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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C. SISTEMAS VEGETALES PARA LA EXPRESIÓN DEL ECTODOMINIO MODIFICADO Y LA PROTEÍNA COMPLETA GP5 DEL VIRUS DEL SÍNDROME RESPIRATORIO Y REPRODUCTIVO PORCINO TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE MAESTRO EN CIENCÍA Y TECNOLOGÍA EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGÍA PRODUCTIVA PRESENTA QFB. AURORA XIHUITL HUERTA ROBLES GUADALAJARA, JAL. OCTUBRE 2013.
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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ASISTENCIA EN TECNOLOGÍA Y DISEÑO DEL ESTADO DE JALISCO, A. C.
SISTEMAS VEGETALES PARA LA EXPRESIÓN DEL
ECTODOMINIO MODIFICADO Y LA PROTEÍNA
COMPLETA GP5 DEL VIRUS DEL SÍNDROME
RESPIRATORIO Y REPRODUCTIVO PORCINO
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO
ACADÉMICO DE
MAESTRO EN CIENCÍA Y
TECNOLOGÍA EN LA
ESPECIALIDAD DE
BIOTECNOLOGÍA PRODUCTIVA
PRESENTA
QFB. AURORA XIHUITL HUERTA ROBLES
GUADALAJARA, JAL. OCTUBRE 2013.
2
A mi mamá, por su dedicación y
total entrega a mi persona, por ser
mi más grande motivación y por su
inmenso amor.
A mi papá, por su incondicional
apoyo, y por convertirse en mi
modelo a seguir y fuente de
inspiración.
A mis queridas hermanas, Minerva,
Diana y Elena, por ser mi
motivación, mi ejemplo y mis
consejeras.
A Emmanuel, por darle armonía a
mis días, por ser mi sostén y por
estar siempre a mi lado.
A Adriana, por ser siempre quién
me pone los pies en la tierra.
4
Guadalajara, Jalisco, a 28 octubre de 2013
CONSEJO GENERAL DEL POSGRADO
INTERISTITUCIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA
PRESENTE
Los abajo firmantes, miembros del Jurado de Examen del estudiante Aurora Xihuitl
Huerta Robles, una vez leída y revisada la Tesis titulada “SISTEMAS VEGETALES
PARA LA EXPRESIÓN DEL ECTODOMINIO MODIFICADO Y LA
PROTEÍNA COMPLETA GP5 DEL VIRUS DEL SÍNDROME RESPIRATORIO
Y REPRODUCTIVO PORCINO”, aceptamos que la referida tesis revisada y
corregida sea presentada por el alumno para aspirar al grado de Maestro en Ciencia y
Tecnología en la opción terminal de Biotecnología Productiva durante el Examen de
Grado correspondiente.
Y para que así conste firmamos la presente a los veintiocho días del mes de octubre del
año dos mil trece.
Dra. Erika Nahomy Marino Marmolejo Dra. Patricia Dupré
Presidente Secretario
Dr. Abel Gutierréz Ortega
Vocal
5
Agradezco a CONACyT por él financiamiento de mis estudios y la beca otorgada (No.
de beca: 235716 ) para el desarrollo de este proyecto en el periodo Septiembre 2009 –
Agosto 2011.
El proyecto “Presentación de antígenos en partículas tipo virus obtenidas de células en
suspensión de tabaco para el desarrollo de vacunas” del cual deriva este trabajo, fue
financiado por el Fondo Sectorial SEP-CONACyT de Investigación Básica 2007 (No.
de proyecto: 83863).
6
ÍNDICE DEL CONTENIDO
1.#ANTECEDENTES#..............................................................................................................#12!
1.1! Virus#del#Síndrome#Respiratorio#y#Reproductivo#Porcino#....................#12!
1.1.1!Epidemiología!....................................................................................................................!12!
1.1.2!Genoma!.................................................................................................................................!13!
1.1.3!Glicoproteína!GP5!............................................................................................................!13!
1.1.4!Vacunas!contra!el!PRRSV!..............................................................................................!14!
1.2#Vacunas#de#nueva#generación#.............................................................................#14!
1.2.1!Vacunas!recombinantes!de!subunidades!..............................................................!14!
1.2.2!Vacunas!de!nueva!generación!como!alternativa!para!el!PRRSV!..................!15!
1.2.3!Adyuvantes!basados!en!partículas!tipo!virus!......................................................!16!
1.3#Producción#de#proteínas#de#interés#en#modelos#vegetales#.......................#17!
1.3.1!Sistemas!de!expresión!de!proteínas!recombinantes!en!plantas!
transgénicas!...................................................................................................................................!18!1.3.1.1!Vectores!virales!.........................................................................................................................................!19!a)#Vectores#de#primera#generación!......................................................................................................!19!b)#Vectores#de#segunda#generación!.....................................................................................................!21!
2.#JUSTIFICACIÓN#................................................................................................................#23!
3.#OBJETIVOS#........................................................................................................................#24!
3.1#Objetivo#general#......................................................................................................#24!
3.2#Objetivos#particulares#...........................................................................................#24!
5.#MATERIALES#....................................................................................................................#25!
5.1#Material#Biológico#...................................................................................................#25!
5.2#Vectores#......................................................................................................................#26!
Tabla#2.#Descripción!de!vectores!utilizados#...............................................................#26!
5.3#Reactivos#y#kits#.........................................................................................................#27!
6.#MÉTODOS#..........................................................................................................................#28!
6.1#Diseño#y#optimización#de#genes#sintéticos#de#GP5#......................................#28!
6.2#Diseño#de#genes#modificados#del#antígeno#GP5MLV#......................................#29!
6.3#Construcción#de#los#plásmidos#de#expresión#en#plantas#para#
trasformación#estable#...................................................................................................#31!
6.3.1!Clonación!de!genes!sintéticos!en!el!cassette!de!expresión!pcass35S!........!31!
7
6.3.2!Subclonación!del!cassette!de!expresión!pcass35S!en!el!!plásmido!binario!
pCambia2300!................................................................................................................................!33!
6.4Construcción#de#módulos#3´#para#la#expresión#transitoria#en#plantas#..#34!
6.4.1!Clonación!de!genes!en!el!plásmido!pICH11599!..................................................!34!6.4.1.1!Clonación!de!genes!sintéticos!de!GP5t!............................................................................................!34!
6.4.2!Clonación!de!genes!en!el!plásmido!pICH31070!con!la!técnica!de!Golden+
gate!....................................................................................................................................................!34!6.4.2.1!Diseño!de!oligonucleótidos!para!la!clonación!de!genes!sintéticos!de!GP5t!....................!36!6.4.2.2!Clonación!de!genes!modificados!de!GP5MLV!..................................................................................!36!6.4.2.3!Modificación!y!clonación!de!GFP!.......................................................................................................!37!
6.5#Transformación#de#explantes#de#Nicotiana*tabacum,#para#la#expresión#
estable#de#la#proteína#GP5t#.........................................................................................#37!
6.5.1!Germinación!de!semillas!de!N./tabacum!................................................................!37!
6.5.2!Transformación!de!células!de!Agrobacterium/tumefaciens!LBA4404!.......!37!
6.5.3!Transformación!estable!mediada!por!A./tumefaciens!......................................!38!
6.5.4!Escrutinio!y!análisis!de!plantas!transformantes!................................................!39!
6.6Transformación#de#plantas#de#N.*benthamiana*y*N.*tabacum*para#la#
expresión#transitoria#de#las#proteínas#GP5t,#GP5MLV#y#GFP#.............................#39!
6.6.1!Germinación!de!semillas!de!N./benthamiana/y/N./tabacum!...........................!39!
6.6.2!Transformación!de!células!de!Agrobacterium/tumefaciens!GV3101!.........!39!
6.6.3!Ensayos!de!infiltración!de!plantas!completas!con!A./tumefaciens!..............!40!6.6.4Análisis!de!GFP!en!N./tabacum!................................................................................................................!41!
6.6.5!Extracción!de!proteínas!................................................................................................!41!6.6.6!SDS+PAGE!y!Western/blot!..........................................................................................................................!42!
7.#RESULTADOS#...................................................................................................................#42!
7.1.#Clonación#de#plásmidos#de#expresión#estable#en#plantas#........................#42!
7.1.2!Clonación!del!cassette!de!expresión!pcass35S!....................................................!42!
7.1.3!Clonación!en!el!!plásmido!binario!pCambia2300!!para!la!expresión!
estable!del!gen!GP5t!...................................................................................................................!44!
7.2#Clonación#en#plásmidos#que#contienen#el#módulo#3’#para#la#
transformación#transitoria#de#plantas#....................................................................#46!
7.2.1!Clonación!de!plásmidos!para!la!expresión!de!genes,!a!partir!del!proX
vector!viral!pICH11599!............................................................................................................!46!
8
7.2.2!Clonación!de!plásmidos!para!la!expresión!de!genes,!a!partir!del!proX
vector!viral!pICH31070!............................................................................................................!47!7.2.2.1!Clonación!de!genes!sintéticos!de!GP5t!............................................................................................!47!7.2.2.2!Clonación!de!genes!modificados!de!GP5MLV!..................................................................................!48!7.2.2.3!Clonación!del!gen!modificado!de!GFPXHis!.....................................................................................!50!
7.3#Obtención#de#plantas#transgénicas#de#N.*tabacum#.......................................#52!
7.3.1!Escrutinio!de!plantas!transgénicas!de!N./tabacum!por!ELISA!......................!52!
7.3.2!Expresión!estable!de!las!versiones!GP5tXCysXHis!y!HisXCysXGp5t!en!N./
tabacum!...........................................................................................................................................!53!
7.4#Expresión#transitoria#en#plantas#de#Nicotiana#..............................................#53!
7.4.1!!Cinética!de!expresión!transitoria!de!GFP!con!el!plásmido!pICH7410!en!N./
benthamiana!..................................................................................................................................!53!
7.4.2!Cinética!de!expresión!transitoria!de!GFPXHis!con!del!plásmido!
pICH31070!en!N./benthamiana!.............................................................................................!54!
7.4.3!Expresión!transitoria!de!GP5tXCysXHis!!y!GP5MLVXCysXHis!en!el!plásmido!
pICH31070!en!N./benthamiana!.............................................................................................!55!
7.4.4!Expresión!de!GFP!en/N./tabacum/con!le!plásmido!pICH7410!.......................!55!
7.4.5!Expresión!de!GP5tXCysXHis!a!partir!del!plásmido!pICH11599!en!N./
tabacum!...........................................................................................................................................!56!
8.#DISCUSIÓN#........................................................................................................................#56!
9.#CONCLUSIONES#...............................................................................................................#60!
10.#PERSPECTIVAS#.............................................................................................................#60!
11.#BIBLIOGRAFÍA#..............................................................................................................#61!
12.#ANEXOS#...........................................................................................................................#67!
12.1#Memoria#en#extenso.##3er#Congreso#Internacional#de#Biología,#Química#
y#Agronomía#(2011).#.....................................................................................................#67!
12.2#Reconocimiento#.....................................................................................................#75!
13.#APÉNDICES#.....................................................................................................................#76!
13.1#Oligonucleótidos#empleados#para#etiquetar##las#diferentes#versiones#
de#la##proteína#GP5MLV#...................................................................................................#76!
13.2#Oligonucleótidos#empleados#para#etiquetar##las#diferentes#versiones#
de#la##proteína#GP5t#y#clonar#en##el#plásmido#pICH31070#................................#77!
9
13.3#Composición#de#medios#de#cultivo#para#bacterias#....................................#77!
13.4##Composición#de#medios#de#cultivo#para#plantas#.......................................#78!
ÍNDICE DE TABLAS
TABLA PÁGINA
1 Listado de material biológico 25
2 Descripción de vectores utilizados 26
3 Listado de reactivos y kits comerciales 27
4 Combinación de oligonucleótidos para PCRs secuenciales 30
5 Programa para PCRs secuenciales 30
6 Oligonucleótidos para la inserción de sitios BsaI en genes sintéticos
36
7 Protocolo de transformación de discos de hoja de N. tabacum para expresión estable
38
8 Resistencia a antibióticos de cada plásmido de expresión transitoria
39
9 Protocolo de infiltración de plantas completas de tabaco para expresión transitoria de proteínas heterólogas
40
10 Diseño de los experimentos de infiltración de plantas completas 41
11 Tamaño de los genes sintéticos 43
12 Relación de muestras positivas a NPTII 53
10
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA PÁGINA 1 a. Representación esquemática del PRRSV. b. Epítopos localizados en la
proteína GP5. 13
2 Técnicas de exposición de antígenos heterólogos en la superficie de PTVs
17
3 Representación de la infección y diseminación de vectores virales de primera generación
20
4 Descripción esquemática del ensamblaje de los vectores virales modulares
22
5 Secuencia de aminoácidos del ORF5 del PRRSV.
28
6 Genes sintéticos del antígeno GP5t
29
7 Mapa de restricción del vector de clonación pUC57 29
8 Genes modificados del antígeno GP5MLV
30
9 Mapa de restricción del plásmido pCass35S
32
10 Mapa de restricción del plásmido pCAMBIA2300
33
11 Esquema del T-ADN del plásmido pICH11599 34 12 Esquema del T-ADN del plásmido pICH31070 35
13 Secuencia nucleotídica de GP5t, flanqueada con los sitios BsaI
35
14 Escisión de genes de pUC57
43
15 Linearización del plásmido pCass35S
43
16 Perfil enzimático EcoRI/XhoI de p35SGp5CysHis
44
17 Esquema del T-DNA de expresión estable
45
18 Perfil de restricción con HindIII/EcoRI de p35SHisCysGp5, p35SGp5His y p35SHisGp5
45
19 Perfil de restricción EcoRI/PstI de pGp5CysHis-2300, pHisCysGp5-2300, pGp5His-2300 y pHisGp5-2300.
46
11
20 Perfil enzimático KpnI/SacI, de genes sintéticos, clonados en pICH11599
46
21 Productos de la PCR de adición de sitios BsaI en los genes de las diferentes versiones de GP5t
47
22 Primera etapa de las reacciones de PCR secuenciales para la modificación del gen GP5MLV
48
23 Fragmentos amplificados en la segunda etapa de las PCRs secuenciales para la modificación del gen GP5MLV
49
24 Confirmación de la amplificación del gen GP5MLV-Cys-His
49
25 Perfil enzimático KpnI/SstI del plásmido pICH31070 con los genes GP5MLV
50
26 Gradiente de Tm para la amplificación de GFP-His
51
27 Perfil enzimático KpnI/SstI de la construcción pICHGFP-His
51
28 a.Desarrollo de brotes en medio selectivo b. Selección de plántulas c.Planta transgénica de tabaco
52
29 Cinética de expresión de GFP en plantas de tabaco co-infiltradas con los módulos pICH2011,pICH14011 y pICH7410
53
30 Cinética de expresión de GFP-His en plantas de tabaco co-infiltradas con los módulos pICH2011,pICH14011 y pICHGFP-His
54
31 Expresión transitoria de GFP en hojas de N. tabacum 55 32
Ensayo de western-blot del tejido vegetal infiltrado con el plásmido pICH-GP5t-Cys-His
56
12
1. ANTECEDENTES
1.1 Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino El Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (PRRSV, por sus siglas en
inglés) es una de las principales amenazas para la industria porcícola en México y
alrededor del mundo. Es el agente causal del Síndrome Respiratorio y Reproductivo
Porcino, caracterizado por fallo respiratorio grave y abortos en cerdas gestantes
(Charerntantanakul et al., 2006). El PRRSV figura en la lista de enfermedades de
notificación obligatoria de la Organización Mundial de Sanidad Animal y en México ha
sido catalogado como la segunda causa de muerte en cerdos (Díaz, 2007).
