para ello, las clulas se congelan rpidamente en nitrgeno lquido y luego se calientan hasta -100C en una cmara de vaco. A continuacin, se fracturan las clulas congeladas con una cuchilla previamente enfriada con nitrgeno lquido (-196C); estas clulas son muy quebradizas y se rompen a lo largo de las lneas muy dbiles, normalmente, por la mitad de las membranas internas. Se deja la muestra en condiciones de alto vaco durante un minuto o ms, de forma que parte del hielo se sublime y se descubra ms el detalle estructural. Finalmente, las superficies expuestas se sombrean y cubren con capas de platino y carbono para formar una rplica de la superficie. Despus de eliminar qumicamente la muestra original, la rplica puede observarse con el MET, que ofrece una vista tridimensional detallada de la estructura32

intracelular. Una ventaja de esta tcnica es la minimizacin del riesgo de formacin artefactos, ya que en lugar de someterlas a fijacin qumica y deshidratacin, las clulas se congelan rpidamente. LOCALIZACIN DE CONSTITUYENTES CELULARES: Se han ideado tcnicas especiales que hacen posible localizar constituyentes qumico de las clulas. Los cortes finos de una clula se tratan con anticuerpos marcado con ferritina. La combinacin de este anticuerpo con el antgeno en la clula producir una entidad en la imagen con el microscopio electrnico.

LOCALIZACIN DE ENZIMAS DE CORTES FINOS: Para localizar enzima en los cortes finos se aplican mtodos de coloracin especficos. Estas tcnicas sirven para depositar en el tejido pequeas partculas densas como el producto final de una reaccin qumica controlada. la estructura clular fina y la actividad enzimtica tienen que sobre vivir a la preparacin y coloracin de los especmenes y, asimismo, en los sitios activos debe depositarse suficiente producto final para que se haga visible. Los tejidos fijados en formol retiene una alta proporcin de su actividad enzimtica de 24 horas. Algunas sales metlicas se precipitan como resultado de la actividad y son excelentes para la microscopia. La mayora de estas tcnicas se basan en la formacin de sales de plomo insoluble. AUTORRADIOGRAFIA: es un mtodo citoqumico en el que se estudia la localizacin de los constituyentes qumicos de los tejidos registrando la posicin del material radiactivo incorporado en la muestra. Un espcimen fino que contiene material radiactivo se cubre con una capa delgada de emulsin fotogrfica y se guarda en la oscuridad durante semanas o meses. La radiacin ionizaste emitida durante la descomposicin de la sustancia radiactiva produce imgenes latentes en la emulsin y despus del revelado la imagen tiene aspecto de granos de plata en el microscopio electrnico. www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r6300.DOC

CONCLUSIONES.

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