Modulación de propiedades antibióticas por luz · 2015-09-17 · Que la presente memoria titulada...
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Elena Contreras García Diego Sampedro Ruiz Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática Máster universitario en Química Avanzada 2014-2015 Título Director/es Facultad Titulación Departamento TRABAJO FIN DE ESTUDIOS Curso Académico Modulación de propiedades antibióticas por luz Autor/es
Transcript of Modulación de propiedades antibióticas por luz · 2015-09-17 · Que la presente memoria titulada...
Elena Contreras García
Diego Sampedro Ruiz
Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática
Máster universitario en Química Avanzada
2014-2015
Título
Director/es
Facultad
Titulación
Departamento
TRABAJO FIN DE ESTUDIOS
Curso Académico
Modulación de propiedades antibióticas por luz
Autor/es
© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2015
publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]
Modulación de propiedades antibióticas por luz, trabajo fin de estudiosde Elena Contreras García, dirigido por Diego Sampedro Ruiz (publicado por la
Universidad de La Rioja), se difunde bajo una LicenciaCreative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.
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Modulación de propiedades
antibióticas por luz
Elena Contreras García
Máster en Química Avanzada
Convocatoria: Junio 2015
Tutor: Diego Sampedro Ruiz
Diego Sampedro Ruiz, Profesor Titular de Química Orgánica de la Universidad de La Rioja
Certifica: Que la presente memoria titulada “Modulación de propiedades
antibióticas por luz” ha sido realizada por la graduada ELENA CONTRERAS GARCÍA en el departamento de Química de la Universidad de La Rioja bajo su inmediata dirección y reúne las condiciones exigidas para conseguir los 30 créditos ECTS correspondientes al periodo de investigación del Trabajo fin de Máster.
Logroño, Junio 2015
Fdo.: Diego Sampedro Ruiz
Ya son dos años los que llevo en el grupo de fotoquímica orgánica y una
vez más me gustaría dar las gracias a todos sus integrantes.
En primer lugar al director de este trabajo Diego Sampedro por hacer que
siga aprendiendo un año más y por ser un jefe con muy buen humor que hace
que el trabajo sea más llevadero.
También al resto de profesores que forman parte del grupo Pedro y
Miguel Ángel y a todas las personas que han trabajado conmigo en el
laboratorio. A Raúl por haber tenido la paciencia de hacerme todos los RMN del
400 MHz y a David y Cris por ayudarme a aprender cosas nuevas. Además a los
nuevos miembros del grupo Maite y Edu ya que sin todos ellos no habríamos
pasado tantos buenos momentos dentro y fuera del laboratorio.
Además de mi grupo, me gustaría hacer referencia también a mis
compañeros de química biológica por su amabilidad siempre que he necesitado
algo, así como al grupo de Carmen Torres, en especial a Carmen Lozano por
llevar a cabo las pruebas de microbiología.
Por último me gustaría dar las gracias a mi familia por todo el apoyo que
me han dado durante este tiempo y a mis compañeras de máster Cintia, Rebeca
y Ana por todo el tiempo que hemos compartido juntas.
Resumen
Durante este trabajo de fin de máster se desarrolla la síntesis y el estudio
fotoquímico de nuevos interruptores moleculares. Dichos interruptores están
basados en estructuras de origen natural como la hidantoína o el cromóforo del
fitocromo. Además, otra parte de su estructura está inspirada en dos agentes
antibacterianos pertenecientes al grupo de las quinolonas, el ácido nalidíxico y
el ciprofloxacino, por lo que se espera que presenten actividad frente a
bacterias.
Tras llevar a cabo la síntesis se realizará un análisis de su comportamiento
fotoquímico que servirá para comprobar si las estructuras sintetizadas pueden
ser utilizadas como interruptores moleculares. Finalmente se lleva a cabo un
estudio para determinar sus propiedades bactericidas.
Abstract
This work is focused on the synthesis and photochemical study of new molecular
switches. The structures of these switches are based on compounds of natural
origin like hydantoin or the phytochrome chromophore. In addition, other part
of their structures are inspired in two antibiotics belonging to the group of
quinolones, the ciprofloxacin and nalidixic acid, so it is expected that they have
bactericidal properties.
After carrying out their synthesis, an analysis of the photochemical
features will be made to check whether the synthesized structures can be used
as molecular switches. Finally a study to determine their bactericide properties
will be performed.
Índice
Abreviaturas 6
1. Introducción 8
2. Antecedentes 12
2.1. Quinolonas como agentes antibacterianos 13
2.2. Máquinas moleculares 15
2.3. Tipos de estímulos para accionar interruptores moleculares 17
2.4. Tipos de interruptores moleculares 18
2.5. Aplicaciones de los interruptores moleculares 24
3. Objetivos 26
4. Estudio fotoquímico 28
4.1. Síntesis de nuevos interruptores moleculares 29
4.2. Espectros UV-Vis y NOESY 31
4.3. Irradiación de interruptores moleculares 35
5. Estudio de propiedades antibióticas 43
5.1. Determinación de la CMI 44
5.2 Determinación de la CMB 47
6. Conclusiones 50
7. Parte experimental 52
7.1. Consideraciones generales 53
7.2. Síntesis de aldehídos: parte antibiótica 55
7.3. Síntesis de interruptores moleculares 60
7.4. Caracterización de interruptores moleculares 65
8. Anexo: Espectros RMN de 1H y 13C 67
Abreviaturas
c Cuatriplete (en RMN)
CCD Dispositivo de carga acoplada
CCF Cromatografía de capa fina
CMI Concentración mínima inhibitoria
CMB Concentración mínima bactericida
13C RMN Resonancia magnética nuclear de 13C
d Doblete (en RMN)
dd Doblete de dobletes (en RMN)
DMAP 4-dimetilaminopiridina
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfóxido
ES+ Electrospray con detección de ion positivo
ES- Electrospray con detección de ion negativo
g/mol Gramos por mol
GFP Proteína verde fluorescente
1H RMN Resonancia magnética nuclear de 1H
hν Luz, fotones, irradiación
Hz Hertzio
J Constante de acoplamiento (en RMN)
M Molaridad
ml Mililitro
mmol Milimol
MS Espectrometría de masas
nm Nanómetro
ppm partes por millón
PSB Base de Schiff protonada
RT Temperatura ambiente
s Singlete (en RMN)
t Triplete (en RMN)
TBTU O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronio
tetrafluoroborato
TFA Ácido trifluoroacético
TMS Tetrametilsilano
TMS-imidazol Trimetilsilil imidazol
UFC Unidades formadoras de colonia bacteriana
UV-Vis Ultravioleta-visible
δ Desplazamiento químico
ε Coeficiente de absorción molar
λ Longitud de onda
1. Introducción
1. Introducción
4
La fotoquímica estudia las reacciones químicas iniciadas por la absorción
de energía en forma de radiación visible, ultravioleta o infrarroja. Esta disciplina
engloba desde el desarrollo de la mecánica de ondas, a estudios sobre la
conversión del dióxido de carbono a carbohidratos en plantas, a las patentes
que dieron lugar a la xerografía y a la cámara Polaroid.
La palabra radiación deriva del nombre del dios egipcio del sol, Aton Ra.
Desde la era primitiva el sol es sinónimo de fuerza y calor. Desde entonces se
conocen también los efectos medicinales del mismo.
Los efectos de la exposición de la luz sobre sustancias puras fueron
probablemente descubiertos por Scheele que observó que las sales de haluros
de plata se oscurecían con la luz del sol. Por otro lado el comienzo de la
fotoquímica orgánica se le atribuye a Trommsdorff en 1834, quién observó que
los cristales de -santonina al ser expuestos a la luz cambiaban de color. Esta
transformación se debía a un proceso de isomerización.1
La ley de Grotthaus-Draper también conocida como “primera ley de la
fotoquímica” explicaba estos hechos. Grotthaus en 1820 y Draper en 1843
enunciaban que para que una radiación provoque una acción química, esta debe
ser absorbida por un cuerpo.
Más allá del uso de la luz solar como fuente de irradiación, la primera
fuente artificial de luz, una lámpara de mercurio, fue publicada en una patente
en 1860.
Hasta ese momento las reactividades eran descritas sin hacer referencia
a la naturaleza electrónica de las especies excitadas. Más tarde, a mediados del
siglo XX se confirmó experimentalmente la existencia del estado triplete
(Terenin y Ermolaev).