El PRRSV pertenece al género Arterivirus y a la familia Arteriviridae. Fue reportado en
1987 en los Estados Unidos de América y en Europa en 1990; desde entonces, se ha
extendido rápidamente en la mayoría de los países productores de cerdo en el mundo
(Mardassi et al., 1994).
Se ha reportado una importante variabilidad genética y antigénica en el virus,
clasificándose, en dos genotipos: europeo y americano, que presentan una similitud del
55 al 70% en su genoma (Flores y Hernández., 2010), lo que complica el desarrollo de
una respuesta inmune efectiva entre cepas heterólogas ante una reinfección. Cerdos
vacunados con vacunas atenuadas de las cepas americanas NADC-8, 9 y 14 fueron
expuestos a las mismas cepas en su forma virulenta, y sólo los cerdos que fueron
expuestos a la misma cepa con la que se inmunizaron, lograron evitar la viremia (Mateu
et al., 2008).
1.1.1 Epidemiología
Se sabe que el virus puede ser transmitido por saliva, semen, orina, leche y que
atraviesa la barrera placentaria. Su periodo de incubación es de 3 a 37 días y, aún
después del cuadro infeccioso, el virus puede permanecer hasta 150 días en tejido
linfático (López y Osorio., 2004). Se replica en células del sistema mononuclear
fagocítico, principalmente, macrófagos alveolares y células dendríticas (Mardassiet al.,
1994), y luego se desencadena a nivel sistémico, una viremia prolongada, que se
manifiesta clínicamente en falla reproductiva e inflamación pulmonar (Suarez et al.,
1995).
13
1.1.2 Genoma
El PRRSV es un virus de ARN de cadena positiva lineal, de aproximadamente 15 kb.
Su genoma es policistrónico, con una estructura de caperuza en el extremo 5´, una
región corta no traducible (UTR, por sus siglas en inglés), seguida de nueve marcos de
lectura abierta (ORF, por sus siglas en inglés), 1a, 1b, y del 2 al 7 y, con una cola de
poli-adenina en el extremo 3´ (Suarez et al., 1995).
Los ORF 1a y 1b, ocupan dos tercios del genoma en su extremo 5´y codifican proteínas
no estructurales, involucradas en la replicación. El resto de los ORF codifican diferentes
glicoproteínas, GP2a, GP2b, GP3, GP4 y GP5, la proteína de matriz M, y la proteína de
la nucleocápside, por los ORF 6 y 7, respectivamente. Las proteínas GP5, M y N son las
tres proteínas estructurales más importantes (Ostrowski et al., 2002).
1.1.3 Glicoproteína GP5
Aunque la respuesta inmune para cada cepa del PRRSV es diferente, se ha definido a la
proteína GP5 como la más importante, debido a que es la principal inductora de la
producción de anticuerpos neutralizantes (AN). Es de aproximadamente 26 kDa,
glicosilada, y se encuentra asociada a la membrana formando heterodímeros con la
proteína M, mediante enlaces disulfuro (Dea et al., 2000).Se ha identificado un péptido
señal N-terminal, seguido de dos dominios de importancia antigénica, uno localizado
dentro del ectodominio N-terminal (27-41 aminoácidos, aa) y el otro en el dominio C-
terminal (130 a 200 aa). En la Figura 1a se muestra un esquema de la localización de
GP5 en la membrana del virus, y en la Figura 1b se indica la organización de los ORFs
en el genoma, así como los epítopos no-neutralizantes y neutralizantes codificados en el
ORF 5; además se indica con * los sitios de N-glicosilación (Plagemann et al., 2002).
Figura 1a. Representación esquemática del PRRSV. b. Epítopos localizados en la
proteína GP5 (según Plagemann et al 2002).
14
1.1.4 Vacunas contra el PRRSV
La vacuna más utilizada contra el PRRSV utiliza virus vivo modificado (MLV, por sus
siglas en inglés), atenuado por pasaje múltiple en cultivo celular. En el caso del
PRRSV, las vacunas atenuadas son más eficientes que las inactivadas debido a que
inducen mayor respuesta celular y humoral (Flores y Hernández., 2010). Sin embargo,
está claro que la vacuna no previene la reinfección contra cepas homólogas, sólo
disminuye los signos de la enfermedad. Frente a cepas heterólogas, es la misma
situación, pero, la protección es menor. Un problema importante relacionado con la
seguridad de esta vacuna, es el hecho de que en algunos casos, los virus atenuados
pueden revertirse a virulencia y ocasionar la propagación del virus en la población
porcina (Botner et al., 1997).
Por otro lado, las vacunas inactivadas, superan el problema de reversión que presentan
las vacunas atenuadas, debido a que utilizan virus muerto. Aunque, específicamente,
para el PRRSV, las vacunas inactivadas de cepas americanas no son capaces de inducir
una respuesta humoral (Revisado en Flores y Hernández., 2010). Cabe señalar que
Charerntantanakul et al (2006), utilizaron vacunas atenuadas y evaluaron la respuesta
inmune a péptidos del ORF5 de varias cepas, por la importancia de la GP5 en la
inducción de AN y observaron un ligero aumento en la respuesta celular, sin incremento
de la producción de anticuerpos.
Hasta ahora, no se ha encontrado un adyuvante o estrategia adecuada para promover la
prevención de la infección por el PRRSV; por lo tanto, es necesaria una nueva
generación de vacunas con mayor seguridad y eficacia protectora para controlar el
PRRS.
1.2 Vacunas de nueva generación
1.2.1 Vacunas recombinantes de subunidades
Consiste en uno o más epítopos antigénicos o proteínas obtenidas a partir de
microorganismos modificados genéticamente. En las que la proteína de interés es
purificada antes de su administración, de modo que no queda ningún agente infeccioso,
y poco o nada de proteína o ADN procedente del vector en la preparación final.
Cultivos de células de mamíferos, de levaduras e insectos han sido usados para producir
vacunas de subunidades debido a su habilidad para procesar proteínas recombinantes de
una manera similar al organismo nativo (Rigano et al., 2005).
15
1.2.2 Vacunas de nueva generación como alternativa para el PRRSV
Se han evaluado varios sistemas de expresión de antígenos de PRRSV, incluyendo
bacterias (Jiang Y et al., 2007, Bastos et al., 2002), baculovirus (Zhisheng et al., 2011),
vacunas de ADN (Jiang Yet al., 2006), adenovirus (Jiang W et al., 2006), y el sistema
del virus de Ankara (Zheng et al., 2007), en busca de una alternativa para mejorar la
respuesta inmune contra el PRRSV o para utilizarse como vacunas.
Una alternativa para mejorar las vacunas de ADN contra el PRRSV es el procesamiento
y presentación de antígenos a través de la conjugación de la ubiquitina con la GP5 en un
plásmido. En este caso la proteína expresada junto a la ubiquitina se dirigió al
proteosoma para ser degradada, con lo que se favorece el procesamiento y presentación,
pues los antígenos degradados por esta vía facilitan su presentación en el complejo
mayor de histocompatibilidad I (MHC I, por sus siglas en inglés), y permiten la
respuesta celular. Hou et al. (2008) determinaron la respuesta inmune de cerdos
vacunados con un plásmido que expresaba la GP5 conjugada a ubiquitina porcina. Se
observó un aumento en la expresión de IFN-γ y disminución de la carga viral en sangre.
Sin embargo la respuesta de anticuerpos fue nula, probablemente debido a la rápida
degradación intracelular de la proteína ubiquitina-GP5, sin dejar un nivel de proteína
suficiente para la interacción con linfocitos B.
Recientemente, se ha evaluado la inmunogenicidad de la proteína GP5 expresada en
plantas de tabaco (Chia et al., 2010), administrado vía oral a los cerdos, para su
protección contra la infección por el PRRSV. Los cerdos fueron alimentados 4 veces,
con un intervalo de 14 días cada vez, con el 5% de hojas de tabaco con un contenido de
0.011% de GP5 respecto a la proteína total soluble, desarrollando anticuerpos
neutralizantes con títulos de 1:4-1:8 después de la 4ª vacunación, alrededor de 48 días
después de la vacunación oral. El mismo grupo de investigación (Chia et al., 2011)
desarrolló una fusión de la proteína GP5 y la subunidad B de la entero-toxina termolábil
de E. coli (LTB, por sus siglas en inglés), la cual actuaría como adyuvante para co-
administración de antígenos, reconocida por su potencial como adyuvante en mucosas.
Sin embargo, no hubo diferencia significativa entre la respuesta inmune que presentaron
los cerdos que fueron inmunizados con la fusión de GP5-LTB y los que se inmunizaron
con GP5.
16
1.2.3 Adyuvantes basados en partículas tipo virus
Las partículas tipo virus (PTVs) son partículas que morfológica y antigénicamente se
parecen a un virus, compuestas de una sola proteína con capacidad de autoensamblarse.
Debido a que las PTVs no son infecciosas y no tienen la capacidad de replicarse,
representan una alternativa segura a las vacunas de virus atenuados (Ludwin et al.,
2007). Tienen una estructura muy ordenada y es repetitiva, lo que facilita su
reconocimiento por el sistema inmune innato y adaptativo, así como la producción
sostenida de anticuerpos como consecuencia de la activación eficiente de células B
(Bachmann et al., 1993). También hay inducción de la respuesta inmune celular,
mediante el transporte de partículas al citosol, donde los antígenos son procesados y
presentados al MHC I (Kovacsovics et al., 1993).
Para emplear las PTVs como adyuvantes, es necesario incorporar o acoplar las
secuencias proteicas, que funcionarían como antígenos. En la Figura 2 se resumen las
principales técnicas para exponer antígenos heterólogos sobre la superficie de las
estructuras del virus. En el caso de la conjugación química (a), las PTVs preformadas se
modifican con una molécula de unión, tal como biotina, o un agente de entre-
cruzamiento químico. Estas partículas se hacen reaccionar luego con el antígeno diana.
Esta técnica es muy flexible, lo que permite la conjugación de diversos tamaños y tipos
de antígenos a las PTVs. La inserción genética de epítopos de péptidos (b), depende de
la capacidad de insertar secuencias de péptidos en las proteínas estructurales virales,
tales que las inserciones están expuestas en la superficie de la partícula del virus y no
interfieren con la capacidad de la proteína estructural de plegar correctamente y
ensamblar las PTVs.
17
Figura 2. Técnicas de exposición de antígenos heterólogos en la superficie de PTVs
(Vaccinology: Principles and Practice 2012)
Los intentos de la creación de nuevos productos basados en la fusión de proteínas hasta
ahora han tenido un éxito limitado (Werner et al., 2006), debido a una gran desventaja
de esta estrategia, relacionada con el tamaño de las secuencias de aminoácidos que se
pueden incorporar, que lo general no superan los 20 aminoácidos. Esto se convierte en
una gran limitante para la inserción de epítopos conformacionales, que podrían ser
inductores de respuestas inmunes adecuadas en ciertos casos, así como en los casos
donde existe más de un epítopo de importancia para la obtención de una protección alta.
En cuanto a la conjugación química, es posible utilizar los residuos reactivos ya
presentes en las proteínas, o bien, incorporarlos mediante ingeniería genética para lograr
una conjugación más eficiente (Smith et al., 2006). Un ejemplo es el HBcAg, que se
conjuga para formar partículas, y ha sido utilizado como prototipo de PTVs, el cual fue
modificado para contener una lisina en la región inmunodominante más expuesta, así
como péptidos y proteínas modificados para contener cisteínas libres, y ser conjugados
químicamente. Tales PTVs decoradas con los antígenos indujeron una potente y larga
respuesta inmune contra los epítopos en ausencia de adyuvantes (Jegerlehner et al.,
2002)
1.3 Producción de proteínas de interés en modelos vegetales La hormona de crecimiento humana fue la primera proteína terapéutica producida en un
sistema vegetal. A partir de entonces, un gran número de proteínas con aplicaciones
18
terapéuticas han sido producidas en distintos sistemas vegetales y actualmente están
siendo evaluadas en ensayos clínicos (Basaran y Rodríguez, 2008).
Los mecanismos de síntesis y secreción de proteínas y las modificaciones post-
traduccionales en plantas son similares a los de las otras células eucariotas y permiten la
producción y ensamblado de proteínas multiméricas como por ejemplo, anticuerpos.
Estas características, otorgan a las plantas el potencial para la producción de proteínas
recombinantes a escala comercial. Algunos anticuerpos monoclonales producidos en
plantas están siendo actualmente evaluados en ensayos clínicos (Abdollahi et al., 2006).
Nicotiana tabacum ha sido usada ampliamente como sistema de expresión modelo para
generar plantas transgénicas de manera estable, pero se han usado otras plantas,
incluyendo Nicotiana benthamiana y Arabidopsis thaliana, debido a su fácil
transformación y regeneración (Giddings G., 2001). Una gran ventaja de las plantas
transgénicas es el bajo costo al producirlas a gran escala. Kusnadi y col., (1998) han
estimado que el costo de producción de proteínas recombinantes en plantas podría ser
de 10 a 50 veces más bajo que produciendo la misma proteína por fermentación de E.
coli, dependiendo del cultivo.
1.3.1 Sistemas de expresión de proteínas recombinantes en plantas transgénicas
Las proteínas producidas en plantas pueden ser expresadas de forma transitoria o
estable. La expresión transitoria puede ser utilizada para verificar la expresión de la
construcción y producir pequeñas cantidades del producto para análisis funcionales.
Aun así, la expresión transitoria por Agroinfiltración en hojas de tabaco puede ser
utilizada para producir grandes cantidades de proteína (mg de anticuerpos
recombinantes en días o semanas) (Rigano y Walmsley., 2005) . Los virus que infectan
plantas también han sido usados para producir proteínas farmacéuticas incluyendo
anticuerpos y vacunas de subunidades. La ventaja de éstos, al igual que la
Agroinfiltración, es que se puede obtener la proteína recombinante de una manera
rápida, pero también hay desventajas, por ejemplo, en la Agroinfiltración hay una baja
capacidad de escalamiento y con los vectores virales hay preocupaciones en cuanto a su
contención. Se han desarrollado tres procedimientos posibles para expresar proteínas en
plantas: a) transformación estable del genoma nuclear de la planta; b) transformación
estable del genoma plastídico de la planta; y c) expresión transitoria mediante vectores
virales.
