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HORASISEMANA:

TITULO:

ASESOR:

LUGAR DE REALIZACI~N

FECHA DE INICIO

FECHA DE TERMINACI~N

PROYECTO:

SOFÍA ORTIZ ISLAS

89342638

(595) 5 1835

BIOLOGÍA EXPERIMENTAL

UNIDAD IZTAPALAPA. D I V I S I ~ N DE CIENCIAS BIOL~GICAS Y DE LA SALUD

98-P

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RELACION ENTRE EL, CONTENIDO DE CARBOHIDRATOS Y LA VIABILIDAD DE LAS ESPORAS DE HELECHO DEL GENERO Dryopteris, CUANDO SON SOMETIDOS A UN PROCESO DE ENVEJECIMIENTO ACELERADO.

Dr. DAVID M. DÍAZ PONTONES PROFESOR T1TULAR.T' T.C. DEPTO. CIENCIAS DE LA SALUD

UNIVERSIDAD A U T ~ N O M A METROPOLITANA

LAB. DE CITOQU~MICA S-247.

UNIDAD IZTAPALAPA. DIVISIóN DE C.B.S. DEPARTAMENTO CIENCIAS DE LA SALUD

26 DE JUNIO DE 1998.

: 6 DE DICIEMI E DE 1998.

ESTUDIO E5 lRUCTUR4L Y BIUQUÍMICO DEL DESARROLLO DE SEMILLAS DEL GÉNERO Ipomoea.

ASESOR

" '

"

Dr. DAVID M. DÍAZ PONTONES

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA

Casa abierta al tiempo DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

DEPARTAMENTO CIENCIAS DE LA SALUD

LICENCIATURA EN BlOLOGlA EXPERIMENTAL

RELACION ENTRE EL CONTENIDO DE CARBOHIDRATOS Y LA VIABILIDAD DE LAS ESPORAS DE HELECHOS DEL GENERO Dryopteris, CUANDO SON

SOMETIDOS A UN PROCESO DE ENVEJECIMIENTO ACELERADO.

SERVICIO SOCIAL QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

LICENCIADO EN BlOLOGlA EXPERIMENTAL

P R E S E N T A :

ALUMNA: SOFIA ORTIZ ISLAS

Matricula 89342638

MEXICO, D. F. A 22 DE JUNIO DEL 2001

Carbohidratos y Envejecimiento en Esporas de Helechos

El presente trabajo fue realizado en el laboratorio de Citoquímica del Departamento de

Ciencias de la Salud de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud de la

Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa bajo la dirección del Dr. David

Díaz Pontones y la asesoría del Dr. Ramón Riba y Nava Esparza y de la Dra. Blanca

Pérez Garcia del Departamento de Biología, UAM-I.

Carbohidratos y Envejecimiento en Esporas de Helechos

AGRADECIMIENTOS:

Al Director del Servicio Social:

Por haber aportado ha mi formación académica sus valiosos conocimientos, su dedicaci6n y sobre todo su invaluable paciencia y comprensión.

DR. DAVID DÍAZ PONTONES

A los Asesores del servicio social: DR. RAMóN RIBA Y NAVA ESPARZA Y LA DRA. BLANCA PÉREZ GARCÍA Por sus comentarios y sugerencias a este servicio social y por sus enseñanzas que con ejemplos dijeron mas que mil palabras.

Carbohidratos y Envejecimiento en Esporas de Helechos

RECONOCIMIENTO

Deseo expresar mi total reconocimiento a la memoria del Dr. Ramón Riba y Nava

Esparza (1934 - 1999) quien fue asesor de este reporte de servicio social. El Dr. Riba fue

sin duda alguna un ejemplo del quehacer científico de un mexicano en la actualidad.

Además de poseer cualidades únicas como científico, su enorme deseo de irradiar su

conocimiento a las generaciones de estudiantes de biología lo caracterizó. Su calidad y

calidez humana fue un sello de su actividad docente. Su labor en la ciencia es y seguirá

siendo la directriz para muchos jóvenes investigadores mexicanos, dentro de los que me

incluyo. El Dr. Riba con ejemplo y entusiasmo siempre impulsó el desarrollo personal e

intelectual de aquellos con los que interactuaba heredando además el compromiso con la

ciencia y el trabajo. Dedico por lo tanto este trabajo que fue parte de su inspiración a su

memoria y como testimonio de su gran aportación a la ciencia en el mundo.

RELACION ENTRE EL CONTENIDO DE CARBOHIDRATOS Y LA VIABILIDAD DE LAS

ESPORAS DE HELECHOS DEL GENERO Dryupteris, CUANDO SON SOMETIDOS A UN PROCESO DE

ENVEJECIMIENTO ACELERADO.

Carbohidratos y Envejecimiento en Esporas de Helechos

INDICE GENERAL

Indice General indice de figuras Índice de tablas

I.- Resumen 11.- Introducción 111.- Antecedentes

A.-Helechos B.-Ciclos de vida C.-Proceso de germinación de las esporas D.-Desarrollo del talo gametofítico E.- Metabolismo de las estructuras de dispersión durante 1a.germinación

1V.- Justificación V.- Objetivos

A.-Objetivo general B.-Objetivos específicos

A.-Colecta del material biológico B .-Tratamiento de las esporas C.- Extracción de carbohidratos solubles D.-Cuantificación de carbohidratos reductores totales E.-Cuantificación de sacarosa y glucosa F.- Germinación de las esporas

A.-Viabilidad de las esporas B.-Cantidad de carbohidratos reductores totales C.-Cantidad de glucosa D.-Cantidad de sacarosa E.-Viabilidad y sacarosa

VI.- Metodología

VI1.- Resultados

VII1.-Discusión 1X.- Conclusiones X.- Bibliografía XI .- Lugar de realización XI1.- Actividades realizadas

I i1 i11

10 11 11 11 12 12 13 13 15 15 15 18 18 20 22 24 26 27 32 33 37 37

I

Carbohidratos y Envejecimiento en Esporas de Helechos

INDICE DE FIGURAS

Fig. l . Ciclo de vida de los helechos

Fig. 2. Diagrama del método de extracción de carbohidratos solubles.

Fig. 3. Diagrama del método de cuantificación de carbohidratos reductores totales con el reactivo de antrona.

Fig. 4. Diagrama del método para cuantificar sacarosa y glucosa por pruebas enzimáticas.

Fig. 5. Porcentaje de germinación de las esporas de helecho para cada tiempo de tratamiento (O, 2 y 5 meses de envejecimiento. ).

Fig. 6. Cuantificación de carbohidratos reductores totales por el método de antrona durante el periodo de tratamiento (O, 2 y 5 meses de enve.jecimiento).

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Fig. 7. Cantidad de glucosa, determinada mediante los equivalentes de NADH producidos en reacciones acopladas durante el periodo de tratamiento (O, 2 y 5 meses de envejecimiento). 23

Fig. 8. Cantidad de sacarosa. determinada mediante los equivalentes de NADH producidos en reacciones acopladas en el periodo de tratamiento (O, 2 y 5 meses de envejecimiento). 25

Fig. 9. Relación entre la cantidad de sacarosa y la viabilidad de las esporas durante el tratamiento (O, 2 y 5 meses). 26

Carbohidratos y Envejecimrento en Esporas de Helechos

INDICE DE TABLAS

Tabla I . Descripción de las colectas de helechos realizadas en diferentes localidades. 12

Tabla 2. Capacidad germinativa de las esporas de helechos del género Dryopteris al tiempo de arribar al laboratorio y Pérdida de la capacidad germinativa de las esporas de helecho después del tratamiento a los 2 y 5 meses. 18

Carbohidratos y Envejecimiento :;: ::$poras de Helechos

Sofía Ortiz Islas. 89342638. Biología Experimental. RELACION ENTRE EL CONTENIDO DE CARBOHIDRATOS Y LA VIABILIDAD DE LAS ESPORAS DE HELECHO DEL GENERO Dryopteris, CUANDO SON SOMETIDOS A UN PROCESO DE ENVEJECIMIENTO ACELERADO. BE. 016. 98. 27 de Junio del 2001. Dr. David M. Díaz Pontones. Profesor Titular “C” T.C. CBS. Depto. Ciencias de la Salud.