1 Trommsdorff, H., Ann. Chem. Pharm. 1834, 11, 190-208.
1. Introducción
5
Al mismo tiempo se descubrió la técnica de fotólisis por destello láser (R.
G. W. Norrish y G. Porter) que hizo posible la detección de intermedios
transitorios.
En la década de los 70 del siglo pasado, la mayoría de los principios básicos
de esta disciplina estaban establecidos y el rápido avance tecnológico permitió
el crecimiento en esta área.
Además de la fotoquímica llevada a cabo en laboratorios, se sabe que los
organismos vivos presentan diferentes respuestas al estímulo de la luz, desde la
fotosíntesis explicada anteriormente hasta la visión de los seres vivos o el
movimiento de los mismos. Todo esto ocurre gracias a la presencia de
fotoproteínas, que al recibir el estímulo de la luz experimentan un cambio en su
conformación o estructura. Se conoce que la estructura de las proteínas está
ligada a la reactividad de las mismas, por lo tanto, un cambio en la conformación
puede llevar a cabo un aumento o disminución de su actividad llegando hasta su
pérdida temporal o permanente si se produce la desnaturalización de la misma.
Cabe destacar que no toda la proteína en su conjunto presenta una
respuesta al estímulo de la luz, sino únicamente una pequeña parte que recibe
el nombre de cromóforo. Un cromóforo se define como una sustancia capaz de
absorber energía de una determinada longitud de onda que depende de su
estructura. De este modo el control fotoquímico de procesos biológicos es
resultado de la excitación fotoquímica y la reacción posterior que se da lugar a
través del cromóforo.
El proceso llevado a cabo sería el siguiente: la proteína es irradiada con
una longitud de onda a la cual el cromóforo absorbe un fotón y pasa del estado
fundamental (S0) a un estado electrónico excitado, a través del cual se produce
la reacción fotoquímica dando lugar al producto o productos correspondientes.
Mediante las reacciones fotoquímicas se pueden llevar a cabo diferentes
procesos:
Ruptura de enlaces
Formación de nuevos enlaces
Isomerización
1. Introducción
6
Durante este trabajo se utilizará la energía lumínica para llevar a cabo
reacciones de isomerización, más concretamente isomerización de alquenos
Z/E. Además los cromóforos empleados para llevar a cabo dicha reactividad
están basados en estructuras de los cromóforos de proteínas como el fitocromo
o la proteína verde fluorescente. En el transcurso del trabajo se estudiará su
fotorreactividad así como la síntesis de dichos compuestos.
2. Antecedentes
2. Antecedentes
8
Los antibióticos son usados en todo el mundo para tratar enfermedades
causadas por bacterias. Sin embargo, su uso, muchas veces de forma indebida,
es una fuente de preocupación, ya que genera diversos problemas como la
resistencia a dichos medicamentos así como la acumulación de los mismos en el
medio ambiente.2
2.1 Quinolonas como agentes antibacterianos
Las quinolonas integran un grupo de agentes sintéticos, es decir que no
son producidos por microorganismos, con actividad antimicrobiana de toxicidad
selectiva. Dentro del grupo de las quinolonas existen en la actualidad cuatro
generaciones distintas:
Primera generación: Se utilizan exclusivamente como antisépticos
urinarios porque no alcanzan niveles séricos suficientes y se eliminan
por orina en forma activa.
Segunda generación: Son derivados fluorados también conocidos como
fluoroquinolonas. Tienen un espectro de actividad más amplio,
cubriendo estafilococos y la Pseudomona Aeruginosa, no sólo en el
tracto urinario sino también a nivel sistémico.
Tercera generación: Integrada por compuestos bi y trifluorados.
Surgieron ante la necesidad clínica de un cubrimiento antibacteriano
más amplio, específicamente contra bacterias Gram positivas. Tienen
actividad contra enterobacterias, la P. Aeruginosa, gérmenes atípicos y
estreptococos.
2 Piddock, L. J. V., The Lancet Infectious Diseases 2011, 12 (3), 249-253.
2. Antecedentes
9
Cuarta generación: Estos nuevos fármacos fueron sintetizados para
aumentar el espectro antibacteriano contra los anaerobios,
preservando a su vez el espectro previo de las quinolonas de tercera
generación.
Figura 2.1. Evolución de las quinolonas en el tiempo.
En el transcurso de este trabajo se estudiaran las propiedades de dos
antibióticos, el ácido nalidíxico de primera generación y el ciprofloxacino de
segunda.
2.1.1 Ácido nalidíxico
En 1962 Lesher y colaboradores identificaron el ácido nalidíxico como
subproducto en la síntesis de la cloroquina. Ese mismo año se evaluaron sus
propiedades como agente antibacteriano.3
Es eficaz contra diversas bacterias de tipo Gram negativo. En altas
concentraciones actúa como bactericida, es decir mata a las bacterias, en
3 Lesher, G. Y., Froelich, E. J., Gruett, M. D., Bailey, J. H., Brundage, R. P., J. Med. Pharm.
Chem. 1962, 5, 1063-1065.
2. Antecedentes
10
cambio en concentraciones más bajas es capaz de actuar como bacteriostático,
es decir, inhibe el crecimiento de las mismas así como su reproducción sin matar
el organismo. Es muy utilizado en el tratamiento contra infecciones urinarias.
Su mecanismo de acción se basa en el bloqueo selectivo y reversible de la
replicación del ADN bacteriano.
2.1.2 Ciprofloxacino
Fue descubierto por la empresa Bayer AG que a principio de la década de
los 80 estudiaba como afectaban pequeñas modificaciones en la estructura del
norfloxacino.4 En la figura 2.1 se puede observar el cambio estructural entre
ambos compuestos que difieren únicamente en el sustituyente de una amina.
Es la quinolona de segunda generación más usada en todo el mundo. Su uso
comenzó a finales de la década de los 80.
Presenta actividad contra diversas bacterias de tipo Gram positiva y Gram
negativa por lo que es considerado de amplio espectro. Se utiliza para tratar
varias enfermedades como: endocarditis, gastroenteritis, otitis, etc.
Su mecanismo de acción se basa en la parálisis de la replicación del ADN
bacteriano.
2.2 Máquinas moleculares
Una máquina molecular puede ser definida como una serie de
componentes moleculares a los que al aplicar un estímulo de entrada, producen
una salida (generalmente un movimiento mecánico).
En la naturaleza se pueden encontrar ejemplos de máquinas moleculares
como la bomba de iones que aparece en la bacteriorodopsina, activada
mediante luz, que permite el transporte de protones a través de las membranas
4 Wise, R., Andrews, J. M., Edwards, L. J., Antimicrob. Agents Chemother. 1983, 23, 559-
564.
2. Antecedentes
11
de las células5,6 o motores lineales como la kinesina.7 Dichos ejemplos son muy
útiles a la hora de diseñar y construir máquinas moleculares sintéticas.
Existen diferentes tipos de máquinas moleculares: motores, lanzaderas,
sensores, interruptores, etc. De entre todas ellas las más estudiadas y utilizadas
en la actualidad son los interruptores moleculares.
Un interruptor molecular es un sistema molecular que puede ser
intercambiado reversiblemente entre dos estados por el efecto de una acción
externa.
Figura 2.2. Esquema de un proceso de isomerización entre dos estados (A y B) que
pueden ser intercambiados por acción de un estímulo externo (S1 y S2).
2.2.1 Diferencias entre interruptor, rotor y motor molecular
Un interruptor, como se ha explicado en el anterior apartado solo tiene
dos posiciones, encendido y apagado.
Un rotor, se define como un dispositivo capaz de rotar en varias
direcciones a través de un movimiento continuo.
5 Lanyi, J. K., Annu. Rev. Physiol. 2004, 66, 665-688. 6 Neutze, R., Pebay-Peyroula, E., Edman, K., Royant, A., Navarro, J., Landau, E. M.,
Biochimica et Biophysica Acta 2002, 1565, 143-368. 7 Shao, Q., Gao, Y. Q., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006, 103, 8072-8077.
2. Antecedentes
12
Por último si el movimiento rotacional continuo es controlado de forma
unidireccional tendremos lo que se conoce como motor molecular. Para poder
sintetizar estos últimos se deben satisfacer tres criterios:
Rotación repetitiva de 360⁰.
