Máster en

Nuevos Alimentos

Modelización de procesos

enzimáticos para la

obtención de oligosacáridos

pécticos.

Ana Blanco Doval

Directores: Dra. Antonia Montilla Corredera

Carlos Sabater Sánchez

Tutor: Dr. Luis Vázquez de Frutos

Lugar de realización: Instituto de Investigación en

Ciencias de la Alimentación / Grupo de química y

funcionalidad de carbohidratos y derivados.

Tra

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o 2

017-

2018

I

ÍNDICE

I. ÍNDICE DE FIGURAS ....................................................................................................... III

II. ÍNDICE DE TABLAS .......................................................................................................... V

III. LISTA DE ABREVIATURAS........................................................................................... VI

IV. RESUMEN ....................................................................................................................... VII

1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 1

1.1 Pectina ............................................................................................................................ 2

1.1.1. Características estructurales ............................................................................... 2

1.1.2. Fuentes naturales ................................................................................................. 3

1.1.3. Métodos de obtención .......................................................................................... 4

1.1.4. Propiedades fisicoquímicas. Usos industriales. ............................................... 6

1.1.5. Propiedades biológicas. Posibles aplicaciones. .............................................. 7

1.2 Oligosacáridos pécticos (POS) ................................................................................... 8

1.2.1. Estructura ............................................................................................................... 8

1.2.2. Métodos de obtención .......................................................................................... 9

1.2.3. Propiedades biológicas. Posibles aplicaciones .............................................. 10

2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 12

3. PLAN DE TRABAJO ......................................................................................................... 14

4. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................... 15

4.1 Reactivos y muestras ................................................................................................. 15

4.2 Caracterización de los preparados enzimáticos .................................................... 15

4.2.1 Purificación de los enzimas ................................................................................ 15

4.2.2 Determinación de la actividad hidrolítica (método del ácido 3,5-

dinitrosalicílico (DNS) o método de Miller) ................................................................. 15

4.2.3 Cuantificación del contenido en proteína (Método de Bradford) .................. 17

II

4.3 Obtención de oligosacáridos pécticos (POS). Diseño experimental. ................. 18

4.3.1 Diseño experimental ............................................................................................ 18

4.3.2 Optimización del diseño experimental .............................................................. 20

4.4 Análisis de los hidrolizados ....................................................................................... 21

4.4.1 Cuantificación de azúcares reductores............................................................. 21

4.4.2 Análisis cromatográfico por GC-FID ................................................................. 21

4.4.3 Análisis cromatográfico por HPSEC-ELSD ...................................................... 22

4.5 Determinación de la actividad antioxidante de los POS ....................................... 23

4.6 Análisis estadístico...................................................................................................... 24

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................... 24

5.1 Actividad hidrolítica de los preparados enzimáticos .............................................. 24

5.2 Caracterización de los hidrolizados enzimáticos de pectina de alcachofa ........ 25

5.2.1 Liberación de azúcares reductores. Extensión global de la hidrólisis. ........ 25

5.2.2 Estudio de la fracción de carbohidratos de baja masa molecular ................ 26

5.2.3 Distribución de la masa molecular de los POS liberados .............................. 29

5.3 Optimización de la obtención de POS ..................................................................... 34

5.4 Análisis de los hidrolizados obtenidos en las condiciones óptimas .................... 37

5.4.1 Determinación de la actividad antioxidante ..................................................... 40

6. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 42

7. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 43

III

I. ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Representación de la estructura química de pectina (Mohnen, 2008). ...................... 3

Figura 2: Plan de Trabajo ........................................................................................................ 14

Figura 3: Diagrama de reacción entre DNS y azúcares reductores (Cruz & Soler, 2014)...... 16

Figura 4: Diagrama de reacción entre Coomassie Brilliant Blue G-250 y proteínas (Mata-

Gómez, Yasui, Guerrero-Rangel, Valdés-Rodrígez & Winkler, 2012). .................................. 17

Figura 5: Representación gráfica del diseño experimental. Los valores factoriales están

representados por su correspondiente símbolo (-, +), los valores axiales se representan mediante

puntos amarillos y los valores centrales se sitúan en la intersección entre las dos líneas continuas

(CAMO, 2018). ........................................................................................................................ 19

Figura 6: Arquitectura de las ANN utilizadas para modelar la producción de POS por PUO (a)

y CAN (b). Los parámetros de entrada fueron las condiciones de reacción (pH, tiempo, cantidad

de enzima e interacciones entre los factores) y el parámetro de salida la cantidad de POS

formada con una Mm comprendida entre 100 y 0,3 kDa. Las conexiones entre los elementos

del modelo son positivas (negras) o negativas (grises) y su grosor representa la repercusión en

el mismo. I: input, O: output, H: hidden, B: bias. .................................................................... 21

Figura 7: Perfiles cromatográficos (GC-FID) de muestras de pectina hidrolizadas, (en rojo:

ensayo 8 con CAN; en azul: ensayo 2 con PUO). .................................................................... 26

Figura 8: Porcentaje de liberación de cada monosacárido cuantificado, en % con respecto a la

pectina original. ........................................................................................................................ 28

Figura 9: Perfiles cromatográficos (HPSEC-ELSD) de muestras de pectina hidrolizadas, (a)

ensayo 14 con CAN; b) ensayo 1 con PUO) y los intervalos de Mm correspondientes a cada

zona del cromatograma. ........................................................................................................... 30

Figura 10: Gráficos de cajas donde se relacionan las variables estudiadas: pH (a, d), tiempo (b,

e) y cantidad de enzima (c, f) con la producción de POS con masas moleculares comprendidas

entre 100 y 0,3 kDa en cada uno de los 17 ensayos que componen los diseños experimentales

para PUO (a, b, c) y CAN (d, e, f). a,b Diferencias estadísticamente significativas entre los

grupos. ...................................................................................................................................... 34

Figura 11: Gráficos de superficie para las ANN utilizadas para modelar el comportamiento de

CAN (a, b, c) y PUO (d, e, f), mostrando la influencia de las variables independientes (tiempo

y cantidad de enzima (a, d), tiempo y pH (b, e) y pH y cantidad de enzima (c, f)) sobre la

producción de POS en el intervalo 100 > Mm > 0,3 kDa. ....................................................... 36

IV

Figura 12: Perfiles cromatográficos (HPSEC-ELSD) de los hidrolizados obtenidos en

condiciones óptimas, (en rojo: CAN; en azul: PUO) y los intervalos de Mm correspondientes a

cada zona del cromatograma. ................................................................................................... 40

V

II. ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1: Fuentes vegetales de pectina y su contenido (%) (Chan et al., 2017). ....................... 4

Tabla 2: Diseños experimentales. Condiciones de reacción para cada ensayo y cada variable:

pH, tiempo (h) y cantidad de enzima (Ud/g pectina). .............................................................. 19

Tabla 3: Actividad hidrolítica, contenido en proteína y actividad hidrolítica específica de los

preparados enzimáticos comerciales. ....................................................................................... 24

Tabla 4: Resultados obtenidos mediante GC-FID de los carbohidratos de baja Mm presentes

en los hidrolizados enzimáticos. Se representan los valores medios de los 17 ensayos realizados

con ambos enzimas (celulasa de A. niger (CAN) y Pectinex® Ultra Olio (PUO)) así como el

rango de la concentración (Cc) expresada en mg/100 mg sólidos y en % respecto al total de

compuestos cuantificados……………………………………………………………………..27

Tabla 5: Resultados obtenidos mediante HPSEC ELSD de los 17 ensayos realizados con CAN.

Para cada rango de Mm (indicados en la Figura 9a) se ha calculado la Mm media en kDa, la

concentración de carbohidratos (Cc) en mg/100 mg de sólidos y el porcentaje (%) frente a los

compuestos cuantificados. Los resultados se expresan como media y desviación estándar entre

paréntesis, (n=2). ...................................................................................................................... 31

Tabla 6: Resultados obtenidos mediante HPSEC-ELSD de los 17 ensayos realizados con PUO.

Para cada rango de Mm (indicados en la Figura 9b) se ha calculado la Mm media en kDa, la

concentración de carbohidratos (Cc) en mg/100 mg de sólidos y el porcentaje (%) frente a los

compuestos cuantificados. Los resultados se expresan como media y desviación estándar entre

paréntesis, (n=2). ...................................................................................................................... 32

Tabla 7: Parámetros estadísticos importantes, ajustes y errores de los modelos RSM y ANN.

Condiciones óptimas determinadas mediante cada modelo. .................................................... 35

Tabla 8: Resultados obtenidos mediante GC-FID de los hidrolizados optimizados. La

concentración de carbohidratos (Cc) se representa en mg/100 mg de sólidos………………..38

Tabla 9: Resultados obtenidos mediante HPSEC-ELSD de los hidrolizados obtenidos en las

condiciones óptimas. Para cada rango de Mm se representa la Mm media en kDa, la

concentración de carbohidratos (Cc) en mg/100 mg y el porcentaje (%) frente al contenido total

de carbohidratos cuantificados. Los datos están representados como valor medio y su

desviación estándar (DE) (n=2). a, b Diferencias estadísticamente significativas entre las masas

moleculares, concentraciones y los porcentajes de los distintos fragmentos determinados en los

hidrolizados con las dos enzimas…………………………………………………………...…39

VI

III. LISTA DE ABREVIATURAS

λ: Longitud de onda.

ANN: Redes neuronales artificiales.

CAN: Celulasa de Aspergillus niger.

DM: Grado de metilación.

DNS: Ácido 3,5-dinitrosalicílico.

DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo.

ELSD: Detector evaporativo de dispersión de luz.

FID: Detector de ionización de llama.

GalA: Ácido galacturónico.

GC: Cromatografía de gases.

GP: Grado de polimerización.

HG: Homogalacturonano.

HM: Pectina de alto grado de metilación.

HPSEC: Cromatografía de exclusión molecular de alta eficacia.

LM: Pectina de bajo grado de metilación.

Mm: Masa molecular.

POS: Oligosacáridos pécticos.

PUO: Pectinex® Ultra Olio.

RG-I: Ramnogalacturonano I.

RG-II: Ramnogalacturonano II.

RMSE: Error de la raíz cuadrada de la media.

RSM: Método de superficie respuesta.

SCFA: Ácidos grasos de cadena corta.

VII

IV. RESUMEN

En la actualidad existe una creciente concienciación por la gestión de los subproductos

generados en la industria alimentaria debido a su alto impacto medioambiental; por ello, se

están estudiando vías de aprovechamiento y revalorización. La alcachofa es un producto que

genera un 70% de residuos, y existen estudios que indican que puede ser una interesante fuente

de pectina. Este polisacárido, y en especial los oligosacáridos pécticos derivados (POS),

presentan propiedades biológicas de gran interés, actividad prebiótica y antiproliferativa de

células cancerosas, entre otras. Por el momento, no existen estudios sobre la generación de POS

a partir de subproductos de alcachofa, por ello, en este Trabajo de Fin de Máster se han

modelizado y optimizado dos métodos de obtención enzimática a través del estudio de las

enzimas celulasa de Aspergillus niger (CAN) y Pectinex® Ultra Olio (PUO). Los rendimientos

y condiciones fueron, para CAN, 66 mg/100 mg de pectina a pH 4,41, 54 minutos y 17,1 Ud/g

pectina, y para PUO 62 mg/100mg de pectina a pH 6,86, 90 minutos y 520,5 Ud/g pectina. Los

productos formados tras la hidrolisis se han caracterizado de forma preliminar, concluyendo

que CAN tiende a formar POS de mayor masa molecular (Mm) (74% tiene una Mm media de

13,8 kDa) que los hidrolizados de PUO (un 35% tiene una Mm media de 8,9 kDa y otro 35%

una Mm media de 3,8 kDa), y éstos presentaban mayor actividad antioxidante.

There is an increasing consciousness about the correct management of industrial by-products

due to their high environmental impact; therefore, the food industry is developing new ways of

reuse and revalorization. Artichoke manufacture industry generates a high amount of waste

(70%), and it has been demonstrated to be an interesting source of pectin. Pectin, and especially

pectic derived oligosaccharides (POS), have shown prebiotic and cancer cell antiproliferative

properties, among others. For the moment, no research has been done about the generation of

POS from artichoke by-products, therefore, the aim of this Final Master’s Degree Project is to

model and optimize enzymatic production of POS using cellulase from Aspergillus niger

(CAN) and Pectinex® Ultra Olio (PUO) enzymes. Reaction yields and conditions were 66

mg/100 mg of pectin at pH 4.41, 54 minutes and 17.1 Ud/g pectin for CAN, and 62 mg/100mg

of pectin at pH 6.86, 90 minutes and 520.5 Ud/g pectin for PUO. Products obtained were

characterized, concluding that CAN tends to form POS with higher molecular mass (Mm) (74%

has an average Mm of 13.8 kDa), than POS from PUO (35% of 8.9 kDa and 35% of 3.8 kDa).

In addition, as a preliminary functional evaluation, PUO’s hydrolysis products showed higher

antioxidant activity.

1

1. INTRODUCCIÓN

El sector agroalimentario desempeña un papel fundamental en España, ya que se posiciona en

el primer lugar de dicho sector económico, representando el segmento de alimentación y

bebidas aproximadamente el 22% de la industria manufacturera (MAPAMA, 2018a).

Según la Comisión Europea, cerca del 33% de los alimentos producidos en Europa se desechan,

y entre un 30 y un 40% de dichas pérdidas ocurre en las etapas de producción y transformación

de productos e ingredientes (Azti Tecnalia, 2015). Muchos de estos residuos se originan a partir

de la propia materia prima, incluso antes de su transformación, por lo que contienen macro- y

micronutrientes de gran interés, los cuales se pueden recuperar y usar como ingredientes en

otros productos y matrices alimentarias, con el fin de revalorizar dichos subproductos. Los

residuos generados suponen una preocupación en el sector alimentario, no sólo por las pérdidas

económicas que puedan suponer, sino también por el impacto medioambiental que conllevan.

Por ello, desde los ámbitos de investigación y desarrollo y empresarial, se trata de buscar e

implementar técnicas de recuperación de ingredientes alimentarios a partir de dichos

subproductos, principalmente en los sectores del aceite, cárnico, pesquero y frutas y hortalizas,

que son los sectores donde más desperdicios se generan (Sigma Biotech, 2017).

Dentro de la amplia variedad de ingredientes, los considerados bioactivos son de gran interés

para la investigación e industria alimentarias. Entre ellos destacan los lípidos insaturados,

compuestos fenólicos, péptidos y carbohidratos funcionales. Los carbohidratos bioactivos, por

su efecto principalmente enfocado al correcto funcionamiento del tracto gastrointestinal,

presentan un gran interés para su uso como ingredientes alimentarios. Entre ellos podemos

destacar dos grupos: la fibra, por su capacidad para mejorar el tránsito intestinal, y los

prebióticos, por su actividad beneficiosa sobre la microbiota intestinal.