Los helechos son plantas criptogamas (plantas sin flores) vasculares que forman parte de las Pteridofitas. Se considera que existen alrededor de 11000 especies de helechos en el mundo y particularmente en México se calcula que hay aproximadamente 1000 de ellas. Los helechos del genero Dryopteris se encuentran distribuidos principalmente en hábitats de alta humedad y temperatura.

El presente trabajo tiene como objetivo relacionar los cambios existentes entre el contenido de carbohidratos solubles y la pérdida de la capacidad de germinación de las esporas de helecho del género Dryopteris sometidas a condiciones controladas de alta humedad (75% HR) y a una temperatura constante de 25°C; tratando de simular las condiciones ambientales a las cuales están sometidas normalmente; el tratamiento se realizó por un periodo de 5 meses. Las especies de helecho estudiadas fueron: D. arguta, D. karwinskiana, D. patula, D. pseudo$lix-max, D. rosea, D. rossi, D. Wullichiunu, D. sp.

En las especies estudiadas se encontró que el porcentaje de germinación era superior al 60% cuando llegaron al laboratorio, mientras que el tratamiento de envejecimiento acelerado provocó a los 2 meses un decremento de éste a menos de la mitad en la mayoría de las especies; los valores de germinación a los 5 meses se encuentran por debajo del 20% de germinación, llegando en algunos casos a perderse totalmente. Existe una estrecha correlación entre la perdida de la capacidad germinativa y el decremento en la cantidad de sacarosa. Se observaron diferentes tendencias en el comportamiento de los niveles de sacarosa durante el tratamiento. la primer tendencia tiene cuatro casos en los cuales el decremento en los niveles de sacarosa conforme transcurre el tiempo de tratamiento es progresivo (D. arguta AMR- 14 1 y BPG- 1054, D. ~~o.ceu. D. rossii y D. sp,). La siguiente tendencia se observa para las esporas de D. kurwinskiana y D. patula, en donde los valores de sacarosa a los dos meses de tratamiento descienden significativamente para posteriormente incrementarse a los 5 meses de tratamiento. La ultima tendencia fue observada en D. pseudo,filix-mux y D. wdichianu en donde ocurre que a los dos meses de tratamiento los niveles de sacarosa se incrementan, para posteriormente descender a los 5 meses en donde presentan sus niveles mas bajos. Cuando se grafica la capacidad de genninación de las esporas contra la cantidad de sacarosa se observa un comportamiento hiperbólico, encontrando que cuando la germinación es inferior al 10% ésta se relaciona con valores de sacarosa de entre 1 y 7 mg/mg de espora.

Cuando se someten a 25” C y 75% de HR, se produce una perdida en la capacidad germinativa. Por lo tanto podemos concluir que las esporas pierden su capacidad germinativa en condiciones de almacenamiento (más de 5 meses). No existe una correlación entre la perdida de la germinación y la cantidad de glucosa o de reductores totales. Esto podría deberse a que la cantidad de glucosa cuantificada no únicamente involucra al almacenamiento intracelular, sino además a los productos de degradación intra y extracelular producto del envejecimiento. La sacarosa, carbohidrato que es almacenado en la espora, es degradado durante el proceso de envejecimiento acelerado y correlaciona con la perdida en la germinación, por lo tanto la sacarosa es un indicador adecuado de la perdida de la germinación.

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Carbohidratos y EnvLw;5tmiento en Esporas de Helechos

11. INTRODUCCI~N

El registro fósil referente a los helechos es abundante desde el periodo Carbonífero. Hoy en día encontramos que el número de helechos comprende alrededor de 1 1 O00 especies; formando un gran grupo de plantas (Raven, et al. 1992).

La diversidad de los helechos es variada en los trópicos, donde alrededor de las tres cuartas partes de las especies son encontradas. CJnicamente alrededor de 380 especies de helechos se encuentran en los Estados Unidos y Canadá, mientras que alrededor de 1 O00 especies se encuentran en la región tropical y subtropical de América (Raven, et d . 1992).

La mayoría de los helechos son homospóricas, esto es, el esporofito produce esporas del mismo tipo, las que al germinar dan lugar a gametofitos bisexuados, monóicos. El esporofito es una planta vascularizada, de vida independiente y autotrófica, con órganos de anclaje y absorción (raíces), un cuerpo de forma variada (tallo o rizoma) y órganos fotosintéticos también muy diversos (hojas). En el esporofito de los helechos encontramos una complejidad estructural muy variada (Pérez G, et al., 1992)

A pesar del gran número de esporas que forman los helechos, en la naturaleza muy pocas completan su desarrollo hasta gametofitos maduros ya que muchas son transportadas por corrientes de aire a lugares desfavorables para su germinación. Otro factor que causa la disminución en la población de helechos es la tala inmoderada y los grandes incendios forestales que están sufriendo bosques y selvas en todo el mundo.

En las Pteridofitas, como en otras plantas, su reproducción depende de la capacidad de sus esporas para germinar y de que los gametofitos resultantes compitan exitosamente entre sí y con otras plántulas por espacio y nutrimentos. Sin embargo, es importante conocer cómo se relaciona la cantidad de carbohidratos presentes en las esporas, asociándolo a la capacidad germinativa cuando son sometidas a temperaturas y humedades altas, en forma análoga como se encuentra en su hábitat.

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Carbohidratos y Envejec:miento en Esporas de Helechos

111. ANTECEDENTES

A.- HELECHOS

Los helechos son plantas criptógamas (plantas sin flores) vasculares que forman parte de las pteridofitas. Se desarrollaron en el periodo Devónico, hace aproximadamente 400 millones de años y aunque gran número de especies se extinguieron durante el Carbonífero, muchas otras especies han sobrevivido hasta nuestros días (Reyes, et al. 1995; Mickel y Beitel, 1988; Tryon y Tryon, 1982).

Se considera que existen alrededor de 1 1000 especies de helechos en el mundo y particularmente en México se calcula que hay aproximadamente 1000 de ellas. Son de gran diversidad en formas y tamaños y su talla puede variar de unos cuantos centímetros hasta varios metros de altura, como ocurre en los helechos arborescentes pertenecientes a las familias Dicksoniaceae y Cyatheaceae (Mickel y Beitel, 1988; Reyes, et al, 1995).

Los helechos se encuentran en diferentes ambientes, desde acuáticos (Salvinia, Azollu y Mursilea), hasta desérticos (Notholaena, Cheilanthes, Pellaea, entre otros), pero la mayoría crecen en bosques templados y tropicales, donde encuentran condiciones de sombra, humedad, luz, temperatura y nutrimentos, entre otros. que les permiten completar su ciclo de vida (Raghavan, 1992; Reyes, et al, 1995; Mickel y Beitel. 1988).

La familia Dryopteridaceae Herter está conformada por 16 géneros con más de 400 especies. En México se encuentra representada por los géneros: Arachniodes, Didynzochlnena, Dryopteris, Olfersia, Phanerophlebia, Polybotrya, Polystichum y Stigmutoptcris. Son plantas terrestres, epipétricas o epífitas, con tallos o rizomas erectos con escamas, tienen los ejes foliares sulcados adaxialmente. con los surcos decurrentes. con tres o más haces vasculares en el pecíolo, esporas monoletes aclorofílicas y número cromosómico n=4 1 (Moran, 1995).

B.- CICLO DE VIDA

El ciclo de vida de los helechos se compone de dos fases independientes y de vida libre, una perenne y conspicua que es el esporofito (2n, generación esporofítica) y la otra inconspicua y de vida relativamente corta que es el gametofito n, generación gametofítica (Raghavan, 1992; Pérez-Garcia, et al, 1995). La generación esporofítica es la planta conocida comúnmente como helecho, compuesta por numerosas hojas, un tallo y rizomas (Fig. 1). Generalmente en el envés de las hojas se forman diminutos esporángios. los cuales pueden estar agrupados en estructuras en forma discoidal conocidas como soros. Dentro de los esporangios se forman las esporas, que son resultado de divisiones meióticas de las células madres esporofíticas y que por lo tanto son haploides (n); cada una contiene únicamente un juego de cromosomas. Cuando los esporangios maduran liberan a miles de esporas, que son llevadas por el viento azarosamente, favoreciendo su dispersión a través de grandes distancias, a diferentes sitios; las que encuentran condiciones favorables para germinar producen un gametofito (Raghavan, 1992; Reyes, et al 1995).