Consumo de energía que se emplea en el movimiento.
Control en la dirección de giro. Esta se puede controlar introduciendo
en la síntesis del motor diversos factores químicos, como pueden ser la
existencia de centros quirales en la molécula o la existencia de puentes
de hidrógeno que favorezcan el giro en un sentido.
Figura 2.3. Esquema de un motor molecular con giro de 360o.
2.3 Tipos de estímulos para accionar interruptores moleculares
Se conocen tres tipos de estímulos capaces de inducir el movimiento
mecánico requerido para activar interruptores moleculares: químicos,
electroquímicos y fotoquímicos.
Es conveniente seleccionar el estímulo adecuado para que el dispositivo
molecular funcione y a su vez los residuos generados sean mínimos. De esta
forma se evita que los productos secundarios se acumulen en el medio de
reacción. Teniendo esto en cuenta los mejores estímulos son los fotones o los
electrones, siempre y cuando estos últimos provengan de fuentes
electroquímicas que no sean reacciones redox.
Más concretamente, la energía fotoquímica presenta una serie de
ventajas aparte de las ya mencionadas:
2. Antecedentes
13
La luz se puede apagar y encender fácilmente.
Los láseres proporcionan energía monocromática de alta intensidad en
un espacio muy pequeño.
Los fotones, además de proporcionar la energía deseada, pueden ser
útiles para leer el estado del sistema, por lo que seremos capaces de
controlar la operación del dispositivo molecular.
Si existe la posibilidad de emplear luz solar, tendremos una fuente de
energía limpia y renovable.
La energía lumínica puede llevar a cabo la fotoisomerización de dobles
enlaces presentes en la estructura de los interruptores moleculares como: -C=C-
, -C=N-, -N=N-.
2.4 Tipos de interruptores moleculares
La gran mayoría de interruptores moleculares se pueden clasificar en dos
grandes grupos atendiendo a la reacción que llevan a cabo para obtener las dos
posiciones: isomerización y apertura y cierre de ciclos.
Figura 2.4. Tipos de interruptores moleculares.
En los interruptores que llevan a cabo una reacción de ciclación se
produce fundamentalmente un cambio electrónico entre sus dos formas,
2. Antecedentes
14
aumentando o disminuyendo la conjugación. En cambio, los interruptores que
realizan una reacción de isomerización sufren sobre todo un cambio a nivel
geométrico, aumentando o disminuyendo la distancia entre los extremos de la
molécula.
2.4.1 Azobencenos
El descubrimiento de los azo compuestos se produjo a mediados del siglo
XIX,8 y durante muchos años se utilizaron como agentes colorantes en la
industria del tinte. Por este motivo existe una gran variedad de azo compuestos
descritos que pueden obtenerse de forma sencilla y barata.
En 1937, Hartley describió la formación de cis-azobenceno tras exponerlo
a la luz.9 Algunas de las ventajas que presentan estos compuestos son el gran
cambio conformacional entre sus formas Z y E, así como las distintas bandas de
absorción que presentan ambos isómeros en UV-vis.
Todas estas razones hacen que este sea el grupo más utilizado a la hora
de sintetizar interruptores moleculares.
2.4.2 Alquenos impedidos
Estos interruptores han sido objeto de estudio durante los últimos años.
Su estructura básica consiste en dos partes aromáticas asimétricas conectadas
mediante un doble enlace.
8 Noble, A., Justus Liebigs Ann. Chem. 1856, 98, 253-256. 9 Hartley, G. S., Nature 1937, 140, 281.
2. Antecedentes
15
Figura 2.5. Estructura básica y proceso de fotoisomerización de alquenos
impedidos.
Por razones estéricas ambas partes pierden su planaridad adoptando una
estructura helicoidal como ocurre en los helicenos.
En la síntesis de alquenos impedidos, el paso crucial es la formación del
doble enlace central C=C. El impedimento estérico, que es la clave del
funcionamiento de estos compuestos, dificulta la formación de este doble
enlace. A pesar de ello, se han desarrollado diferentes métodos para su
síntesis.10,11,12
10 Shimasaki, T., Kato, S.-I., Ideta, K., Goto, K., Shinmyozu, T., J. Org. Chem. 2007, 72,
1073-1087. 11 Buter, J., Wassenaar, S., Kellogg, R. M., J. Org. Chem. 1972, 37, 4045-4060. 12 Geertsema, E. M., Hoen, R., Meetsma, A., Feringa, B. L., Eur. J. Org. Chem. 2006, 3596-
3605.
X = CH2, O, SO2, S
Y = C, O, S, C(CH3)3…
R1, R2, R3 = H, alquil, OCH3,
NO2
2. Antecedentes
16
2.4.3 Basados en la estructura del cromóforo de la rodopsina
La rodopsina es una proteína transmembranal que se encuentra en los
discos de los bastones de la retina. Es una proteína foto-receptora cuyo
cromóforo es el 11-cis-retinal, una base de Schiff protonada (PSB). La
isomerización del mismo inicia el proceso de visión y a esta le sigue un cambio
conformacional en la proteína rodopsina.
Este compuesto constituye un ejemplo de interruptor molecular basado
en isomerización E/Z muy eficiente. La isomerización mencionada presenta un
rendimiento cuántico in vivo de 0,67. Esto significa que de cada 100 fotones que
llegan al cromóforo, emplea 67 para realizar la isomerización.
Figura 2.6. Estructura de la Rodopsina y su cromóforo (PSB-retinal).
2. Antecedentes
17
En nuestro grupo de investigación se han sintetizado y estudiado distintos
interruptores moleculares basados en la PSB-retinal.13,14,15
2.4.4 Basados en la estructura de la proteína verde fluorescente
El cromóforo de la GFP, es capaz de llevar a cabo procesos fotoquímicos
de manera eficiente. Este compuesto es producido por la medusa Aequorea
victoria y emite en la zona verde del espectro visible.
Figura 2.7. Estructura de la proteína verde fluorescente y su cromóforo.
Debido a su atractiva emisión fluorescente, la GFP se ha convertido en
objeto de estudio como marcador celular y molecular. Así, pueden seguirse
dinámicas intracelulares de distintas moléculas ya que se pueden activar a su
estado fluorescente, por ejemplo, se puede conseguir iluminar células
tumorales y ver su expansión.
13 Blanco-Lomas, M., Samanta, S., Campos, P. J., Woolley, G. A., Sampedro, D., J. Am.
Chem. Soc. 2012, 134, 6960-6963. 14 Blanco-Lomas, M., Martinez-Lopez, D., Campos, P. J., Sampedro, D., Tetrahedron Lett.
2014, 55, 3361-3364. 15 Martinez-Lopez, D., Blanco-Lomas, M., Campos, P. J., Sampedro, D., Tetrahedron Lett.
2015, 56, 1991-1993.
2. Antecedentes
18
2.4.5 Basados en la estructura del cromóforo del fitocromo
Los fitocromos son proteínas foto-receptoras que aparecen en plantas,
bacterias y hongos utilizados para detectar la luz.
La absorción de luz por parte del cromóforo da lugar a la
fotoisomerización del doble enlace entre los anillos C y D.
Figura 2.8. Cromóforo del fitocromo.
2.4.6 Basados en la estructura de la hidantoína
Estos compuestos pertenecen a una nueva familia donde la unidad de
imidazol del cromóforo de la GFP es reemplazada por una imidazolinona.
Figura 2.9. Interruptor basado en la estructura de la hidantoína.
2. Antecedentes
19
La primera síntesis de un 5-arilidenhidantoina (5-AHT) fue publicada en
1899.16 Años después, Wheeler y Hoffman describieron un método más
eficiente de preparar 5-AHT a partir de la condensación de hidantoína y
benzaldehído en disolución ácida.17
Las aplicaciones de estas moléculas están basadas principalmente en
actividades biológicas (anticancerígenos,18,19 antibióticos20,21) por lo que su uso
como interruptores moleculares es novedoso.22
2.5 Aplicaciones de los interruptores moleculares
El uso de los interruptores moleculares abarca diferentes campos. En
biología, la introducción de estos en proteínas y péptidos da lugar al fotocontrol
de la conformación.23 Dentro de la rama industrial, los azobencenos
ensamblados en monocapas pueden dar lugar a la modificación de las
propiedades de un material, como por ejemplo, la adsorción o repulsión de la
humedad.24 Por otro lado los alquenos impedidos pueden ser utilizados como
sistemas moleculares de almacenamiento de datos.25 Las propiedades de otros
16 Ruhemann, S., Cunnington, A. V., J. Chem. Soc., Trans. 1899, 75, 954-963. 17 Wheeler, H. L., Hoffman, C., Am. Chem. J. 1911, 45, 368. 18 Kaminskyy, D. V., Lesyk, R. B., Biopolym. Cell 2010, 26, 136-145. 19 El-Deeb, I. M., Bayoumi, S. M., El-Sherbeny, M. A., Abdel-Aziz, A. A. M., Eur. J. Med.