Se entiende por prebiótico aquel ingrediente alimentario no digerible que llega al colon y sirve

de sustrato a la microbiota intestinal, dando lugar a metabolitos y micronutrientes que estimulan

el crecimiento selectivo de determinadas especies colónicas beneficiosas, fundamentalmente

bifidobacterias y lactobacilos (Corzo et al., 2015). La mayoría de los prebióticos son

oligosacáridos no digeribles los cuales se obtienen bien por síntesis enzimática a partir de

disacáridos o bien por hidrólisis química o enzimática de polisacáridos, carbohidratos más

complejos. Entre los prebióticos reconocidos se encuentran los fructanos (inulina y

oligofructosa) y fructo-oligosacáridos, galacto-oligosacáridos y lactulosa (Gibson et al., 2017),

2

y entre los posibles prebióticos con evidencias científicas importantes destacan las pectinas y

los oligosacáridos pécticos (POS) obtenidos por hidrólisis de la pectina (Gerschenson, 2017).

1.1 Pectina

1.1.1. Características estructurales

Las pectinas son polisacáridos muy complejos presentes en la estructura primaria de la pared

celular vegetal, cuyos principales dominios estructurales son el homogalacturonano (HG) y el

ramnogalacturonano I (RG-I) y II (RG-II). El HG es una cadena lineal (“región lisa”) de

moléculas de ácido galacturónico (GalA) unidas por enlaces α (1-4), con una longitud de hasta

un centenar de monómeros, que pueden estar parcialmente metilados en el grupo carboxilo (C-

6), u O-acetiladas en las posiciones O-2 u O-3, aunque se pueden encontrar también otro tipo

de sustituciones con azúcares neutros como la xilosa en el O-3 (Mohnen, 2008). La “región

ramificada” está formada por los dominios RG-I y RG-II, ambos compuestos por una cadena

de unidades de ramnosa y GalA alternadas ([4-α-D-GalA-1,2-α-L-Rha-1-]n). El RG-I puede

contener ramificaciones de arabinano, galactano y arabinogalactano en la posición O-4 de los

residuos de ramnosa (Babbar, Dejonghe, Sforza & Elst, 2017), y puede presentar acetilaciones

o metilaciones muy variadas, se cree que debido a una especialización funcional. Por último, el

RG-II, que suele ser la fracción péctica menos abundante, posee la estructura más compleja,

constituida por al menos 8 unidades de GalA y ramificada con hasta 12 tipos de azúcares unidos

por más de 20 tipos de enlaces diferentes (Gullón et al., 2013; Mohnen, 2008). La proporción

de cada una de las regiones de pectina varía en función de la fuente vegetal y del método de

extracción (Yang, Mu & Ma, 2018).

Una característica estructural relevante de las pectinas es su grado de metilación (DM), definido

como el porcentaje de unidades de GalA esterificadas con grupos metilo. En la naturaleza, la

pectina suele presentar un DM hasta del 90%, dependiendo de la especie vegetal, el tejido y su

madurez. Los grupos carboxílicos libres tienen una distribución definida a lo largo de la cadena

polimérica, por lo que existen dominios diferenciados por sus unidades de GalA esterificados

y libres (Pagan, 2001). Como se verá más adelante, esta característica influye en el

comportamiento fisicoquímico de la pectina, por lo que se considera un parámetro de gran

importancia.

En cuanto a la masa molecular (Mm), es difícil establecer valores específicos debido a la gran

heterogeneidad entre distintas pectinas, pero se considera que oscila entre 100 y 700 kDa, y

depende de la longitud de la cadena y la presencia de ramificaciones (Pagan, 2001; Muñoz-

3

Almagro, Rico-Rodríguez, Villamiel & Montilla, 2018). La Mm está estrechamente relacionada

con la viscosidad, y por tanto con la gelificación de las soluciones de pectina.

Figura 1: Representación de la estructura química de pectina (Mohnen, 2008).

1.1.2. Fuentes naturales

Las fuentes de obtención de pectina son productos de origen vegetal. En la industria se extraen

principalmente a partir de subproductos de cítricos (producción de zumo), pulpa de manzana

(elaboración de zumo y sidra) y remolacha azucarera (producción de azúcar), capítulos de

girasol (tras la separación de la semilla), etc. (Pagan, 2001). El contenido de pectina en

productos vegetales varía en función del género, especie y a veces incluso de la variedad del

producto, así como su grado de maduración y la parte de la planta. En la siguiente tabla (Tabla

1) se recogen algunas de las fuentes más importantes de pectina y su contenido.

Otra de las materias primas vegetales a partir de las cuales se puede obtener pectina son los

subproductos de la industria conservera de la alcachofa. España es el segundo productor

mundial de alcachofa, con alrededor de 225.600 toneladas producidas en 2016, de las cuales el

60% se destina a la industria. Su principal producción se da en provincias del litoral

mediterráneo, especialmente Murcia con el 47% de la producción total (MAPAMA, 2017;

MAPAMA, 2018b). Dentro de la industria transformadora de alcachofa, el 70% de la materia

prima se desecha como subproducto y se destina a alimentación animal. Dichos residuos se

componen fundamentalmente de tallo y brácteas (López-Molina et al., 2005). Teniendo en

cuenta las grandes cantidades de producto que se procesan en España anualmente, la pérdida

4

de materia prima que se genera es enorme, y cabría considerar otras vías de aprovechamiento.

En un estudio realizado por Sabater, Corzo, Olano y Montilla (2018) se han llegado a obtener

cantidades de pectina de 221 mg/g de subproducto, expresado en materia seca, mediante

hidrólisis enzimática con el preparado comercial Celluclast® 1,5L, lo que demuestra que los

subproductos de alcachofa son una fuente alternativa de pectina de gran interés.

Tabla 1: Fuentes vegetales de pectina y su contenido (%) (Chan et al., 2017).

FUENTE ALIMENTARIA CONTENIDO DE PECTINA (%)

Manzana 4,6 - 20,9

Cítricos (piel) 9,0 - 33,6

Remolacha azucarera 4,1 – 25,0

Semillas de girasol 7,4 – 11,6

Plátano (piel) 2,4 – 21,7

Zanahoria (desechos y piel) 8,7 – 9,1

Alubia (piel) 9,6 – 15,8

Puerro 10,6 – 11,0

Mango (piel) 9,2 – 31,8

Fruta de la pasión (piel) 2,3 – 30,3

Papaya (piel) 11,1 – 49,8

Pomelo (piel) 8,3 – 27,6

Tomate (piel) 14,9 – 83,5

1.1.3. Métodos de obtención

Aunque la pectina se puede obtener mediante síntesis química (Kinnaert, Daugaard, Nami &

Clausen, 2017), esto resulta sólo de interés científico, siendo habitual la extracción a partir de

subproductos agro-industriales, promoviendo así su revalorización, reduciendo los costes de

producción y el impacto medioambiental que ello conlleva. En cuanto a los procesos de

extracción, tradicionalmente se han utilizado métodos químicos, aunque actualmente están en

auge los métodos físicos y enzimáticos (Marić et al., 2018).

El método químico convencional consiste en una extracción sólido-líquido, utilizando

soluciones (0,05-2 M) de ácidos minerales fuertes (ácido sulfúrico, nítrico, fosfórico o

clorhídrico) como disolvente, durante 1-5 h a 80-100 °C, con agitación; la pectina se purifica

por precipitación, con alcoholes o por neutralización de cargas, y posterior filtración o

5

centrifugación; o por técnicas de membranas como ultrafiltración, entre otras (Marić et al.,

2018; Rabetafika, Bchir, Blecker & Richel, 2014). La extracción química tiene ciertas

desventajas, entre ellas la posible degradación de los compuestos de interés y el gran impacto

medioambiental, ambas debidas al tipo de disolvente tan agresivo que se utiliza. Por ello, se

han buscado disolventes alternativos para la extracción, por ejemplo, soluciones de ácidos

orgánicos, ácido acético o cítrico principalmente. Este tipo de disolventes son menos agresivos,

aunque por ello son también menos efectivos, que los ácidos minerales y, aunque suponen un

mayor coste económico, son más interesantes desde un punto de vista medioambiental (Marić

et al., 2018), y están más en línea con el concepto de “química verde” (Anastas & Warner,

1998) que tanta importancia ha adquirido en los últimos años.

Entre los métodos físicos ensayados, se han obtenido resultados positivos mediante el uso de

microondas. En este caso, son dos los fenómenos que hacen posible la extracción: por un lado,

el calor generado en el interior de la célula provoca una expansión de la misma y daña o rompe

la pared celular, posibilitando la pérdida de material celular; por otro lado, al aumentar la

temperatura del solvente polar (generalmente agua) aumenta su difusividad y se facilita la

transferencia de compuestos del interior al exterior de la célula (Marić et al., 2018; Rabetafika

et al., 2014). Otro proceso térmico es la aplicación de calor inducido por electromagnetismo.

Mediante esta técnica se han obtenido rendimientos similares al calentamiento convencional y

en menores tiempos. A pesar de las ventajas de los procesamientos térmicos (rendimientos altos

y tiempos cortos), existe una desventaja en común: el compuesto de interés (pectina) puede ser

degradado por efecto del calentamiento (Rabetafika et al., 2014; Zouambia, Ettoumi, Krea &

Moulai-Mostefa, 2017). Por ello, se están valorando nuevas técnicas físicas con el fin de reducir

la agresividad del proceso y preservar así la integridad de la pectina. Los ultrasonidos presentan

un mecanismo interesante para la extracción. La cavitación producida favorece la rotura de las

paredes celulares y la liberación de compuestos. La extracción por ultrasonidos es más rápida,

requiere menos energía y menor uso de disolventes y es medioambientalmente más adecuada,

en comparación con los métodos tradicionales (Marić et al., 2018; Rabetafika et al., 2014).

Por último, actualmente se está estudiando la extracción enzimática, muy prometedora a nivel

de tecnología de los alimentos. Se utilizan preparaciones comerciales multienzimáticas con

distintas actividades capaces de romper la pared celular liberando pectina: celulasa,

hemicelulasa, xilanasa, arabinasa, proteasa, alcalasa, α-amilasa, β-galactosidasa, etc.,

dependiendo del producto que se quiera obtener (Marić et al., 2018; Wikiera, Mika, Starzyńska-

Janiszewska & Stodolak, 2015). La utilización de enzimas para la hidrólisis de la pared celular

6

tiene diversas ventajas que la hacen interesante tecnológicamente. Primero, cabe mencionar que

se engloba dentro de la química verde, ya que reduce o elimina el uso de disolventes agresivos

y nocivos para el medioambiente. Los enzimas son capaces de actuar de forma específica (factor

propio de los catalizadores biológicos y que no ocurre en tratamientos físicos y químicos), es

relativamente rápida y actúa en condiciones de temperatura y pH suaves, lo cual permite

mantener la integridad de la pectina y una extracción más limpia y selectiva. Además, la

reducción del uso de disolventes permite un ahorro económico a nivel tecnológico, interesante

para procesos industriales (Marić et al., 2018). Para que la extracción sea más eficaz se pueden

combinar métodos enzimáticos y químicos o físicos, obteniendo mayor rendimiento con un

gasto de disolvente y de energía más reducido (Marić et al., 2018; Wikiera et al., 2015), aunque

en tal caso la selectividad del proceso se podría ver comprometida. Se ha observado que las

pectinas obtenidas mediante métodos enzimáticos tienen estructuras más complejas que

aquellas tradicionalmente extraídas mediante procesamiento químico (Wikiera et al., 2015).

1.1.4. Propiedades fisicoquímicas. Usos industriales.

Las propiedades fisicoquímicas de la pectina son muy importantes para su utilización en la

industria como ingrediente funcional. Este polisacárido es soluble en agua a bajas

concentraciones (1-5%), así como en otros disolventes como formamida, dimetilformamida o

glicerina caliente, y es insoluble en disolventes orgánicos y en soluciones con presencia de

detergentes cuaternarios, polímeros, proteínas y cationes polivalentes. La insolubilidad en este

tipo de soluciones permite la separación física por precipitación de la pectina disuelta en un

medio acuoso. Aunque las pectinas son neutras en su forma original, al solubilizarlas en

soluciones acuosas adquieren un carácter ácido, el cual depende del DM. Una solución de

pectina suele tener un pH de 2,8-3,4, y su grado de disociación es de 0,1-10 x10-4 (a 19 °C)

(Cabarcas, Guerra, Henao & Acevedo Morantes, 2012). Otra propiedad de la pectina es su

capacidad de formar soluciones viscosas en agua. Ambas propiedades, solubilidad y viscosidad,

dependen de diversos factores, entre ellos pH, temperatura, DM, Mm y concentración de

electrolitos. Además, la viscosidad de una solución de pectina aumenta a medida que la

temperatura se acerca al punto de ebullición (Cabarcas et al., 2012; Pagan, 2001). Por otra parte,

se ha visto una relación lineal entre la concentración en la solución y un aumento de la

viscosidad en pectina procedente de algunas frutas concretas: pulpa de manzana, cáscara de

cacao y piel de cítricos, entre otras (Chan, Choo, Young & Loh, 2017).

Como se ha mencionado previamente, el HG puede estar metil-esterificado; en función de la

proporción de grupos metilo se establece el DM, parámetro que determina algunas propiedades

7

fisicoquímicas de gran interés en tecnología alimentaria, como la viscosidad y la capacidad de

gelificación (Pagan, 2001). Se diferencian dos tipos de pectina en función de esta propiedad: de

alto grado de metilación (HM), donde más del 50% de los grupos carboxilo están metilados, y

de bajo grado de metilación (LM), con menos del 50%. Las pectinas de HM presentan mayor

viscosidad a medida que aumenta la Mm y las ramificaciones, y tienen la capacidad de formar

geles a pH ácido (2,8 a 3,5) y en medios con contenido de sólidos solubles de 60-70%. Las

pectinas de LM forman soluciones más viscosas cuanto mayor sea la presencia de cationes

divalentes, por lo que requieren su presencia (generalmente calcio) para formar geles (Cabarcas

et al., 2012). Los iones de calcio interaccionan con los grupos carbonilo libres de azúcares

neutros o ácidos (Pagan, 2001), formando complejos con estructura de red tridimensional. En

este caso, la gelificación puede ocurrir en un intervalo de pH y sólidos solubles más amplio (pH

1-7; contenido en sólidos solubles o azúcares de 0-80%), y el calcio debe estar presente en

concentraciones comprendidas entre 40 y 100 mg/g de pectina (Cabarcas et al., 2012).

