Nuevas perspectivas en el diagnostico de Clostridium...
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Nuevas perspectivas en el diagnóstico de
Clostridium difficile
Evelyn Rodríguez Cavallini
Pruebas diagnósticas
Detectan productos
de C. difficile
•GDH (glutamatodeshidrogenasa)
•Toxinas A y/o B
Métodos de cultivo
• para detección de CD y confirmar cultivo toxigénico
Detección de genes o deleciones
• RNA 16 S, genes de toxinas, genes GDH, tpi, tcdC
Detección Prueba utilizada
Toxinas Cultivo celular
Inmunoensayo
PCR
C. difficile Cultivo
PCR
Variantes de
C.difficile
PCR: deleción en tcdC
y toxina binaria
Tipificación
Inmunoensayos o inmunocromatografías
Los que detectan toxinas A y B: muy baja sensibilidad (desde 50% a 85%)
Si se incluye GDH: hasta 83-90% de sensibilidad
Estrategia!!!! Evaluar costos
GDH a las muestras sospechosas
Toxinas A y B solo a las muestras positivas por GDH.
RIDA®QUICK Clostridium difficile Toxin A/B
Es una inmunocromatografía
Emplea anticuerpos contra toxinas A y B marcados con biotina y oro
Si hay reacción AgAc hay migración del complejo y unión con estreptavidina
Si no hay reacción AgAc los Ac marcados con oro impiden la migración
Técnicas moleculares
Altamente específicas y sensibles
Caras, equipo especial
Detectan el gen y no las toxinas
Algunos detectan deleciones en tcdC
Agunos detectan genes de resistencia a quinolonas
Requieren de entrenamiento de variable complejidad
PCR tradicional, CR.
Extracción de ADN
Verificación de ARNr16S
Detección de genes tpi, tcdA,
tcdB, tcdC y ctdB
Multiplex 1: tcdA, tcdB y ctdB
Multiplex 2: tpi, tcdC
RIDA®GENE CD Toxin A/B PCR tiempo real
•Solo detecta genes para toxina A y B
Utiliza fluorocromos
Requiere equipo de PCR RT
•Diferentes ciclos según el equipo
No incluye los reactivos de extracción de ADN
•Señalan marcas específicas
Requiere equipo revelador
Additional equipment and materials required
DNA-Extraction kit for stool samples or DNA-Extraction system
for stool samples
Real-time PCR Instrument:
QIAGEN: Rotor-Gene Q
RIDA®GENE Color Compensation II
Real-time PCR consumables (plates, tubes, foil)
Centrifuge with a rotor for the reaction vials
-Vortexer
-Pipettes (0.5 – 20 µl, 20 – 200 µl, 100 – 1000 µl)
-Filter tips
-Powder-free disposal gloves
Caro,limitado
Gene-Xpert, de Cepheid, PCR tiempo real
Gene-Xpert-C.difficile
PCR- Tiempo Real
deteta C. difficile y C. difficile NAP1/027
• toxB, deleción, tox binaria
Resultados en una hora
De uso en dos hospitales
nacionales en Costa Rica
Caro, $90 por cartucho + equipo
Solo para grandes volúmenes de
muestras
Buena correlación con los pulsotipos, hasta el momento
Although Xpert can provide rapid laboratory diagnosis of C. difficile and
presumptive 027/NAP1/BI identification in stool within 45 min it is
suggested that positive results be confirmed by formal typing of
cultures. A North American study recently reported five stool samples in
which 027/NAP1/BI was identified by Xpert but not confirmed by two or
more typing methods (PCR ribotyping, pulsed-field gel electrophoresis
[PFGE], and/or restriction endonuclease analysis [REA])
Genotype C.diff. (PCR isotérmico)
para C. difficile
tpi
para toxigenicidad de la muestra o del
aislamiento
tcdA
tcdB
Para NAP1/027
cdtA/cdtB de tox binaria
tres tipos de deleción en tcdC
mutación en gyrA
Procedimiento
Extracción de ADN
Amplificación multiplex con
primers marcados con biotina
Hibridación reversa en
membranas recubiertas con
sondas específicas
complementarias a los ADN
amplificados
No incluye reactivos de extracción, ni taq polimerasa.
No requiere equipo de PCR.
De díficil interpretación!!!!
Muy caro. No hay estudios evaluativos
AmpliVue (Quidel molecular)
• Amplificación isotérmica llamada amplificación dependiente de helicasa (HDA)
Detección de C. difficile directamente
en la muestra
• Por tratamiento térmico Tampón de lisis para
muestras
•Región conservada de las toxinas
• Sondas marcadas con biotina
Tubo de reacción con primers específcos y
HDA
•Detecta el híbrido sonda-amplicón por conjugación con estreptavidina para la visualización
Cartucho para detección rápida.
C. diff. toxig C. diff. no toxig No interpretable
La línea C es un
control de
amplificación
$780, en CR Fácil
Excelente especificidad y
sensibilidad
Importa menos el almacenamiento de la muestra porque no detecta las toxinas
Solo reconce C difficile toxigénico
¿Es imprescindible usar técnicas moleculares?
103 hospitales en España-
2011
95% utiliza EIA
10% EIA y cultivo
16% cultivo celular
Solo 2% PCR
Recomendación
Combinar varios métodos de detección
•GDH
• Toxinas
•Genes
Cultivo
•para estudios epidemiológicos
•De sensibilidad a los antibióticos