Chem. 2010, 45, 2516-2530. 20 Handzlik, J., Matys, A., Kiec-Kononowicz, K., Antibiotics 2013, 2, 28-45. 21 Handzlik, J., Szymanska, E., Alibert, S., Chevalier, J., Otrebska, E., Pekala, E., Pages, J.-
M., Kiec-Kononowicz, K., Bioorg. Med. Chem. 2013, 21, 135-145. 22 Martinez-Lopez, D., Yu, M.-L., Garcia-Iriepa, C., Campos, P. J., Frutos, L. M., Golen, J.
A., Rasapalli, S., Sampedro, D., J. Org. Chem. 2015, 80, 3929-3939. 23 Beharry, A. A., Wong, L., Tropepe, V., Woolley, G. A., Angew. Chem., Int. Ed. 2011, 50,
1325-1327. 24 Moeller, G., Harke, M., Motschmann, H., Prescher, D., Langmuir 1998, 14, 4955-4957. 25 Feringa, B. L., Huck, N. P. M., van Doren, H. A., J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 9929-
9930.
2. Antecedentes
20
grupos de interruptores como los basados en la GFP y en la estructura de la
hidantoína se han comentado en sus apartados correspondientes.
El fin de los interruptores moleculares que se describen en este trabajo
está orientado al campo de la medicina, más concretamente se espera que
actúen como antibióticos con actividad fotocontrolada.26
26 Velema, W. A, van der Berg, J. P., Hansen, M. J., Szymanski, W., Driessen, A. J. M.,
Feringa, B. L., Nat. Chem. 2013, 5, 924-928.
3. Objetivos
3. Objetivos
22
Los objetivos que se quieren conseguir en este trabajo de fin de máster
se presentan a continuación:
En primer lugar, llevar a cabo la síntesis de diferentes tipos de
interruptores moleculares con potenciales efectos bactericidas. Estos
compuestos presentan una parte de su estructura basada en
cromóforos de origen natural, esta parte les confiere la característica de
interruptor molecular, por otro lado su estructura también se inspira en
distintos antibióticos como el ciprofloxacino o el ácido nalidíxico.
Una vez sintetizados, realizar un estudio de su comportamiento
fotoquímico y evaluar sus características como interruptores
moleculares eficientes.
Por último, una vez que se hayan cumplido los dos primeros objetivos,
analizar las propiedades de estos compuestos como agentes
bactericidas, tanto del isómero térmicamente estable como del
fotoquímico, y analizar si existe diferente comportamiento entre
ambos.
4. Estudio fotoquímico
4. Estudio fotoquímico
24
4.1 Síntesis de nuevos interruptores moleculares
En primer lugar se realizó la síntesis de los interruptores moleculares.
A continuación se resumen las rutas sintéticas llevadas a cabo para la
obtención de tres tipos de interruptores, dos de ellos basados en el
cromóforo del fitocromo (12, 13) y uno en la estructura de la hidantoína (17):
Figura 4.1. Ruta sintética seguida para la obtención de los interruptores basados en el
ciprofloxacino (parte antibiótica) con en el cromóforo del fitocromo (12) y la estructura
de la hidantoína (17).
4. Estudio fotoquímico
25
El primer paso es llevar a cabo una reacción entre la anilina (1) y el
malonato, de esta forma se obtiene el compuesto 2. A continuación se produce
la ciclación del productor obtenido para dar lugar al compuesto 3. El siguiente
paso consiste en una metilación para obtener la amina terciaria (4), después se
lleva a cabo la desprotección del acetal empleando un medio ácido. A partir del
aldehído (5) la ruta se bifurca para obtener dos tipos distintos de interruptores.
Si se utiliza 3-etil-4metil-3-pirrolin-2-ona se sintetiza el interruptor basado en el
cromóforo del fitocromo (12). En cambio, si se añade la hidantoína metilada se
obtiene el interruptor basado en la estructura de la hidantoína (17).
Figura 4.2. Ruta sintética seguida para la obtención del interruptor basado en el ácido
nalidíxico (parte antibiótica) y en el cromóforo del fitocromo.
4. Estudio fotoquímico
26
Primero se lleva a cabo la reacción entre el ácido nalidíxico (8) y la
hidracina protegida (7), para la obtención de 9. A continuación se lleva a cabo la
desprotección de la hidrazina para obtener el producto 10. A partir de este
producto en el siguiente paso se obtiene el aldehído (11). Por último se lleva a
cabo la síntesis del interruptor molecular basado en la estructura del fitocromo,
para ello se hace reaccionar 11 con 3-etil-4metil-3-pirrolin-2-ona, de esta forma
se consigue el compuesto 13.
4.2 Espectros UV-Vis y NOESY
Una vez llevada a cabo la síntesis de los distintos tipos de interruptores
moleculares se realiza el estudio de su comportamiento fotoquímico.
Como se ha explicado anteriormente, el fundamento de un interruptor
molecular es la capacidad de ser intercambiado entre dos estados distintos por
la acción de un estímulo externo. Más concretamente en este caso los dos
estados distintos serán las configuraciones Z/E y el estímulo externo vendrá
dado por una fuente de luz. El proceso fotoquímico que se lleva a cabo es un
proceso de fotoisomerización del doble enlace C=C situado entre los anillos de
5 y 6 miembros, es decir el doble enlace que une la parte antibiótica y la parte
que confiere las propiedades de interruptor molecular. Tras la síntesis se
obtiene el isómero estable térmicamente, cuando se irradia este compuesto y
se produce su isomerización se obtiene el conocido como isómero fotoquímico
en un tanto por ciento determinado. La irradiación continúa hasta que la
proporción de isómeros no varíe, es decir hasta que el tanto por ciento de
isómero fotoquímico deje de crecer, en este momento se alcanza lo que se
conoce como estado fotoestacionario.
h
ν1
h
ν1
h
ν1
4. Estudio fotoquímico
27
Figura 4.3. Proceso de fotoisomerización de los distintos interruptores moleculares.
Previamente a la irradiación de los compuestos es aconsejable realizar
una serie de medidas como la obtención de los espectros de absorción. Para ello
se preparan disoluciones con una concentración en torno a 5x10-5M. Las
medidas se realizan empleando una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso óptico. A
continuación se muestran los espectros obtenidos así como los valores de
longitud de onda y coeficiente de extinción molar para la banda de máxima
absorción.
hν2 o Δ
hν2 o Δ
hν2
hν1
hν1
hν1
4. Estudio fotoquímico
28
Figura 4.4. Espectro UV-Vis de los compuestos 12 y 13 en MeOH.
Figura 4.5. Espectro UV-Vis del compuesto 17 en CHCl3.
250 300 350 400 450 5000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
Ab
sorb
anci
a (u
a)Longitud de onda (nm)
Compuesto 12
Compuesto 13
250 300 350 400 450 5000,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,01,11,21,31,41,5
Ab
sorb
anci
a (u
a)
Longitud de onda (nm)
Compuesto 17
4. Estudio fotoquímico
29
Tabla 4.1. Valores de longitud de onda y coeficiente de extinción molar para la
bandas de máxima absorción.
Compuesto λmáx (nm) / ε (M-1cm-1)
12
308 / 9600
13
364 / 45968
17
263, 314 / 23826, 10570
Como se puede observar, al cambiar la parte antibiótica de ciprofloxacino
(12, 17) a ácido nalidíxico (13) se produce un desplazamiento a longitudes de
onda mayores.
En el caso de los compuestos 12 y 17 que tienen en común dicha parte, al
cambiar el interruptor y pasar del fitocromo (12) a la hidantoína (17) se produce
un aumento en la intensidad de la banda que aparece a menores longitudes de
onda.