19
En las estrategias que involucran transformación estable, una construcción que acarrea
el gen de interés se integra en el genoma, y de esta manera, el nuevo gen es heredado a
través de las generaciones y las plantas transgénicas obtenidas pueden ser multiplicadas
para la producción de la proteína de interés. Sin embargo, la obtención de plantas
transgénicas tiene algunas desventajas. La obtención de líneas transgénicas es un
procedimiento que insume mucho tiempo. Otra desventaja del uso de plantas
modificadas genéticamente para la producción de proteínas de interés, reside en que
muchas veces la transformación nuclear origina bajos niveles de expresión,
principalmente debido a efectos posicionales sobre la expresión del transgén o al
silenciamiento.
1.3.1.1 Vectores virales
En los sistemas de expresión transitoria, el gen de interés es integrado a un genoma
viral, y el virus así modificado es utilizado como vector para infectar plantas. Una vez
en la célula vegetal, el genoma viral se replica en el citoplasma, dando como resultado
altos niveles de expresión de la proteína de interés. Además del alto nivel de expresión,
otras ventajas adicionales de los vectores virales son que resultan relativamente fáciles
de manipular mediante ingeniería genética y que la infección de plantas con un virus
recombinante es mucho más sencilla que la generación de plantas transgénicas.
El primer vector viral desarrollado utilizó como base al CaMV. El genoma de este virus
es ADN dc, pero presenta la desventaja de su limitada capacidad de encapsidación de
material genético. Además, algunas modificaciones en su secuencia genómica afectan
su funcionalidad como sistema de expresión (Fütterer et al., 1989).
a) Vectores de primera generación
Los vectores de primera generación son virus funcionales, que contienen todos sus
genes, a los que se les inserta el gen de interés, y son capaces de causar infección
sistémica en las plantas, debido a que mantienen todas las funciones virales normales.
Su inoculación se puede hacer mecánicamente mediante viriones maduros o copias
infectivas del genoma viral, o mediante infiltración del tejido vegetal con una cepa de
Agrobacterium tumefaciens transformada con la construcción de interés (Figura 3).
Esta última técnica es conocida como “agroinfiltración”. A partir del punto inicial de
infección, las partículas virales que acarrean el gen de interés se esparcen a través de la
planta para provocar una infección sistémica, asegurando así altos niveles de expresión.
20
En los vectores virales de primera generación la inserción del gen de interés no debe
interferir con la expresión de las funciones virales, dado que todas ellas son requeridas
para una infección exitosa.
Las proteínas recombinantes producidas a partir de vectores de primera generación
pueden expresarse a partir de un promotor independiente fuerte, o como fusiones a la
proteína de la cápside viral. En el primer caso, se produce proteína heteróloga soluble,
que puede ser extraída y purificada en forma similar a lo que ocurre con las proteínas
producidas en plantas transgénicas.
En el caso de proteínas de fusión, las partículas virales quiméricas son purificadas a
partir del tejido infectado y utilizadas como tales o como fuente de proteína
recombinante. Si la secuencia aminoacídica fusionada es un epítopo que será utilizado
como antígeno, la presentación de la misma en la superficie de la partícula viral pueden
utilizarse para incrementar una respuesta inmune específica.
Figura 3. Representación de la infección y diseminación de vectores virales de primera
generación. Adaptado de Gleba et al., 2007.
Los vectores de inserción han sido utilizados para expresar numerosos antígenos. Sin
embargo, una de sus mayores limitaciones tiene que ver con el tamaño de la secuencia
que se desea expresar, sin afectar la estabilidad de la partícula viral.
21
Los vectores de fusión no tienen la restricción del tamaño de la secuencia, pero la
proteína de fusión debe ser compatible con el correcto ensamblado del virus. Los
resultados de algunos trabajos, indican que, sólo epítopos pequeños (menos de 25
aminoácidos) pueden ser exitosamente expresados como proteínas de fusión a la cápside
(Durrani et al., 1998; Lico et al., 2006; Cerovská et al., 2008)
b) Vectores de segunda generación
Los vectores de segunda generación fueron diseñados con el fin de superar los
problemas de producción de viriones funcionales y el riesgo de la propagación hacia
otras plantas, asociados a los de primera generación. En lugar de poseer un genoma
viral completo, utilizan sólo las secuencias indispensables para replicarse (vectores
modulares), donde, los genes virales no esenciales son sustituidos por el gen de interés,
lo que evita que el virus genere una infección sistémica.
Icon Genetics, una compañía alemana de biotecnología vegetal, ha desarrollado una
plataforma de expresión de nueva generación, que utiliza al máximo las ventajas de los
“virus desarmados”, y además aborda la mayoría de las deficiencias de las tecnologías
actuales. El proceso denominado “magnifection”, es simple y totalmente escalable para
la expresión de proteínas heterólogas en plantas, sin necesidad de la transformación
genética estable de una planta, pero que requiere de una amplificación transitoria de
vectores virales, liberados a múltiples áreas de la planta por A. tumefaciens (Figura 4).
En este proceso, un cultivo líquido de las bacterias que alojan los ADNs de
transferencia (T-ADNs), que codifican los replicones de ARN, es infiltrado en las
plantas completas, mediante vacío, causando en principio la infección primaria y luego
la infección sistémica, a través de las bacterias, superando la necesidad de utilizar
vectores capaces de movilizarse por sí mismos, mientras que el vector viral provoca la
propagación célula-célula, la amplificación y los altos niveles de expresión.
Estos componentes son ensamblados dentro de la célula vegetal, con la ayuda de una
recombinasa sitio-específica. El ADN resultante se transcribe y se empalma, eliminando
de esta manera los elementos no deseados, tales como los sitios de recombinación, y se
crea una secuencia gen-vector perfecta en un replicón infectivo totalmente funcional.
Dependiendo de la proteína de interés, este sistema podría producir hasta 0,5-5 g de
proteína recombinantes por kg de biomasa de hojas. El tiempo de expresión ronda los 6-
22
10 días. Hasta el momento, el vector más exitoso desarrollado para implementar esta
estrategia es un vector basado en el virus TMV (Virus del Mosaico del Tabaco, por sus
siglas en inglés) que expresa la proteína de interés a partir del promotor subgenómico de
la cápside (Marillonnet et al., 2004).
Figura 4. Descripción esquemática del ensamblaje de los vectores virales modulares.
Adaptado de Marillonnet et al., 2004.Act2, promotor de actina de Arabidopsi; AttP y AttB,
sitios de recombinación de la integrasa de PhiC31; INT, integrasa del fago PhiC31 de
Streptomyces; LB y RB, bordes izquierdo y derecho de la región del T-ADN; MP, proteína de
movimiento; nos, terminador de la nopalina sintasa; 3´-NTR, región no traducible; P-hsp,
promotor de la proteína de shock térmico de Arabidopsis; RdRp, ARN polimerasa dependiente
de ARN.
En los vectores modulares es posible insertar el gen de interés en un vector que carece
de las funciones esenciales para el movimiento de célula a célula y para la infección
sistémica. No obstante, las funciones faltantes pueden ser administradas mediante co-
infiltración con una cepa de A. tumefaciens, o utilizando plantas transgénicas que las
provean.
23
2. JUSTIFICACIÓN El PRRS es la segunda causa más importante de muerte de cerdos en México. El estudio
de los antígenos del virión ha demostrado que la proteína GP5 es la más inmunogénica,
por lo tanto, la de mayor interés en el desarrollo de vacunas subunitarias. Sin embargo,
a la fecha no se ha explorado el potencial del ectodominio de la proteína, para ser
empleado como subunidad antigénica.
Por otro lado, recientemente, se ha considerado el uso de partículas virales como
plataforma de presentación de antígenos, los cuales pueden ser acoplados mediante los
grupos químicos disponibles para su conjugación.
La utilización de plantas como sistema de expresión de proteínas de alto valor agregado,
presenta ventajas de tipo económico, técnico y de seguridad del producto frente a otros
sistemas actualmente utilizados para este fin.
Debido al aumento en el interés de diseñar vacunas subunitarias, y a la importancia del
ectodominio de la proteína GP5, es necesario expresar esta proteína completa y su
ectodominio, para determinar si la adición de un grupo sulfhidrilo, aumenta su
capacidad de conjugarse químicamente a adyuvantes particulados.
24
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general Expresar en plantas de tabaco, la proteína GP5 del PRRSV y su ectodominio,
modificados con la adición de una cisteína.
3.2 Objetivos particulares
• Diseñar diferentes versiones de los genes modificados con cisteínas, de la
proteína completa GP5 del PRRSV y su ectodominio.
• Comparar la expresión de los genes en el sistema vegetal, con las estrategias de
transformación estable y expresión transitoria.
25
5. MATERIALES
5.1 Material Biológico
Material Proveedor
Semillas de tabaco: Nicotiana tabacum (Varidedad Xanti)
Dr. Abel Gutiérrez
Nicotiana benthamiana Donada por el Dr. Angel Alpuche del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica (IPICYT)
Agrobacterium tumefaciens LBA4404: Síntesis de octopina
Cepario del Dr. Abel Gutiérrez (CIATEJ)
GV3101:Síntesis de nopalina
Donada por el Dr. Angel Alpuche del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica (IPICYT)
E. coli TOP 10: Expresión de la enzima β-galactosidasa, sin necesidad de adicionar inductor, para la selección de colonias recombinantes.
Cepario del Dr. Abel Gutiérrez (CIATEJ)
Tabla 1. Listado de material biológico
26
5.2 Vectores
Vector y características Proveedor
pUC57: Vector de clonación GenScript pCass35S: Vector que contiene el casete de expresión, para clonar los genes de interés. Requiere ampicilina para la selección de colonias recombinantes.
Cepario del Dr. Abel Gutiérrez (CIATEJ)
pCambia2300: Vector de expresión. Contiene el gen de NPTII para la selección e colonias recombinantes.
Cepario del Dr. Abel Gutiérrez (CIATEJ)
pICH11599: Módulo 3´, provector viral. Contiene los sitios NcoI/SstI para la clonación del gen de interés.
Donado por el Dr. Angel Alpuche (IPICYT)
pICH15879: Módulo 5´, provecto viral. Contiene la ARN polimerasa dependiente de ARN, y la proteína de movimiento célula-célula, moduladas por el promotor de actina de arabidopsis.
Donado por el Dr. Angel Alpuche (IPICYT)
pICH14011: Contiene el casete de expresión de la integrasa, la cual media la recombinación de los provectores 5´y 3´.
A. Donado por el Dr. Angel Alpuche (IPICYT)
B. Donado por IconGenetics pICH20111: Módulo 5´, provecto viral. Contiene la ARN polimerasa dependiente de ARN, y la proteína de movimiento célula-célula, moduladas por el promotor de actina de arabidopsis.
Donado por IconGenetics
pICH331070: Módulo 3´, pro-vector viral. Contiene los sitios BsaI para la clonación del gen de interés.
Donado por IconGenetics
pICH7410: Contiene el casete de expresión de GFP.
A. Donado por el Dr. Angel Alpuche (IPICYT)
B. Donado por IconGenetics
Tabla 2. Descripción de vectores utilizados
27
5.3 Reactivos y kits
Reactivo Proveedor
1"Kb"Plus"DNA"Ladder"1μg/μl! Invitrogen*®**Agarose"Ultra"Pure! Invitrogen*®**Anti"IgG"de"ratón,"Blotting"Grade"Affinity"Purified" Goat" Anti@Mouse" IgG"Horseradish"Peroxidase"Conjugate"!
Biorad*®**
Anti@His6*100*μg/ml* Roche*®**BsaI!10*U/μl* Fermentas*®**Complete( EDTA( Free( Protease( Inhibitor(Cocktail(Tablets(
Roche*®**
dNTPs"(dATP,"dCTP,"dGTP,"dTTP)"! Invitrogen*®**Eco"RI*100*U/μl* Invitrogen*®**GeneJET"Plasmid"Miniprep"Kit* Fermentas*®**Hind"III"10*U/μl* Invitrogen*®**ImProm@II"Reverse"Transcriptase! Promega*®**KpnI*10*U/μl* Invitrogen*®**Leche*descremada* Svelty*Marcador*de*peso*molecular*de*proteínas*SDS@Page"Broad"Range""Standard*
Biorad*®**
NcoI*10*U/μl* Invitrogen*®**PathoScreen kit for neomycin phosphotransferase II "
Agdia®*
QIAquick"Gel"Extraction"Kit! Qiagen®**
Rnase@Free"Dnase! Promega*®**SacI"10*U/μl* Invitrogen*®**SeeBlue®"Pre@stained"Standard"NuPAGe! Invitrogen*®**
SYBR"®"Safe"in"DMSO"10*000X*100mM* Invitrogen*®**T4"DNA"Ligase"5*U/μl* Invitrogen*®**XhoI*10*U/μl* Invitrogen*®**
Tabla 3. Listado de reactivos y kits comerciales
28
6. MÉTODOS
6.1 Diseño y optimización de genes sintéticos de GP5 Se analizaron las secuencias que codifican para la proteína GP5 del PRSSV de aislados
virales mexicanos, proporcionadas por Boehringer Ingelheim Vetmedica. A partir de la
secuencia PRRSV-2005/sitio 27-1, se seleccionó una región de 89 aminoácidos de la
proteína GP5 (GP5t, 1-89 aa.) (Figura 5), de la cual los 40 primeros aa pertenecen a la
región del ectodominio (Ostroswsky et al., 2002).
Figura 5. Secuencia de aminoácidos del ORF5 del PRRSV. Los posibles sitios de N-
glicosilación están indicados con estrellas; la región que se resalta en color amarillo
indica la selección GP5t.
El gen fue optimizado con el uso de codones de Nicotiana tabacum, para favorecer el
nivel de expresión del transgén, y modificado, con la adición de una secuencia
espaciadora, ((Gly)4Ser)3, la secuencia GlyGlyCysGlyGly, que contiene la cisteína, y
una etiqueta de seis histidinas 6X His, situadas en diferentes posiciones , dando lugar a
cuatro genes modificados, nombrados Nt-GP5t-Cys-His, Nt-His-Cys-GP5t, Nt-GP5t-
His y Nt-His-GP5t, que se indican con las letras a, b, c y d, respectivamente, en la
Figura 6. Los genes c y d, corresponden a los que sólo contienen la secuencia de GP5t
y la etiqueta de histidinas, que serían empleados como control de conjugación. A todos
los genes se les incorporaron los sitios de restricción NcoI(5´C↓CATGG-3´) en el
extremo 5’ y el sitio SstI(5´GAGCT↑C-3’) en el extremo 3’ para su clonación. Todos
los diseños fueron analizados en el programa informático CLC DNA Workbench 6.0.2 y
sintetizados por la empresa GenScript, con EcoRV como estrategia de clonación en el
vector pUC57 (Figura 7).
Secuencia/señal
Extravirión////////////////////////////////////////////////////////Región/transmembranal/1 ★ ★
Intravirión//////////////R./transmembanal/2/////////////////////////R./transmembranal/3
Intravirión
200
29
Figura 6.Genes sintéticos del antígeno GP5t
Figura 7. Mapa de restricción del vector de clonación pUC57
6.2 Diseño de genes modificados del antígeno GP5MLV Se utilizó como secuencia molde, el producto de PCR previamente amplificado,
GP5MLV, que corresponde a la secuencia completa del ORF5, obtenida a partir del ARN
viral de la cepa vacunal proporcionado por Boehringer Ingelheim Vetmedica mediante
RT-PCR (García, 2011).