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Carbohidratos y Envejeclmrento en Esporas de Helechos

De la misma manera que las plantas con flores que producen estructuras de dispersión como las semillas (fase esporofitica) o los granos de polen que cuando germinan dan origen al gametofito masculino para reproducirse, los helechos forman esporas, que son estructuras microscópicas que dan origen al gametofito (n) (Reyes, et al, 1995; Rudramuniyappa, 1991).

La generación gametofítica es inconspicua y la más vulnerable a los cambios micro ambientales y a las presiones de selección del medio; comienza con la formación de las esporas en el esporangio del helecho; las esporas germinan y forman diminutas plantas pluricelulares, conocidas como protalos o gametofítos, los cuales posteriormente forman 6rganos sexuales masculinos (anteridios) y femeninos (arquegonios). en los que se forman gametos que al unirse inician la fase diploide, es decir la generación esporofítica (Reyes, et al, 1995). Ésta fase es esencial por la variabilidad genética, la que puede fomentar adaptaciones en estas plantas, lo que trae como consecuencia una mejora en la especie. En ésta fase se presentan dos posibilidades de fecundación, autofecundación y fecundación cruzada.

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Carbohidratos y Envejecimienf. :n Esporas de Helechos

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Fig. 4 . Life cyces of ferns

Fig. 1.- Ciclo de vida de los helechos (tomado de American Fern Society en: www.amerfernsoc.org)

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Carbohidratos y Envejecimiento en Esporas de Helechos

C.- PROCESO DE GERMINACION DE LAS ESPORAS

La espora de los helechos es unicelular con un núcleo central rodeado por el citoplasma en el cual están inmersos cloroplastos o leucoplastos y cuerpos lipidicos. El contenido protoplásmico está rodeado por una delgada pared, la intina; rodeada por una capa externa, gruesa, impermeable, de esporopolenina, de muy diversa ornamentación, la exina. En la mayoría de los helechos las esporas son liberadas del esporangio una vez que estas han alcanzado su completo desarrollo y son capaces de permanecer viables por tiempo variable (Perez-Garcia, 1988; Lloyd y Davis, 1994; Rudramuniyappa, 1991).

Los helechos pueden ser homospóricos, es decir, las esporas de una especie tienen el mismo tipo, forma y tamaño que al germinar originan gametofitos bisexuados, este tipo de esporas está presente en la mayoría de las familias de helechos como Polypodiaceae. Thelypteridaceae, Dryopteridaceae, Aspleniaceae, Cyatheaceae. Los helechos heterospóricos pueden presentar dos tipos de esporas, unas pequeñas (microsporas) y otras grandes (megasporas) las cuales al germinar dan gametofitos unisexuados: este tipo de esporas se presenta en helechos acuáticos Azolla. Salvinia, Marsilea. Pilularia, Regnellidium y Platyzoma (Schneller y Holderegger, 1994; Tryon, 1 964).

En la mayoría de los helechos homospóricos, la germinación es precedida por el hinchamiento del contenido de la espora por absorción de agua; la intina se expande, pero la exina se abre por la lesura. Una serie de divisiones celulares subsecuentes en una secuencia definida, dan como resultado la formación de un protalo. Comílnmente la germinación de la espora produce un rizoide primario seguido por un filamento germinal pluricelular y uniseriado. Raramente, en algunos helechos más primitivos se forma una masa celular o una lámina en lugar de un filamento germinal (Lloyd y Davis, 1994; Raghavan, 1992).

Un 90% de los helechos forman esporas no clorofílicas, con viabilidad larga y el resto forman esporas clorofílicas que tienen viabilidad corta y se presentan en helechos de familias tales como Grammitidaceae. Hymmenophyllaceae y Vittariaceae (Raghavan, 1992).

D.- DESARROLLO DEL TALO GAMETOF~TICO

Cuando la espora germina, generalmente se forman dos tipos de células: protálicas y rizoidales, las primeras tienen cloroplastos y las segundas son alargadas; la función de las células rizoidales es similar a la de una raíz, proporcionan a la planta sostén. agua y nutrimentos (Raghavan, 1992; Reyes, et al, 1995).

El gametofito joven en los primeros días tiene aspecto filamentoso, formado por una hilera de células, resultado de divisiones mitótica que definen el patrón de germinación. Posteriormente adquiere forma espatulada y presenta un meristem0 pluricelular marginal que le permite continuar su crecimiento. Durante su desarrollo (dependiendo de la especie) puede formar tricornas o pelos (Rudramuniyappa, 1991; Reyes, et d. 1995).

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Carbohidrato3 y Envej,:L 4enfo en Esporas de Helechos

Los protalos más comunes de los helechos avanzados forman esporofítos jóvenes en un periodo de 4 a 8 meses, sin embargo varias especies de la familia Polypodiaceaes, requieren únicarnente de 60 a 90 días, por ejemplo: Niphidium crasslfoliurn y diferentes especies de Pleopeltis (Reyes, et al, 1995).

La forma de los garnetofitos maduros puede ser acintada, reniforme o cordiforme. Esta última, en forma de corazón es la más frecuente en los helechos homospóricos. Se forma un meristemo pluricelular en la escotadura de la región apical del gametofito; la región media tiene varias células de grosor y recibe el nombre de co-jinete y a los lados de &te resaltan las alas que se extienden formando una lámina unicelular; en el extremo opuesto del meristemo se observan numerosos rizoides marginales y superficiales (Reyes, et al. 1995).

Los gametofitos son el talo sexual de los helechos, cuando alcanzan su madurez formarán órganos femeninos (arquegonios) y masculinos (anteridios). Aunque puede variar su localización en el gametofito, normalmente los arquegonios se forman por abajo de l a escotadura meristemática, en la región anterior del cojinete; por otra parte los anteridios se encuentran en la región posterior del talo cerca o entre los rizoides. Normalmente son bisexuales o monoicos y la fecundación ocurre entre gametos del mismo gametofito (intragametofítica); en ocasiones pueden ser unisexuales o dioicos y entonces l a fecundación ocurre entre gametos de gametofítos diferentes: intergametofítica (Reyes, et al, 1995).

El protalo de los helechos es relativamente simple, no hay diferenciación en cirganos especializados como ocurre en otras plantas. Los arquegonios de los helechos homospóricos tienen una forma similar a la de una botella, donde unas células forman el cuello que sobresale de la superficie del talo y otras en la parte globosa rodean a la oosfera que es el gameto femenino y que está sumergida en el gametofito (Reyes, et al, 1995).

Por otra parte los anteridios son estructuras simples, compuestas principalmente de tres células: basal, anular y opercular en los helechos leptosporangiados y es donde se producen los anterozoides, es decir los gametos masculinos, los cuales tienen motilidad y por medio del agua se desplazan hasta el cuello de los arquegonios, por donde se introducen y descienden hasta fusionarse con la oosfera, formando como resultado de la fecundación un huevo o cigoto a partir del cual se inicia la generación esporofítica (Raghavan, 1992; Reyes, et al, 1995).

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Carbohidratos y Enve]. - wlento en Esporas de Helechos

E.- METABOLISMO DE LAS ESTRUCTURAS DE DISPERSIóN DURANTE LA GERMINACI~N

En las diasporas únicamente se ha utilizado como modelo de estudio a las semillas de angiospermas, desconociendo así el metabolismo que ocurre durante la germinación en otros modelos como las esporas o los granos de polen.