La pectina tiene también cierto poder emulsificante, determinado por los dominios RG I y II,

que interaccionan con las proteínas, que son las verdaderas emulsificantes, confiriéndoles

mayor estabilidad (Funami et al., 2011). Se ha visto que existe una relación entre el grado de

acetilación y los azúcares neutros de las cadenas laterales y la capacidad de estabilización de

emulsiones (Yang et al., 2018), si bien el mecanismo por el que esto ocurre no está del todo

descrito, y la Mm y el contenido de proteínas influyen también en su emulsificación (Leorux,

Langendorff, Schick, Vaishnav & Mazoyer, 2003).

Debido a sus propiedades tecno-funcionales, la pectina es muy utilizada en la industria

alimentaria como agente gelificante, espesante o estabilizante de proteínas y carbohidrato

mimético (sustituto de grasas) (Dominiak et al., 2014). Como agente gelificante, las pectinas

de HM son utilizadas en matrices ácidas y azucaradas, como mermeladas o yogures. Para que

la gelificación sea rápida conviene utilizar pectinas de alto DM, Mm elevada y ramificaciones

abundantes. Por otro lado, las pectinas con LM pueden ser muy interesantes por gelificar, en

presencia de calcio, en matrices menos ácidas y con menos sólidos solubles, es decir, necesitan

menor cantidad de azúcares añadidos. Las pectinas se utilizan frecuentemente en la elaboración

de mermeladas, caramelos y gominolas de fruta, bebidas a base de fruta o bebidas lácteas ácidas,

sorbetes, preparados de fruta, postres ácidos, etc. (QuimiNet, 2011).

1.1.5. Propiedades biológicas. Posibles aplicaciones.

Otro aspecto importante de las pectinas son sus propiedades bioactivas. En primer lugar, son

consideradas como fibra soluble, que no puede ser digerida en el tracto gastrointestinal, y sin

8

embargo, puede ser degradada y fermentada por la microbiota del colon. Pero la pectina no sólo

presenta las propiedades de la fibra soluble, sino que es fermentada por ciertas bacterias

colónicas beneficiosas (Bacteroides thetaiotaomicron), formándose ácidos grasos de cadena

corta (SCFA) que favorecen el equilibrio de la microbiota intestinal (Gerschenson, 2017). El

DM es un factor de gran importancia en la fermentación de las pectinas, siendo más fácilmente

fermentables aquellas con LM (Olano-Martín, Gibson & Rastall, 2002). Por ello, se cree que,

mediante pectinas con estructura específica, sería posible extender la región de formación

intensa de SCFA desde las partes del colon proximales a las distales (Gerschenson, 2017). Por

otra parte, diversos estudios han demostrado que las pectinas presentan efecto prebiótico,

incrementando el nivel de bacterias beneficiosas como Bifidobacterium y Lactobacillus, e

inhibiendo el crecimiento de bacterias patógenas como Clostridium (Gullón et al., 2013).

Además, la pectina puede ayudar a reducir el riesgo de cáncer de colon, al afectar a la apoptosis

de las células cancerígenas (Gerschenson, 2017). Así, se ha visto que diferentes sustancias

pécticas o pectinas modificadas mediante tratamientos químicos, térmicos y/o enzimáticos han

presentado propiedades antiproliferativas en líneas celulares cancerosas. También pueden

adherirse a ácidos biliares y glucosa, lo que favorece la reducción de los niveles de colesterol

en sangre y la absorción intestinal de glucosa (Morris, Belshaw, Waldron & Maxwell, 2013).

Gracias a sus propiedades biológicas, la pectina y las sustancias pécticas resultan de gran interés

como ingrediente bioactivo para su incorporación a alimentos funcionales, aunque para su uso

existe una limitación, su baja solubilidad y alta viscosidad, que limitan su incorporación a dosis

superiores al 1%. Una forma de solventar este problema es la obtención de moléculas derivadas

de menor Mm, es decir, POS.

1.2 Oligosacáridos pécticos (POS)

1.2.1. Estructura

Los POS son oligosacáridos obtenidos por despolimerización parcial de la pectina con una

estructura que presenta entre 2 y 50 unidades monoméricas o Mm hasta 10 kDa, en función del

criterio seguido (Bonnin, Garnier & Ralet, 2014; Babbar et al., 2017). Los POS se producen

mediante métodos físicos, químicos, enzimáticos o una combinación de ellos. Las cadenas de

HG, RG-I y RG-II, en función de la materia prima de que proceda, pueden presentar importantes

diferencias estructurales, de forma que los POS obtenidos poseen distintos tipos de enlaces, α

y β, y hasta 14 monosacáridos diferentes, liberándose oligosacáridos ácidos sustituidos y no

sustituidos como oligogalacturónidos, ramnogalacturónidos o xilogalacturónidos, y neutros,

9

galactooligosacáridos, arabinooligosacáridos, y arabinogalactooligosacáridos, o una mezcla de

ellos (Gullón et al., 2013).

1.2.2. Métodos de obtención

Normalmente, la obtención de POS se realiza a partir de material vegetal en dos pasos, primero

extracción de la pectina de la pared celular y segundo rotura de la cadena polimérica para la

formación de oligosacáridos. Aunque con el fin de optimizar el proceso, se están estudiando

vías de obtención de POS directamente a partir de la materia prima en una sola etapa por medio

de combinación de enzimas (Babbar et al., 2017).

En los procesos químicos de despolimerización de la pectina, generalmente se realiza una rotura

parcial de las distintas fracciones pécticas por adición de ácidos, a altas temperaturas y/o

presiones (Berlin, Maximenko, Gilkes & Saddler, 2007).

En lo que a los métodos enzimáticos se refiere, se utilizan enzimas denominados pectinasas. Se

considera pectinasa, en general, a todo aquel enzima que catalice la hidrólisis o rotura del HG

y/o RG de una cadena péctica, dando lugar tanto a monómeros como a POS. Se incluyen

poligalacturonasas (E.C. 3.2.1.5), hidrolasas que rompen los enlaces α (1-4) de la cadena de

ácido poligalacturónico; las pectin liasas (E.C. 4.2.2.10), que catalizan la β-eliminación de la

pectina; y por último, las pectin esterasas (o metil esterasas; E.C. 3.1.1.11), las cuales catalizan

la hidrólisis de los grupos acetilo y/o metilo de los oligogalacturónidos (Kohli & Gupta, 2015).

Como pectinasas no se consideran otros enzimas que, aunque actúen sobre la pectina, no lo

hacen específicamente sobre las zonas de HG o RG, como es el caso de arabinasas o

galactanasas (Alimardani-Theuil, Gainvors-Claisse, & Duchiron, 2011; Castilho, Medronho &

Alves, 2000). Las pectinasas son enzimas que están naturalmente presentes en frutos y plantas,

ya que son las responsables del ablandamiento propio de la maduración (John, Yang, Liu, Jiang

& Yang, 2018), aunque su extracción a partir de esta matriz no es muy común. Además de para

la obtención de POS como ingrediente, este tipo de enzimas son muy utilizados en la industria

alimentaria para múltiples procesos: extracción, clarificación y concentración de zumos de

fruta, clarificación de vinos, y extracción de aceites, aromas y pigmentos de materia vegetal

(Castilho et al., 2000).

Para la rotura de la pectina se utilizan principalmente poligalacturonasas, pectin liasas, pectin

metilesterasas, ramnogalacturonasas, galactasas y arabinasas; dependiendo del enzima que se

utilice se obtendrán diferentes tipos de POS. Entre las glicosidasas en general y las

poligalacturonasas en particular, existen dos tipos de enzimas según la forma de hidrolizar los

10

carbohidratos: endo- y exopoligalacturonasas. Las exopoligalacturonasas eliminan residuos de

GalA desde los extremos mientras que las endopoligalacturonasas catalizan la rotura de enlaces

α (1-4) al azar; la actividad de las primeras se puede ver limitada con la aparición de residuos

diferentes de GalA, como ramnosa o arabinosa. Debido a su actividad, las

exopoligalacturonasas dan lugar a cadenas de pectina de alto Mm y residuos monoméricos de

GalA, mientras que las endopoligalacturonasas dan lugar a POS; por ello, es preferible el uso

de endopoligalacturonasas para alcanzar un mayor rendimiento en la obtención de POS, que

puede llegar al 95%. (Pagan et al., 2001; Gullón et al., 2013), mientras que las pectin liasas dan

lugar a oligogalacturónidos de bajo grado de polimerización (GP). Los otros tipos de enzimas,

como ramnogalacturonasas, galactasas o arabinasas, producen oligosacáridos con azúcares

distintos al GalA (ramnogalacturónidos, por ejemplo). También se han empleado mezclas de

los enzimas anteriores para obtener productos más variados (Gullón et al., 2013), si bien lo más

común es utilizar preparados enzimáticos comerciales que suelen presentar, junto con la

actividad principal, otras actividades que influyen también en las características de los POS

(Babbar et al., 2017).

Las pectinasas comerciales suelen ser de origen microbiano. Se obtienen principalmente a partir

de extractos celulares de Aspergillus spp. (Combo, Aguedo, Goffin, Wathelet & Paquot, 2012),

aunque hay investigaciones que han obtenido buenos resultados utilizando otras especies

microbianas como Bacillus spp. (Rehman et al., 2015; Uzuner & Cekmecelioglu, 2015; Yu &

Xu, 2017), Saccharomyces cerevisiae (Poondla, Bandikari, Subramanyam & Obulam, 2015) o

Penicillium viridicatum (Silva, Martins, Silva & Gomes, 2002). Según la bibliografía, los

hongos filamentosos del género Aspergillus spp. tienen la capacidad de sintetizar una gran

batería de enzimas involucrados en la degradación de los polisacáridos presentes en la pared

celular, como es el caso de la pectina (de Vries & Visser, 2001), y su expresión puede modularse

en función de las condiciones de crecimiento a las que es sometido.

1.2.3. Propiedades biológicas. Posibles aplicaciones

Como ingredientes bioactivos los POS parecen aún más interesantes que las pectinas. Algunos

POS se han propuesto como potenciales prebióticos por ser oligosacáridos no digeribles

(Gullón et al., 2013), ya que el carbono anomérico (C1 o C2) de las unidades monoméricas

posee una configuración que no es reconocida por los enzimas digestivos humanos (Roberfroid

& Slavin, 2000). Al ser oligosacáridos no digeribles, llegan al intestino grueso o colon y son

fermentados por la microbiota intestinal, donde se ha comprobado que expresan funcionalidad

bifidogénica, favoreciendo el crecimiento y colonización de este género. Como resultado de la

11

fermentación, se sintetizan metabolitos tales como SCFA, los cuales reducen el pH del medio

e inhiben la proliferación de bacterias patógenas, evitando así infecciones y un desequilibrio

del ecosistema microbiológico intestinal. Además de por su efecto prebiótico, se están

estudiando los POS para otros posibles usos beneficiosos como la inducción de la apoptosis y

la reducción de la progresión, transformación y metástasis de células cancerosas de colon, la

prevención de la adhesión de patógenos (Campylobacter jejuni, por ejemplo) y sus toxinas a

los receptores epiteliales, la detoxificación de metales pesados (RG II, específicamente), la

inhibición de la acumulación lipídica, la reducción de los niveles de glucosa en sangre y la

modulación del sistema inmune (Babbar et al., 2017; Bonnin et al., 2014; Gerschenson, 2017;

Holck, Hotchkiss, Meyer, Mikkelsen & Rastall, 2014).

Los POS son muy apropiados para su utilización en alimentos por ser azúcares no-cariogénicos

y tener un valor calorífico reducido (Mussatto & Mancilha, 2007). Además, debido a su baja

Mm, su mayor solubilidad en soluciones acuosas que la de la pectina, por lo que pueden ser

más adecuados para su incorporación como ingrediente bioactivo en alimentos funcionales. En

cuanto a la dosis necesaria para causar los efectos deseables, no hay consenso al respecto. Dicha

dosis debe basarse en estudios clínicos, y debe ser específica para cada tipo de oligosacárido,

ya que depende de numerosos factores (Illanes, 2015). Aunque existen pocos estudios que

relacionen la dosis con el efecto provocado, se ha comprobado que éste no depende tanto de la

cantidad de prebiótico ingerida sino del estado de la microbiota intestinal al inicio del

tratamiento, y de si se administra de forma simbiótica o no, por lo que es muy difícil establecer

valores generales. En los estudios realizados de cara a la mejora del tracto digestivo, se han

venido utilizando cantidades de entre 8 y 30 g/día (Hidalgo-García & Farran-Codina, 2013).

Por otra parte, existen pocas evidencias en lo que a la relación estructura-función respecta,

aunque se ha demostrado que los oligosacáridos parcial o totalmente ácidos no presentan

actividad bifidogénica, mientras que fragmentos neutros de bajo GP sí que presentan dicha

propiedad, sobre todo durante las primeras horas de fermentación colónica (Bonnin et al.,

2014). Considerando que la bioactividad de los POS está determinada por su estructura, se están

desarrollando métodos para la extracción y separación selectiva de mezclas de POS. Dichos

procesos proporcionarán nuevas rutas de valorización para los subproductos que proceden de

la biomasa vegetal de bajo valor (Holck et al., 2014). Aunque, por el momento, no existen

técnicas estandarizadas para su producción y dada la amplia variedad de sustratos utilizables y

la falta de estudios sistemáticos sobre su estructura, no es posible sacar conclusiones sobre la

12

relación estructura-función, y es necesario profundizar en estos estudios para ayudar al uso

racional de los POS en ingredientes funcionales.

2. OBJETIVOS

En los últimos años, la industria alimentaria está desarrollando una línea orientada hacia la

creación de nuevos alimentos funcionales con alto valor añadido y cada vez es más amplio el

mercado de este tipo de productos a nivel mundial. Esto, sumado a la mayor concienciación de

los consumidores y de la industria por la sostenibilidad medioambiental, ha provocado que se

esté mostrando un gran interés en la utilización de subproductos de la industria alimentaria para

obtener ingredientes funcionales y de esta forma lograr un aprovechamiento más sostenible de

las materias primas.

De entre los diferentes ingredientes funcionales descritos, uno de los grupos más atractivos para

la industria alimentaria es el de los prebióticos, relacionados con una mejora en la función

gastrointestinal. Dentro del grupo de prebióticos emergentes se están considerando los POS, ya

que existen trabajos en los que se ha demostrado su carácter prebiótico. Por este motivo, resulta

de gran interés la optimización de métodos de obtención de POS que permita producir grandes

cantidades de manera rápida y barata utilizando subproductos que genera la industria

agroalimentaria. Tradicionalmente, la pectina se extrae de subproductos de cítricos, manzana y

remolacha, aunque se están estudiando nuevas fuentes de las que se puedan obtener POS con

distintas características estructurales y, por tanto, distintas propiedades funcionales. Por el

momento, hasta nuestro conocimiento, hay pocos estudios acerca de la obtención de pectina a

partir de subproductos de alcachofa y ninguno de la obtención de POS, por lo que esta

investigación aportaría soluciones de cara a una posible revalorización de subproductos en un

sector de la industria alimentaria que, como se ha visto, es de gran importancia, principalmente

en el litoral mediterráneo. Por otro lado, y gracias a los últimos avances en los métodos

enzimáticos de extracción, es posible la producción de ingredientes y productos a nivel

industrial de forma económicamente viable.