A partir de la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína GP5MLV completa, se
diseñaron 16 oligonucleótidos denominados pICH-GP5MLV (Anexo1), para agregar las
secuencias que codifican para las etiqueta 6X His y GlyGlyCysGlyGly, en diferentes
posiciones del gen, para obtener 4 versiones (Figura 8).Así mismo, se adicionaron las
secuencias de reconocimiento y de corte de la enzima BsaI para la clonación en el
plásmido pICH31070.
30
Figura 8. Genes modificados del antígeno GP5MLV
Se realizaron las reacciones de PCR para la adición de las secuencias que contienen las
etiquetas, así como los sitios de reconocimiento y corte enzimático, de manera
secuencial en 2 etapas empleado los oligonucleótidos como se muestra en la Tabla 4.
Con
stru
cció
n 1ª Etapa 2ª Etapa
Com
bina
ción
Fwd
Rev Com
bina
ción
Fwd
Rev
1 A pGP5MLV 1 pGP5MLV 2 A pGP5MLV 3 pGP5MLV 4
2 B pGP5MLV 1 pGP5MLV 5 B pGP5MLV 3 pGP5MLV 6
3 C pICH-GP5MLV 7 pICH-GP5MLV 8 C pICH-GP5MLV 9 pICH-GP5MLV 10
4 D pICH-GP5MLV 11 pICH-GP5MLV 8 D pICH-GP5MLV 12 pICH-GP5MLV 10
Tabla 4. Combinación de oligonucleótidos para PCRs secuenciales
En general, el programa para las reacciones secuenciales de PCR consta de 5 etapas
(Tabla 5), la etapa 1 corresponde la desnaturalización de la secuencia de doble cadena
del ADN molde, en la etapa 2 se realiza el alineamiento, sólo de las pares de bases
específicas de la secuencia molde inicial, seguida de 45 ciclos en la etapa 3, con una
temperatura de alineamiento que contempla la secuencia molde generada inicialmente
en la etapa 2. El programa de PCR con 5 etapas se realizó, con el objetivo de asegurar la
amplificación, con la generación de algunas copias iniciales de la secuencia molde
original. La relación de las temperaturas de alineamiento se detalla en el Apéndice 1.
Tabla 5. Programa para PCRs secuenciales
∞
Etapa 1 2 (X10) 3 (X45) 4 5
Temperatura 95o 95o Tm-1 72o 95o Tm-2 72o 72o 4o
Tiempo 5:00 0:30 0:30 0:40 0:30 0:30 0:40 7:00 ∞
COOH
a) 3HN
b) 3HN
COOH GP5MLV 6X His
GlyGlyCysGlyGly
6X His
COOH 6X His
COOH 6X His
d) 3HN
c) 3HN
GP5MLV
GP5MLV
GlyGlyCysGlyGly GP5MLV
31
Todos los productos de PCR fueron separados por electroforesis en geles de agarosa al
1% y observados en un analizador de imágenes, bajo luz UV.
Los productos de PCR que mostraron el tamaño deseado en pares de bases, fueron
purificados antes de ser empleados para las reacciones de digestión y/o ligación.
6.3 Construcción de los plásmidos de expresión en plantas para
trasformación estable
6.3.1 Clonación de genes sintéticos en el cassette de expresión pcass35S
Los plásmidos pUC57, con los genes sintéticos, fueron resuspendidos en 200 µL de
agua desionizada estéril, de los cuales se tomaron 3 µL para transformación de E. coli
One Shot TOP 10, mediante choque térmico, siguiendo las indicaciones del proveedor.
Las células transformadas fueron extendidas por superficie en placas de medio LB
sólido adicionado con ampicilina (100 mg /L), para la selección de colonias
transformadas, e incubadas durante 18 horas a 37 ºC. Se tomó una colonia de cada
construcción, para inocular 3 mL de medio LB líquido y se incubo durante 18 horas a
37 ºC y 250 rpm.
Se aisló y purificó el ADN plasmídico de los cultivos líquidos, mediante el kit QIAprep
Spin Miniprep, se cuantificó por espectrofotometría a 260 nm en NANODROP y se
sometió a restricción enzimática con EcoRI y Hind III. Los productos de la restricción
fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa al 0.8 % y analizados bajo luz
UV en un foto documentador.
Una vez que se verificó que el patrón de restricción de los plásmidos pUC57,
correspondían al mapa original, se realizó una restricción enzimática con NcoI y SstI,
para liberar los genes sintéticos, así como del vector de destino pcass35S (Figura 9) .
Los productos de la digestión fueron purificados mediante el Kit MinElute Gel
Extraction, después de ser separados por electroforesis en gel de agarosa al 0.8%.
Una vez que se purificaron los fragmentos, se sometieron a una reacción de ligación con
Ligasa T4, durante toda la noche a 16ºC, manteniendo la relación 1:2 (vector:inserto),
para generar las cuatro construcciones del nuevo plásmido pcass35S.
32
Se transformaron por electroporación células de E. coli TOP10 electrocompetentes1 con
los productos de ligación. Las células fueron extendidas por superficie en placas de
medio LB sólido adicionado con ampicilina (100 mg /L), para la selección de colonias
transformadas, e incubadas durante 18 horas a 37 ºC. Se tomó una colonia de cada
construcción, para inocular 3 mL de medio LB líquido y se incubaron durante 18 horas
a 37 ºC y 250 rpm.
El ADN plasmídico fue aislado y purificado por Miniprep, cuantificado por
espectrofotometría a 260 nm en NANODROP y sometido a restricción enzimática con
EcoRI y XhoI, para comprobar la ligación de los insertos en el vector pcass35S. Los
productos de la restricción fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa al
0.8 % y analizados bajo luz UV en un foto documentador.
Figura 9. Mapa de restricción del plásmido pcass35S
1 Células bacterianas electrocompetentes, preparadas y transformadas de acuerdo al protocolo de Sharma y Schimke, 1996
p35Scass4 8 6 2 bp
TEV5'
vsp3'
HBcAg
35S2X
BamHI (18 17)
ClaI (74 4 )
EcoR I (2706 )
Hind III (74 9 )
NcoI (158 5)
KpnI (717)
Sac I (214 9 )
XbaI (18 11)
EcoR V (134 8 )
ApaL I (1)
ApaL I (36 17)
AvaI (728 )
AvaI (14 4 1)
PstI (76 5)
PstI (2716 )
Sal I (734 )
Sal I (20 0 6 )
XhoI (728 )
XhoI (14 4 1)
pcass35S 4862 pb
33
6.3.2 Subclonación del cassette de expresión pcass35S en el plásmido binario
pCambia2300
Una vez que se confirmó la clonación de los genes sintéticos en el plásmido pcass35S,
se movilizaron los cassettes de expresión al plásmido binario pCambia2300 (Figura 10),
mediante restricción enzimática con EcoRI y HindIII seguida de una reacción de
ligación con la enzima Ligasa T4, manteniendo la relación 1:2 (vector:inserto).
Se transformaron por electroporación células de E. coli TOP10 electrocompetentes con
los productos de ligación. Las células fueron extendidas por superficie en placas de
medio LB sólido adicionado con Kanamicina (100 mg /L) y X-gal (20 mg/ml), para la
selección de colonias transformadas, e incubadas durante 18 horas a 37 ºC. Se tomaron
tres colonias de cada construcción, para inocular 3 mL de medio LB líquido y se
incubaron durante 18 horas a 37 ºC y 250 rpm.
El ADN plasmídico fue asilado y purificado con el kit QIAprep Spin Miniprep,
cuantificado por espectrofotometría a 260 nm en NANODROP y sometido a restricción
enzimática con EcoRI y XhoI, para comprobar la ligación de los insertos. Los productos
de la restricción fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa al 0.8 % y
analizados bajo luz UV en un foto documentador.
Figura 10. Mapa de restricción del plásmido pCambia2300.
34
6.4Construcción de módulos 3´ para la expresión transitoria en plantas
6.4.1 Clonación de genes en el plásmido pICH11599
6.4.1.1 Clonación de genes sintéticos de GP5t
Los genes sintéticos fueron clonados en el plásmido pICH11599 (Figura 11),
empleando las enzimas NcoI y SstI. Se transformaron por electroporación células de E.
coli TOP10 electrocompetentes con los productos de ligación, y se sembraron por
extensión en superficie, en placas de medio LB sólido adicionado con Carbenicilina
(100 mg /L), para la selección de colonias transformadas.
El ADN plasmídico fue purificado mediante el kit QIAprep Spin Miniprep, cuantificado
por espectrofotometría a 260 nm en NANODROP y sometido a restricción, con las
enzimas KpnI y SacI, para comprobar la ligación de los insertos en el vector de
expresión pICH11599. Los productos de la restricción fueron separados por
electroforesis en un gel de agarosa al 0.8 % y observados en un analizador de imágenes,
bajo luz UV.
Figura 11. Esquema del T-ADN del plásmido pICH11599
6.4.2 Clonación de genes en el plásmido pICH31070 con la técnica de Golden-gate
En la figura 11, se esquematiza el T-ADN del plásmido de destino, pICH31070, que
contiene el gen Lac Z, flanqueado por dos sitios de BsaI, que corresponde a la
clasificación de enzimas de restricción tipo IIS, caracterizadas por reconocer una
secuencia específica no palindrómica y siempre cortar entre los mismos nucleótidos. En
este caso, las secuencias de corte aggt y gctt (1234 y 5678, respectivamente), y la
secuencia de reconocimiento de la enzima BsaI, fueron adicionadas por PCR a los genes
de interés (Figura 12) para realizar la clonación con la técnica Golden-gate, descrita
por Engler et al., 2008.
35
matg… GP5
5´tttggtctcN1234
GP5 …act
5678Nctctggttt 5´
Figura 12. Esquema del T-ADN del plásmido pICH31070
Figura 13. Secuencia nucleotídica de GP5t, flanqueda con los sitios BsaI. Los números
1, 2,3, 4, 5, 6 y N indican los nucleótidos que corresponden a la secuencia de corte del
plásmido de destino.
La clonación de los genes en el plásmido pICH31070, se realizó en un solo paso, con 50
ng de plásmido sin digerir, 50 ng de producto de PCR, previamente purificado, en un
solo tubo, junto con, 2.5 unidades de la enzima BsaI y 2.25 unidades de DNA ligasa T4,
con el buffer de la ligasa, en un volumen final de 10 µl. La reacción de restricción-
ligación se llevó a cabo con el siguiente programa: 4 horas a 37ºC, seguidas por 30
minutos a 50ºC, y finalmente durante 10 minutos a 80ºC. La incubación a 50ºC se
realizó con el fin de re-digerir y eliminar cualquier secuencia que aún contuviera el sitio
de restricción, mientras que la incubación a 80ºC se realizó para inactivar ambas
enzimas, la ligasa y la endonucleasa.
LB AttB RB
int
SpeI
Sa
cI Kpn
I Apa
I
nos 3’NTR
Bsa
I
GCTT
Nsi
I
EcoRI
BstXI
LacZα
EcoR
I +
site
s
Bsa
I
1 2 3 4 5 6 7 8
AGGT
36
Se transformaron 50 µl de células electrocompetentes de E. coli, inmediatamente
después de la incubación, con 2 µl de la reacción. 20 µl de las células, después de la
recuperación en medio SOC, fueron sembradas por extensión en superficie, en placas de
LB sólido, adicionado con Kanamicina (50 mg/L) y X-gal (20 mg/ml).
Se seleccionaron 2 colonias blancas de cada construcción, se incubaron en 3 ml de
medio LB, durante 18 horas a 37ºC, con agitación a 250 rpm.
El DNA plasmídico fue aislado y purificado por miniprep, cuantificado, y sometido a
restricción enzimática con KpnI y SstI, para comprobar que las colonias seleccionadas,
contengan las clonaciones. Los productos de la restricción fueron separados por
electroforesis en un gel de agarosa al 0.8 % y analizados bajo luz UV.
6.4.2.1 Diseño de oligonucleótidos para la clonación de genes sintéticos de GP5t
Se diseñaron 2 pares de oligonucleótidos, (Tabla 6, Apéndice 2) para adicionar los
sitios de reconocimiento y corte de la enzima BsaI, según las secuencias 1234 y 5678,
presentes en el plásmido de destino (Figura 13), a los cuatro genes sintéticos. La
selección del oligonucleótido usado para cada construcción, se hizo, conforme a la
etiqueta de His, es decir, los genes que comparten la etiqueta en 3´, se amplificaron con
el primer par, y los que comparten la etiqueta en 5´, con el segundo.
El programa de PCR fue de 5 etapas, como se describe en la Tabla5.
Par Identificación Tm-1 Tm-2 Gen
1 GP5t-1 Fwd 54ºC 60ºC Nt-GP5t-Cys-His
Nt-GP5t-His GP5t-2 Rev
2 GP5-3 Fwd 54ºC 60ºC Nt-His-Cys-GP5t
Nt-His-GP5t GP5-4 Rev
Tabla 6. Oligonucleótidos para la inserción de sitios BsaI en genes sintéticos
6.4.2.2 Clonación de genes modificados de GP5MLV
Los genes modificados de la proteína completa de GP5, denominados GP5MLV, en sus
diferentes versiones, están flanqueados por dos sitios de restricción BsaI, con las
secuencias aggt y gctt (1234 y 5678, respectivamente en la Figura 13), presentes en el
plásmido (Figura 12).
37
6.4.2.3 Modificación y clonación de GFP
Se seleccionó la secuencia que codifica a la proteína GFP a partir del plásmido
pICH7410, para la adición de la etiqueta 6X His en el extremo 3, así como los sitios de
reconocimiento y corte enzimáticos de BsaI. Se realizó un análisis in silico, para
asegurar que no existieran sitios BsaI internos, y se diseñó un par de oligonucleótidos,
GFP-HISF: 5´tttggtctcaaggtatggtgagcaagggcgag-3´ y GFP-HISR: 5´ttt
ggtctctaagcttaatgatgatgatgatgatgcttgtacagctcgtccat -3, que tienen Tm teóricas de 75.9 y
80.16 ºC, y específicas de 60.7 75.0 ºC, respectivamente, las cuales fueron empleadas
para llevar a cabo una PCR de 5 etapas, tal como se muestra en la Tabla 5 para todas
las etapas, excepto por el gradiente de Tm en la etapa 3, de 73.6 a 78 ºC.
Una vez que se realizó la amplificación del fragmento, se siguió con la purificación y
finalmente la clonación, mediante una reacción de digestión-ligación con la técnica de
golden-gate, resultando la construcción GFP-His.
6.5 Transformación de explantes de Nicotiana tabacum, para la expresión
estable de la proteína GP5t
6.5.1 Germinación de semillas de N. tabacum
Se esterilizaron semillas de N. tabacum con el siguiente protocolo:
1. Lavado con etanol al 70%, durante 3 minutos, con agitación constante, en
condiciones estériles.
2. Enjuagado con agua desionizada estéril.
3. Lavado con una solución de cloro comercial al 6%, durante 5 minutos, con
agitación constante.