Las semillas, como estructuras de dispersión son las que más se han estudiado ya que &as son el vehículo natural para la reproducción de las plantas, así como para la recolección. transporte, manejo y almacenamiento de germoplasma, con la ventaja de que éstas preservan la variabilidad genética resultante de la reproducción sexual. La ciencia de las semillas se ha desarrollado a lo largo de muchos años, acumulándose hasta la fecha un importante volumen de conocimientos acerca de muchos aspectos de los procesos de desarrollo, germinación, biología y manejo (Vázquez-Yanes. et al, 1997). Sin embargo en el caso de otras estructuras de dispersión, la germinación se presenta sólo hasta que se ha pasado por un período considerable de crecimiento, desarrollo y acumulación de sustancias de reserva y finalmente por un etapa de desecación. Posterior a estos eventos en el caso de las semillas atraviesan por una etapa de latencia. la cual puede durar meses o años. Una vez que se colocan en presencia de agua, comienza la imbibición y con ella una fase diferente. Esta fase tiene como resultado el crecimiento de la radícula y más tarde del tallo a expensas de los materiales de reserva (Murray, 1984). La germinación se ha definido como la reanudación del metabolismo. crecimiento y expresión del genoma, acompañado de la transformación del embrión en una plántula (Jam y Amen. 1977). Sin embargo, desde el punto de vista fisiológico. Bewley y Black (1978) delimitan el término y consideran que la germinación comienza con la entrada de agua a la semilla (imbibición) y termina cuando se inicia el crecimiento del eje embrionario, y se da la protrusión de la radicula, acompaiiado de numerosos eventos celulares.

Durante la imbibición de la semilla y al parecer de otras estructuras de dispersión. se activan al menos tres vías metabólicas: glucólisis, vía de las pentosas fosfato y ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La glucólisis es catalizada por enzimas citosólicas las cuales pueden operar bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas, produciendo piruvato en la primera condición y ácido láctico, etanol y COZ en ausencia de oxígeno. La cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa están relacionadas directamente con respiración de las semillas. Durante esta fase el transporte de electrones ocurre por una vía alternativa denominada de la oxidasa alternativa; posteriormente la generación de ATP se da por la vía clásica de la cadena respiratoria. Por otro lado la síntesis de proteínas es esencial en la germinación. Esta síntesis comienza después de la imbibición y es independiente en muchos casos de la síntesis de novo de RNA, sin embargo antes de completar la germinación se sintetiza nuevo RNA. L a síntesis de DNA ocurre en muchas semillas solo después de la germinación y se considera una parte integral del crecimiento del eje embrionario. Debido a que el evento más importante en los tejidos de almacenamiento es la movilización de reservas , lo cual requiere de la participación de varias enzimas, es necesario en algunos casos sintetizarlas de novo (Murray, 1988).

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Carbohidratos y Envejecimientf , .v. Esporas de Helechos

Durante la germinación de las semillas, la sacarosa y los oligosacáridos de la serie de la rafinosa son hidrolizados y sus niveles declinan. Aún cuando existe muy poca evidencia de que los monosacáridos liberados son utilizados como substratos para la genninación es probable que esto suceda. La fructosa y glucosa libre pueden acumularse en las semillas durante la hidrólisis de la sacarosa y de los oligosacáridos, sin embargo no se ha encontrado galactosa, por lo que se propone que ésta sea rápidamente utilizada en la formación de paredes celulares (McCleary y Matheson, 1974; Bewley y Black, 1985).

La movilización de sustancias de reserva en tejidos de almacenamiento invariablemente comienza después de la protrusión de la radícula, considerado entonces como un evento post-germinativo. En regiones de crecimiento algunas movilizaciones pueden ocurrir antes de que la germinación sea completada, es este caso las reservas están generalmente presentes en cantidades menores, de esta forma los productos de la hidrólisis pueden ser importantes para los procesos de establecimiento de la plántula. La forma de movilizar las reservas de alto peso molecular, es su conversión a formas transportables hacia los sitios de requerimiento (tejidos en crecimiento) donde serán utilizados en la producción de energía y síntesis de otras sustancias (Bewley y Black, 1978).

Debido al desconocimiento del metabolismo de la fuente de carbono en esporas, es importante el estudiarlas ya que esto nos permitirá entender de una manera más simple todo el proceso de almacenamiento y movilización que se da en las semillas que en conjunto es complejo.

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Carbohidratos y Envejecimiento en Esporas de Helechos

IV. JUSTIFICACIóN

El aumento en las necesidades humanas, ha producido un desplazamiento de los recursos naturales. La distribución de especies nativas ha sido restringido a áreas muy pequeñas, situación que limita la propagación de las mismas . Aunado a ésto, el número de incendios forestales ha traído que este problema se acentúe. Los helechos no son excluyentes de ésta problemática, y juegan un papel importante en diferentes ecosistemas, por lo que es importante su estudio en diversas facetas; una de ellas es la viabilidad de las esporas, tanto para la propagación como para la conservación del germoplasma vegetal y para la recuperación de especies valiosas sobreexplotadas.

La prolongación de la viabilidad de las esporas en almacenamiento no solo es importante para la conservación de bancos de esporas en los trópicos a causa de la destrucción de las comunidades, sino tambien para mantener el equilibrio ecológico. Además el presente trabajo proveerá un modelo a nivel celular para estudiar el deterioro causado por condiciones ambientales y asociar el papel fundamental de las sustancias de reserva (carbohidratos) como substancias protectoras que mantienen la integridad de las membranas y la propia estructura celular; o bien para mantener un metabolismo basal permitiendo que las esporas permanezcan vivas.

De esta forma al conocer la manera en que las condiciones ambientales afectan la capacidad de germinación de las esporas, los bancos de almacenamiento de éstas podrían prevenir la pérdida del material y la adecuada regeneración del mismo. Basados en un programa de colecta por localidades y un eficaz establecimiento de especies y su almacenamiento. se podrá prevenir la perdida de especies de helechos en peligro de extinción. Esta estrategia junto con los esfuerzos de catalogar y determinar especies podrán generar un conocimiento mas profundo de la flora en México y su conservación. Es importante señalar que el mantenimiento del germoplasma permitirá mantener el equilibrio ecológico y sobre todo después de una reforestación se pueda recuperar el mayor número de especies establecidas en esas zonas.

Con base en lo anterior es de importancia la conservación del germoplasma, por lo que este trabajo tiene como objetivo determinar la importancia que desempeñan los carbohidratos en la viabilidad de las esporas de varias especies del género Dryoperis sometidas a una alta humedad relativa y una temperatura de 25" C.

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Carbohidratos y Envep- wrento en Esporas de Helechos

V. OBJETIVOS

A.- OBJETIVO GENERAL

Determinar el efecto en la viabilidad de las esporas de helechos del género DIflyopteris sometidas a una temperatura de 25 "C y una humedad relativa del 75% y su relación con el contenido de carbohidratos.

B.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar la viabilidad de las esporas colectadas de las especies: D. arguta, D. karwinskiana, D. patula, D. pseudo-filix-mux, D. rosea, D. rossi, D. Wullichian, y D. sp.

Someter las esporas de las especies antes mencionadas a una temperatura de 25°C y a una humedad relativa del 75% durante 2 y 5 meses.

Cuantificar la cantidad de carbohidratos totales, glucosa y sacarosa en el periodo de estudio.

Determinar la viabilidad mediante la capacidad germinativa de las esporas después del tratamiento de 2 y 5 meses.

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Carbohidratos y Envejecirnrri:lc, en Esporas de Helechos

VI. METODOLOG~A

A.- Colecta del Material Biológico

Se colectaron esporas de helechos de especies del género Dryopteris. Estas colectas se realizaron en varias visitas y localidades (Tabla 1).

Número

colecta Especie Localidad de Colecta De Habitats/Altit Fecha

1 AMR-141 1 La Misión, entre Ensenada y Tijuana, Baja California. I MX, 90 m snm 1 15- 1-1996

Punta Banda, rumbo a la Bufadora, Baja California. MX, 90 m snm 15- I -1996

D. kurwinskiunu Rincón de Ugarte, Tejupilco de Hidalgo, Edo. México. BE, 1340 m snm 27- VIII-1994

Cañón de Escahuasco, Tetela de 1500 m , x- 995

, Autopista Cuernavaca- México,

Cuautla-Oaxtepec, Morelos Autopista Cuernavaca- México,

Cuautla-Oaxtepec, Morelos

BPE, 22251n

D. roseu 14- IX- 1994 BPE’ 2200 In km 72.5 salida a la carretera AMR-68 snm

D. roxvi 14- 1X- 1994 km 72.5 salida a la carretera AMR-75 snm

D. walliclziuna Sierra del Tepozteco, camino a la Pirámide, Tepoztlán, Morelos. I BP, 2740 m snm 28- Xl- 1994

D. y’. 1 IRJ-66 I Cañón de Escahuasco, Tetela de I500 m , 5- x- 1995 Ocampo, Puebla

Tabla 1 . Descripción de las colectas de helechos realizadas en diferentes localidades.