Teniendo en cuenta lo anterior y la utilidad de la modelización matemática mediante técnicas

avanzadas de machine learning para optimizar procesos, el objetivo general planteado en este

Trabajo de Fin de Máster es la optimización de la obtención de oligosacáridos derivados de

pectina por vía enzimática, así como el análisis de los productos obtenidos, utilizando

pectina extraída a partir de subproductos de alcachofa generados en la industria.

13

Para cumplir el objetivo general se han tenido en cuenta los siguientes objetivos específicos:

• Obtención de POS mediante hidrólisis enzimática de la pectina de alcachofa, realizando

un diseño experimental y utilizando dos preparados enzimáticos comerciales: celulasa

de Aspergillus niger (CAN) y Pectinex®Ultra Olio (PUO).

• Análisis en los hidrolizados obtenidos de i) azúcares reductores liberados; ii)

carbohidratos de baja Mm y iii) distribución de la Mm de las fracciones liberadas y

cuantificación de las mismas.

• Modelización y optimización del proceso mediante un diseño experimental analizado

por el método de superficie respuesta (RSM) y el de redes neuronales artificiales (ANN)

utilizando los POS cuantificados con Mm entre 100 y 0,3 kDa.

• Determinación de las propiedades antioxidantes de los POS obtenidos de la pectina de

alcachofa en las condiciones óptimas.

14

3. PLAN DE TRABAJO

POS EN CONDICIONES ÓPTIMAS

- GC-FID

- HPSEC-ELSD

- DPPH (propiedades antioxidantes)

MODELIZACIÓN Y OPTIMIZACIÓN

Método de superficie respuesta (RSM) y redes neuronales

artificiales (ANN).

Variable a optimizar: POS 100 > Mm > 0,3 kDa

Método DNS

Cuantificación de azúcares

reductores liberados.

GC-FID

Cuantificación de monosacáridos

y oligosacáridos liberados.

HPSEC-ELSD

Distribución Mm de fracciones

liberadas y cuantificación.

OBTENCIÓN DE MEZCLAS DE POS

CARACTERIZACIÓN

Preparados enzimáticos.

Actividad

(DNS)

Proteína

(Bradford)

DISEÑO EXPERIMENTAL

3 factores: pH (4,5, 5,5 y 6,5), tiempo de reacción (1,5, 3,25 y 5 h) y

cantidad de enzima (CAN: 25,9-77,6 Ud/g pectina; y PUO: 123,9-

464,7 Ud/g pectina).

Enzimas comerciales

Pectinex® Ultra Olio (PUO)

Celulasa Aspergillus niger

(CAN)

Pectina

(Subproductos de

alcachofa).

MEZCLAS DE POS

DETERMINACIONES ANALÍTICAS

Figura 2: Plan de Trabajo

15

4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 Reactivos y muestras

Los patrones utilizados para la identificación y cuantificación de azúcares (D-xilosa, D-arabinosa,

L-ramnosa, D-galactosa, D-manosa, D-glucosa, GalA, sacarosa, β-fenil-glucósido, kestosa,

nistosa y fructosil nistosa) se adquirieron en Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania). Los

preparados enzimáticos comerciales utilizados en este estudio, Pectinex®Ultra Olio (PUO)

(preparado líquido), una pectin liasa con actividad secundaria poligalacturonasa de A. niger y A.

aculeatus, fue un regalo de la casa comercial Novozymes (Bagsvaerd, Dinamarca) y celulasa de

A. niger (CAN, preparado sólido) se obtuvo de la casa comercial Sigma-Aldrich (Steinheim,

Alemania).

La pectina de alcachofa utilizada como sustrato fue obtenida previamente en el laboratorio

mediante extracción enzimática (Sabater et al., 2018). Todas las disoluciones se realizaron con

tampón de acetato de sodio 50 mM al pH correspondiente a cada ensayo. El ajuste de pH se realizó

con ácido acético. El agua utilizada para preparar las distintas soluciones fue ultra-pura (18,2 MΩ

cm, Milli-Q Synthesis A 10 de Millipore, Billerica, MA, EEUU).

4.2 Caracterización de los preparados enzimáticos

4.2.1 Purificación de los enzimas

Para eliminar las impurezas de los preparados enzimáticos se purificaron mediante una columna

de desalinización con un volumen de resina de 2,4 mL (PD-10 Sephadex G25, Desalting

Workmate, General Electric, Buckinghamshire, Reino Unido). Primero, la columna se equilibró

con 10 volúmenes de tampón acetato 50 mM (pH 4,5; 5,5; 6,5 según el ensayo realizado) y

después se añadió 1 volumen de PUO (líquida) o de una solución de 140 mg/mL de CAN. Las

muestras se eluyeron con 1,4 volúmenes de tampón y la columna se lavó con otros 4 volúmenes

del mismo buffer.

4.2.2 Determinación de la actividad hidrolítica (método del ácido 3,5-

dinitrosalicílico (DNS) o método de Miller)

Este ensayo consiste en la determinación de grupos reductores que se liberan tras una reacción

enzimática que se encuentra en la fase lineal de la cinética, la cual equivale a la velocidad lineal

de la reacción. El ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) es un reactivo de color amarillo con un

grupo nitro que, en medio alcalino, es reducido por el grupo carbonilo libre de los azúcares

16

reductores, dando lugar a un producto monoamino de color rojizo que se puede cuantificar

mediante espectrofotometría a una longitud de onda (λ) de 560 nm, ya que la intensidad de

color es proporcional a la cantidad de grupos reductores presentes en la disolución (Miller,

1959; Cruz & Soler, 2014).

Figura 3: Diagrama de reacción entre DNS y azúcares reductores (Cruz & Soler, 2014).

En este caso, se realizó la determinación de la actividad hidrolítica de los preparados

enzimáticos PUO y CAN antes y después de la purificación. Para el desarrollo del ensayo de

DNS se incubaron 0,5 mL de pectina de alcachofa al 2% en tampón a pH 5, con 125 µL de

disolución de 20 mg/mL de CAN o 12,5 µL de PUO, a 50 °C durante 5 minutos. La reacción

enzimática se paró añadiendo 0,5 mL de DNS y enfriando en hielo. Se tomaron 0,2 mL de la

mezcla de reacción y se llevaron a ebullición en un baño de agua durante 5 minutos. Después,

se añadieron 750 µL de agua, se centrifugó durante 2 minutos a 10.000 rpm y se transfirieron

300 µL de los sobrenadantes de cada muestra a una placa multipocillos, por duplicado. La

lectura se realizó mediante espectrofotometría en un lector de placas multipocillo a 560 nm.

Para la cuantificación se preparó GalA (azúcar mayoritario de la pectina) en tampón de acetato

de sodio pH 5 a distintas concentraciones entre 5 y 0,02 mg/mL. Cada patrón se preparó por

duplicado y se sometió al mismo proceso de reacción que las muestras. La curva de calibrado

17

presentaba una relación lineal con R2 ≥ 0,99. El cálculo se hizo considerando que la actividad

hidrolítica se define como la cantidad de enzima (en µg o µL) que es capaz de liberar 1 µmol

de azúcares reductores (expresado como µmol de GalA) por minuto. Este valor se expresa en

unidades por mL o por g de preparado enzimático (Ud/mL o Ud/g).

4.2.3 Cuantificación del contenido en proteína (Método de Bradford)

Para determinar la cantidad de proteína que contienen los preparados enzimáticos purificados

se utilizó el método de Bradford (Bradford, 1976). Este método utiliza un reactivo que contiene

Coomassie Brilliant Blue G-250 en dilución acuosa de ácido fosfórico. Éste es un agente

colorante que forma unión con proteínas, pasando de su color rojo original a un color azulado,

con lo que permite la cuantificación por colorimetría. Tras la unión, se observa un incremento

de la absorbancia, que se determina a una λ de 595 nm.

Figura 4: Diagrama de reacción entre Coomassie Brilliant Blue G-250 y proteínas (Mata-Gómez, Yasui,

Guerrero-Rangel, Valdés-Rodrígez & Winkler, 2012).

Para este ensayo se utilizó el preparado comercial BioRad Protein Assay Dye Reagent

(Hercules, California). Se mezcló 1 volumen del reactivo sin filtrar con 4 volúmenes de agua

MilliQ y, en tubos Eppendorf, se incorporaron 600 µL de esta disolución a 30 µL de muestra o

patrón. Esto se agitó en vórtex, se pasó a una placa multipocillo, se dejó en incubación a

temperatura ambiente durante 5 minutos y se cuantificó mediante un lector espectrofotométrico,

a una λ de 595 nm. Cada una de las muestras o patrones se preparó por duplicado. La curva de

calibrado se realizó con albúmina sérica bovina en concentraciones de 0,05 a 0,5 mg/mL (R2 ≥

0,99). Los enzimas comerciales purificados, CAN y PUO, se diluyeron a 5 mg/mL y 50 µL/mL,

respectivamente, para que la medida de absorbancia entrase dentro de la recta patrón.

18

La actividad específica de los preparados enzimáticos se calculó dividiendo la actividad

enzimática entre el contenido en proteína y se expresó como unidades por mg de proteína.

4.3 Obtención de oligosacáridos pécticos (POS). Diseño experimental.

Para la obtención de POS a partir de pectina de alcachofa por vía enzimática utilizando los

enzimas CAN y PUO se prepararon disoluciones de pectina de alcachofa al 2% en tampón de

acetato de sodio 50 mM (pH variable según el ensayo), a las cuales se añadió la correspondiente

cantidad de enzima. Los ensayos se realizaron en un baño de agua a 50 °C con agitación durante

el tiempo especificado para cada muestra. Terminada la reacción, el enzima se inactivó

introduciendo las muestras en un baño de agua en ebullición durante 5 minutos.

Una vez determinadas las condiciones óptimas de hidrólisis para maximizar la obtención de

POS a partir de pectina, se llevaron a cabo las reacciones enzimáticas en las condiciones de pH,

tiempo y cantidad de enzima determinadas. La hidrólisis de la pectina se realizó por duplicado

con cada enzima.

Todos los hidrolizados se conservaron en congelación a – 18 °C.

4.3.1 Diseño experimental

Para modelar y establecer las condiciones óptimas de las distintas reacciones enzimáticas,

primero se utilizó el programa Statgraphics Centurion XVII para generar el diseño

experimental. Mediante el mismo, se obtuvieron un total de 17 ensayos para cada uno de los

enzimas, que se realizaron al azar y se resumen en la Tabla 2. En este diseño experimental se

utilizaron 3 variables independientes: cantidad de enzima, pH y tiempo de reacción, a cada cual

se le asignó un valor central (0), un valor factorial mínimo y uno máximo (-1 y +1,

respectivamente) y dos valores axiales (-α y +α), que se combinaron de forma lineal en un

sistema coordinado. Así, se obtuvieron 3 puntos centrales (x0, y0, z0), 8 puntos factoriales

(formados por combinaciones de -1, +1) y 6 puntos axiales, formados por alguno de los

extremos (-α, +α) y valores centrales (0).

19

Tabla 2: Diseños experimentales. Condiciones de reacción para cada ensayo y cada variable: pH, tiempo (h)

y cantidad de enzima (Ud/g pectina).

Celulasa de Aspergillus niger (CAN) Pectinex® Ultra Olio (PUO)

Ensayo pH Tiempo Enzima Ensayo pH Tiempo Enzima

1 5,5 (0) 3,25 (0) 51,8 (0) 1 5,5 (0) 3,25 (0) 294,3 (0)

2 6,5 (+1) 5 (+1) 25,9 (-1) 2 4,5 (-1) 1,5 (-1) 123,9 (-1)

3 4,5 (-1) 1,5 (-1) 25,9 (-1) 3 6,5 (+1) 1,5 (-1) 464,7 (+1)

4 6,5 (+1) 1,5 (-1) 77,6 (+1) 4 6,5 (+1) 5 (+1) 123,9 (-1)

5 4,5 (-1) 5 (+1) 77,6 (+1) 5 4,5 (-1) 5 (+1) 464,7 (+1)

6 4,5 (-1) 1,5 (-1) 77,6 (+1) 6 6,5 (+1) 5 (+1) 464,7 (+1)

7 6,5 (+1) 1,5 (-1) 25,9 (-1) 7 6,5 (+1) 1,5 (-1) 123,9 (-1)

8 5,5 (0) 3,25 (0) 51,8 (0) 8 4,5 (-1) 5 (+1) 123,9 (-1)

9 6,5 (+1) 5 (+1) 77,6 (+1) 9 5,5 (0) 3,25 (0) 294,3 (0)

10 4,5 (-1) 5 (+1) 25,9 (-1) 10 4,5 (-1) 1,5 (-1) 464,7 (+1)

11 3,83 (-α) 3,25 (0) 51,8 (0) 11 5,5 (0) 0,32 (-α) 294,3 (0)

12 5,5 (0) 0,32 (-α) 51,8 (0) 12 5,5 (0) 6,18 (+α) 294,3 (0)

13 7,17 (+α) 3,25 (0) 51,8 (0) 13 3,83 (-α) 3,25 (0) 294,3 (0)

14 5,5 (0) 3,25 (0) 51,8 (0) 14 7,17 (+α) 3,25 (0) 294,3 (0)

15 5,5 (0) 3,25 (0) 95,1 (+α) 15 5,5 (0) 3,25 (0) 9,3 (-α)

16 5,5 (0) 3,25 (0) 8,5 (-α) 16 5,5 (0) 3,25 (0) 579,3 (+α)

17 5,5 (0) 6,19 (+α) 51,8 (0) 17 5,5 (0) 3,25 (0) 294,3 (0)

Figura 5: Representación gráfica del diseño experimental. Los valores factoriales están representados por

su correspondiente símbolo (-, +), los valores axiales se representan mediante puntos amarillos y los

valores centrales se sitúan en la intersección entre las dos líneas continuas (CAMO, 2018).

20

4.3.2 Optimización del diseño experimental

Para optimizar las condiciones de reacción, estudiando el comportamiento de cada una de las

variables dependientes en función de las variables independientes, primero se utilizó el método

de superficie de respuesta (RSM) mediante el programa informático StatGraphics Centurion

XVI. Se trata de un programa que es capaz de predecir el efecto de distintas variables en

términos lineales, cuadráticos y de correlaciones cruzadas (Astray, Gullón, Labidi & Gullón,

2016; Sabater et al., 2018). No obstante, dada la complejidad del proceso estudiado, se buscaron

métodos alternativos que permitiesen explicar y analizar el diseño con mayor exactitud. Con

este fin, se emplearon dos modelos de redes neuronales artificiales (ANN) previamente

programados en lenguaje R v3.4.3 en el grupo de investigación (Sabater, Ferreira-Lazarte,

Montilla & Corzo, en revisión).