4. Enjuagado con agua desionizada estéril
Sembrar las semillas en medio de germinación (MS) sin la adición de antibióticos, y
colocarlas en condiciones de crecimiento controladas, con fotoperiodo luz/oscuridad de
16/8 horas y 26 ±1 ºC, hasta su crecimiento y uso.
6.5.2 Transformación de células de Agrobacterium tumefaciens LBA4404
Con los plásmidos pCambia2300 que contenían los insertos correspondientes a los
genes sintéticos, se transformaron por electroporación células de A. tumefaciens
LBA4404, seleccionadas con Kanamicina (50 mg/L) y Rifampicina (50 mg/L) en placas
de medio YEB sólido.
38
6.5.3 Transformación estable mediada por A. tumefaciens
Se realizó el protocolo descrito por Horsch et al., (1985) para la transformación de
discos de hoja de N. tabacum mediada por A. tumefaciens, como se indica en la Tabla 7.
Día Actividad Descripción 1
Prep
arac
ión
del p
re-
inóc
ulo
Sembrar las cepas de A. tumefaciens, que contiene los plásmidos de expresión, en 3 ml de medio YEB adicionado con Kanamicina (50mg/L), incubar durante 18 horas a 30ºC, con agitación a 250 rpm.
2
Prep
arac
ión
del
in
ócul
o Transferir 100 µl del pre-inóculo a un matraz de 250 ml con 50 ml de medio YEB adicionado con Kanamicina (50 mg/L) y Acetosiringona (100 µM), incubar durante 18 horas a 30ºC, con agitación a 250 rpm.
3
Prep
arac
ión
de
disc
os d
e ho
ja
• Cortar las hojas de N. tabacum de un tamaño aproximado a 1 cm2.
• Eliminar las orillas y la nervadura central, sobre una tapa de caja de Petri.
• Transferir los discos de hoja a una caja con agua desionizada estéril y mantenerlos húmedos, hasta su uso.
Co-
culti
vo
• Colocar 20 discos en una nueva caja de Petri y añadir el cultivo de A. tumefaciens, hasta cubrirlos.
• Incubar durante 3 a 5 minutos a temperatura ambiente, con agitación ocasional.
• Separar los discos y escurrirlos perfectamente, para colocarlos en medio MS semisólido, adicionado con BAP (1 mg/ml), con el envés hacia arriba.
• Incubar durante 48 horas a 18ºC en oscuridad. 5-35
Sele
cció
n
• Transferir los discos con el haz hacia arriba en medio MS semisólido, adicionado con BAP (1 mg/ml), Kanamicina (100 mg/L) y Cefotaxima (300 mg/L).
• Incubar por un mes, hasta la aparición de brotes, en fotoperiodo de 16/8 horas luz/oscuridad., a 26 ºC±1.
• Realizar cambio de medio cada 2 semanas, o en caso de que aparezca contaminación.
35-55
Enra
iza
mie
nto • Seleccionar y separar los brotes en frascos de vidrio con
medio MS semisólido adicionado con BAP (1 mg/ml), Kanamicina (100 mg/L) y Cefotaxima (300 mg/L), para el desarrollo de las plántulas, y hasta la aparición de raíces.
60-65
Pase
a
mac
eta
• Seleccionar las plantas que hayan desarrollado raíces, y pasarlas a macetas con sustrato húmedo.
• Regar cada tres días. • Colectar tejido y almacenarlo a 80ºC hasta su uso.
Tabla 7. Protocolo de transformación de discos de hoja N. tabacum para expresión
estable
39
6.5.4 Escrutinio y análisis de plantas transformantes
Se colectaron 100 mg de tejido de cada plántula, después del desarrollo de raíces, se
extrajo proteína total soluble (PTS) y se realizó el ensayo tipo ELISA para la detección
de la proteína neomicin fosfotransferasa II (NPTII, pos sus siglas en inglés), con el kit
PathoScreen kit for neomycin phosphotransferase II Agdia®, siguiendo las indicaciones
del proovedor. Fueron analizadas 3 plantas de cada construcción ( GP5t-Cys-His y His-
Cys-GP5t). Se utilizo el extracto de una planta sin transformar como control negativo.
6.6Transformación de plantas de N. benthamiana y N. tabacum para la
expresión transitoria de las proteínas GP5t, GP5MLV y GFP
6.6.1 Germinación de semillas de N. benthamiana y N. tabacum
Se germinaron semillas de Nicotiana en una mezcla homogénea de Peat-Moss y
vermiculita, como sustrato, en condiciones controladas de crecimiento, con fotoperiodo
luz/oscuridad de 16/8 horas y 26 ±1 ºC, durante 4 a 8 semanas.
6.6.2 Transformación de células de Agrobacterium tumefaciens GV3101
Una vez que se obtuvieron las clonas deseadas, evaluadas por el patrón de restricción
del DNA plasmídico, fueron transformadas por electroporación células de A.
tumefaciens GV3101, seleccionadas en placas de medio LB sólido, adicionadas con
antibiótico, según el plásmido, como se describe en la Tabla 8, y Rifampicina (50
mg/L) en todos los casos.
Paquete Plásmido Módulo Antibiótico
de selección
Observaciones
A pICH11599 3´ Ampicilina Clonación de los genes que codifican para las proteínas GP5t
pICH115879 5´ Ampicilina -
pICH14011 INT Ampicilina -
pICH7410 GFP Ampicilina -
B pICH31070 3´ Kanamicina Clonación de los genes que codifican para las proteínas GP5t, GP5MLVy GFP-His
pICH20111 5´ Ampicilina -
pICH14011 INT Ampicilina -
pICH7410 GFP Ampicilina -
Tabla 8. Resistencia a antibiótico de cada plásmido de expresión transitoria
40
6.6.3 Ensayos de infiltración de plantas completas con A. tumefaciens
En la Tabla 9 se resume el protocolo de infiltración de plantas completas, según lo
descrito por Medrano et al., 2009.
Día Actividad Descripción 1
Prep
arac
ión
del p
re
inóc
ulo
Crecer las cepas transformadas de A. tumefaciens en 3 ml de medio LB adicionado con Kanamicina o Ampicilina (50mg/L), incubar durante 18 horas a 30ºC, con agitación a 250 rpm.
2
Prep
arac
ión
del
in
ócul
o Transferir 100 µl del pre inóculo a un matraz de 250 ml con 50 ml de medio LB adicionado con Kanamicina o Ampicilina (50 mg/L) y Acetosiringona (100 µM), incubar durante 18 horas a 30ºC, con agitación a 250 rpm.
3
Prep
arac
ión
del
med
io d
e in
filtra
ción
• Medir la DO600nm de los cultivos de A. tumefaciens.Hasta alcanzar 0.6.
• Centrifugar los cultivos por 20 minutos a 4ºC a 5000 rpm. • Re-suspender los cultivos con el volumen, de medio de
infiltración (MI), necesario para igualar las concentraciones.
• Preparar 1800 mL de suspensión bacteriana en MI, manteniendo una relación 1:1:1 de cada cepa.
3
Infil
traci
ón p
or v
acío
• Cubrir la maceta de N. benthamiana, para asegurar que se retenga el sustrato durante el vacío.
• Invertir la planta dentro del desecador que contiene el MI y colocar la maceta en el centro. Asegurarse que todas las hojas estén sumergidas en la solución.
• Colocar la tapa del desecador. • Aplicar vacío durante 30-60 segundos a la máxima
presión. Pasado el tiempo, soltar lentamente el vacío. • Repetir esta operación las veces necesarias, hasta que
todas las hojas de la planta indiquen su infiltración, mediante el oscurecimiento de su color.
• Remover la maceta del desecador, eliminar el exceso de solución con papel absorbente, etiquetar la maceta con la construcción designada.
4-15
Incu
baci
ón • Mantener las plantas en la cámara de crecimiento con las mismas condiciones de germinación.
Tabla 9. Protocolo de infiltración de plantas completas de tabaco para expresión
transitoria de proteínas heterólogas
41
Se realizaron cuatro diferentes ensayos de infiltración, con la combinación de
plásmidos, como se detalla en la Tabla10, según Medrano et al., 2009 (Tabla 9).
Ensayo 1 2 3 4
Especie N. tabacum N. benthamiana N.
benthamiana
N. benthamiana
Proteína GP5t-Cys-His GFP GP5t-Cys-
His
GP5MLV-
Cys-His
GP5MLV-Cys-
His
GFP GFP-His
Mód
ulos
3´ 11599 7410-A 31070 31070 31070 7410-B 31070
INT 14011-A 14011-A 14011-B 14011-B 14011-A 14011-B 14011-B
5´ 15879 15879 20111 20111 15879 20111 20111
Días post-
infección
7 3 8 8 10 2,4,6,8,
12 y 15
0,3,6,9,12
y 17
Tratamiento
del tejido
Liofilizado NA Pulverizado en N2 líquido
Análisis
Western Blot Microscopía
de
fluorescencia
SDS-PAGE y Western Blot SDS-
PAGE
SDS-PAGE y
Western Blot
y RT-PCR
Tabla 10. Diseño de los experimentos de infiltración de plantas completas
6.6.4Análisis de GFP en N. tabacum
Como examen preliminar, se observó bajo luz UV en un microscopio confocal, hojas
completas de N. tabacum infiltradas con A. tumefaciens, transformada con los
plásmidos pICH7410-A, pICH14011-A y pICH11599, en el experimento 1, a los tres
días post-infección (dpi).
6.6.5 Extracción de proteínas
En todos los casos, se extrajo la proteína total soluble (PTS), de ≈100 mg de tejido
vegetal previamente liofilizado o pulverizado, según se indica en la Tabla10, con
Buffer de fosfatos salino (PBS) y tritón al 0.1%, adicionado con cóctel de inhibidores de
proteasas.
Para la cuantificación de las proteínas totales, diluciones de los extractos de proteína
fueron sometidos a espectrofotometría, con el método de Bradford, con albúmina de
suero bovina (BSA) como estándar.
42
6.6.6 SDS-PAGE y Western blot
Para el ensayo de western blot, las proteínas fueron separadas en un gel de
poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) al 14%, transferidas a membrana de nitrocelulosa e
incubadas toda la noche con un anticuerpo primario monoclonal de ratón Anti-poli
Histidina en dilución 1:2000. Después de lavar la membrana con PBS-Tween al 0.1%,
se incubó con el segundo anticuerpo de cabra, anti-IgG de ratón, acoplado a peroxidasa
en dilución 1:3000 durante 3 horas y se reveló con el sustrato para peroxidasa (4-cloro-
naftol).
Las proteínas del experimento 4 se separaron en SDS-PAGE y se tiñeron para su
visualización con una solución de tinción de azul de Coomassie.
7. RESULTADOS A continuación se presentan los resultados obtenidos de los experimentos anteriormente
expuestos. Iniciando por la clonación de los genes sintéticos de GP5t en el plásmido de
expresión estable en plantas, pCAMBIA2300, y los plásmidos de expresión transitoria
pICH11599, así como la clonación de los mismos genes, los genes modificados de
GP5MLV y GFP-His en el plásmido de expresión transitoria pICH31070 con la técnica de
Golden gate.
Posteriormente los resultados de la expresión estable de 2 versiones de los genes
sintéticos en N. tabacum.
Y finalmente todos los experimentos de expresión transitoria, desde las cinéticas de
expresión de GFP y GFP-His, hasta la expresión de una versión de GP5t con el
plásmido pICH11599, en N. tabacum.
7.1. Clonación de plásmidos de expresión estable en plantas
7.1.2 Clonación del cassette de expresión pcass35S
A partir de cada uno de los plásmidos pUC57, entregado por GenScript, se escindieron
los genes sintéticos, modificados y optimizados para la expresión en plantas.
Existe una diferencia en tamaño en cada uno de los genes modificados, debido a que
dos de ellos contienen la secuencia GlyGlyCysGlyGly, en uno de los extremos, y
paralelamente, se diseñó un gen análogo control, sin esta secuencia. (Tabla 11).
43
Tabla11. Tamaño de los genes sintéticos clonados en pUC57
En la Figura 14, se muestra los fragmentos obtenidos de la restricción con las enzimas
EcoRI/HindIII a partir de los plásmidos pUC57, para comprobar la presencia de los
genes sintéticos. Los carriles 1, 2, 3 y 4 corresponden a las construcciones Nt-GP5t-
Cys-His, Nt-His-Cys-Gp5t, Nt-Gp5t-His y Nt-His-Gp5t, respectivamente.
Se hizo digestión del plásmido pCass35S con las enzimas NcoI y SstI, para la clonación
de los genes en el sitio de clonación múltiple (MCS, por sus siglas en inglés), así como
de los plásmidos pUC57, para la liberación de los genes sintéticos con las enzimas
NcoI/SstI, obteniendo los fragmentos de 564 (corresponde a un gen clonado
previamente en el plásmido, que será reemplazado por los de nuestro interés), 359 y
368 pb, para el plásmido pCass35S (carril P), y las construcciones Nt-GP5t-Cys-His
(carril 1) y Nt-His-Cys-GP5t (carril 2), respectivamente, como se muestra en la Figura
15.
Identificación Gen Tamaño (pb)
NcoI/ SstI EcoRI/HindIII
1 Nt-GP5t-Cys-His 359 434
2 Nt-His-Cys-Gp5t 368 443
3 Nt-Gp5t-His 344 419
4 Nt-His-Gp5t 374 449
2000 1650
1000
850 650 500 400
300
200
100
M 1 2 3 4 M P 4 5
2000
1650
1000
850
650 500 400
300 200 100
Figura 14. Escisión de genes de pUC57 con EcoRI/ HindIII. (1) Nt-GP5t-Cys-His, (2) Nt-His-Cys-Gp5t, (3) Nt-Gp5t-His y (4) Nt-His-Gp5
Figura 15. Restricción de plásmidos pCass35S y pUC57. (P) Plásmido pCass35S, (1) NtGP5t-Cys-His, (2) Nt-His-Cys-GP5t.
44
Después de la reacción de ligación de los genes sintéticos en el plásmido pCass35S, se
evidenció la obtención de una clona (carril A) con la construcción denominada
p35SGp5CysHis, analizando el perfil de restricción en la Figura 16, producto de la
digestión con las enzimas EcoRI y XhoI. En el carril E, se observa el perfil del plásmido
pCass35S, sin transformar, con una diferencia de ≈ 200 pb, con respecto al fragmento
del carril A.
Figura 16. Perfil enzimático EcoRI/XhoI de p35SGp5CysHis. (A) Clona con la construcción p35SGp5CysHis, (B, C, D) Clonas incorrectas, (E) Plásmido pCass35S sin transformar.
7.1.3 Clonación en el plásmido binario pCambia2300 para la expresión estable del
gen GP5t
Todas las versiones del gen modificado de GP5t, se clonaron inicialmente en el
plásmido pCass35S, para construir el cassette de expresión, que contiene el promotor
duplicado del Virus del Mosaico de la coliflor (35S X2), seguido de la región no
traducible del Tobacco Echt Virus (TEV 5’), el gen modificado de la proteína GP5, en
cada una de sus versiones (GP5t), así como, la secuencia del terminador de la
transcripción de la proteína de almacenamiento vegetativo(VPS 3’).