Además de conocer la zona en la que absorben los compuestos también
es interesante conocer el isómero inicial obtenido en la síntesis, es decir el más
estable térmicamente. Para ello se realizaron experimentos mediante
4. Estudio fotoquímico
30
resonancia magnética nuclear, más concretamente un NOESY. A continuación
se muestran los resultados obtenidos, los espectros se pueden encontrar en el
capítulo 8.
Figura 4.6. Protones correlacionados mediante NOESY para el compuesto 12.
Figura 4.7. Protones correlacionados mediante NOESY para el compuesto 13.
Como se puede observar el isómero obtenido tras la síntesis de ambos
compuestos es el Z. Por otro lado, para el compuesto 17 no se ha observado
correlación entre el protón vinílico y el metilo del ciclo de 5, por este motivo y
por comparación con los compuestos encontrados en bibliografía se ha
determinado que el isómero obtenido en la síntesis es el E.27
4.3 Irradiación de interruptores moleculares
El siguiente paso es la irradiación de los compuestos utilizando una
lámpara de Hg de media presión. Una vez analizado el espectro ultravioleta, se
27 Ver referencia 22(Capítulo 2).
4. Estudio fotoquímico
31
selecciona el filtro adecuado para cada uno de los compuestos. Para 12 y 13 se
ha elegido filtro de Pyrex, ya que evita radiaciones de longitudes de onda
inferiores a 290 nm, las cuáles pueden producir reacciones secundarias debido
a transiciones más energéticas. En cambio para el 17 se ha probado tanto con
filtro de Pyrex como de cuarzo, ya que presenta una banda a 263 nm.
A la hora de irradiar los compuestos se utilizan tubos de RMN de Pyrex o
cuarzo, que contienen una disolución del compuesto seleccionado. Con el fin de
seguir la irradiación mediante la técnica de resonancia magnética nuclear se
emplean disolventes deuterados, DMSO-d6 en el caso de 12, metanol-d4 para 13
y CDCl3 para 17. La irradiación se sigue a intervalos cortos de tiempo realizando
espectros de 1H-RMN para poder observar la isomerización de los compuestos.
Una vez que el interruptor comience a girar se observará la aparición de un
nuevo juego de señales en el espectro correspondientes al nuevo isómero que
se está formando. Mediante la integración de las señales en el espectro de 1H
correspondientes a cada uno de los isómeros, se calcula la proporción Z/E en
cada momento. La irradiación finalizará una vez que se alcance el estado
fotoestacionario de cada uno de los productos.
4.3.1 Irradiación de los interruptores basados en el cromóforo del fitocromo
Compuesto 12:
La irradiación del compuesto 12 en DMSO-d6, con filtro Pyrex, durante 25
minutos es suficiente para que se alcance el estado fotoestacionario. La lámpara
seleccionada tiene una potencia de 125W. A continuación se muestran los
espectros de 1H-RMN obtenidos:
4. Estudio fotoquímico
32
Figura 4.8. Espectro 1H-RMN tras haber sido irradiado (a) t=0min (b) t=25 min.
(b)
(a)
4. Estudio fotoquímico
33
En este caso la proporción de isómeros en dicho estado es de 63% Z / 37%
E. Es decir se obtiene una mezcla en la que el componente mayoritario es el
compuesto Z.
Tras la irradiación se lleva a cabo un estudio de la estabilidad térmica de
este compuesto. Si se deja la muestra a oscuras y a temperatura ambiente
durante 15 días después de la irradiación de la misma, se sigue manteniendo
una proporción Z/E idéntica a la que se muestra en la figura 4.8. Esto es debido
a que la barrera energética de isomerización térmica es alta. Para conseguir la
reversión térmica completa, es decir para obtener un 100% de isómero Z se ha
de calentar la muestra durante 3 días a 100 °C.
Compuesto 13:
Este caso es similar al anterior, la irradiación se lleva a cabo en metanol-
d4, utilizando filtro Pyrex y el estado fotoestacionario se alcanza a los 20
minutos. La potencia de la lámpara empleada es de 125W.
Cabe destacar que inicialmente se eligió CDCl3 como disolvente, pero la
fotoisomerización no tenía lugar. Esto es probablemente debido a la formación
de puentes de hidrógeno intramoleculares. Para evitar dichos puentes se eligió
un disolvente capaz de competir por la formación de estos. De esta forma,
utilizando metanol-d4 los puentes se forman con el disolvente y se produce la
isomerización. Seguidamente se muestran los espectros de 1H-RMN obtenidos:
4. Estudio fotoquímico
34
Figura 4.9. Espectro 1H-RMN tras haber sido irradiado (a) t=0min (b) t=20 min.
(a)
(b)
0 0
0 0 0 0
4. Estudio fotoquímico
35
La proporción de isómeros en el estado fotoestacionario es de 59% Z /
41% E. De nuevo se sigue manteniendo mayoritariamente el isómero de partida.
Tras la irradiación se lleva a cabo un estudio de la estabilidad térmica de
este compuesto. Se probaron diferentes temperaturas para comprobar la
reversión del sistema al estado inicial, pero fue necesario calentar a 110 °C
durante 3 días para obtener de nuevo un 100% del isómero Z.
4.3.2 Irradiación del interruptor molecular basado en la hidantoína
Compuesto 17:
La irradiación de este interruptor se llevó a cabo utilizando CDCl3 como
disolvente. A la hora de seleccionar el filtro se realizó una primera irradiación
con cuarzo y una segunda muestra se irradió con Pyrex. En el primer caso el
estado fotoestacionario se alcanza tras dos horas de irradiación con una lámpara
de 125W. En el segundo caso la irradiación se llevó a cabo utilizando una
lámpara de 400W y el estado fotoestacionario se obtuvo tras 1 hora de
irradiación. En ambas muestras a medida que avanza el tiempo se observa la
descomposición parcial del producto. A continuación se presentan los espectros
de 1H-RMN obtenidos:
4. Estudio fotoquímico
36
(a)
(b)
0
0
0 0
0 0
0
4. Estudio fotoquímico
37
Figura 4.10. Espectro 1H-RMN tras haber sido irradiado (a) t=0min (b) t=120 min con
filtro de cuarzo y lámpara de 125W (c) t=60 min con filtro de Pyrex y lámpara de 400W.
La proporción de isómeros al irradiar en cuarzo es de 43%E / 57% Z. Por
lo tanto en este caso se consigue una mezcla con un mayor tanto por ciento del
isómero fotoquímico. En cambio al irradiar en Pyrex se consigue una proporción
69% E / 31% Z, es decir la mezcla está compuesta mayoritariamente por el
isómero térmicamente estable.
Por último se realiza un estudio de la estabilidad térmica de este
compuesto. La mezcla de isómeros es estable hasta alcanzar los 60 °C sin variar
la proporción de los mismos. En cambio al calentar a 70 °C se produce la
descomposición total del producto por lo que no se ha conseguido llevar a cabo
la reversión vía térmica.
0
0
0
0
0
(c)
5. Estudio de propiedades
antibióticas
5. Estudio de propiedades antibióticas
40
Con el fin de determinar si los compuestos sintetizados poseen
propiedades antibióticas se realiza un estudio de los siguientes parámetros:
Concentración mínima inhibitoria (CMI): Se define como la mínima
cantidad de agente antimicrobiano que inhibe el crecimiento de un
microorganismo tras una noche de incubación. La concentración
mínima inhibitoria es importante en diagnósticos de laboratorio para
confirmar la resistencia de microorganismos a un agente antimicrobiano
y además para monitorizar la actividad de los nuevos agentes
antimicrobianos.28
Concentración mínima bactericida (CMB): Se considera CMB la mínima
concentración del compuesto capaz de matar al 99.9% de los
microorganismos inicialmente inoculados
Además de conseguir que los compuestos sintetizados actúen como
agentes antimicrobianos, se busca que haya una diferencia de actividad
entre los isómeros Z/E de los compuestos. De esta forma será posible ejercer
un control sobre el poder bactericida mediante el estímulo externo de la luz.