Las esporas fueron colectadas por: M en C Aniceto Mendoza Ruíz =AMR; Dra. Blanca Pérez Garcia =BPG y M en C Irma Reyes Jaramillo =IRJ del laboratorio de Pteridofitas del departamento de Biología, área de Botánica, C.B.S., de la Universidad Autónoma Metropolitana unidad Iztapalapa.

Hábitats: Bosque de Encino =BE; Bosque de Pino =BP; Bosque de Pino-Encino =BPE; Bosque Ripario con Alnus, Platanus =MX.

12

Carbohidratos y Envejecimiento s . 5sporas de Helechos

B.- Tratamiento de las Esporas

Se colocaron en 6 bolsas de papel filtro (Whatman NO.^), 5 mg de esporas de cada especie se suspendieron en una cámara hermética que contenía una solución saturada de NaC1. la cual permite obtener una humedad relativa del 75% (Blackman. et al. 1991: Koster y Leopold, 1988). Esta cámara se mantuvo a 25 " C durante 5 meses que duró el experimento. Se tomaron tres bolsas de cada especie a los dos meses y finalmente se tomaron las tres restantes a los cinco meses.

C.- Extracción de Carbohidratos Solubles.

Para cada una de las especies de helechos y cada tratamiento (O, 2 y 5 meses) se tomaron 5 mg de esporas y se homogeneizaron a temperatura ambiente adicionando 1 m1 de etanol al 80%. Las muestras homogeneizadas se colocaron en un baño a 84°C durante 15 min. Después de ser solubilizadas las muestras se centrifugaron a 1 1 00 g durante 1 O min., el sobrenadante se retiro y se almacenó a 4 "C. El botón se lavo una vez con 0.5 m1 de etanol al 80% (Adams, et al, 1980; Saravitz, et al, 1987; Lambrechts, et ctl, 1994). El extracto etanólico y el lavado se colocaron en un tubo y se fracciono en alícuotas de 0.5 ml, dos de las cuales se colocaron en un desecador con silica gel durante 48 hrs para desecación y se dejó el remanente en congelación (Fig. 2).

13

Carbohidratos y E: cimiento en Esporas de Helechos

Material Biológico

Homogenización con etanol al 80%

Solubilización 84 *C durante 15 min.

Homogenización con etanol al 80%

Botón

Sobrenadante Guardar a 4°C e

Alícuota

Desecador

Fig. 2. Diagrama del método de extracción de carbohidratos solubles

14

Carbohidratos y Envejecimrcwn en Esporas de Helechos

D- Cuantificación de Carbohidratos Reductores Totales.

El material soluble en etanol obtenido en la sección anterior se sometió a la cuantificación de carbohidratos reductores totales por el método de Antrona (Yemn y Williams. 1954; González y Penaloza, 1984). Se utilizó una curva estándar con base en D-glucosa y las muestras se midieron a 620 nm (Fig.3).

E- Cuantificación de Sacarosa y Glucosa

L a muestra desecada h e resuspendida en 0.05 m1 de agua. Se determinó la cantidad de sacarosa y glucosa, utilizando pruebas enzimáticas específicas (Boehringer Mannheim Gmbh). Se cuantificaron los equivalentes de glucosa-6-fosfato productos de la glucosa libre ó de la hidrólisis de sacarosa. La glucosa 6-fosfato se acoplo a una reaccih en presencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa para producir gluconato-6- fosfato y NADH +H' (Fig. 3). La concentración del último producto se determinó a 365 nm (Bergmeyer et al, 1974; Beuther, 1984; Kurz y Wallenfels, 1974; Walter, 1980).

F- Germinación de las esporas

Se tomó por triplicado una muestra de 1 mg de esporas de cada especie tratadas a O. 2 y 5 meses y posteriormente se sembraron en cajas de Petri con agar solidificado al 1 % en el medio inorgánico de Parker y Thompson (Raghavan, 1992).

Los cultivos se colocaron a temperatura ambiente, con un fotoperíodo de 12 horas luz y 12 horas de oscuridad durante 3 semanas. Se realizó un conteo de las esporas germinadas en una superficie de 25 cm2 dividida a su vez en 25 cuadrantes, para obtener el porcentaje de germinación por especie; considerando que habían germinado cuando el rizoma alcanza una longitud superior al de la espora.

Las observaciones se hicieron después de 1 semana de iniciado el proceso de germinación, haciendo un conteo cada 3 días. Se considero que no se presentaría germinación después de 15 días.

15

Carbohidratos y Envejecimien::, e17 Esporas de Helechos

Las muestras refrigeradas de cada tratamiento y la curva estándar se colocan en hielo durante 45 min.

Adicionar I ml de la solución de antrona) a los extractos etanolicos de las muestras.

Inmediatamente colocar las muestras En baño Maria a 92 "C durante 5 min.

Detener la reacción colocando las muestras en hielo. a Leer la absorbencia de las muestras a 620 nm

Colocar la solución de Antrona (0.2% de antrona en H2S04) en hielo durante 45 min.

Fig. 3.- Diagrama del método de cuantificación de carbohidratos reductores totales con el reactivo de antrona.

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Carbohidratos y Envejecimiento t a i l 5. noras de Helechos

GLUCOSA

1 SACAROSA + HZ0 GLUCOSA + FRUCTOSA

Glu-6-P

GLUCONATO -Pod

+

NADPH2

LEER 365nrn.

Fig. 4. Diagrama del método para cuantificar sacarosa y glucosa por pruebas enzimáticas. 1 : P-fructosidasa, 2: Hexocinasa, 3: Glu-6-P deshidrogenasa.

17

Carbohidratos y Envejecimiento en Esporas de Helechos

VII. RESULTADOS

A. Viabilidad de la Espora

Se determinó la capacidad de germinación de las esporas de las 9 especies, tratadas a los 0 meses. Los resultados obtenidos demuestran que las esporas que llegaron al laboratorio poseían una capacidad germinativa promedio del 73.50% (+I 5.50), encontrándose dos especies D. pseudo$lix-mux y D. rusea que poseían una capacidad baja de genninación con 56.25% y 55.1 1% respectivamente; mientras que D.kul-win.skimm y D.putulu tuvieron una capacidad alta de germinación del 96.53% y 94.41 YO . tomándose estos valores como el basal para cada especie recolectada (Tabla 2; Fig. 5 ) .

El someter a las esporas a una humedad relativa alta (75%) y temperatura alta (25°C) durante 2 y 5 meses (Tabla 2) muestra un claro decremento en el porcentaje de germinación en todas las especies estudiadas (Figura 5); en donde la capacidad germinativa a los 2 meses se encuentra disminuida en un 71 .S5 f 13.87% con respecto a 0 meses de tratamiento. A los 5 meses se observa que la capacidad germinativa disminuyo en un 93.87 k 10.94% con respecto a O meses de tratamiento (Tabla 2; Fig.5).

Tabla 2. *Capacidad germinativa de las esporas de helechos del género Dryopteris al tiempo de llegar al laboratorio. **Pérdida de la capacidad germinativa de las esporas de helecho después de 2 y 5 meses de tratamiento. Estos datos son los porcentajes de la Germinación neta en cada caso.