Posteriormente, se escindieron con las enzimas HindIII y EcoRI, para movilizarlos al
plásmido binario pCambia2300. En la Figura 17, se esquematiza la estructura del T-
DNA, que contiene el gen de selección NPTII, que confiere resistencia a las células
vegetales transformadas, bajo el control del promotor 35S.
M A B C D E
45
Figura 17. Esquema del T-DNA de expresión establ
En la Figura 18, se muestra la separación de los fragmentos, delimitados por HindIII y
EcoRI, de tres de las construcciones obtenidas, en los carriles 2, 3 y 4, las
construcciones nombradas p35SHisCysGp5, p35SGp5His y p35SHisGp5,
respectivamente, así como la linearización del plásmido de destino para la subclonación,
pCambia2300, en el carril 1.
Figura 18. Perfil de restricción con HindIII/EcoRI, (1) Plásmido de destino pCambia 2300,
(2) p35SHisCysGp5, (3) p35SGp5His y (4) p35SHisGp5.
Posterior a la reacción de ligación de los cassettes de expresión en el vector de
expresión pCambia 2300, se comprobó por restricción la clonación, después de
seleccionar dos colonias blancas de cada construcción, empleando las enzimas
EcoRI/PstI. En la Figura 19 la clona 1, correspondiente a una colonia seleccionada de
la construcción pGp5CysHis-2300, no cumple con el perfil estimado, no así la clona 2,
que tiene fragmento esperado (≈ 1776 pb). Asimismo, resultaron positivas las clonas 3 y
4 (construcción nombrada pHisCysGp5-2300), 5 y 6 (construcción pGp5His-2300), y
en 7 y 8 (pHisGp5-2300).
TXBL GP5t
TXBR
NPTII
HindIII EcoRI
35SX2 TEV!5’ CAMV35S VSP!3’
2000 1650
M 1 2 3 4
4000 3000
1000 850
46
Figura 19. Perfil de restricción EcoRI/PstI. (2) pGp5CysHis-2300, (3,4) pHisCysGp5-2300,
(5, 6) pGp5His-2300 y (7,8) pHisGp5-2300.
7.2 Clonación en plásmidos que contienen el módulo 3’ para la
transformación transitoria de plantas
7.2.1 Clonación de plásmidos para la expresión de genes, a partir del pro-vector
viral pICH11599
Se construyeron los plásmidos de expresión transitoria, pICH11599 (Figura 12), con la
estrategia de clonación NcoI/SacI, y se comprobaron las construcciones con el perfil
enzimático KpnI/SacI, en la Figura 20, se indican los carriles 1 y 2 con la construcción
denominada pICH-GP5t-Cys-His, y en los carriles 3 y 4, la construcción pICH-GP5t-
His.
Figura 20. Perfil enzimático KpnI/SacI, de genes sintéticos, clonados en pICH11599.
(1,2) pICH-GP5t-Cys-His y (3,4) pICH-GP5t-His.
2000 1650
M 1 2 3 4 5 6 7 8
4000 3000
3000
1000
M 1 2 3 4
6
47
7.2.2 Clonación de plásmidos para la expresión de genes, a partir del pro-vector
viral pICH31070
Se obtuvieron los genes de las diferentes versiones de la proteína GP5 y se clonaron en
el plásmido pICH31070, con la técnica de Golden gate, descrita en el 2008, por Engler
y colaboradores.
7.2.2.1 Clonación de genes sintéticos de GP5t
Se realizó una PCR de 5 etapas, para la inserción de los sitios BsaI en los extremos de
cada uno de los genes, de las diferentes versiones de GP5t.
En la Figura 21, se muestra el resultado de la PCR, con dos pares diferentes de
oligonucleótidos, según la orientación de la etiqueta de histidina. En los carriles 1 y 2,
las construcciones con etiqueta en 3’, y en los carriles 3 y 4 las construcciones con
etiqueta en 5’, los carriles identificados con CA y CB, corresponden a los controles
negativos de cada mezcla de reacción.
Debido a que en la primera reacción de PCR, sólo se amplificó el producto esperado
para las construcciones 3 y 4, nombradas pHis-Cys-GP5t-31070 y pHis-GP5t-31070,
respectivamente, se realizaron varios experimentos de PCR para optimizar las
condiciones de amplificación, de las construcciones 1 y 2, correspondientes a pGP5t-
Cys-His-31070 y p-GP5t-His-31070, respectivamente.
Figura 21. Productos de la PCR de adición de sitios BsaI en los genes de las diferentes
versiones de GP5t. (1,2) Construcciones con etiqueta en 3´, (3,4) Construcciones con etiqueta
en 5´. (CA y CB) controles negativos de cada reacción.
M 1 2CA3 4 CB
6
1000 850 650 500 400 300 200 100
48
7.2.2.2 Clonación de genes modificados de GP5MLV
Para la expresión de la proteína completa de GP5MLV, fue necesaria la inserción de los
sitios de BsaI, así como la etiqueta de 6XHis y la secuencia GlyGlyCysGlyGly, que
contiene a la cisteína, para la generación de las cuatro versiones diferentes, de acuerdo a
la orientación de las secuencias añadidas a la proteína completa.
Para insertar los nucleótidos adicionales, a la secuencia de GP5MLV, fue necesario hacer
reacciones de PCR secuenciales, ya que se trataba de más de 20 nucleótidos, en cada
caso. En la Figura 22, se muestra el resultado de la reacción de PCR en la 1ª etapa. Los
carriles A, B, C y D corresponden al producto de las secuencias nombradas pGP5MLV-
Cys-His-31070, pGP5MLV-His-31070, pHis-Cys-GP5MLV- 31070 y pHis-GP5MLV-
31070, respectivamente (≈ 620 pb). Los carriles identificados como C1, C2, y C3,
corresponden a los controles negativos de cada reacción. En los carriles con C+, se
corrió un control positivo de la reacción de PCR.
Figura 22 Primera etapa de las reacciones de PCR secuenciales para la modificación
del gen GP5MLV. (A) pGP5MLV-Cys-His-31070, (B) pGP5MLV-His-31070, (C) pHis-Cys-
GP5MLV- 31070 y (D) pHis-GP5MLV- 31070, (C1, C2, y C3) controles negativos de cada reacción.
(C+) control positivo.
En la Figura 23, se muestran los fragmentos amplificados en la reacción de PCR de la
2ª etapa, donde se incluyeron controles positivos y negativos, para cada combinación de
oligonucleótidos. Los carriles E, F, G y H corresponden a los fragmentos con las
etiquetas completas, amplificados a partir de los fragmentos A, B, C y D,
respectivamente. Puede observarse una ligera diferencia de tamaño entre los fragmentos
de la primera etapa y los de la segunda (≈ 20 pb).
100
200
300
400
500
650
1000 850
M C+ A C1 B C2 C D C3C+
6
49
F
Figura 23. Fragmentos amplificados en la segunda etapa de las PCRs secuenciales para
la modificación del gen GP5MLV. (A, E) pGP5MLV-Cys-His-31070, (B, F) pGP5MLV-His-
31070, (C, G) pHis-Cys-GP5MLV- 31070 y (D, H) pHis-GP5MLV- 31070, (C1, C2, y C3) controles
negativos de cada reacción. (AC+) control positivo.
Se realizó una 3ª etapa de PCR, solo para la confirmación de la amplificación de cada
gen, ya con la adición de etiquetas. En la Figura 24 se muestra en el carril A, el
fragmento amplificado en la PCR 1ª etapa (≈620 pb), en el carril E, el fragmento
amplificado en la PCR 2ª etapa (≈649 pb), y en el carril EN, la confirmación de la
amplificación del gen GP5MLV-Cys-His, y en el carril C+, el control positivo. Es posible
observar la pequeña diferencia de aproximadamente, 29 pares de bases, entre el
fragmento del carril A y el E, lo que indica, que se adicionaron las etiquetas diseñadas
para el gen.
Figura 24. Confirmación de la amplificación del gen GP5MLV-Cys-His. (C+) control
positivo, (A) 1ª etapa, (E) 2ª etapa, (EN) confirmación de amplificación,
1000 850
M AC+ A E C1 B F C2 AC+ C C3 G AC+ D H C3
6
1000 850
650 500 400
M C+ A E EN
6
650 500 400
650
500
400
50
Después de la clonación con Golden-gate, se observó el patrón de digestión enzimática
con KpnI/SstI, (≈4228/1450 pb), del ADN plasmídico de 2 clonas de E. coli para
verificar la inserción del gen en el plásmido pICH31070 (Figura 25), incluyendo en el
carril P, la digestión del plásmido sin transformar (≈4275/920pb). Los carriles 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7 y 8, corresponden a las construcciones nombradas pGP5MLV-Cys-His-31070,
pGP5MLV-His-31070, pHis-Cys-GP5MLV- 31070 y pHis-GP5MLV- 31070,
respectivamente, 2 carriles por construcción.
Figura 25. Perfil enzimático KpnI/SstI del plásmido pICH31070 con los genes GP5MLV.
(P) plásmido pICH31070 sin transformar, (1,2) pGP5MLV-Cys-His-31070, (3,4) pGP5MLV-His-
31070, (5,6) pHis-Cys-GP5MLV- 31070 y (7,8) pHis-GP5MLV- 31070.
7.2.2.3 Clonación del gen modificado de GFP-His
Con el fin de contar con un gen que pudiera ser monitoreado durante una cinética de
expresión con el plásmido pICH31070, y empleado como control positivo del sistema,
se utilizó la secuencia de la proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés),
para la adición de una etiqueta de 6 His. Se realizó una PCR de 5 etapas a partir del
plásmido pICH7410. Se probaron temperaturas de alineamiento para la optimización de
las condiciones de reacción. En la Figura 26, los carriles 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7
corresponden los fragmentos amplificados (≈750 pb), con las temperaturas 76.6, 74.2,
75, 76, 76.8, 77.5, y 76, respectivamente, además se incluyó un control positivo (C+),
de 620 pb aproximadamente.
2000 1650 1000
850 650 500
M P 1 2 3 4 5 6 7 8
6
51
Figura 26. Gradiente de Tm para la amplificación de GFP-His. (1) 76.6ºC, (2) 74.2ºC, (3)
75ºC, (4) 76ºC, (5) 76.8ºC, (6) 77.5ºC, (7) 76ºC, (C+) Control positivo, (C-) Control negativo.
Después de la clonación con Golden-gate, se observó el patrón de digestión enzimática
con KpnI/SstI, (≈4228/1450 pb) (Figura 27), del DNA plasmídico de 3 clonas de E.
coli, para verificar la inserción del gen en el plásmido pICH31070, incluyendo en el
carril P, la digestión del plásmido sin transformar (≈4275/920pb). Esta construcción se
denominó pICHGFP-His.
Figura 27. Perfil enzimático KpnI/SstI de la construcción pICHGFP-His. (1, 2 y 3) ADN
plasmídico de tres clonas de E.coli, transformada. (P) plásmido pICH 31070 sin transformar.
M 1 2 3 P
2
M 1 2 3 4 5 6 7 C+ C-
6
52
7.3 Obtención de plantas transgénicas de N. tabacum
Para la transformación del genoma nuclear de N. tabacum, se usó la cepa de A.
tumefaciens LBA4404, se transformó con las cuatro diferentes versiones del gen GP5t
en el vector de expresión pCambia2300.
Después de la selección de los brotes que crecieron de los discos (Figura 28a), luego de
15 días de cultivo en medio selectivo, se separaron en cajas independientes, para el
desarrollo de plántulas (Figura 28b),, hasta la aparición de raíces. Sin embargo, sólo las
plantas transformadas con las construcciones pGp5tCysHis-2300 y pHisCysGp5t-2300,
desarrollaron brotes, en el medio semisólido MS adicionado con Kanamicina, después
de 60 días.
Las líneas transformantes fueron trasplantadas a macetas (Figura 28c), para permitir el
crecimiento de las hojas, y contar con tejido suficiente para las posteriores pruebas de
escrutinio.
Figura 28a. Desarrollo de brotes en medio selectivo b. Selección de plántulas c. Planta
transgénica de tabaco
7.3.1 Escrutinio de plantas transgénicas de N. tabacum por ELISA
Se extrajo la proteína total soluble del tejido vegetal pulverizado, para realizar una
prueba de ELISA dirigida a la proteína NPTII. Resultando una planta positiva para cada
construcción evaluada, como se muestra en la Tabla12.
a
b
c
53
Construcción Id Muestra Resultado NPTII GP5t-Cys-His
A 1 + A2 - A3 -
His-Cys-Gp5t
B1 - B2 - B3 +
Tabla 12. Relación de muestras positivas a NPTII
7.3.2 Expresión estable de las versiones GP5t-Cys-His y His-Cys-Gp5t en N.
tabacum
No se detectaron las proteínas esperadas de 15 kDa, en los ensayos de western blot,
dirigido a la etiqueta de His 6X, en ninguna de las muestras positivas a NPTII.
7.4 Expresión transitoria en plantas de Nicotiana
7.4.1 Cinética de expresión transitoria de GFP con el plásmido pICH7410 en N.
benthamiana
En la Figura 29 se muestra el perfil de las PTS de las plantas de tabaco co-infiltradas
con los módulos pICH2011,pICH14011 y pICH7410, en diferentes dpi, así como, el de
una planta sin infiltrar (control negativo). En el carril que corresponde a los 15 dpi se
indica con una flecha, una banda de ≈30 kDa, la cual es visible desde los 12 dpi, y no
se observa en el carril C-- que corresponde a una planta sin infiltrar, como control
negativo, lo cual sugiere que podría tratarse de la proteína GFP.
Figura 29. Cinética de expresión de GFP en plantas de tabaco co-infiltradas con los
módulos pICH2011, pICH14011 y pICH7410, de los 2 a 15 días post-infección.
54
Se observa, también, una importante reducción de la intensidad de la subunidad grande
de Rubisco (≈50kDa) a los 15 dpi, que es normalmente la más abundante, y ya se ha
descrito en este sistema, según Marillonnet et al. (2004).
7.4.2 Cinética de expresión transitoria de GFP-His con del plásmido pICH31070 en
N. benthamiana
Con el fin de contar con una proteína que pudiera ser monitoreada durante una cinética
de expresión, en las condiciones de trabajo disponibles, fue necesario etiquetar la
secuencia de la proteína GFP, a partir del plásmido pICH7410, con 6 histidinas para su
detección en ensayos tipo western blot, y así, contar con un control del funcionamiento
del sistema, en particular con el plásmido pICH31070, mismo que acarrea los genes de
interés.
En la Figura 30 se muestra el perfil de las PTS de las plantas de tabaco co-infiltradas
con los módulos pICH2011, pICH14011 y pICHGFP-His, en diferentes días post-
infección, así como el de una planta infiltrada con los módulos pICH2011, pICH14011
y pICH31070, como control negativo. En este caso se consideró un control positivo
(C+), que corresponde a la proteína GFP semi-purificada a partir de E. coli.