5.1 Determinación de la CMI
Se determinó la CMI del agente antimicrobiano en estudio por el método
de microdilución en medio líquido Mueller Hinton (Difco), según el protocolo del
CLSI.29
En primer lugar se prepararan diluciones seriadas de los compuestos a
estudiar en placas microtiter en un rango de concentraciones de 1000 mg/L
hasta 0.49 mg/L (diluciones dobles). Adicionalmente se preparan dos filas con
28 Andrews, J. M., Determination of minimum inhibitory concentrations. [Erratum to
document cited in CA135:223525]. J. Antimicrob. Chemother. 2002, 49, 1049. 29 CLSI, Clinical and Laboratory Standars Institute. Performance Standards for
Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement (M100-
S25).CLSI, Wayne, PA, USA, 2015.
5. Estudio de propiedades antibióticas
41
distinta concentración de metanol ya que es el disolvente utilizado para
solubilizar los compuestos analizados, de esta forma se analiza el efecto de este
disolvente sobre el crecimiento bacteriano.
El siguiente paso es preparar un inóculo bacteriano a 0.5 McFarland en
solución salina de la cepa control E. coli ATCC 25922 (equivalente a 108 UFC/mL).
Después se prepara una dilución 1:100 en caldo Mueller Hinton de la
suspensión bacteriana anterior para obtener concentración bacteriana de 108
UFC/mL.
Seguidamente se inocula cada uno de los pocillos de la placa Microtiter
con esta suspensión bacteriana con el objetivo de disponer de una
concentración de bacterias en cada pocillo equivalente a 5x105 UFC/mL (para
evitar la aparición de mutantes espontáneos). Se agita suavemente y se incuba
durante 24h a 37ºC.
Transcurrido este tiempo se observa la presencia o ausencia de un
depósito de células en el fondo de los pocillos. Se tomó como CMI la menor
concentración de antimicrobiano capaz de inhibir completamente el
crecimiento de la bacteria inoculada, evidente por la ausencia de turbidez en el
pocillo.
A continuación se muestran los pocillos empleados para la determinación
de la CMI:
5. Estudio de propiedades antibióticas
42
Figura 5.1. Pruebas para la determinación de la CMI.
En cada una de las filas se ha probado un agente antimicrobiano, ya sea
su isómero térmicamente estable o la mezcla en el estado fotoestacionario.
También se ha probado el compuesto 5 correspondiente a la parte antibiótica
sin el interruptor enlazado, es decir al aldehído análogo del ciprofloxacino. En
las dos últimas filas aparecen los controles correspondientes al disolvente
utilizado.
Por otro lado en las columnas aparecen las distintas concentraciones de
cada uno de los compuestos.
Como se ha explicado anteriormente la CMI se determina visualmente
como la mínima concentración en la que hay ausencia de turbidez. En el
compuesto 17 no se observa diferencia entre el isómero Z y el estado
fotoestacionario, ya que ambos presentan una CMI de 125 mg/ml. Por otro lado
en el compuesto 12 sí se observan diferencias entre ambos isómeros ya que el
5. Estudio de propiedades antibióticas
43
Z presenta una CMI de 15.63 mientras que en la mezcla en estado
fotoestacionario es de 62.50 mg/ml. Por lo tanto el isómero térmicamente
estable es el más activo contra las bacterias.
Asimismo se puede afirmar que el efecto antibacteriano de los
compuestos no es debido al uso de metanol como disolvente ya que en los
controles realizados con distintos volúmenes ambas pruebas presentan CMI
superiores a las de los productos sintetizados.
5.2 Determinación de la CMB
Para determinar la CMB de los agentes antimicrobianos se toman 10 µL
de cada uno de los pocillos que no presentan depósito de células en la
determinación de la CMI y se siembra en placas de BHI agar sin el agente
antimicrobiano. A continuación se incuban las placas durante 24 horas a 37 °C.
Transcurrido este tiempo se realiza un recuento de colonias con el fin de
determinar la CMB (límite 5 colonias).
Seguidamente se recogen los resultados obtenidos en una tabla donde
aparece resaltada la CMB para cada compuesto:
5. Estudio de propiedades antibióticas
44
Tabla 5.1. Determinación de CMB
11
22
33
44
55
66
77
17-Z (0.5+1) 0
0 0
0 0
0 5
5
12-Z (0.5+1) 0
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
0 2
26
12-Z/E (1+1) 0
0 0
0 0
0 0
0 2
25
17-Z/E (2+5) 0
0 0
0 0
0 0
0
EC12 (4+6) 0
0 0
0 0
0 0
0
Control 1 (1+1) 0
0 0
0 0
0 0
0 4
4
Control 2 (0.5+1) 0
0 0
0 0
0 0
0
En la fila superior de la tabla aparecen recogidos los números de los
pocillos en los que se ha inhibido el crecimiento bacteriano al determinar la CMI.
En las columnas para cada uno de los compuestos aparece el número de colonias
de bacterias. Como se ha mencionado anteriormente el límite para la CMB es de
5 colonias.
Para el compuesto 17 el CMB del isómero inicial y el estado
fotoestacionario es prácticamente igual. En el primer caso tiene un valor de
entre 250 y 125 mg/L y en el segundo de 125. En el compuesto 12 se observa de
Compuesto
(mlMeOH + mlH2O)
Pocillo (nº)
5. Estudio de propiedades antibióticas
45
nuevo una mayor diferencia entre ambos isómeros, ya que el Z presenta un valor
de 31.25 y la mezcla del estado fotoestacionario 125 mg/L. Estos resultados
concuerdan con los anteriores ya que el isómero térmicamente estable sigue
siendo el más activo.
Una vez más se han realizado dos controles con el disolvente empleado
para constatar que los resultados obtenidos no sean debidos al uso de este.
A la vista de los resultados obtenidos, se puede afirmar que es posible
ejercer un control en la capacidad antibacteriana mediante el estímulo de la luz.
Más concretamente, los resultados del compuesto 12 muestran una mayor
actividad del isómero térmicamente estable. Una de las posibles aplicaciones
consistiría en la desactivación de los antibióticos una vez que son vertidos al
medio ambiente mediante su exposición a la luz.
En un futuro cercano sería interesante llevar a cabo la separación de los
isómeros, de esta forma, las pruebas se podrían realizar por separado para cada
uno de ellos. Otro objetivo sería la modificación de la estructura con el fin de
introducir un grupo flúor, ya que las fluoroquinolonas además de ampliar el
espectro a bacterias Gram positivas presentan una mayor actividad.
6. Conclusiones
6. Conclusiones
48
Durante este trabajo se han estudiado distintos tipos de interruptores
moleculares en los que una parte de los mismos está inspirada en diferentes
antibióticos. Las conclusiones obtenidas se resumen a continuación:
La síntesis de los tres interruptores moleculares se ha llevado a cabo de
forma exitosa. Además los dos interruptores que comparten la parte
antibiótica basada en el ciprofloxacino (12 y 17) se pueden obtener a
través de una sola reacción a partir del compuesto 5. Esto mismo es
aplicable para el compuesto 11.
La irradiación de los tres compuestos en las condiciones
correspondientes, ha dado lugar a los distintos estados
fotoestacionarios (12: 63% Z / 37% E, 13: 59% Z / 41% E, 17: 57% Z / 43%
E). En los dos primeros casos se partía del isómero Z y en el último del
E. Además tanto para el compuesto 12 como para el 13 se han
propuesto las condiciones para llevar a cabo la reversión vía térmica del
isómero E al Z.
Por último se han comprobado las propiedades como agentes
antibacterianos de los compuestos 12 y 17. En el compuesto 17 no se
han observado diferencias entre los dos isómeros presentando una CMI
de 125 mg/L y una CMB de entre 250 y 125 mg/L. El compuesto 12 sí
que presenta diferencias entre sus dos isómeros. Los resultados
obtenidos para el estado fotoestacionario son CMI: 62.50 mg/L CMB:
125 mg/L mientras que para el Z varían en dos órdenes de dilución CMI:
15.63 mg/L, CMB: 31.25 mg/L. Por lo tanto se ha conseguido sintetizar
un interruptor molecular con distinta actividad antibiótica controlada
mediante isomería Z/E utilizando la luz como estímulo.
7. Parte experimental
7. Parte experimental
50
7.1. Consideraciones generales
Resonancia magnética nuclear:
Los experimentos de resonancia magnética nuclear de 1H y 13C se han
llevado a cabo en un equipo Bruker-ARX-300 y/o Bruker Avance 400. Se han
utilizado como disolventes CDCl3 con TMS como referencia interna, DMSO-d6 o
metanol-d4. Los valores de desplazamiento químico (δ) se expresan en ppm y las
constantes de acoplamiento en Hertzios (Hz). Las multiplicidades de las señales
se indican de la siguiente forma: (s) = singlete, (d)= doblete, (t)= triplete, (c)=
cuatriplete, (dd) = doblete de dobletes.