Porcentaje

Meses (YO)** Meses (YO)**

Germinació Germinació n Basal De Especie

Porcentaje Número

n a 5 n a 2 ( Y O ) * colecta

de la de la Germinació

D. u q y t a

1.55 23.57 81 .O4 BPG- 1054 D. arguta

0.07 22.46 61.66 AMR- 14 1

D. kur-winskiuna

31.11 43.35 94.4 1 AMR- 124 D. putula

6.08 40.03 96.53 BPG- 1025

D. pseudo- filixmax BPG-1015 O 5.1 8 56.25

D. rosea

8.36 27.28 80.34 IRJ-66 D. sp. 0.06 1 1.65 64.93 BPG- 1 O 14 D. wnllichiuna

0.60 13.73 71.19 AMR-75 D. rossi

O 8.49 55.1 1 AMR-68

18

Carbohidratos y Eme/t'..:wiento en Esporas de Helechos

o 2 5 O 2 5

O 2 5

a 2 5

8 2 5 Tiempo de Enveiectrnlento (Meses) Tiempo de Envejecimiento (Meses)

' . . .... . .... . . ......... . . . . . . . . .. . . .... .. la0

D. rose.

a0

LO

40

20

O I' F O 2 5

O 2 5

Tiempo de Envejecimiento (Meses)

Fig. 5.- Porcentaje de germinación de las esporas de helecho para cada tiempo de tratamiento: 0, 2 y 5 meses. A -Dryopteris arguta (AMR-l41), B -Dryopteris urguta (BPG- 1054). C -Dryopteris karwinskiana, D -Dryopteris patula, E -Dryopteris pswdoTfilix-max. F -Dryopteris rosea, G -Dryopteris rossii, H -Dryopteris sp., I - Dryopteris wallichiana. Los valores para cada una de las especies en cada tratamiento fueron estandarizados a 100% de acuerdo al valor basal al tiempo de llegar al laboratorio.

19

Carbohidratos y Envejecimit.v:o t w Esporas de Helechos

B. Cantidad de Carbohidratos Solubles Totales

Se cuantificó la cantidad de carbohidratos reductores totales a las esporas de las 9 especies tratadas a los O meses. Los resultados obtenidos determinados por el método de antrona se encuentran ejemplificados en la figura 6 y demuestran que las esporas que llegaron al laboratorio poseían una cantidad de carbohidratos solubles totales de 64.84 f30.00 pg/mg espora. No existe un patrón general, sin embargo, se encontraron 4 patrones diferentes de cambios a lo largo del tratamiento. El primer grupo incluye a D. urgu~u (BPG-1054), D. patulu y D. sp (Fig 6B, 6D, 6H). en que se observo que la cantidad de reductores totales se incrementa entre O y dos meses para después decrementar a los 5 meses a un nivel semejante de O meses en D. patulu y D. sp, a un nivel inferior a O meses como en D. arguta (BPG-1054). El segundo grupo en donde se incrementa la cantidad de reductores totales hacia los 5 meses de tratamiento incluye a D. w p t u (AMR-141), D. karwinskiana (Fig. 6A, 6C). El tercer grupo que incluye a D. rossi y D. wullichiunu se observó un decremento en la cantidad de reductores totales conforme transcurre el tratamiento (Fig. 6G, 61). El cuarto grupo, D. pseudo$lix-max y D. I-OSL'U posee una cantidad de reductores totales alta a tiempo O, llegando a un valor mínimo a los 2 meses de tratamiento, para incrementar a un nivel medio a los 5 meses de tratamiento (Fig. 6E, 6F).

20

Carbohidratos y Envejecimiento cn c:x,mras de Helechos

TO D. -gula AMU-141

L. 1

OL

100

o

O 2 5 A

D. p.tula 40

35 30

25

20

15

10

5 O

D. pseudo-filir-max ~

O 2 5 D O 2 5 E

D. rossii AMR-75 70

M m 40

M m 10

O o 2 5 G

Tiempo de Envejecimiento (Meses)

O 2 5 H

Tiempo de Envejecimiento (Mere.)

D. karwimkina

D. rotea

. . . .

2 5 F

O 2 5 I

Tiempo de Enuejecimiento (Meces)

Fig. 6 Cuantificación de carbohidratos reductores totales por el método de antrona durante el periodo de tratamiento (O, 2 y 5 meses de tratamiento). A -Dryopteris urguta (AMR- 141 ). B -Dryopteris arguta (BPG-1054). C -Dryopteris kurwinskiunu. D - Dryopteris putulu. E -Dryopteris pseudo-flix-ma. F -Dryopteris roseu. G - Dryy~teris rossii. H -Dryopteris sp. I -Dryopteris wallichiuna.

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Carbohidratos y Envejt,~::miento en Esporas de Helechos

C. Cantidad de Glucosa

Se determinó la cantidad de glucosa de O a 5 meses de tratamiento (Fig. 7) No se encontró un patrón general, pero se observaron varios comportamientos que se integraron en 4 grupos. El primer grupo que incluye a D. patula, D. pseudoTfilix-max, D. ~"oseu y D. rossii en donde se tiene una cantidad basal a tiempo O de 0.665 f 0.259 pg/mg espora, se incrementa a los dos meses para decrecer a los 5 meses de tratamiento (Fig. 7D, 7E. 7F. 7G). El segundo grupo, en que la cantidad de glucosa es alto en tiempo O de 1.45 f 0.235 ug/mg de espora y disminuye drásticamente a los 2 meses como en D. urgutu (AMR-141, Fig. 7A), D. arguta (BPG-1054, Fig. 7B) o en forma más lenta como en D. sp en que a los 5 meses todavía existe glucosa (Fig. 7H). El tercer grupo. en donde la concentración de glucosa a tiempo O es de 1.85 f 0.35 ug/mg de espora es muy alta y posteriormente baja a los dos meses para ascender ligeramente a los 5 meses como se observa en D. kurwinskiana (Fig. 7C). El cuarto grupo, sigue el mismo patrón que el grupo 3, en donde existe una cantidad basal de glucosa, que a los 2 meses desciende a su nivel más bajo y aumentar a una cantidad máxima a los 5 meses, ejemplificado por D. wallichiana (Fig. 71).

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Carbohidratos y Envejt.::In!,wo en Esporas de Helechos

1.2

- 1

I f 0.8

0.6

J .$ 0.4 ¶ - 0.2

O

2 1.8

7 1.6

1.2 b 1.4

u 1

m 0.6

0.2 O

3 c 0.8

2 0.4

O 2 5 A

O 2 5 D

0.4 0.2

D. uguta WC-9054 ~

0 2 5

- D. oseudo-Fdu-max

1.4 1.2

1

0.8 as

a2 a4

8 O 2 5

Tiempo de Enuejecimlento (Meres)

2 5 t

. . .. . . .

0 2 5 C

D. rosea

0 2 5 F

0 2 5

Tiempo de Envejecimiento (Meres) ’

Fig. 7.- Cantidad de glucosa, determinada mediante los equivalentes de NADH producidos en reacciones acopladas durante el periodo de tratamiento (O, 2 y 5 meses de tratamiento). A -Dryopteris arguta (AMR-141). B -Dryopteris argutu (BPG-1054). C -Dryopteri.s kurwinskiana. D -Dryopteris patula. E -Dryopteris pseudoTjilix-mux. F - Dryop1eri.v roseu. G -Dryopteris rossii. H -Dryopteris sp. I -Dryopteris wullichiana

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Carbohidratos y Emrejecirnmro ( '11 Esporas de Helechos

D. Cantidad de Sacarosa

La cantidad de sacarosa determinada en las muestras tratadas se encuentran en la figura 8. Se observa un claro decremento en la cantidad de sacarosa entre el tiempo O y 5 meses en D. arguta (AMR-141 y BPG-1054), D. rosea, D. rossii y D.sp. ; en donde la cantidad de sacarosa inicial es de 12.5 k 3.65 ug/mg de espora (Fig. SA, SB, SF, SG y SH). Por otra parte D. pseudo-JiZix-max y D. waZZichiana (Fig. SE y SI), en donde la sacarosa aumenta hacia los dos meses y desciende al quinto mes, D. karwinskiana y D. pddL1 presentan una cantidad de sacarosa alta (30 y 16 ug/mg de espora respectivamente) empero desciende rápidamente a los dos meses en donde la proporción entre O y 2 meses es de 2.4, para aumentar posteriormente a los 5 meses de tratamiento (Fig. SC y SD).