Figura 30. Cinética de expresión de GFP-His en plantas de tabaco co-infiltradas con los
módulos pICH2011, pICH14011 y pICHGFP-His, de los 0 a 12 días post-infección. (C-)
extracto de planta sin infiltrar, (C+) GFP, expresada en E. coli.
55
Igual que en el experimento anterior, se observa una banda de ≈30 kDa, a los 12 dpi,
que no se observa en el control negativo (C-), además de una importante reducción de la
intensidad de la subunidad grande de Rubisco, a partir de los 9 dpi, igual que en las
plantas infiltradas con pICH7410. Sin embargo, en los ensayos de western blot
realizados a la réplica del gel de la Figura 30, no se observó la proteína en ninguna de
las plantas infiltradas con la construcción que contiene el gen de interés, solamente se
revelaron las bandas correspondientes al control positivo.
7.4.3 Expresión transitoria de GP5t-Cys-His y GP5MLV-Cys-His en el plásmido
pICH31070 en N. benthamiana
No se detectó ninguna banda en el ensayo de western blot, dirigido a la etiqueta His 6X,
en los extractos de proteínas de las plantas co-infiltradas con los plásmidos pICH2011,
pICH14011 y pICH31070 (este plásmido acarrea los genes GP5t-Cys-His y GP5MLV-
Cys-His).
7.4.4 Expresión de GFP en N. tabacum con le plásmido pICH7410
Bajo luz UV se observó una hoja completa (Figura 30) del tejido co-infiltrado con los
plásmidos pICH14011, pICH15879 y pICH7410, el cual contiene el gen de la proteína
GFP. La presencia de la proteína indicó que el sistema funciona en las condiciones
empleadas para el ensayo de infiltración con los plásmidos que contienen los genes de
interés.
Figura 31. Expresión transitoria de GFP en hojas de N. tabacum
56
7.4.5 Expresión de GP5t-Cys-His a partir del plásmido pICH11599 en N. tabacum
La versión GP5t-Cys-His de la proteína GP5t modificada, fue satisfactoriamente
expresada en N. tabacum. El peso molecular teórico de la proteína recombinante es de
13 kDa, mientras que el ensayo de western blot con el anticuerpo monoclonal de ratón
Anti-poli-Histidina, después de 7 dpi (Figura 32), reveló una banda de ≈ 15 kDa
(Carril 3), correspondiente a la proteína GP5t-Cys-His, y otra de 15 kDa que
corresponde al control positivo (Carril 1). No se observaron bandas en el control
negativo (Carril 2).
Figura 32. Ensayo de western-blot del tejido vegetal infiltrado con el plásmido pICH-
GP5t-Cys-His.(M) Marcador See Blue®, (1) Control positivo de 15 kDa, (2) Control negativo,
(3) GP5t-Cys-His.
8. DISCUSIÓN Debido a que se ha demostrado que la proteína GP5 del PRRSV contiene epítopos
neutralizantes (Plagemann et al., 2002), se han evaluado varios sistemas para su
expresión o co-expresión con la proteína M, desde bacterias (Jiang Y et al., 2007,
Bastos et al., 2002), baculovirus (Zhisheng et al., 2011), vacunas de ADN (Jiang Y et
al., 2006), adenovirus (Jiang W et al., 2006), y el sistema del virus de Ankara (Zheng et
al., 2007).
También se ha evaluado la imunogenicidad de plantas de tabaco transgénico que
expresan la proteína recombinante GP5 (Chia et al., 2010), la fusión de GP5 con la
subunidad B de la enterotoxina termolábil de E. coli (Chia et al., 2011), además de
papas transgénicas que expresan GP5 (Chen et al., 2011), para administración oral.
Sin embargo, en plantas no se ha reportado la expresión de la proteína GP5 del PRRSV
o de su ectodominio, modificados genéticamente para acoplarse a adyuvantes
57
vacunales. En el 2012, Robles-Machuca, expresa en E. coli una versión modificada de
la proteína de GP5, y se encontró localizada en cuerpos de inclusión, lo cual complica
su purificación y evaluación.
En este estudio, Se realizaron experimentos independientes para la obtención de
proteínas heterólogas de secuencia modificada, de la proteína GP5 del PRRSV y su
ectodominio, con el fin de purificarlas y evaluar su capacidad de acoplarse a adyuvantes
vacunales.
Se realizó la transformación genética de plantas de N. tabacum, mediada por
Agrobacterium tumefaciens para expresión estable, con el plásmido de expresión
pCambia 2300, el cual contiene un marcador de selección de transformantes, que le
confiere resistencia a kanamicina a las células vegetales que hayan integrado el ADN de
transferencia.
El escrutinio de las líneas de tabaco resistentes a kanamicina, por los ensayos tipo
ELISA a NPTII, reveló la obtención de plantas transgénicas para las construcciones
pGp5tCysHis-2300 y pHisCysGp5t-2300, después de 60 días de la transformación. Sin
embargo, no se detectaron bandas del tamaño esperado en los ensayos de inmunoblot en
ninguna de las versiones de la proteína GP5t.
Una de las principales limitantes de la producción de proteínas en plantas transgénicas,
ha sido el nivel relativamente bajo de expresión, normalmente <1% de la proteína total
soluble, que puede ser aumentado con el uso de promotores fuertes (Mason et al.,
2002). El promotor 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor, es comúnmente usado,
promueve la alta expresión en tejido vascular (Lessardet al., 2002). Inclusive, se ha
empleado por duplicado, obteniendo hasta 7.3µg por g de peso fresco de hojas de
plantas de Lycopersicon esculentum del gen fusionado de las dos cadenas de la IL-12
de ratón (Gutiérrez-Ortega., 2005).
Otro factor considerable, en la transformación genética de plantas para la expresión de
proteínas heterólogas, es que la inserción del material genético es aleatoria y puede
ocurrir en varios sitios dentro de una misma célula, pudiendo originar problemas de
silenciamiento o efectos posicionales.
Chia y colaboradores en el 2010 y 2011, evaluaron la inmunogenicidad de la proteína
GP5 expresada en plantas de tabaco, de manera individual y con la fusión de la
58
subunidad B de la enterotoxina termolábil de E. coli, bajo el control del promotor 35S y
de la ubiquitina, respectivamente. Además de la incorporación de una secuencia que
codifica para una señal de retención en retículo endoplásmatico, HDEL, fusionada en el
extremo C-terminal, que ha sido utilizada con éxito para estabilizar la proteína de
interés, así como el incremento en los niveles de acumulación en hojas (Gomord et al.,
1997). Sin embargo, los niveles de las proteínas fueron muy bajos (0.011% de la
proteína total soluble).
En este estudio, se comprobó la integración de el transgén que codifica para la proteína
GP5t en las versiones GP5t-Cys-His y His-Cys-GP5t, con la detección de la proteína
NPTII en las plantas que desarrollaron raíces, mediante un ensayo tipo ELISA. Sin
embargo, no se detecto la proteína de interés en ninguno de los casos, por lo que, se
sugiere que las líneas de tabaco resistentes a kanamicina, presentaron niveles de
expresión, insuficientes para detectarse por inmuboblot, en las condiciones empleadas
en este estudio, a pesar de que se utilizó el promotor duplicado 35S, así como la
optimización de la secuencia de nucleótidos con el uso de codones del tabaco.
Por otro lado, el sistema de magnICON, basado en el uso de le Virus del Mosaico del
Tabaco representa una alternativa importante a los sistemas de expresión estable de
proteínas en plantas, por la reducción del tiempo de obtención de los productos de
interés, así como, altos niveles de expresión. Por ejemplo, se logra la expresión de GFP
en las hojas de N. benthanmiana agroinfiltradas, por arriba de 5 mg/g de tejido, y 80%
de la proteína total soluble, con el plásmido pICH7410, que lleva el módulo 3´con el
gen de GFP (Marillonnet et al. 2004).
En nuestro caso, se realizaron diferentes experimentos de infiltración de plantas
completas, con los pro-vectores virales, facilitados por ICON Genetics, y el Dr. Angel
Alpuche (IPICYT).
Se infiltraron en IPICYT plantas de N. tabacum, con el plásmido pIC11599, módulo 3’,
el cual acarrea una parte del gen de la proteína GP5, en su versión GP5t-Cys-His y se
observó en el ensayo tipo western blot, dirigido a la etiqueta de 6His, una banda de
15kDa Figura 32. El peso teórico es de 13 kDa, por lo que, se alude, que ocurrieron
modificaciones postraduccionales, considerando la presencia de sitios de glicosilación
en el ectodominio de GP5 (Plagemann et al., 2002). No se observó ninguna banda en el
extracto sin infiltrar. Como control del sistema de expresión, en este experimento, se
59
utilizó el plásmido pICH7140, módulo 3’, que contiene el gen de GFP, y se observó la
fluorescencia bajo luz UV, de las hojas completas de las plantas infiltradas, no así en las
hojas de plantas sin infiltrar.
Con el fin de implementar la técnica de magnifection en CIATEJ, con los plásmidos
proporcionados por ICON Genetics, se realizó una cinética de expresión de GFP con
plantas de N. benthamiana, con el plásmido pICH7410. Se esperaba un perfil de
proteínas, separadas en PAGE-SDS, que mostrara un aumento considerable, al paso de
los días, de una proteína de alrededor de 30 kDa, a partir del 3 día post-infección
(Marillonnet et al. 2004). En la Figura 29, se observa claramente, la aparición de una
banda del peso estimado, a partir de los 12 dpi, así como la reducción de la banda de
aproximadamente 40 kDa, correspondiente a la subunidad pequeña de la proteína más
abundante, Rubisco.
Con el fin de comprobar el funcionamiento del sistema, con el plásmido pICH31070, se
decidió modificar la secuencia nucleotídica, a partir del plásmido pICH7410, con la
adición de una etiqueta de 6XHis, para facilitar su monitoreo durante una nueva cinética
de expresión, mediante inmunoblot con un anticuerpo monoclonal que detecta la
etiqueta, ya que no se contaba con anticuerpos específicos para la proteína GFP. El gen
de GFP etiquetada, nombrado GFP-His, fue clonado, con la técnica de Golden-gate, en
el plásmido pICH31070. Después de la infiltración de N. benthamiana no se detectaron
bandas en los ensayos de western blot.
El plásmido pICH31070 fue manipulado para la adición de los genes de interés, por
separado, y no se detectaron proteínas en los ensayos de western blot, de los extractos
de plantas infiltradas con el plásmido, en ninguna de las versiones de GP5t y GP5MLV.
Los experimentos llevados a cabo en CIATEJ, con los módulos entregados por ICON
genetics, proporcionan información preliminar, de que existe alguna limitante con el uso
del plásmido pICH31070, ya que, se observó (Figura 29), el aumento de la intensidad
de una banda, correspondiente al peso de la proteína GFP, acarreada por el plásmido
pICH7410. Sin embargo, después de modificar y movilizar la secuencia que codifica
para la proteína GFP al plásmido 31070, no se detectó en los ensayos de western blot,
la expresión de la proteína.
60
Debido a que no se observó la expresión de ninguna proteína, con el uso del plásmido
pICH31070, resulta necesario, cerciorase de que no hubo modificación del marco de
lectura de la proteína, así como de los sitios de recombinación, mediante la
secuenciación de los plásmidos, antes de realizar los experimentos de infiltración y
expresión de las proteínas.
Una vez que se compruebe que la secuencia que codifica para la proteína de interés, se
encuentra correctamente clonada, son necesarios algunos experimentos adicionales para
establecer las condiciones óptimas de cultivo de A. tumefaciens, así como el tiempo de
expresión de cada proteína en particular, después de la infiltración de plantas de tabaco.
9. CONCLUSIONES Se obtuvieron plantas transformadas con las construcciones GP5t-Cys-His y His-Cys-
GP5t, mediante el plásmido de expresión en plantas pCAMBIA2300.
La proteína GP5 del PRRSV fue modificada y clonada en los plásmidos de expresión
transitoria pICH31070, mediante la técnica Golden gate y pICH11599 de manera
convencional.
Se expresó de forma transitoria la proteína GP5 en la versión GP5t-Cys-His, en plantas
de tabaco, con el plásmido pICH11599.
10. PERSPECTIVAS Establecer las condiciones óptimas para la expresión transitoria de GFP, en cuanto a la
concentración bacteriana mínima necesaria para la infiltración, con los módulos 3’, 5’e
integrasa.
Reproducir la expresión transitoria de la proteína GP5t-Cys-His, para evaluar los
niveles de expresión que pueden alcanzarse, y comparar con el sistema bacteriano de E.
coli, que ya ha sido explorado en el laboratorio.
Obtener por lo menos dos versiones de las proteínas GP5t y GP5MLV, para realizar
experimentos de purificación, y finalmente, evaluar la disponibilidad de grupos
sulfhídrilos, para conjugación química a adyuvantes vacunales.
61
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67
12. ANEXOS
12.1 Memoria en extenso. 3er Congreso Internacional de Biología, Química
y Agronomía (2011).
Expresión transitoria del antígeno modificado GP5 del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino en plantas de
tabaco Aurora Xihuitl Huerta Robles 1, Ángel Gabriel Alpuche Solís2, José Francisco Robles
González3, Abel Gutiérrez Ortega1,*
1 Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco A. C. / Av. Normalistas No. 800, Col. Colinas de la Normal, CP 44270, Guadalajara, Jal., México /
2 Instituto Potosino De Investigación Científica y Tecnológica A. C/ Camino a la Presa San José 2055, Col. Lomas 4 sección, CP. 78216. San Luis Potosí, S.L.P., México/
3 Boehringer Ingelheim Vetmedica S.A. de C.V., Product Development & Diagnostic/ Calle 30 No. 2614, Z. Industrial, Guadalajara, Jal., México/ [email protected]
*Autor a quien la correspondencia deba ser enviada; Tel.: +52 (33) 3355.2000 ext. 1630; Fax: +52 (33) 3345.5200 ext. 1630, Unidad de Biotecnología Médica y Farmacéutica.
Área del Conocimiento: Biotecnología Farmacéutica
Resumen: El Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (PRRSV) posee tres proteínas estructurales principales, designadas como GP5, M y N, las cuales se han expresado y/o co-expresado en diferentes sistemas biológicos, para la creación de vacunas de nueva generación. Sin embargo la proteína GP5 del PRRSV es la principal proteína asociada con la inducción de anticuerpos neutralizantes en cerdos. En esta investigación se modificó la proteína GP5, con la adición de una cisteína reactiva para la futura conjugación química a adyuvantes particulados, y se expresó de manera transitoria en plantas de N. tabacum, usando una técnica desarrollada recientemente por Icon Genetics denominada “Magnifección” basada en módulos virales desarmados.
Palabras Clave: PRRSV, GP5, Magnifección
Abstract: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) has three major structural proteins, designated GP5, M and N, which have been expressed and/ or co-expressed in different biological systems, for the creation of new generation vaccines. However, GP5 is the major protein associated with the induction of neutralizing antibodies in pigs. In this research the GP5 protein was modified with the addition of a reactive
68
2
�
cysteine for future chemical conjugation to particulate adjuvants, and was expressed transiently in plants of N. tabacum, using a technique recently developed by Icon Genetics called “Magnifection” based in deconstructed viral modules.