Espectroscopia ultravioleta visible:
Los espectros de absorción molecular se han obtenido mediante un
espectrofotómetro modelo Ocean Optics USB4000, provisto de un detector
CCD de 3648 pixels y acoplado a una lámpara DT-MINI-2GS. Se emplearon
disoluciones con una concentración aproximada de 5x10-5 M en cubetas de
cuarzo con un paso óptico de 1 cm.
Espectrometría de masas:
Los análisis de espectrometría de masas se han realizado en un equipo HP
Bruker MicrOTOF-Q provisto de una interfase de electrospray y se registraron
en modo ion positivo o ion negativo.
Cromatografía:
La cromatografía de columna se llevó a cabo empleando gel de sílice como
fase estacionaria y los eluyentes que se indican en cada caso. Para la
cromatografía de capa fina se utilizaron cromatofolios de gel de sílice de 0.2 mm
de espesor, con indicador de ultravioleta (F254).
Lámparas e instrumentación fotoquímica:
Las irradiaciones se han realizado en reactores de inmersión de Pyrex o
cuarzo empleando un cilindro de vidrio Pyrex o de cuarzo respectivamente como
7. Parte experimental
51
filtro y utilizando lámparas de mercurio de media presión de 125 o 400W de la
marca PhotochemicalReactors LTD (UK). A continuación se muestra una foto del
equipo utilizado, así como de su espectro de emisión:
Figura 7.1. Foto y esquema del reactor empleado en la irradiación.
Figura 7.2. Espectro de emisión de la lámpara de Hg.
Entrada de gas
Salida de gas
Entrada de refrigerante
refrigerafrigerante
Salida de refrigerante
Disolución muestra
Lámpara de Hg de
media presión
7. Parte experimental
52
7.2 Síntesis de aldehídos: parte antibiótica
La síntesis de los compuestos estudiados en este trabajo se puede dividir
en dos grandes bloques, en primer lugar se verá la síntesis de la parte antibiótica
que posteriormente se unirá a distintos interruptores (apartado 7.3).
En este apartado se pretende conseguir sintetizar los aldehídos de los
antibióticos seleccionados o de estructuras análogas de los mismos.
7.2.1 Síntesis del aldehído derivado del ciprofloxacino
Como se ha explicado en el capítulo 2, uno de los antibióticos
seleccionados es el ciprofloxacino. A partir de su estructura se desarrollado la
síntesis de un compuesto análogo.
El procedimiento general para la síntesis de este compuesto se muestra a
continuación:
7. Parte experimental
53
Figura 7.3. Ruta sintética seguida para la obtención del aldehído basado en la
estructura del ciprofloxacino.
En los siguientes párrafos se describen más detalladamente los pasos
necesarios para esta síntesis.
7. Parte experimental
54
Síntesis de 2:
En un schlenk bajo atmósfera de argon se añade 1 equivalente (15 mmol)
de acetal (1) y un equivalente de dietil-etoximetilenmalonato. La mezcla se agita
durante 1 hora a 80 °C. La reacción puede seguirse mediante CCF (2:1
hexano/acetato) hasta la total desaparición de ambos productos de partida.
Posteriormente se lleva a cabo una primera extracción con HCl 1M (50 ml) y
CH2Cl2 (50 ml), se recoge la fase orgánica y se realiza una segunda extracción con
NaCl saturado (50 ml). La fase orgánica se seca (MgSO4), se filtra y se elimina el
disolvente en el rotavapor.
Síntesis de 3:
Se calienta 2 a 270 oC durante 1 hora en difenil éter. Se precipita el
producto obtenido en hexano y se filtra en caliente. El sólido se filtra a vacío y
se lava con hexano.
Síntesis de 4:
Se disuelve el compuesto 3 en DMF (5 mmol) y se le añaden 2
equivalentes de K2CO3 (aq) y 10 equivalentes de MeI. Se agita la mezcla durante
24 horas a temperatura ambiente. Una vez transcurrido ese tiempo se eliminan
los disolventes en rotavapor. A continuación se disuelve el producto obtenido
en CH2Cl2 (50 ml) y se extrae con H2O (3x50 ml). Por último se seca la fase
orgánica (MgSO4), se filtra y se elimina el disolvente en el rotavapor.
Síntesis de 5:
La desprotección de 4 se lleva a cabo con HAcO (80%), la mezcla se agita
durante una hora a 70 oC. Posteriormente se elimina el ácido en el rotavapor.
7.2.2 Síntesis del aldehído derivado del ácido nalidíxico
El segundo antibiótico seleccionado es el ácido nalidíxico. En este caso se
ha mantenido intacta su estructura cambiando únicamente el grupo ácido por
un aldehído.
7. Parte experimental
55
El procedimiento general para la síntesis de este compuesto se muestra a
continuación:
Figura 7.4. Ruta sintética seguida para la obtención del aldehído derivado del ácido
nalidíxico.
7. Parte experimental
56
A continuación se detallan los pasos que se han seguido para llevar a cabo
la síntesis de dichos compuestos:
Síntesis de 7:
Se disuelve 1 equivalente (30 mmol) de terc-butil carbazato (6) en DMF a
0 oC, 1.1 equivalentes de K2CO3 y 1 equivalente de cloruro de p-toluensulfonilo.
La mezcla se agita durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción se puede
seguir por CCF (1:1 hexano/acetato) Rf = 0.61. Posteriormente el bruto de
reacción se diluye con acetato de etilo y se neutraliza con NH4Cl (aq) saturado.
Se recoge la fase orgánica y se extrae la fase acuosa con acetato de etilo (2x20
ml). Las fases orgánicas se juntan y se extraen con HCl 1M (1x10 ml) y NaCl
saturado (2x15 ml). Por último se seca la fase orgánica con MgSO4, se filtra y se
elimina el disolvente en rotavapor. El producto se puede purificar mediante
cromatografía de columna flash (4:1 hexano/acetato).
Síntesis de 9:
Se disuelve 1 equivalente (5 mmol) de ácido nalidíxico (8) en CH2Cl2 a
temperatura ambiente y se añade 1.1 equivalentes de TBTU, 0.18 equivalentes
de DMAP, 1.36 equivalentes de i-Pr2NEt y 0.91 equivalentes de TsNHNHBoc. La
reacción se puede seguir por CCF (1:1 hexano/acetato) Rf = 0.47. Tras 2 horas la
reacción se neutraliza con NH4Cl (aq) saturado. Se añaden 5 ml de H2O y 25 ml
de acetato y la fase acuosa se extrae con acetato (2x20 ml). Se juntan las fases
orgánicas y se extraen con NaCl saturado (2x10 ml). Por último se seca la fase
orgánica con MgSO4, se filtra y se elimina el disolvente en rotavapor. El producto
se puede purificar mediante cromatografía de columna (3:2 hexano/acetato).
Síntesis de 10:
La desprotección del carbamato se lleva a cabo disolviendo 9 en una
mezcla 1:1 TFA/CH2Cl2 a temperatura ambiente. La reacción se puede seguir por
CCF (1:1 hexano/acetato) Rf = 0.23. Tras 2 horas de agitación la reacción se
7. Parte experimental
57
neutraliza añadiendo K2CO3 (aq). El sólido obtenido se recoge por filtración a
vacío.
Síntesis de 11:
A una disolución de 1 equivalente (1.5 mmol) de 10 en 2.5 ml de tolueno
a temperatura ambiente se le añaden 3 equivalentes de TMS-imidazol y se agita
durante 5 minutos. Transcurrido este tiempo se le añaden 2 equivalentes de
imidazol y la mezcla se calienta a 55 oC. La reacción se puede seguir por CCF (1:1
hexano/acetato) Rf = 0.33. Tras 20 horas se añaden 20 equivalentes de ácido
cítrico 1M (aq) y se agita la mezcla durante 2 horas más a temperatura ambiente.