Las ANN son una serie de modelos basados en el aprendizaje de máquinas (machine learning)

ampliamente utilizados para el reconocimiento de patrones en campos como la minería de datos

o la metabolómica. Se componen de una capa de entrada (input) que consta de los factores

estudiados (pH, tiempo, cantidad de enzima y las interacciones entre estos tres factores), una

capa de salida (output) que corresponde a la variable a optimizar (formación de POS) y una

serie de capas intermedias u ocultas (hidden layers) formadas por nodos o “neuronas”

conectadas entre sí mediante funciones matemáticas y cuyo número depende de la complejidad

del proceso que se estudia. La red utilizada para modelar el comportamiento de PUO poseía

una capa oculta de 9 nodos y la utilizada para modelar el comportamiento de CAN poseía una

capa oculta de 6 nodos. La arquitectura de las ANN se muestra en la Figura 6. La función de

activación de las ANN fue logística. Una función de activación es una transformada no lineal

que se aplica a los valores de entrada, después de que éstos hayan sido multiplicados por una

serie de coeficientes (weights), para determinar si la información que reciben los nodos es

relevante o no. Además, el resultado de estas decisiones que se van tomando en cada etapa del

modelo también está determinado por una constante (bias).

Los modelos se entrenaron con el 70% de los datos, se validaron mediante validación cruzada

y se comprobaron con el 30% de los datos restantes. De esta manera, se asegura la capacidad

del modelo de predecir muestras nuevas y, por tanto, de generalizarse. Posteriormente, se

realizó un análisis de sensibilidad para determinar la importancia de los factores estudiados

dentro del modelo. La exactitud del ajuste se midió calculando los coeficientes de regresión R2

y R2 ajustado, así como el error de la raíz cuadrada media (RMSE).

21

Figura 6: Arquitectura de las ANN utilizadas para modelar la producción de POS por PUO (a) y CAN (b).

Los parámetros de entrada fueron las condiciones de reacción (pH, tiempo, cantidad de enzima e

interacciones entre los factores) y el parámetro de salida la cantidad de POS formada con una Mm

comprendida entre 100 y 0,3 kDa. Las conexiones entre los elementos del modelo son positivas (negras) o

negativas (grises) y su grosor representa la repercusión en el mismo. I: input, O: output, H: hidden, B: bias.

4.4 Análisis de los hidrolizados

Las muestras hidrolizadas se caracterizaron mediante 3 técnicas: método espectrofotométrico

del DNS, análisis cromatográfico por GC-FID y análisis cromatográfico por HPSEC-ELSD.

4.4.1 Cuantificación de azúcares reductores

Mediante el método del DNS se realizó una estimación preliminar de la intensidad de la

hidrólisis, ya que cuantifica los azúcares reductores presentes.

Este ensayo se realizó como se explica en el apartado 4.2.2, tomando 100 µL de las muestras

de hidrolizado y 100 µL de reactivo DNS. Para cada hidrolizado se preparó, en las mismas

condiciones, un control que era el sustrato con el enzima inactivado en agua en ebullición

durante 5 minutos. Sólo los ensayos del diseño experimental se analizaron por este método y

no se aplicó a los óptimos.

4.4.2 Análisis cromatográfico por GC-FID

Para cuantificar los carbohidratos con un GP ≤ 5 los hidrolizados enzimáticos se analizaron por

cromatografía de gases (GC) con detector de ionización de llama (FID). Se utilizó un

cromatógrafo de gases GC7890A con inyector automático 7693A (Agilent Technologies Inc.,

Palo Alto, CA). Debido a la baja volatilidad que los azúcares tienen por naturaleza, fue

necesario someter las muestras a un pretratamiento de derivatización donde se formaron

trimetilsilil oximas a partir de los carbohidratos presentes. Para ello, se tomaron 250 µL de

22

muestra (equivalente a 5 mg de carbohidratos), se añadieron 400 µL de patrón interno (β-fenil-

glucósido a 0,5 mg/mL) y la mezcla se deshidrató por rotaevaporación a 40 ºC. Tras esto, se

procedió a la formación de las trimetilsilil oximas siguiendo el método de Brobst y Lott (1966):

primero, se añadieron 250 µL de una disolución de cloruro de hidroxilamina en piridina al 2,5%

y se mantuvo a 70 °C en estufa durante dos etapas de 15 minutos, con una agitación en vórtex

entre ambas; después, se añadieron 250 µL de hexametildisilazano y 25 µL de ácido

trifluoroacético y se mantuvo a 50 °C durante 30 minutos. Finalmente, las muestras se

centrifugaron durante 2 minutos a 10.000 rpm, y el sobrenadante se recogió en un vial para su

posterior análisis por GC-FID.

Para la identificación y cuantificación se utilizó una columna capilar de sílice DB-5HT (30 m

× 0,25 mm × 0,10 µm) (J&W Scientific, Folson, California, USA). El horno se programó con

el siguiente gradiente de temperaturas: temperatura inicial 150 ̊ C, incremento de 1 ̊ C/min hasta

165 ˚C, incremento de 10 ˚C/min hasta 200 ˚C e incremento de 50 ˚C/min hasta 380 ˚C,

manteniéndose a esta temperatura durante 2 minutos. La temperatura del inyector y del detector

fue de 280 ˚C y 385 ˚C, respectivamente. La inyección de la muestra se realizó en modo split,

relación 1:30. El gas portador utilizado fue N2 a un flujo de 1 mL/min.

Para el análisis cuantitativo se calcularon los factores de respuesta de los distintos carbohidratos

respecto al patrón interno, β-fenil-glucósido. Para ello, se prepararon mezclas de patrones de

xilosa, arabinosa, ramnosa, galactosa, manosa, glucosa y GalA, sacarosa para disacáridos y

kestosa para la cuantificación de tri-, tetra- y pentasacáridos, a distintas concentraciones, en un

rango entre 0,02 y 2 mg/mL. La preparación de estas mezclas y su análisis por GC se realizaron

por duplicado; en todos los casos, la desviación estándar relativa fue inferior al 10%. La

adquisición y procesado de los datos obtenidos se realizó con el software Agilent ChemStation

en todos los casos.

4.4.3 Análisis cromatográfico por HPSEC-ELSD

Para cuantificar todos los carbohidratos presentes en las muestras y determinar la distribución

de la Mm de los compuestos se utilizó la cromatografía de exclusión molecular (HPSEC) con

un detector evaporativo de dispersión de luz (ELSD, evaporative light scattering detector). El

análisis se realizó en un equipo Agilent 1200 Infinity equipado con dos columnas de

polimetacrilato hidroxilado en serie: TSKgel G5000PWXL (7,8 mm × 300 mm, tamaño de

partícula 10 µm) específica para compuestos de tamaño molecular entre 50-7.000 kDa, y

TSKgel G2500PWXL, semejante con un tamaño de partícula de 6 µm (Tosoh Bioscience,

23

Montgomeryville, PA, USA) para la separación de compuestos de menor Mm (< 8 kDa). La

elución de los carbohidratos se realizó con acetato de amonio 10 mM como fase móvil, a un

flujo de 0,5 mL/min.

Antes de proceder con el análisis, las muestras se diluyeron en agua Milli-Q hasta una

concentración de 1 mg/mL de azúcares y se filtraron utilizando un filtro de PVDF de 0,45 µm

(Agilent Technologies Inc.), inyectándose posteriormente 50 µL en el sistema cromatográfico.

Los datos obtenidos se procesaron con el software Agilent ChemStation.

Para la estimación de la Mm y concentración de los distintos carbohidratos se usó calibración

externa. Para ello, se utilizaron muestras de pululanos comerciales (Fluka Analytical) de Mm

conocida (0,342-788 kDa), a concentraciones entre 0,1 y 1,0 mg/mL cada uno. A partir de los

perfiles obtenidos, utilizando el tiempo de retención para la estimación de la Mm y el área de

los picos para las concentraciones y, dada la respuesta exponencial de este tipo de columnas de

exclusión molecular y del detector, se realizó una representación logarítmica en ambos casos,

obteniéndose una relación lineal con R2 ≥ 0,98.

4.5 Determinación de la actividad antioxidante de los POS

El método se fundamenta en que el DPPH• (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) es un radical coloreado

que absorbe luz a λ = 516 nm y es altamente oxidante. Cuando el DPPH• se añade en un medio

en presencia de un compuesto antioxidante, éste último o bien capta el DPPH• o bien le dona

un átomo de hidrógeno, de forma que lo transforma en una molécula químicamente estable y

deja de ser oxidante. La disminución de radicales de DPPH se puede medir por

espectrofotometría, ya que la forma estable de la molécula tiene un color diferente al radical, y

disminuirá la absorbancia a 516 nm (Antolovich, Prenzler, Patsalides, McDonald & Robards,

2002).

Para este estudio se utilizó el protocolo descrito por Rha et al. (2011), con alguna modificación.

La curva de calibrado se realizó con soluciones de trolox (análogo hidrosoluble de la vitamina

E) en metanol, a concentraciones de 0,2 a 1,0 mM. El reactivo DPPH• de partida se disolvió en

etanol hasta una concentración 40 mM. Para la preparación de muestras, se hizo una dilución

1:10 en metanol de los hidrolizados optimizados, hasta llegar a una concentración de 2 mg/mL.

En una placa multipocillo se añadieron, por duplicado, 100 µL de muestra o patrón y 100 µL

de solución de DPPH 40 mM. La placa se incubó a temperatura ambiente y protegida de la luz

durante 30 minutos. Tras este tiempo, se realizó la lectura a una λ de 516 nm.

24

4.6 Análisis estadístico

Para complementar el análisis de datos se realizaron ANOVA y test de Tukey (p < 0,05) de

todos los resultados obtenidos.

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1 Actividad hidrolítica de los preparados enzimáticos

Mediante el método de Miller se estimó la actividad hidrolítica de los enzimas utilizando GalA

como patrón, al tratarse del glucósido principal de la cadena de HG de la pectina, y llevando a

cabo la cinética de reacción con la pecina de alcachofa, en las mismas condiciones de pH y

temperatura que se iban a utilizar para la obtención de POS, pero a un tiempo corto para que la

reacción estuviera en la fase lineal. De esta forma, se pudo estimar la actividad hidrolítica

global, que viene dada por los azúcares reductores totales liberados, que pueden ser desde

monosacáridos a grandes fragmentos de pectina, y es debida posiblemente a la presencia de

distintas actividades en los preparados enzimáticos comerciales como poligalacturonasa,

arabinasa o galactasa, al no tratarse de enzimas puros. En la Tabla 3 se muestran los resultados

obtenidos, donde se observa que los enzimas sin purificar presentan mayor actividad hidrolítica;

concretamente en CAN se produce una importante pérdida durante la purificación,

posiblemente porque parte del enzima se haya quedado retenido en la columna de purificación.

A pesar de ello, este paso es necesario dada la gran cantidad de compuestos de baja Mm,

generalmente monosacáridos y polialcoholes, que presentan estas preparaciones enzimáticas y

los cuales pueden interferir en la reacción como sustrato competidor o en los análisis posteriores

de los hidrolizados (Cardelle-Cobas, Martínez-Villaluenga, Sanz & Montilla, 2009).

Tabla 3: Actividad hidrolítica, contenido en proteína y actividad hidrolítica específica de los preparados

enzimáticos comerciales.

ACTIVIDAD

(Ud/g o Ud/mL) PROTEÍNA

(mg/g o mg/mL)

ACTIVIDAD

ESPECÍFICA

(Ud/mg proteína) Sin purificar Purificada

Celulasa A.

niger (CAN) 459,4 ± 39,5a 258,8 ± 56,4b 15,7 ± 1,2a 16,5 ± 3,6a

Pectinex® Ultra

Olio (PUO) 381,2 ± 16,4a,b 309,8 ± 14,2b 11,9 ± 0,2b 26,0 ± 1,2a

a, b Diferencias estadísticamente significativas entre las dos enzimas estudiadas antes y después de la purificación.

25

A continuación, mediante el método Bradford, se cuantificó la proteína contenida en esos

mismos preparados purificados para poder calcular la actividad específica (Tabla 3). Como se

observa, el contenido en proteína es muy bajo; el resto se podría considerar agentes de carga e

impurezas y disolventes líquidos en el caso de PUO. La ventaja del cálculo de actividad

específica es que nos permite comparar enzimas, ya que la medida se hace independientemente

de la pureza proteica de la preparación, al referirse la actividad a mg de proteína, si bien también

hay que tener presente que no se trata de enzimas puros sino de extractos multienzimáticos, por

lo que esa proteína corresponderá a distintas enzimas.

5.2 Caracterización de los hidrolizados enzimáticos de pectina de

alcachofa

Una vez determinada la temperatura de reacción en base a la información del fabricante y la

experiencia con otros enzimas del mismo género y especie (Al Loman & Ju, 2016; Cardelle-

Cobas, et al., 2009) y conociendo la actividad específica de ambos enzimas, fijamos unos

intervalos de estudio para las variables independientes (pH, tiempo y concentración de enzima)

y, en base a ellos, se construyeron los dos diseños experimentales (cuyas condiciones se recogen

en la Tabla 2 de Materiales y Métodos), se realizaron los ensayos y se procedió a caracterizar

los distintos hidrolizados, como base para la posterior optimización de la obtención de POS.

5.2.1 Liberación de azúcares reductores. Extensión global de la hidrólisis.

Mediante el método de DNS se hizo una estimación preliminar de la intensidad de la hidrólisis

en cada uno de los ensayos experimentales con la finalidad de valorar globalmente las

reacciones. Para facilitar el análisis del conjunto se ha calculado una media de los azúcares

reductores presentes en todos los ensayos experimentales, así como los intervalos de los valores,

expresados como equivalentes de mg de GalA, utilizado en la calibración. Así, se observó que

PUO liberó durante la hidrólisis una media de azúcares reductores de 43,0 ± 14,3 mg/100 mg

de pectina (19,3 ± 0,1 – 58,2 ± 1,7 mg/100 mg); por otro lado, CAN liberó una media de 10,4

± 7,7 mg/100 mg de pectina (0,0 ± 0,2 – 24,8 ± 0,2 mg/100 mg). Se aprecia claramente cómo

en las reacciones con PUO la hidrólisis ha avanzado más que en las reacciones con CAN. Este

resultado era de esperar, ya que, como se ve en las condiciones del diseño experimental, la

cantidad de enzima añadida, expresada como Ud/g de pectina, es considerablemente mayor para

PUO. A la hora de plantear los diseños con ambos enzimas se querían obtener mezclas con

distinto grado de hidrólisis, de forma que los productos de reacción pudieran presentar

características diferentes.