24

Carbohidratos y Envejecirnienr~~ L' . :.:yporas de Helechos

35

30

25

20

15

IO

5

O

D 2 5

O. roeeii O. ep I N - C O

O 2 5 O 2 3

Tiempo de Envejecimknto (Mesee) G Tiempo de Enuejecirn&ento (Mesea)

O 2 5

25

20

15

$0

5

O

O. WaIIIchianl

O 2 5

Tiempo de Enuejetimiento (Meses) I

Fig. 8.- Cantidad de sacarosa, determinada mediante los equivalentes de NADH producidos en reacciones acopladas en el periodo de tratamiento (O, 2 y 5 meses de tratamiento). A- Dryopteris arguta (BPG-1054). B- Dryopteris argutu (AMR-141). C- Dryper i s karwinskiana (BPG-l025).D- Dryopteris patula (AMR-124). E- Dryopteris pseudo-filix-mux (BPG-1 O1 5). F- Dryopteris rosea (AMR-68). G- Dryopteris rossii ( AMR-75). H- Dryopteris wallichiana (BPG- 1 O 14). I- Dryopteris sp. (IRJ-66).

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Carbohidratos y Enver~.:.inrwnto en Esporas de Helechos

E. Viabilidad y Sacarosa

Cuando se graficó el logaritmo de la concentración de sacarosa de las diferentes especies contra la viabilidad de las esporas, se observo que existe un comportamiento hiperbólico, en donde existe una abrupta caída de la concentración de sacarosa cuando la viabilidad. medida con el porcentaje de germinación es inferior al 10% (Fig. 9). Las esporas poseen por lo tanto mayor capacidad germinativa cuando este valor es superior.

1 O0

1 O 20 40 60 80 1 O0 120

GERMINACI~N (%) O, 2 y 5 meses de envejecimiento

Fig. 9.- Relación entre el logaritmo de la cantidad de sacarosa y la viabilidad de las esporas durante el tratamiento (O. 2 y 5 meses). Se grafica el logaritmo de las cantidades de sacarosa de todas las especies estudiadas en todos los tratamientos.

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Carbohidratos y Emejecimicl?:. 1 ( w Esporas de Helechos

significante para la población. La longevidad de semillas por ejemplo, tiene una gran importancia para el hombre debido ha que de ella depende la continuidad de una especie. Esta longevidad esta determinada por factores genéticos y morfofisiológicos que interactúan con los cambios ambientales que modifican tanto la producción como el almacenamiento de semillas (Perez-Garcia, et al, 1994). Las semillas ortodoxas pueden ser desecadas a bajos contenidos de humedad sin ningún daño y pueden soportar diferentes condiciones de almacenamiento conservando su longevidad. Las semillas recalcitrantes, por otro lado, no pueden sobrevivir con bajos contenidos de agua más aún deben tener alto contenido de humedad y comparativamente tienen menor longevidad (Roberts y Ellis, 1989).

Para determinar los parámetros de viabilidad en Dryopteris, las esporas se colocaron en condiciones de envejecimiento artificial (condiciones seminaturales). El tratamiento de las esporas a 0, 2 y 5 meses en humedad relativa alta (75%HR) y temperatura de 25 O C trae como consecuencia una disminución en la viabilidad como fue demostrado en las especies estudiadas. Se encontró que la disminución en la germinación al segundo mes de tratamiento fue en promedio del 71.85 f 13.87 % mientras que al quinto mes la disminución en la germinacióncon respecto al valor basal de germinación de las esporas al llegar al laboratorio fue superior al 93.87 * 10.94 %, teniendo como 100% los valores del porcentaje de germinación de las esporas cuando arribaron al laboratorio (Tabla 2). Este deterioro en la viabilidad de las esporas se observó con mayor intensidad a los 5 meses de tratamiento. En este caso el porcentaje de germinación llega a niveles menores del 30% e incluso la viabilidad llega a perderse por completo (Tabla 2; Fig. 5).

Debido a que en helechos no se ha reportado ninguna molécula protectora que permita tolerar la desecación, el siguiente paso fue determinar los niveles de azucares en las distintas especies y asignar un posible papel a estos. Inicialmente se midieron los azilcares reductores por el método de antrona. Los niveles de carbohidratos reductores totales no demuestra una clara correlación con respecto a la perdida de la viabilidad como se observa al comparar las figuras 5 y 6. El efecto que causa los cambios de la glucosa en la poza de carbohidratos reductores es insignificante pues existe una relación 75: 1 lo cual demuestra que la glucosa es uno de los componentes de esa poza. Únicamente existe una relación directa entre la perdida de la viabilidad contra los carbohidratos reductores en D. rossii y D. wallichiana, mientras que en D. argutu y D. kurwinkiunu existe una relación inversa entre estos dos parámetros; obervando las relaciones entre germinación y la cantidad de glucosa es directamente proporcional en D. urguta AMR-141, D. arguta BPG-1054 y D. sp. Esta gama de patrones de acumulación sugiere por lo tanto que es posible que no una sola molécula esta involucrada en la tolerancia a la desecación.

En cuanto a la sacarosa es claro que entre 0 y 5 meses existe un decremento en la concentración de este carbohidrato. Existe una correlación directamente proporcional entre la germinación y la cantidad de sacarosa en D. arguta (AMR-141, Fig.8A), D. urgztta (BPG-1054, Fig.8B), D rosea (Fig.8F) D. Rossi (Fig. 8G) y D.sp (Fig. 8H); un comportamiento diferente se observa en D willichiana (Fig.81) y en D. pseudo-flix-max (Fig. 8E) donde la sacarosa aumenta a los dos meses de tratamiento o bien a los 5 meses en D. kurwinskiana (Fig. 8C) y D. patula (Fig. 8D).

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Curbohidrutos y Envejecimientc, :'I? Esporas de Helechos

De estos resultados se evidencia que ni los carbohidratos reductores, ni la cantidad de glucosa reflejan los cambios que se dan a nivel celular y que involucran la perdida de la viabilidad. En el caso de la sacarosa es claro que en las especies estudiadas existe una correlación directa. En aquellas especies en que existe un aumento en la sacarosa a los dos meses, esta se puede considerar como un valor estable comparado con el tiempo O, o bien entre los 2 y 5 meses. Este puede ser el resultado de u n metabolismo diferencial, donde el requerimiento de sacarosa es mayor para mantener viable a las esporas. Por lo tanto la relación anabolismo/catabolismo cambia de forma tal que existe una acumulación parcial de sacarosa para estos casos.

Estas evidencias indican que existe una marcada correlación entre la cantidad de sacarosa y la capacidad de germinación (Fig. 9). Aunque es clara esta relación, existe un valor umbral del 10% de viabilidad en que corresponde a un valor máximo de sacarosa , por debajo del cual puede considerarse que la espora esta muerta. Es importante resaltar que la proporción entre esporas vivas y muertas tiene un papel importante en los parámetros medidos al relacionarse con el porcentaje de germinación que es un valor cuantitativo.

Existe un factor sumamente importante que determina la sobrevivencia de la senilla y esporas a condiciones de estrés hídrico y es la tolerancia a la desecación que es l a capacidad de un organismo de resistir la deshidratación extrema. Se ha sugerido que la tolerancia a la desecación se alcanza principalmente por la adaptación en la organización estructural del citoplasma y de sus componentes y10 a través del desarrollo de la capacidad de revertir dichos daños durante la etapa siguiente de rehidratación. La tolerancia a la desecación en plantas y animales depende de la presencia de algunas moléculas protectoras durante el proceso de secado. La trealosa es uno de ellos. Esta molécula es el Único disacárido no reductor de la glucosa, cuyos monómeros se encuentran unidos por un enlace glucosídico a (1,l). Este disacárido estabiliza y protege a las membranas biológicas mediante la interacción con el grupo fosfato de las cabezas polares de los fosfolípidos, a través de puentes de hidrógeno y sustituyendo de ésta manera al agua durante la deshidratación (Crowe, et al, 1984). Se ha encontrado que además de la trealosa hay otros carbohidratos capaces de proteger a las membranas durante la desecación. También la glucosa y la fructosa tienen capacidad protectora pero menor que la que presentan la sacarosa y la maltosa ante la pérdida de agua conservando así sus características morfológicas y fisiológicas (Crowe, et al, 1987).