Key words: PRRSV, GP5, Magnifection
1. Introducción
El síndrome respiratorio y reproductivo porcino actualmente representa una de las enfermedades
infecciosas más importantes por el gran impacto económico que tiene en la industria porcina a nivel
nacional y se encuentra en la lista de enfermedades y plagas exóticas y enzoóticas de notificación
obligatoria publicada en el Diario Oficial de la Federación en Septiembre de 2007.
El virus que ocasiona esta enfermedad, denominado virus del síndrome respiratorio y reproductivo
porcino (PRRSV), tiene seis proteínas estructurales, cuatro glicoproteínas (GP2, GP3, GP4 y GP5),
una proteína de membrana (M) y una proteína de nucleocápside (N) [1]. Existen antecedentes de que la
proteína GP5 posee un ectodominio con sitios de N-glicosilación, donde se ha demostrado la
localización de epítopos neutralizantes [2].
La producción del antígeno modificado GP5 del PRSSV en un sistema de expresión que permita su
procesamiento adecuado proporcionaría antígenos capaces de ser acoplados a partículas tipo virus
mediante conjugación química. Esto probablemente representa una buena alternativa a las vacunas
actualmente disponibles contra este patógeno, por tratarse de una vacuna subunitaria de nueva
generación.
Recientemente, la utilización de plantas transgénicas en la producción de vacunas, anticuerpos y
proteínas de interés farmacéutico ha sido objeto de estudio en la ingeniería genética vegetal y se
pueden destacar dos características importantes: capacidad de llevar a cabo modificaciones
postraduccionales complejas, como la glicosilación, y la minimización de riesgo de contaminación por
patógenos potenciales para los humanos y animales [3]. Sin embargo, todos los métodos de expresión
69
3
�
tienen varias limitantes, como el largo período de tiempo necesario para la transformación estable, el
bajo rendimiento obtenido, y la inhabilidad de los sistemas transitorios de ser escalados [4]. Una
técnica desarrollada recientemente por Icon Genetics (Bayer), conocida como Magnifección, puede
superar estas desventajas. El sistema de Magnifección permite una producción más rápida, altos
niveles de expresión de proteínas recombinantes y es un proceso muy versátil que permite trabajar
satisfactoriamente con varias proteínas recombinantes [5].
El objetivo de esta investigación es expresar de manera transitoria el antígeno GP5 del virus del
síndrome respiratorio y reproductivo porcino en plantas de tabaco. Dicho antígeno se modificó a nivel
de la secuencia nucleotídica de manera que pueda tener potencial para conjugarse químicamente a
algún adyuvante particulado, gracias a la incorporación de residuos de cisteína.
2. Materiales y Métodos
Diseño del gen sintético y construcción de plásmidos
Se diseñó un gen sintético que codifica para el antígeno GP5 del PRRSV basado en la secuencia
nucleotídica de un aislado viral mexicano, proporcionado por Boehringer Ingelheim Vetmedica. A
partir de la secuencia PRRSV-2005/sitio 27-1, se seleccionó una región de 89 aminoácidos que
corresponden a la parte amino-terminal de la proteína GP5 (Figura 1), de la cual los 40 primeros aa
corresponden a la región del ectodominio [2]; el gen fue optimizado con el uso de codones de
Nicotiana tabacum, para aumentar los niveles de expresión del transgén. Se modificó la secuencia que
codifica para la glicoproteína 5 truncada (GP5t,1-89 aa.) con la adición de una secuencia espaciadora,
((Gly)4Ser)3, seguida de la secuencia GGCGG donde se encuentra la cisteína, y una etiqueta de seis
histidinas. Además, se integraron los sitios de restricción NcoI y SacI en los extremos 5´y 3´,
respectivamente. El gen sintético se denominó GP5-cys, se diseñó en el programa informático CLC
DNA Workbench 6.0.2 y se sintetizó por la empresa GenScript, con EcoRV como estrategia de
clonación en el vector pUC57.
70
4
�
Figura 1. Secuencia de aminoácidos del ORF5 del PRRSV. Los posibles sitios de N-glicosilación están indicados con estrellas; la región que se resalta en color amarillo corresponde a la selección
GP5t.
Los vectores binarios, pICH11599, pICH14011, pICH15879 y pICH7410 [4] se describen en la Figura
2. Se movilizó el gen sintético con las enzimas de restricción NcoI y SacI del vector de clonación
pUC57 al vector binario pICH11599, resultando pICH-GP5 (Figura 2). El vector pICH-7410, que
contiene el gen de la proteína verde fluorescente, fue empleado como control de expresión y
funcionamiento de los módulos utilizados.
71
5
�
Figura 2. Representación esquemática de los genes y vectores. A. Gen sintético GP5-cys. (GP5t: secuencia de 89 aa de GP5. ((Gly4)Ser)3:Linker. GGCGG: cisteína reactiva. 6X His:etiqueta de histidinas). B. Regiones del T-DNA de los constructos de ICON usados en este estudio. (Act2: promotor de la actina 2 de Arabidopsis. P-hsp: promotor de la proteína de choque térmico de
Arabidopsis. INT: integrasa del fago PhiC31 de Streptomyces. AttP/AttB: sitios de recombinación de la integrasa PhiC31. RdRp, RNA polimerasa dependiente de RNA, MP: proteína de movimiento.
3´NTR, Región no traducible 3´. nos: terminador de la nopalina sintasa. LB y RB: bordes izquierdo y derecho de la región del T-DNA. GP5: gen sintético. GFP: proteína verde fluorescente)
Procedimiento de Agroinfiltración
Cada uno de los vectores binarios ICON fueron introducidos por separado en Agrobacterium
tumefaciens GV3101 por electroporación. Las cepas resultantes se crecieron en 50 mL de medio LB
suplementado con Kanamicina (50 µg/ml) y Rifampicina (50 µg/ml), a 28 ºC, por 24 horas. Las células
se centrifugaron 10 minutos a 4500 rpm a 4ºC, y se resuspendieron en 1 volumen de medio de
infiltración (10 mM MES-NaOH pH 5.5, 10 mM Mg2SO4). Las suspensiones bacterianas fueron
mezcladas en volúmenes iguales (modulo 5´:modulo 3´:integrasa 1:1:1) previo a la infiltración, y se
diluyó la mezcla 1:1000 (§ 104- 105 ). Se sumergieron las plantas completas en el medio y se aplicó
vacío durante 45 segundos.
Análisis de proteínas
Las hojas de N. tabacum infiltradas se cosecharon a los 7 días post-infección (dpi), se congelaron en
N2 líquido, y se liofilizaron. Una porción del tejido (80 mg peso seco) se homogeneizó con buffer de
extracción de proteínas adicionado con cóctel de inhibidores de proteasas (Roche). Se cuantificó la
proteína total soluble con el método de Bradford con albúmina de suero bovina como estándar.
Para el western blot, las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE en gel de poliacrilamida al l4%,
transferidas a una membrana de nitrocelulosa e incubadas toda la noche con un anticuerpo monoclonal
de ratón Anti-poliHistidina (Sigma), como anticuerpo primario en dilución 1:2000. Después de lavar la
72
6
�
membrana con PBS-Tween, se incubó con el segundo anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón acoplado a
peroxidasa (Biorad) en dilución 1:3000 durante 3 horas y se reveló con el sustrato para peroxidasa (4-
cloro-naftol de Biorad).
3. Resultados
Se comprobó el funcionamiento de los vectores virales empleados para le expresión transitoria con la
observación bajo luz UV de la proteína verde fluorescente en el tejido fresco de N. tabacum (Fig. 3).
El antígeno modificado GP5 fue satisfactoriamente expresado en hojas de N. tabacum. El peso
molecular teórico de la proteína recombinante es de 13 kDa, mientras que el western blot con el
anticuerpo monoclonal de ratón Anti-poliHistidina como anticuerpo primario, después de 7 dpi (Figura
4), reveló una proteína de § 15 kDa. No se observaron bandas en las hojas de la planta del control
negativo.
Figura 3. Expresión transitoria de GFP (7 dpi)
en hojas de N. tabacum coinfiltradas con los
vectores: pICH-1401, pICH-15879 y pICH-7410.
Figura 4. Western-blot. M: Marcador See Blue®
1: Control positivo (15 kDa). 2: Control
Negativo (Extracto sin infiltrar). 3: GP5 (15 kDa)
4. Discusión
Durante la última década, la posibilidad de utilizar a las plantas como sistemas de producción de
proteínas de interés farmacéutico ha sido demostrada. Las plantas ofrecen varias ventajas: son
económicas, escalables y tienen un riesgo muy bajo de contaminación con patógenos humanos y
73
7
�
animales [3]. Sin embargo existen dos limitaciones importantes en el desarrollo de proteínas y vacunas
basadas en la generación de transgénicos estables: en primer lugar, el tiempo necesario para generar,
seleccionar y caracterizar las líneas transgénicas estables es, por lo general, largo, y, en segundo lugar,
nivel de expresión que se logra con este método es bajo [6].
En el caso de la proteína GP5 del PRRSV producida en plantas de tabaco transgénicas bajo el
promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor [tabaco que expresa GP5], se obtuvieron niveles muy
bajos de expresión, aproximadamente 0.011% de la proteína total soluble, después de 3 meses de
selección y regeneración de transformantes[7]. En contraste, con el uso del sistema de pro-vectores
virales [5] desarrollado por Icon Genetics, se logró expresar la proteína modificada GP5 en niveles
detectables por inmmunoblot, a los 7 dpi. Por otro lado, de acuerdo al programa computacional Expasy
el peso molecular (PM) para la proteína recombinante es de 13 kDa sin glicosilaciones. En la figura 4
se observa una diferencia entre el PM teórico y el de la proteína producida por la planta (§ 15 kDa). En
este sentido, el resultado puede compararse con lo observado en la fusión de la proteína de la
nucleocápside de la Hepatitis B y la proteína de envoltura del virus del dengue, expresados en N.
benthamiana [8].
5. Conclusiones
El protocolo y los vectores descritos representan un sistema simple, económico y versátil de expresión
de proteínas recombinantes en plantas. El sistema es muy rápido y se aprovechó la capacidad de las
plantas de realizar modificaciones postraduccionales, considerando la naturaleza de la glicoproteína de
interés.
Agradecimientos
Al fondo Sectorial SEP-CONACYT de Investigación Básica 2007 a través del proyecto aprobado con
clave 83863.
74
8
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12.2 Reconocimiento
76
13. APÉNDICES
13.1 Oligonucleótidos empleados para etiquetar las diferentes versiones de la
proteína GP5MLV
Tm: temperatura de alineamiento, pb: pares de bases, E: específicas a la secuencia
original
No Nombre Papel SECUENCIA Tm pb pb E
TmE
1 pGP5MLV-1 Fwd 5´ TTTATGTTGGAGAAATGCTTGAC CGCGGGC 3´
76 30 27 75
2 pGP5MLV-2 Rev 5´TTTATGATGATGATGATGATGAGGACGACCCCATTGTTC 3´
77 39 18 57
3 pGP5MLV-3 Fwd 5´TTTGGTCTCAAGGTATGTTGGAGAAATGCTTGAC 3´
71.4 34 20 54
4 pGP5MLV-4
Rev 5´TTTGGTCTCTAAGCCTAATGATGATGATGATGATG 3´
70 35 21 50
5 pGP5MLV-5 Rev 5´TTTTCCTCCACATCCTCCAGGACGACCCCATTGTTC 3´
80 36 18 57
6 pGP5MLV-6 Rev 5´TTTGGTCTCTAAGCCTAATGATGATGATGATGATGTCCTCCACATCCTCCAGG 3´
83 53 39 77
7 pICH-GP5MLV7
Fwd 5´TTTATGCATCATCATCATCATCAT TTGGAGAAATGCTTGACC 3´
77 42 18 53
8 pICH-GP5MLV8 Rev 5´TTTCTAAGGACGACCCCATTGTTCCGCTGAA 3´
75 31 28 73
9 pICH-GP5MLV9
Fwd 5´TTTGGTCTCAAGGTATGCATCATCATCATCATCAT TTG 3´
74 38 24 60
10 pICH-GP5MLV10
Rev 5´TTTGGTCTCTAAGC CTAAGGACGACCCCATTGTTC 3´
74.2 35 21 59
11 pICH-GP5MLV11
Fwd 5´TTT GGAGGATGTGGAGGA TTGGAGAAATGCTTGACC 3´
77.4 36 18 53
12 pICH-GP5MLV12
Fwd 5´TTTGGTCTCAAGGT ATGCATCATCATCATCATCATGGAGGATGTGGAGGA TTG 3´
84.2 53 18 55
13 GP5MLV-His 1
Fwd 5´TTTGGTCTCAAGGTATGTTGGAGAA 3´
61 25 - -
14 GP5MLV-His 2
Rev 5´TTTGGTCTCTAAGCCTAATGATGAT 3´
62 25 - -
15 His-GP5MLV 3
Fwd 5´TTTGGTCTCAAGGTATGCATCATC 3´
61 24 - - 16 His-GP5MLV 4
Rev 5´TTTGGTCTCTAAGCCTAAGGACGAC 3´
62 25 - -
77
13.2 Oligonucleótidos empleados para etiquetar las diferentes versiones de la
proteína GP5t y clonar en el plásmido pICH31070
Tm: temperatura de alineamiento, pb: pares de bases, E: específicas a la secuencia
original
13.3 Composición de medios de cultivo para bacterias
LB 250 ml
NaCl 2.5 g
Peptona 2.5 g
Extracto de levadura 1.25 g
Agar 5 g
YEB
Extracto de carne 0.5 %
Extracto de levadura 0.1 %
Peptona 0.5 %
Sacarosa 0.5 %
MgSO4 0.04 %
Agar 2 %
No Nombre Papel SECUENCIA Tm pb pb E Tm E
1 pGP5t-1 Fwd 5´TTTGGTCTCAAGGTATGGTTCTTGTTAATGCTAATTCTTC 3´
60.9 40 26 53.6
2 pGP5t-2 Rev 5´TTTGGTCTCTAAGCTCAATGATGATGATGATGATGTCC3
61.8 38 24 54.2
3 pGP5t-3 Fwd TTTGGTCTCAAGGTATGGGGCATCATCATCATCA 3
63.4 34 20 54.6
4 pGP5t-4 Rev TTTGGTCTCTAAGCTCAAACAACAGCATAAATAGAAGAAA 3
60.8 40 26 53.1
78
13.4 Composición de medios de cultivo para plantas
Medio de recuperación de explantes 1 L
Sales MS 4.42 g
Sacarosa 30 g
Fitagel 2.5 g
BAP 0.5 mg
pH 5.8
Medio de selección de explantes 1 L
Sales MS 4.42 g
Sacarosa 30 g
Fitagel 2.5 g
BAP 0.5 mg
Kanamicina 100 mg
Cefotaxima 300 mg
pH 5.8
Medio de enraizamiento 1 L
Sales MS 4.42 g
Sacarosa 30 g
Fitagel 2.5 g
Kanamicina 100 mg
Cefotaxima 300 mg
pH 5.8