26

Los datos obtenidos con esta técnica, aunque muy básicos, nos dan una primera aproximación

de la extensión de la hidrólisis con ambos enzimas y, aunque este método colorimétrico

generalmente se utiliza para medir la actividad de diferentes enzimas (Martínez, Ruiz-Duenas,

Martínez, del Río & Gutiérrez, 2009), también se ha utilizado para el seguimiento de reacciones

de hidrólisis enzimática de distintos sustratos, como pectina de manzana (Dinnella, Stagni,

Lanzarini & Laus, 1996), de colza (Jeong et al., 2014) o carbohidratos de soja (Al Loman & Ju,

2016), entre otros.

5.2.2 Estudio de la fracción de carbohidratos de baja masa molecular

La fracción de carbohidratos de baja Mm, hasta GP 5, fue analizada por GC-FID. En la Figura

7 podemos observar los diferentes azúcares liberados, entre ellos monosacáridos pécticos

(xilosa, arabinosa, ramnosa, galactosa y GalA), disacáridos, trisacáridos y tetrasacáridos

desconocidos; los pentasacáridos estaban presentes únicamente en algunas muestras

hidrolizadas con CAN y en cantidad mínima.

Figura 7: Perfiles cromatográficos (GC-FID) de muestras de pectina hidrolizadas, (en rojo: ensayo 8 con

CAN; en azul: ensayo 2 con PUO).

Los datos de los análisis por GC se resumen en la Tabla 4. En primer lugar, podemos valorar

globalmente los monosacáridos y oligosacáridos presentes en los hidrolizados. Como se

observa, CAN tiende a liberar mayor cantidad de POS y menor cantidad de monosacáridos que

PUO. Esto, una vez más, coincide con los resultados vistos con anterioridad, y puede ser

27

indicador de que CAN tiene mayor actividad endopoligalacturonasa, por lo que tendría mayor

predisposición a romper enlaces internos, liberando grandes fragmentos de carbohidratos y

oligómeros, pero menos monómeros. En cambio, PUO tendría mayor actividad

exopoligalacturonasa, rompiendo los enlaces glicosídicos de los extremos y liberando GalA.

Aunque CAN se trate de una celulasa, en un trabajo previo (Sabater et al., 2018) se comprobó

que tenía una gran actividad hidrolítica frente a ácido poligalacturónico, y fue esta la causa de

su utilización en este estudio. Por otra parte, Latarullo, Tavares, Maldonado, Leite y Buckeridge

(2016) han descrito que A. niger produce endopoligalacturonasa, en concordancia con nuestros

resultados. En cuanto a PUO, la liberación de GalA se corresponde con la actividad pectin liasa

indicada por el fabricante. Gracias a esta actividad se produce la rotura del enlace α (1-4) de

una molécula de GalA metil-estarificada, dando lugar a oligosacáridos con grupos 4-deoxi-6-

O-metil-α-D-galacto-4-enuronosil en los extremos no reductores (Novozymes, 2015).

Tabla 4: Resultados obtenidos mediante GC-FID de los carbohidratos de baja Mm presentes en los

hidrolizados enzimáticos. Se representan los valores medios de los 17 ensayos realizados con ambos enzimas

(celulasa de A. niger (CAN) y Pectinex® Ultra Olio (PUO)) así como el rango de la concentración (Cc)

expresada en mg/100 mg sólidos y en % respecto al total de compuestos cuantificados.

Celulasa de A. niger Pectinex® Ultra Olio

Cc % Cc %

Media ±

DE Rango

Media ±

DE Rango

Media±

DE Rango

Media ±

DE Rango

Xilosa 0,5 ± 0,2 0,3 – 1,3 12,5 ± 7,3 2,9 – 25,4 0,6 ± 0,2 0,3 – 1,2 2,6 ± 0,7 1,1 – 4,0

Arabinosa 0,9 ± 0,8 0,0 – 3,1 15,5 ± 9,1 0,0 –30,3 7,0 ± 2,4 0,9 – 9,3 26,6 ± 6,7 10,4 – 36,4

Ramnosa - 0,0 – 0,1 0,0 ± 0,2 0,0 – 0,8 0,9 ± 0,3 0,1 – 1,5 3,4 ± 1,0 1,5 – 5,1

Galactosa 0,6 ± 0,5 0,1 – 1,5 10,8 ± 7,2 2,2 – 22,1 2,5 ± 0,6 1,0 – 3,1 10,0 ± 0,9 8,2 – 12,1

GalA 1,5 ± 1,8 0,1 – 6,1 19,9 ±14,0 4,2 – 47,6 12,7 ± 3,4 4,7–20,2 49,9 ± 4,6 39,0 – 57,6

TOTAL

Monosacáridos 3,5 ± 2,8 0,9 - 11,1 58,8 ±16,9 34,7 – 83,0 23,9 ± 6,2 7,0 – 32,8 92,6 ± 4,4 79,0 – 96,1

Disacáridos 1,6 ± 1,3 0,8 – 5,0 31,1 ±12,9 12,3 – 48,2 1,3 ± 0,4 0,7 – 2,3 5,7 ± 3,5 2,8 – 16,7

Trisacáridos 0,4 ± 0,3 0,2 – 1,3 7,9 ± 3,3 2,6 – 14,4 0,3 ± 0,1 0,2 – 0,5 1,5 ± 1,0 0,8 – 4,1

Tetrasacáridos 0,1 ± 0,1 0,0 – 0,3 2,0 ± 2,0 0,3 – 5,8 0,1 ± 0,0 0,0 – 0,1 0,2 ± 0,1 0,0 – 0,4

Pentasacáridos - 0,0 – 0,1 0,2 ± 0,1 0,0 – 0,5 - - - -

TOTAL POS 2,1 ± 1,7 1,0 – 6,4 41,2 ±16,9 17,0 – 65,3 1,7 ± 0,5 1,0 – 2,9 7,4 ± 4,4 3,9 – 21,0

Por otro lado, aunque con ambos enzimas la abundancia de monosacáridos liberados sigue casi

el mismo orden (GalA > arabinosa > galactosa), la cantidad es mucho mayor con PUO, salvo

28

en el caso de xilosa en el que es casi igual, indicando que la actividad xilanasa de CAN es

superior. Otro aspecto aún más importante es la ausencia de ramnosa en los hidrolizados con

CAN, esto nos estaría indicando que el esqueleto de los dominios RG-I y II quedaría intacto en

estas muestras.

Por otra parte, la cuantificación de los monosacáridos individuales permite analizar con mayor

profundidad la actividad glicolítica de ambos enzimas; para ello, podemos calcular qué

porcentaje de cada monosacárido se ha hidrolizado respecto a su contenido en la pectina

original, caracterizada previamente en el laboratorio (Sabater et al., 2018). Estos resultados

quedan reflejados en la Figura 8, salvo el caso de la xilosa que en la pectina original no fue

determinada. Visualmente, una vez más se confirma que la capacidad glicosidasa de PUO es

mucho mayor que la de CAN, aun considerando que de PUO se utilizaban dosis mayores de

enzima. Además, se puede observar cómo ambos enzimas poseen mayor actividad

galactosidasa y baja especificidad para la liberación de GalA. Quizás esta actividad pueda

parecer mayor que la pectin liasa y poligalacturonasa, pero puede ser debido a que la cantidad

de sustrato (galactosa) disponible sea mucho menor. Esto puede explicar que, en general para

ambos enzimas el GalA haya sido el monómero que menos se ha liberado. CAN apenas actúa

sobre GalA y no hidroliza ramnosa, a diferencia de PUO, que actúa sobre la ramnosa de forma

considerable. En otros estudios se ha comprobado que existía actividad β-galactosidasa en

preparados enzimáticos provenientes del mismo microorganismo, A. aculeatus (Cardelle-Cobas

et al., 2009).

Figura 8: Porcentaje de liberación de cada monosacárido cuantificado, en % con respecto a la pectina

original.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

Arabinosa Galactosa Ramnosa GalA

% li

be

raci

ón

CAN

PUO

29

En cuanto a los POS liberados, en ambos casos la cantidad era muy baja (1,7 - 2,1 mg/100 mg),

siendo principalmente disacáridos, algo de trisacáridos y tetrasacáridos, encontrándose poco

más que trazas de pentasacáridos en algún hidrolizado de CAN. Una posible explicación a esta

baja presencia de POS sería que la técnica de GC-FID no es capaz de detectar oligómeros de

este tipo con GP > 5 y la respuesta del detector disminuye al aumentar el GP, aunque su

presencia en las muestras hidrolizadas sea muy probable. El análisis por la técnica HPSEC-

ELSD permitirá su confirmación.

5.2.3 Distribución de la masa molecular de los POS liberados

Mediante HPSEC-ELSD se estudió la totalidad de carbohidratos obtenidos tras la hidrólisis de

pectina, pudiéndose establecer grupos de carbohidratos según rangos de Mm (Figura 9). Según

podemos observar en ambos perfiles, en todas las muestras se pudieron identificar entre 3 y 5

picos, que corresponden a los rangos de Mm identificados en la Figura 9a para CAN y 9b para

PUO, aunque para su cuantificación se han agrupado todos los fragmentos mayores de 100 kDa,

ya que se consideraban pectina o pectina modificada, no POS.

Según se puede apreciar en la Figura 9 y en las Tablas 5 y 6, los resultados obtenidos para

ambos enzimas son muy diferentes. CAN tiende a formar fragmentos de mayor Mm (100-5

kDa) que representan un promedio del 27,9 ± 5,9% frente al 13,6 ± 2,7% de fragmentos de 5-

0,3 kDa que forma, mientras que PUO tiene tendencia a formar POS de menor Mm (5-0,3 kDa)

con una media del 25,8 ± 3,3% frente al 20,3 ± 5,0% de los comprendidos entre 5 y 100 kDa.

Cabe mencionar que con PUO apenas quedan fracciones de 100 kDa, estando estas presentes

sólo en tres ensayos, uno correspondiente al valor –α de tiempo (0,32 h), otro al +α de pH (7,17)

y el último al –α de enzima (9,3 Ud/g pectina). Por otra parte, este análisis corrobora los datos

obtenidos por GC para los fragmentos con Mm ≤ 0,3 kDa formados con PUO (20,1 ± 4,9%),

mucho más abundantes que con CAN (11,5 ± 0,9%), y que corresponden fundamentalmente a

monosacáridos. Estos datos confirman que en las reacciones llevadas a cabo con PUO la

hidrólisis ha sido mayor, pero también y más importante, que los productos de hidrólisis

obtenidos presentan un patrón de Mm muy distinto, por lo que puede resultar muy interesante

su producción a mayor escala para comprobar si las propiedades que presentan son distintas.

Según los resultados obtenidos con los tres tipos de análisis, si bien son complementarios, han

sido los datos obtenidos mediante HPSEC-ELSD los que han resultado más informativos. Por

este motivo, hemos profundizado en su análisis, considerando para ello la concentración de los

30

POS con Mm inferior a 100 kDa y superior a 0,3 kDa, y se ha estudiado el efecto sobre este

parámetro de las variables independientes estudiadas en los diseños experimentales (Figura 10).

Figura 9: Perfiles cromatográficos (HPSEC-ELSD) de muestras de pectina hidrolizadas, (a) ensayo 14 con

CAN; b) ensayo 1 con PUO) y los intervalos de Mm correspondientes a cada zona del cromatograma.

31

Tabla 5: Resultados obtenidos mediante HPSEC-ELSD de los 17 ensayos realizados con CAN. Para cada

rango de Mm (indicados en la Figura 9a) se ha calculado la Mm media en kDa, la concentración de

carbohidratos (Cc) en mg/100 mg de sólidos y el porcentaje (%) frente a los compuestos cuantificados. Los

resultados se expresan como media y desviación estándar entre paréntesis, (n=2).

> 100 kDa 100-5 kDa 5-0,3 kDa < 0,3 kDa

Mm Cc % Mm Cc % Mm Cc % Mm Cc %

Ensayo

1

675

(230)

10,4

(0,2)

16,6

(0,3)

9,1

(2,1)

28,2

(0,1)

45,1

(0,2)

2,4

(2,6)

12,5

(0,2)

19,9

(0,3)

0,1

(0,1)

11,4

(0,0)

18,3

(0,0)

Ensayo

2

339

(60)

27,1

(0,2)

46,0

(0,3)

7,8

(1,2)

10,7

(0,2)

18,1

(0,3)

4,3

(0,4)

10,7

(0,1)

18,1

(0,1)

0,2

(0,3)

10,4

(0,0)

17,7

(0,0)

Ensayo

3

814

(410)

9,8

(0,2)

13,7

(0,1)

11,5

(0,0)

38,5

(0,5)

53,8

(0,3)

4,5

(0,1)

13,1

(0,4)

18,3

(0,1)

0,2

(0,1)

10,2

(0,0)

14,2

(0,3)

Ensayo

4

598

(117)

11,5

(0,1)

17,9

(0,2)

10,3

(0,6)

29,6

(0,1)

46,0

(0,0)

2,3

(0,2)

12,1

(0,1)

18,8

(0,0)

0,2

(0,0)

11,1

(0,1)

17,2

(0,1)

Ensayo

5

278

(98)

19,1

(0,1)

24,4

(0,2)

9,4

(0,1)

27,8

(0,6)

35,4

(0,5)

4,6

(0,8)

17,7

(0,5)

22,6

(0,1)

0,2

(0,0)

13,8

(0,5)

17,6

(0,1)

Ensayo

6

402

(445)

19,7

(0,0)

25,7

(0,2)

10,4

(1,2)

28,5

(0,2)

37,2

(0,1)

4,0

(0,0)

16,6

(0,3)

21,6

(0,2)

0,1

(0,1)

11,9

(0,1)

15,5

(0,0)

Ensayo

7

630

(136)

12,9

(0,6)

19,6

(0,3)

10,2

(0,2)

31,1

(1,0)

47,2

(1,1)

3,0

(0,6)

11,4

(0,3)

17,3

(0,0)

0,1

(0,1)

10,5

(0,0)

15,9

(0,4)

Ensayo

8

367

(65,3)

11,2

(0,1)

17,2

(0,6)

10,9

(0,8)

28,9

(0,8)

44,6

(0,9)

4,0

(0,1)

13,1

(0,4)

20,2

(0,0)

0,2

(0,0)

11,6

(0,3)

18,0

(0,1)

Ensayo

9

433

(113)

11,0

(0,2)

19,8

(0,1)

37,0

(12,2)

19,7

(0,3)

35,4

(0,1)

4,1

(0,6)