Existe otro grupo importante de carbohidratos no reductores que se han asociado a la tolerancia al estrés hídrico. Carbohidratos solubles y particularmente azúcares, están presentes en grandes cantidades en las semillas y han sido implicados en la protección tanto de membranas (hipótesis de remplazamiento de agua) como del citoplasma (hipótesis de vitrificación) (Leopold, 1990). La acumulación de azúcares solubles es una característica de muchas semillas maduras. Se ha sugerido que durante el proceso de maduración de la semilla el agua es remplazada por azúcares y por grupos polihidroxilo que pueden estabilizar la estructura de la membrana en el estado de desecación (Crowe, c / LII, 1986). Esto ha sido demostrado en sistemas de membrana artificial, los azúcares pueden servir como el principal agente de tolerancia a la desecación, como se ha propuesto para semillas maduras.

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Carbohidratos y Envr:lL-: !miento en Esporas de Helechos

Por lo anterior podemos concluir que existe una correlación directa entre la viabilidad de las esporas medida como su capacidad germinativa y la cantidad de sacarosa, siendo una relación directa entre ambos parámetros y no existiendo un reflejo de la perdida de viabilidad con la cantidad de carbohidratos reductores y/o glucosa. La cantidad de carbohidratos solubles cuantificada refleja tanto el anabolism0 y catabolismo; que enmascara probablemente al metabolismo de manutención del estado viable. El papel de la sacarosa como lo han propuesto otros autores puede explicase como agente protector de la estructura de la membrana (hipótesis de remplazamiento de agua) como del citoplasma (hipótesis de vitrificación), también como fuente de carbono para el proceso de germinación de la espora. Como en cualquier célula puede formar parte del metabolismo basal y estructural.

Se sabe que los oligosacáridos pueden incrementar el efecto protector de la sacarosa limitando la cristalización y favoreciendo la vitrificación en semillas maduras (Caffrey. et al. 1988; Koster, 1991). Blackman y colaboradores (1992) sugieren que la desecación lenta funciona para inducir la acumulación de azucares de la serie de la rafinosa. así como la acumulación de altos niveles de azucares. Sin embargo es este estudio solo se encontraron trazas de estos oligosacáridos (datos no mostrados) y no represente un concentración determinada en los valores registrados para otros modelos biológicos.

Es por esto que la perdida paulatina de la viabilidad debida a la desaparición de carbohidratos y cualquier sustancia de preservación a temperatura y humedades relativas altas pueda considerarse en esporas de helechos como un proceso de envejecimiento. En este estudio la perdida de la viabilidad con un tratamiento de temperatura y humedad relativa alta, produce un deterioro o envejecimiento acelerado en la espora. esto provoca que la espora consuma la sacarosa para mantener su estado homeostático afectando posteriormente la capacidad germinativa.

Un 90% de los helechos forman esporas no clorofílicas (esporas con características de semillas ortodoxas) que tienen un bajo contenido de agua y un promedio de vida de hasta 3 años, el resto de los helechos forman esporas clorofílicas que tienen las características de las semillas recalcitrantes. Ellas tienen un alto contenido de agua y una viabilidad de alrededor de 7 semanas y se presentan en helechos de familias tales como Grammitidaceae, Hymmenophyllaceae y Vittariaceae (Dyer. 1979; Raghavan, 1992). De esta manera, la viabilidad esta definida como la habilidad de las esporas para retener su capacidad de germinar (Perez-Garcia, et al, 1 994).

Queda por establecer el papel de las proteínas en esta perdida de la tolerancia a la desecación. Una vía por la cual las plantas responden a la desecación es por la producción de proteínas especificas, las cuales están involucradas para evitar los efectos del estrés. también están involucradas en reparar el daño producido, pero principalmente en proteger la organización estructural y funcional de las células previniendo la cristalización de iones durante la desecación (Rosenberg L.A y Rinne R.W, 1988; Bettey, et al, 1998). El grupo de proteínas conocidas como ‘Late Embryogenesis Accumulating’ o proteínas LEA, se acumulan en las semillas durante la fase tardía de la

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Carbohidratos y Envejecimiento en Esporas de Helechos

embriogénesis (Bettey, et al, 1998) e incluye algunas que se acumulan durante la fase de desecación en la maduración del desarrollo de la semilla. Algunas de estas proteínas de maduración han sido correlacionadas con la habilidad de la semilla para continuar con el crecimiento de la nueva planta (Rosenberg L.A y Rinne R.W. 1988) mientras otras han sido correlacionadas con la tolerancia a la desecación. Blackman y colaboradores ( 1 992) demostraron que la acumulación de proteínas por si sola no es suficiente para conferir tolerancia a la desecación en el desarrollo del frijol de soya.

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Carbohidratos y Envejccol nto en Esporas de Helechos

IX. CONCLUSIONES

Las esporas del género Dryupteris con características de semillas ortodoxas conservan su capacidad germinativa en condiciones de almacenamiento (Temperatura ambiente y HR baja) por mas de 5 meses.

0 Cuando se someten al tratamiento de envejecimiento acelerado (25" C y 75% de HR), se produce una perdida en la capacidad germinativa.

0 No existe una correlación entre la perdida de la germinación y la cantidad de glucosa o de reductores totales. Esto podría deberse a que la cantidad cuantificada no únicamente involucra al almacenamiento intracelular, sino además a los productos de degradación intra y extracelular producto del envejecimiento.

La sacarosa, carbohidrato que es almacenado en la espora, es degradado durante el proceso de envejecimiento acelerado y correlaciona con la perdida en la germinación.

0 La sacarosa es un indicador adecuado de la perdida de viabilidad en un proceso de envejecimiento acelerado en esporas de helechos.

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x. BIBLIOGRAFÍA

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Carbohidratos y Emejecimienrc- Lsporas de Helechos

XI. LUGAR DE REALIZACI~N

Universidad Autónoma Metropolitana. Unidad Iztapalapa División de Ciencias Biológicas y de la Salud Departamento de Ciencias de la Salud Laboratorio de Citoquímica

XII. ACTIVIDADES REALIZADAS

.JULIO-

- Obtención de las esporas de las diferentes especies de helecho a estudiar. - Inicio del tratamiento de envejecimiento acelerado de las esporas. - Germinación de las esporas de helechos sin tratamientos.

AGOSTO-

A las esporas de helecho sin tratamiento: - Extracción de los carbohidratos reductores totales solubles de las esporas. - Cuantificación de los carbohidratos reductores totales presentes en los extractos de

- Cuantificación de sacarosa y glucosa de los extractos desecados utilizando pruebas esporas.

enzimáticas comerciales.

SEPTIEMBRE-

A las esporas de helecho envejecidas dos meses: - Extracción de los carbohidratos reductores totales solubles de las esporas. - Cuantificación de los carbohidratos reductores totales presentes en los extractos de

- Cuantificación de sacarosa y glucosa de los extractos desecados utilizando pruebas esporas.

enzimáticas comerciales.

OCTUBRE-

- Germinación de las esporas de helechos tratadas durante dos meses. - Análisis de todos los resultados obtenidos durante el primer trimestre de trabajo. - Bkqueda bibliográfica.

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Carbohidratos y EnveJ,2c:nliento en Esporas de Helechos

NOVIEMBRE-

A las esporas envejecidas cinco meses: - Extracción de los carbohidratos reductores totales solubles de las esporas.

Cuantificación de los carbohidratos reductores totales presentes en los extractos de esporas.

- Cuantificación de sacarosa y glucosa de los extractos desecados utilizando pruebas enzimáticas comerciales.

- Germinación de las esporas de helechos tratadas.

DICIEMBRE-

- Análisis de los resultados obtenidos durante el segundo trimestre de trabajo. - Escritura del informe del servicio social. - Presentación final del trabajo ante el grupo de investigación del laboratorio. - Realización del resumen y presentación del cartel del trabajo en el congreso

latinoamericano de botánica.

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