El bruto de reacción se diluye con 20 ml de acetato y se neutraliza con NaHCO3
saturado (aq). La fase acuosa se extrae con acetato (2x20 ml). Las fases orgánicas
se juntan y se extraen con NaCl saturado (aq). Por último se seca la fase orgánica
con MgSO4, se filtra y se elimina el disolvente en rotavapor. El producto se puede
purificar mediante cromatografía de columna (3:2 hexano/acetato).
7.3 Síntesis de interruptores moleculares
Una vez que hemos sintetizado los aldehídos derivados de los distintos
antibióticos el paso final es unirlos a un interruptor molecular. En este caso los
interruptores empleados son el basado en el cromóforo del fitocromo y el
basado en la estructura de la hidantoína.
7.3.1 Síntesis de interruptores basados en el cromóforo del fitocromo
A continuación se presenta la ruta utilizada para la formación del
interruptor molecular con el derivado del ciprofloxacino:
7. Parte experimental
58
Figura 7.5. Reacción de formación del interruptor molecular basado en el cromóforo
del fitocromo con el ciprofloxacino.
La reacción se describe más detalladamente a continuación:
Síntesis de 12:`
Bajo atmósfera de argon se añade 1 equivalente de aldehído (5) y 2
equivalentes de 3-etil-4metil-3-pirrolin-2-ona. Se disuelven en DMSO y se
añaden 4 equivalentes de KOH 4M (aq). La mezcla se agita durante 12 horas a
60 oC. A continuación se neutraliza la disolución obtenida utilizando HCl 37%. El
sólido obtenido se filtra a vacío y se lava con agua. El sólido obtenido puede ser
redisuelto en MeOH.
El cromóforo del fitocromo ha sido utilizado también para formar un
interruptor molecular mediante su unión con el aldehído derivado del ácido
nalidíxico. La reacción se muestra a continuación:
7. Parte experimental
59
Figura 7.6. Reacción de formación del interruptor molecular basado en el cromóforo
del fitocromo con el ácido nalidíxico.
La reacción se describe más detalladamente a continuación:
Síntesis de 13:
Bajo atmósfera de argon se añade 1 equivalente (1 mmol) de aldehído
(11) y 2 equivalentes de 3-etil-4metil-3-pirrolin-2-ona. Se disuelven en DMSO y
se añaden 4 equivalentes de KOH 4M (aq). La mezcla se agita durante 12 horas
a 60 oC. Transcurrido ese tiempo se deja enfriar la mezcla y se precipita el
producto añadiendo H2O. El sólido se filtra a vacío.
7.3.2 Síntesis de interruptores basados en la estructura de la hidantoína
Se ha construido un interruptor molecular basado en la estructura de la
hidantoína con el análogo del ciprofloxacino. En este caso la ruta seguida
requiere de más pasos que las vistas en el apartado anterior ya que en primer
lugar se lleva a cabo la síntesis del derivado de la hidantoína.
7. Parte experimental
60
Figura 7.7. Ruta sintética para la obtención del derivado de la hidantoína.
Los pasos de esta ruta sintética se describen más detalladamente a
continuación:
Síntesis de 15:
A 1 equivalente (44 mmol) de glioxal se le añade gota a gota trietilamina
hasta conseguir pH = 9 manteniendo la temperatura entre 25 y 35 oC. A
continuación se añade 1 equivalente de dimetilurea disuelto en H2O y se agita
durante 16 horas. Por último se evapora el disolvente en el rotavapor.
Síntesis de 16:
Se disuelven 3.7 equivalentes (42 mmol) de 15 en 12 ml de H2O y se añade
1 equivalente de H2SO4. Se calienta la mezcla a 95-100 oC durante 6 horas.
Transcurrido este tiempo se neutraliza la reacción añadiendo 2 equivalentes de
NaHCO3. A continuación se realizan extracciones sucesivas con acetato (4x20
7. Parte experimental
61
ml). Se juntan las fases orgánicas y se extraen con NaCl saturado. Por último se
seca la fase orgánica (MgSO4), se filtra y se elimina el disolvente en el rotavapor.
El último paso es llevar a cabo la formación del interruptor molecular
mediante la unión de la estructura derivada de la hidantoína y el aldehído
análogo del ciprofloxacino. La reacción se muestra a continuación:
Figura 7.8. Reacción de formación del interruptor molecular derivado de la estructura
de la hidantoína con el análogo del ciprofloxacino.
Síntesis de 17:
A 1 equivalente (1 mmol) de aldehído (5) se le añade una disolución de 1
equivalente de hidantoína metilada y 0.18 equivalentes de acetato de amonio
en ácido acético. La mezcla se agita a 120 oC durante 16 horas. Por último se
evapora el disolvente en el rotavapor. El producto se puede purificar mediante
cromatografía de columna (10:1 acetato/metanol).
7. Parte experimental
62
7.4 Caracterización de interruptores moleculares
Compuesto 12:
Fórmula molecular: C19H18N2O4
Peso molecular: 338,36 g/mol
Rendimiento: 50%
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 15.30 (s, 1H), 10.28 (s, 1H), 9.04 (s, 1H),
8.31 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.80 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 6.40 (s, 1H), 4.16 (s,
3H), 2.31 (c, J= 7.2 Hz, 2H), 2.14 (s, 3H), 1.04 (t, J= 7.5 Hz, 3H).
13C-RMN (100 MHz, DMSO-d6) δ ppm 177.21, 172.89, 166.13, 150.32, 141.67,
140.75, 140.71, 140.55, 133.87, 127.04, 125.74, 123.51, 117.89, 107.42, 105.89,
41.61, 16.33, 13.16, 9.38.
UV-Vis (MeOH): λ (nm) = 308 (ε=9600 M-1cm-1)
ES-MS (-) (C18H16N2O4 - H): 337,1198
Observaciones: Sólido amarillo
Compuesto 13:
Fórmula molecular: C19H21N3O2
Peso molecular: 323,39 g/mol
Rendimiento: 94%
1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ ppm 10.19 (s, 1H), 8.61 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 7.81 (s,
1H), 7.21 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 5.61 (s, 1H), 4.49 (q, J= 7.1 Hz, 2H), 2.66 (s, 3H), 2.37
(q, J= 7.5 Hz, 2H), 2.07 (s, 3H), 1.49 (t, J= 7.1 Hz, 3H), 1.11 (t, J= 7.5 Hz, 3H).
7. Parte experimental
63
13C-RMN (100 MHz, CDCl3) δ ppm 175.85, 170.99, 162.81, 147.93, 144.64,
139.58, 138.71, 136.94, 134.85, 120.76, 119.50, 119.14, 102.49, 46.32, 25.32,
17.23, 15.41, 13.63, 9.76.
UV-Vis (MeOH): λ (nm) = 364 (ε= 45968 M-1cm-1)
ES-MS (-) (C19H21N3O2 + H): 324,1707
Observaciones: Sólido amarillo
Compuesto 17:
Fórmula molecular: C19H19N3O5
Peso molecular: 369,38 g/mol
Rendimiento: 50%
1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ ppm 10.15 (s, 1H), 8.64 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 8.51 (s,
1H), 7.96 (d, J=1.3 Hz, 1H), 7.88 (dd, J= 8.1, 1.2 Hz, 1H), 4.36 (c, J= 7.1 Hz, 2H),
3.95 (s, 3H), 2.99 (s, 6H), 1.39 (t, J= 7.1 Hz, 3H).
13C-RMN (100 MHz, CDCl3) δ ppm 191.35, 173.88, 170.12, 165.32, 157.23,
150.80, 140.17, 138.87 , 132.55, 129.26, 125.85, 116.98, 111.98, 61.21, 51.94,
41.69, 29.83, 25.08, 14.57.
UV-Vis (CHCl3): λ (nm) = 263 (ε=23826 M-1cm-1), 314 (ε=10570 M-1cm-1)
ES-MS (-) (C19H19N3O5 + H): 370,1394
Observaciones: Sólido amarillo pálido
8. Anexo: Espectros RMN
de 1H y 13C
8. Anexo: Espectros de 1H y 13C
66
1
2-Z
8. Anexo: Espectros de 1H y 13C
67
COSY
NOESY
8. Anexo: Espectros de 1H y 13C
68
1
3-Z
8. Anexo: Espectros de 1H y 13C
69
COSY
NOESY
8. Anexo: Espectros de 1H y 13C
70
1
7-E
8. Anexo: Espectros de 1H y 13C
71
COSY
NOESY