13,0

(0,2)

23,4

(0,0)

0,2

(0,0)

12,0

(0,0)

21,5

(0,3)

Ensayo

10

348

(90)

20,4

(0,2)

25,0

(0,2)

8,4

(1,6)

31,1

(0,4)

38,1

(0,4)

3,4

(0,3)

18,0

(0,5)

22,1

(0,5)

0,2

(0,0)

12,1

(0,2)

14,8

(0,2)

Ensayo

11

230

(121)

19,4

(0,2)

23,6

(0,2)

9,1

(0,2)

30,9

(0,1)

37,4

(0,2)

4,1

(0,0)

19,6

(0,7)

23,7

(0,5)

0,2

(0,1)

12,6

(0,1)

15,3

(0,1)

Ensayo

12

677

(24,0)

13,2

(0,7)

19,1

(0,7)

14,0

(0,1)

31,6

(0,4)

45,8

(0,5)

3,3

(0,1)

13,0

(0,3)

18,8

(0,7)

0,2

(0,0)

11,3

(0,1)

16,3

(0,2)

Ensayo

13

839

(127)

12,2

(0,1)

17,6

(0,1)

16,0

(2,4)

32,2

(0,3)

46,6

(0,5)

4,8

(1,1)

13,3

(0,1)

19,2

(0,2)

0,2

(0,1)

11,6

(0,2)

16,7

(0,0)

Ensayo

14

588

(102)

10,3

(0,1)

16,5

(0,8)

10,2

(0,8)

28,2

(0,9)

45,2

(0,5)

3,9

(0,0)

12,6

(0,7)

20,2

(0,3)

0,2

(0,0)

11,2

(0,2)

18,0

(0,4)

Ensayo

15

627

(36,6)

10,1

(0,0)

16,4

(0,0)

11,6

(1,0)

26,5

(0,2)

42,7

(0,4)

3,8

(0,0)

13,3

(0,0)

21,4

(0,0)

0,2

(0,0)

12,1

(0,0)

19,6

(0,0)

Ensayo

16

710

(35,0)

10,5

(0,1)

19,0

(0,2)

11,2

(4,6)

24,9

(0,0)

45,0

(0,0)

4,1

(0,0)

10,0

(0,1)

18,1

(0,2)

0,2

(0,0)

10,0

(0,0)

18,0

(0,1)

Ensayo

17

630

(23,1)

10,0

(0,1)

16,9

(0,1)

11,1

(0,6)

26,5

(0,4)

44,8

(0,4)

3,7

(0,1)

11,8

(0,1)

19,9

(0,1)

0,2

(0,0)

11,0

(0,0)

18,5

(0,3)

32

Tabla 6: Resultados obtenidos mediante HPSEC-ELSD de los 17 ensayos realizados con PUO. Para cada

rango de Mm (indicados en la Figura 9b) se ha calculado la Mm media en kDa, la concentración de

carbohidratos (Cc) en mg/100 mg de sólidos y el porcentaje (%) frente a los compuestos cuantificados. Los

resultados se expresan como media y desviación estándar entre paréntesis, (n=2).

> 100 kDa 100-5 kDa 5-0,3 kDa < 0,3 kDa

Mm Cc % Mm Cc % Mm Cc % Mm Cc %

Ensayo

1 - - -

8,4

(0,4)

22,5

(1,3)

31,0

(0,6)

3,7

(0,0)

29,1

(4,7)

40,0

(1,5)

0,1

(0,0)

21,0

(1,9)

29,0

(1,0)

Ensayo

2 - - -

8,8

(0,2)

23,1

0,3)

34,9

(0,1)

3,6

(0,1)

27,3

(1,2)

41,2

(0,5)

0,1

(0,0)

15,9

(0,2)

23,9

(0,4)

Ensayo

3 - - -

12,2

(1,2)

30,7

(0,2)

38,9

(0,2)

3,7

(0,0)

26,3

(0,4)

33,3

(0,0)

0,1

(0,0)

21,9

(0,2)

27,8

(0,1)

Ensayo

4 - - -

8,2

(0,4)

22,7

(0,1)

34,6

(0,2)

3,6

(0,1)

25,3

(0,1)

38,6

(0,2)

0,1

(0,0)

17,6

(0,1)

26,8

(0,1)

Ensayo

5 - - -

11,3

(0,4)

22,2

(0,1)

28,6

(0,2)

3,5

(0,0)

26,0

(0,4)

33,5

(0,1)

0,1

(0,0)

29,5

(0,4)

37,9

(0,1)

Ensayo

6 - - -

11,1

(3,7)

14,7

(1,7)

20,9

(1,5)

3,5

(0,0)

26,9

(1,1)

38,4

(0,2)

0,1

(0,0)

28,5

(0,4)

40,7

(1,3)

Ensayo

7 - - -

7,7

(1,2)

23,4

(0,3)

35,5

(0,5)

3,6

(0,0)

26,2

(0,3)

39,7

(0,6)

0,1

(0,0)

16,4

(0,0)

24,8

(0,1)

Ensayo

8 - - -

10,0

(0,7)

19,6

(1,4)

27,8

(0,9)

3,6

(0,1)

31,6

(1,2)

44,7

(0,1)

0,1

(0,0)

19,4

(0,1)

27,5

(0,9)

Ensayo

9 - - -

11,5

(4,7)

21,3

(0,1)

31,3

(0,2)

3,5

(0,0)

25,9

(0,3)

38,0

(0,2)

0,1

(0,0)

21,0

(0,3)

30,7

(0,3)

Ensayo

10 - - -

15,3

(4,9)

12,6

(0,4)

22,7

(0,3)

3,7

(0,0)

23,1

(1,1)

41,8

(0,3)

0,1

(0,0)

19,6

(0,8)

35,5

(0,0)

Ensayo

11

113

(3,9)

9,2

(0,1)

13,7

(0,5)

9,9

(0,4)

22,8

(0,5)

34,0

(0,2)

3,7

(0,1)

22,2

(1,4)

33,1

(0,6)

0,2

(0,1)

12,8

(0,7)

19,1

(0,2)

Ensayo

12 - - -

8,6

(1,6)

12,2

(0,1)

19,1

(0,5)

3,6

(0,1)

26,0

(0,6)

40,6

(0,2)

0,1

(0,0)

25,8

(0,7)

40,3

(0,3)

Ensayo

13 - - -

19,8

(3,5)

13,4

(0,5)

22,7

(0,5)

3,7

(0,1)

27,7

(0,2)

46,7

(0,3)

0,1

(0,0)

18,1

(0,2)

30,6

(0,2)

Ensayo

14

94,2

(31,2)*

10,2

(0,0)

14,9

(0,3)

10,2

(1,1)

16,0

(0,2)

23,5

(0,2)

3,8

(0,1)

22,5

(0,8)

32,9

(0,6)

0,1

(0,0)

19,6

(0,3)

28,7

(0,1)

Ensayo

15

99,7

(15,3)*

9,8

(0,0)

15,5

(0,4)

12,8

(0,8)

26,0

(0,5)

41,2

(0,6)

3,7

(0,1)

16,4

(0,7)

26,1

(0,4)

0,2

(0,1)

10,9

(0,3)

17,3

(0,1)

Ensayo

16 - - -

11,3

(3,2)

20,5

(0,4)

30,5

(0,7)

3,8

(0,1)

23,8

(0,0)

35,4

(0,2)

0,1

(0,0)

22,9

(0,2)

34,1

(0,1)

Ensayo

17 - - -

8,6

(0,1)

21,2

(0,1)

31,2

(0,2)

3,7

(0,1)

26,5

(0,2)

39,0

(0,1)

0,1

(0,0)

20,3

(0,2)

29,8

(0,0)

* Valor de Mm fuera del rango correspondiente a su ubicación, clasificado según la distribución global de los picos.

33

En cuanto a las tendencias de hidrólisis en función de cada variable, se observa cómo en el caso

de CAN las tendencias son más lineales, salvo en alguna de las condiciones extremas, mientras

que con PUO no hay tendencias claras. Por lo general, para ambos enzimas se obtiene una

mayor formación de POS a pH bajo, tiempos cortos de reacción y bajas cantidades de enzima.

Estos resultados tienen sentido, teniendo en cuenta que se busca un equilibrio para que la

pectina se hidrolice pero sin excesiva liberación de monosacáridos.

En la Figura 10a y 10d se observa el efecto del pH, en líneas generales, opuesto para ambos

enzimas. Para PUO, la formación de POS a pH extremos (3,8 y 7,2) era más baja probablemente

por una menor actividad del enzima que se ve claramente a pH 7,2, ya que es una de las

condiciones en la que queda algo de pectina sin hidrolizar, mientras que para CAN la liberación

de POS era mayor a pH 3,8 y significativamente inferior a pH 6,5. En los valores centrales

también se observan diferencias significativas: en el caso de CAN la formación de POS

disminuye a medida que el pH aumenta, mientras que para PUO, se observa una mínima

formación de POS en el valor central (pH 5,5), mientras que a pH 4,5 y 6,5 su liberación es

similar. Teniendo en cuenta el tiempo, se ve cómo los extremos axiales (0,32 y 6,19 h) tienen

una distribución lógica. Para PUO a tiempo corto la hidrólisis aún no ha avanzado demasiado

y la cantidad de POS es más alta, aunque queda pectina sin hidrolizar, mientras que a tiempos

largos la hidrólisis ha avanzado en exceso y la fracción más importante es la de Mm < 0,3 kDa;

este efecto es más marcado con CAN. Centrándose en la cantidad de enzima añadida, en el caso

de PUO se da una tendencia lógica, donde una menor cantidad de enzima produce una hidrólisis

de menor intensidad, con presencia de pectina sin hidrolizar y pocos monosacáridos, mientras

que añadiendo grandes cantidades de enzima hay mayor cantidad de monosacáridos; en ambos

casos la cantidad de POS es baja. En el caso de CAN, la tendencia de los valores medios es

semejante, y cuando se analizan los datos de la Tabla 5 se ve que la influencia de la cantidad

de enzima no es clara.

No obstante, aunque se aprecian ligeras diferencias entre las distintas condiciones ensayadas,

éstas no son estadísticamente significativas, poniendo de manifiesto una gran variabilidad entre

los resultados. Esto y la falta de tendencias definidas o intuitivas en los perfiles de hidrólisis en

función de cada variable hacen que el proceso de optimización sea muy complejo. Además, la

formación de POS es un concepto un tanto ambiguo, ya que es difícil establecer el límite entre

lo que se considera POS de alta Mm, pectina modificada, y pectina sin hidrolizar.

34

Figura 10: Gráficos de cajas donde se relacionan las variables estudiadas: pH (a, d), tiempo (b, e) y cantidad

de enzima (c, f) con la producción de POS con masas moleculares comprendidas entre 100 y 0,3 kDa en cada

uno de los 17 ensayos que componen los diseños experimentales para PUO (a, b, c) y CAN (d, e, f). a,b

Diferencias estadísticamente significativas entre los grupos.

5.3 Optimización de la obtención de POS

Para optimizar la obtención de POS utilizando los dos enzimas, primero se analizó el diseño

mediante RSM y se estudiaron como variables dependientes Y1: POS de Mm en el intervalo de

100 < Mm < 0,3 kDa, determinados por HPSEC-ELSD (mg/g); Y2: POS de GP 2-5,

determinados por GC-FID (mg/g), ambas se maximizaban; e Y3: liberación de monosacáridos

pécticos, que se minimizaban. Sin embargo, dada la complejidad de la optimización del proceso

estudiado, los coeficientes de regresión R2 y R2 ajustado obtenidos eran muy bajos,

comprendidos entre 0,8 y 0,5 para la primera variable e inferiores para Y2 e Y3 (datos no

mostrados) (Tabla 7). Además, se produjeron errores pronunciados en las predicciones del

modelo, medidos por los valores de RMSE, que evidenciaban una baja calidad y exactitud del

ajuste. Probablemente debido a la falta de robustez del modelo, las condiciones de reacción

óptimas indicadas por el mismo correspondían a algunos valores extremos del diseño para pH

y tiempo (Tabla 7), siendo para CAN pH bajo y tiempo largo y para PUO pH alto y tiempo

mínimo; únicamente la cantidad de enzima no se encontraba en los extremos. Estos resultados

35

cuestionan también la validez del modelo, poniendo en duda si se ha alcanzado o no una

verdadera optimización. Por este motivo, se recurrió a un método de regresión más avanzado

como las ANN, que permitan explicar en mayor medida el comportamiento de los enzimas.

En este estudio, en base a los resultados obtenidos para RSM, nos centramos en los datos

facilitados por HPSEC-ELSD, variable Y1, que han resultado más informativos y más

importantes cuantitativamente, considerando que las fracciones de más de 100 kDa son pectina

sin hidrolizar y las de menos de 0,3 kDa son monosacáridos. Por esta razón, son estos los datos

que hemos utilizado para modelizar con las ANN el proceso con ambos enzimas y obtener las

condiciones óptimas de reacción para maximizar la obtención de POS.

Estos modelos se entrenaron con el 70% de los datos (correspondientes a los resultados de los

ensayos que componen cada diseño, incluyendo los duplicados para considerar también el error

de las determinaciones), y se validaron con el 30% como muestras ajenas al modelo. La división

de los datos se realizó al azar. Como se observa en la Tabla 7, los coeficientes R2 de las ANN

respecto a RSM mejoraron, pero la diferencia entre ambos métodos fue mayor para los R2

ajustados. Otro aspecto importante del método ANN es que tiene una parte de validación, que

hace que sea un método mucho más robusto que RSM. Además, se calcularon los valores

RMSE, uno de los parámetros más importantes en un modelo predictivo, y se observó cómo

estos eran mucho menores para ANN.

Tabla 7: Parámetros estadísticos importantes, ajustes y errores de los modelos RSM y ANN. Condiciones

óptimas determinadas mediante cada modelo.

RSM ANN

CAN PUO CAN PUO

ENTRENAMIENTO R2 0,86 0,88 0,99 0,89

R2 ajustado 0,57 0,62 0,98 0,87

RMSE 0,21 0,16 0,02 0,08

VALIDACIÓN R2 - - 0,96 0,91

R2 ajustado - - 0,94 0,85

RMSE - - 0,04 0,09

CONDICIONES ÓPTIMAS

pH 3,8 7,2 4,41 6,86

Tiempo (h) 6,18 0,32 0,9 1,5

Cantidad de enzima

(Ud/g pectina) 47,2 459,7 17,1 520,5

36

El hecho de que para ANN los coeficientes de regresión sean elevados y los errores de

entrenamiento y validación sean similares indica la posibilidad del modelo de generalizarse y,

por tanto, optimizarse. Con este fin, se calcularon todos los rendimientos teóricos del modelo

considerando todas las posibles combinaciones de las tres condiciones de reacción estudiadas

(pH, tiempo y cantidad de enzima). De esta manera, se obtuvieron una serie de gráficos de

superficie que se muestran en la Figura 11. Analizando la información generada, se llegó a la

conclusión de que con las condiciones de reacción que aparecen en la Tabla 7 se obtenían los

rendimientos teóricos máximos. Como se puede ver, y a diferencia de la RSM, para las

condiciones óptimas no fueron seleccionadas condiciones extremas de reacción.

Con el análisis por ANN se lograron mejores ajustes que con RSM, se disminuyó el error de

las predicciones y se puso de manifiesto que en los diseños experimentales los intervalos de

valores elegidos para las variables independientes fueron adecuados. La deseabilidad teórica

para la obtención de POS con ambas enzimas fue superior a 0,99, mientras que la experimental

fue de 0,95 y 0,97 para CAN y PUO, respectivamente. En general, la deseabilidad representa

el valor de las variables independientes sobre la variable dependiente, determinando la

eficiencia del proceso, muy elevada en este caso.

Figura 11: Gráficos de superficie para las ANN utilizadas para modelar el comportamiento de CAN (a, b,

c) y PUO (d, e, f), mostrando la influencia de las variables independientes (tiempo y cantidad de enzima (a,

d), tiempo y pH (b, e) y pH y cantidad de enzima (c, f)) sobre la producción de POS en el intervalo 100 >

Mm > 0,3 kDa.

37

Por último, se estudió la importancia de los distintos factores para la modelización, determinada

mediante un análisis de sensibilidad. En el caso de CAN, se obtuvieron valores relativos de

importancia para cada variable estudiada, que se calcularon sumando los productos de los

coeficientes que conectan la capa de entrada con la capa oculta y la capa oculta con la capa de

salida. Así, se observó que tanto la interacción del pH y la cantidad de enzima, la interacción

del tiempo y la cantidad de enzima como la interacción de los tres factores, presentaban los

coeficientes de importancia más elevados (11,15; 11,62 y 11,18; respectivamente). En cuanto

al efecto de los factores individuales, el más influyente fue la cantidad de enzima, cuya

importancia también se aprecia en la interacción de las variables estudiadas, seguida del tiempo

y el valor de pH como el menos importante. Por otra parte, en la modelización de PUO, los

factores más influyentes fueron la interacción del pH y la cantidad de enzima seguida de la

interacción del tiempo y la cantidad de enzima, así como la cantidad de enzima, con unos

coeficientes de importancia de 53,58; 26,33 y 23,52 respectivamente. De manera similar al caso

anterior, nuevamente se pudo apreciar que el factor menos influyente era el pH. Estos datos

ponen de manifiesto que la cantidad de enzima es el parámetro con mayor relevancia a la hora

de obtener POS utilizando CAN y PUO, así como el efecto de la interacción de este parámetro

con el resto de variables estudiadas, siendo el pH el parámetro que menos influencia ejercía

sobre los modelos.

En general, existen pocos estudios relativos a la optimización de la obtención de POS, pudiendo

reseñarse la producción ácida de POS a partir de mangostán (Gan & Latiff, 2011) utilizando un

diseño experimental analizado por RSM donde los rendimientos fueron inferiores a los de este

trabajo, estando comprendidos entre el 10 y el 25%. El empleo de modelos como las ANN

mejora la capacidad predictiva de los ajustes en comparación con la RSM, con una disminución

importante del error. En el campo de los carbohidratos este método ha sido utilizado para la

modelización de la obtención de mezclas de oligosacáridos a partir de la pulpa de la remolacha

azucarera (Astray et al., 2016). Estos modelos son prometedores dentro de la extracción de

ingredientes funcionales, pudiéndose aplicar a otro tipo de compuestos como a la optimización

de la extracción de resveratrol mediante la combinación de pectinasas y ultrasonidos (Lin et al.,

2016), donde las ANN también permitieron mejorar notablemente la exactitud de los ajustes

frente a la RSM.

5.4 Análisis de los hidrolizados obtenidos en las condiciones óptimas

En cuanto a los resultados de los carbohidratos de baja Mm liberados en las condiciones óptimas

de estos ensayos (Tabla 8) se puede observar que, porcentualmente, CAN tiene mayor tendencia

38

a la formación de POS que PUO, de igual forma que se observaba en los ensayos del diseño

experimental. Aun así, en ninguno de los casos se muestra una gran cantidad de POS. La

explicación a este hecho podría ser que las condiciones de hidrolisis se han optimizado para

una mayor obtención de POS en función de los resultados del HPSEC-ELSD, y no los del GC-

FID, por su menor importancia cuantitativa. En la cromatografía de exclusión molecular se ven

fracciones moleculares de mayor tamaño (el calibrado incluye patrones desde disacáridos

(0,342 kDa) hasta 788 kDa) que las que se pueden analizar por GC; esta técnica sólo nos ha

permitido ver hasta pentasacáridos en algún ensayo, que corresponden a una Mm ≤ 1 kDa, y

son precisamente compuestos entre 100 y 0,3 kDa los que se han maximizado en estos diseños.

En cuanto a los monosacáridos, se puede observar la misma tendencia que en el apartado 5.2.2,

(Tabla 4) con la única excepción de la ausencia de ramnosa también en el hidrolizado con PUO.

Tabla 8: Resultados obtenidos mediante GC-FID de los hidrolizados optimizados. La concentración de

carbohidratos (Cc) se representa en mg/100 mg de sólidos.

Celulasa de A. niger Pectinex® Ultra Olio

Cc % Cc %

Media ± DE Media ± DE Media ± DE Media ± DE

Xilosa 0,5 ± 0,0a 32,1 ± 3,6a 0,4 ± 0,0b 1,7 ± 0,1b

Arabinosa 0,2 ± 0,0b 9,9 ± 1,2b 5,7 ± 0,1a 24,2 ± 0,8a

Ramnosa - - - -

Galactosa 0,1 ± 0,1b 8,8 ± 4,1a 1,5 ± 0,0a 6,5 ± 0,0a

Ácido galacturónico 0,5 ± 0,1b 30,0 ± 6,0b 15,7 ± 0,4a 66,2 ± 0,7a

TOTAL

MONOSACÁRIDOS 1,2 ± 0,1b 78,7 ± 0,5b 23,3 ± 0,3a 98,6 ± 0,0a

Disacáridos 0,3 ± 0,0a 20,8 ± 0,4a 0,3 ± 0,0a 1,4 ± 0,0b

Trisacáridos - 0,5 ± 0,1a - 0,1 ± 0,0a

Tetrasacáridos - - - -

Pentasacáridos - - - -

TOTAL POS 0,3 ± 0,0a 21,3 ± 0,5a 0,3 ± 0,0a 1,4 ± 0,0b

a, b Diferencias estadísticamente significativas entre las concentraciones y los porcentajes de los distintos azúcares

determinados en los hidrolizados con las dos enzimas.

Los resultados del análisis por HPSEC-ELSD, recogidos en la Tabla 9, muestran nuevamente

que CAN hidroliza en menor extensión que PUO, y que la primera forma mayor cantidad de

POS de 5-100 kDa, que pueden ser de gran interés, que el segundo enzima, que libera mayor

cantidad de monosacáridos y POS de tamaño molecular menor a 5 kDa. Si se comparan con el

39

ensayo 3 de CAN y PUO, que fue el que mayor cantidad de POS dio en los diseños

experimentales, se observa un claro aumento en la producción de los que se consideran POS.

Por tanto, se demuestra que las condiciones seleccionadas como óptimas son las adecuadas para

producir una mayor cantidad de POS.

Tabla 9: Resultados obtenidos mediante HPSEC-ELSD de los hidrolizados obtenidos en las condiciones

óptimas. Para cada rango de Mm se representa la Mm media en kDa, la concentración de carbohidratos

(Cc) en mg/100 mg y el porcentaje (%) frente al contenido total de carbohidratos cuantificados. Los datos

están representados como valor medio y su desviación estándar (DE) (n=2). a, b Diferencias estadísticamente

significativas entre las masas moleculares, concentraciones y los porcentajes de los distintos fragmentos

determinados en los hidrolizados con las dos enzimas.

Pectina POS Monosacáridos

> 100 kDa 100-5 kDa 5-0,3 kDa < 0,3 kDa

Mm Cc % Mm Cc % Mm Cc % Mm Cc %

Celulasa de

A. niger

555a

(53,4)

11,2a

(0,0)

12,5a

(0,1)

13,8a

(0,1)

65,9a

(2,1)

73,7a

(2,1) - - -

0,2a

(0,0)

12,3b

(0,2)

13,8b

(0,1)

Pectinex®

Ultra Olio - - -

8,9b

(0,1)

31,1b

(1,2)

35,1b

(0,4)

3,8a

(0,1)

31,2a

(3,7)

35,1a

(1,0)

0,1b

(0,0)

26,4a

(2,5)

29,8a

(0,1)

Celulasa de A. niger Pectinex® Ultra Olio

ÓPTIMO Ensayo 3 ÓPTIMO Ensayo 3

TOTAL

POS

(mg/100 mg)

65,9 ± 2,1 51,6 ± 1,6 62,4 ± 5,6 57,0 ± 0,9

La Figura 12 muestra los perfiles cromatográficos de los hidrolizados obtenidos con CAN y

PUO en las condiciones óptimas. En ella se pueden apreciar claramente sus diferencias

cualitativas.

40

Figura 12: Perfiles cromatográficos (HPSEC-ELSD) de los hidrolizados obtenidos en condiciones óptimas,

(en rojo: CAN; en azul: PUO) y los intervalos de Mm correspondientes a cada zona del cromatograma.

5.4.1 Determinación de la actividad antioxidante

Para comprobar si la diferencia que se ha apreciado con los análisis cromatográficos anteriores

se ve reflejada en otras propiedades de los hidrolizados se decidió estudiar la actividad

antioxidante de los mismos por el método del DPPH. Este método es uno de los métodos más

comunes para determinar la actividad antioxidante in vitro. Este tipo de análisis se utiliza

cuando el compuesto potencialmente antioxidante actúa sobre los radicales libres, como

secuestrante o neutralizador.

Mediante este método se determinó la capacidad antioxidante de los POS optimizados. Los

resultados fueron una capacidad antioxidante (valor TEAC) de 97,9 ± 14,0 mg de equivalentes

de trolox por g de POS para CAN y 121,1 ± 1,4 mg de equivalentes de trolox por g de POS para

PUO. La actividad antioxidante de los POS de PUO ha resultado ser algo mayor que la de CAN,

quizás por la mayor cantidad de GalA liberado.

Como numerosos autores, Fissore et al. (2014) indica que la alcachofa es una buena fuente

natural de compuestos antioxidantes como cinarina y otros compuestos fenólicos, y a ellos

atribuye la actividad antioxidante encontrada en los extractos que analiza, coextraídos junto con

pectina e inulina. Tiveron et al. (2012), con un método semejante al utilizado en este trabajo,

determina una actividad antioxidante de 17,5 mg equivalentes de trolox/g de hoja de alcachofa

en polvo, si bien esta es la concentración requerida para reducir la cantidad inicial del radical

DPPH un 50%. Guven, Sensoy, Senyuva y Karakaya (2018) determinan que el incremento de

actividad antioxidante de harina de trigo cuando se adiciona hoja de alcachofa en polvo

corresponde a 63,9 mg equivalentes de trolox/g de hoja de alcachofa en polvo. En cuanto a la

actividad antioxidante de otras pectinas y POS determinadas con el mismo método, Huang, Lu,

41

Wang y Wu (2011) determinan que para la pectina de cítricos con Mm de 353 kDa era de 5 mg

equivalentes de trolox/g de pectina, y este valor se incrementaba hasta 108 mg equivalentes de

trolox/g de POS obtenidos enzimáticamente con una Mm media de 1 kDa. Este incremento de

la capacidad antioxidante estaba positivamente relacionado con la menor Mm de los POS. Por

tanto, al igual que en este último estudio, los POS aquí obtenidos podrían utilizarse como

antioxidantes.

Este trabajo se ha basado en la utilización de dos enzimas, CAN y PUO, seleccionadas en

ensayos previos realizados en el grupo de investigación (Química y Funcionalidad de

Carbohidratos y Derivados) donde se evaluó la utilización de estas enzimas para la obtención

de pectina de alcachofa utilizando distintos preparados enzimáticos comerciales (Sabater et al.,

2018). En dicho trabajo, se determinó de forma aproximada la capacidad pectinolítica de ambos

enzimas, obteniendo resultados que nos llevaron a plantear este estudio.

Aunque es necesario realizar un estudio más exhaustivo sobre las características estructurales

y otras propiedades biológicas de interés de los POS aquí obtenidos, los resultados obtenidos

en este Trabajo Fin de Máster han cumplido con creces sus expectativas al obtener POS

utilizando dos enzimas distintas, CAN y PUO, con altos rendimientos (62 y 66 mg/100 mg de

pectina) y con características estructurales distintas según los resultados obtenidos por GC y

HPSEC, que pueden dar lugar a variaciones en sus propiedades funcionales como es el caso de

las propiedades antioxidantes.

42

6. CONCLUSIONES

- El preparado enzimático celulasa de A. niger (CAN) presenta mayor actividad

endopoligalacturonasa, que Pectinex® Ultra Olio (PUO), con mayor actividad

exopoligalacturonasa.

- Según el análisis de los monosacáridos que liberan ambos enzimas y la Mm de los POS

liberados, es de esperar que las características estructurales de los mismos sean distintas.

- La modelización de los procesos mediante ANN ha permitido determinar las condiciones

óptimas de reacción para obtener el máximo rendimiento de POS para cada uno de los enzimas.

Dichos rendimientos y condiciones fueron, para CAN, 66 mg/100 mg de pectina a pH 4,41, 54

minutos y 17,1 Ud/g pectina, y para PUO 62 mg/100mg de pectina a pH 6,86, 90 minutos y

520,5 Ud/g pectina.

- Los POS obtenidos por CAN tienen mayor masa molecular (un 74% tiene una Mm media de

13,8 kDa) que los obtenidos por PUO (un 35% tiene una Mm media de 8,9 kDa y otro 35% una

Mm media de 3,8 kDa).

- El hidrolizado obtenido en condiciones óptimas con PUO posee mayor poder antioxidante que

el de CAN, posiblemente por la menor Mm de las fracciones formadas.

Dado el interés que plantean los POS aquí obtenidos es recomendable profundizar en su

caracterización. Para ello, deberían fraccionarse los POS según Mm utilizando técnicas de

separación por membranas (ultrafiltración o nanofiltración) y estudiar en las distintas fracciones

su composición monomérica, grado de metilación y la estructura de los compuestos de baja Mm

por GC-FID y MALDI-TOF, así como su capacidad antioxidante y digestibilidad.

43

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