Nuevos patógenos y protocolos a Nuevos patógenos y protocolos a incorporar a PulseNet:incorporar a PulseNet:

Shigella flexneriShigella flexneri y y Enterobacter sakazakiiEnterobacter sakazakii

23 al 25 de octubre 200723 al 25 de octubre 2007

Norma Binsztein Angela Salve

Desarrollo deDesarrollo deprotocolo estandarizado de PFGEprotocolo estandarizado de PFGE

para incorporación de para incorporación de Shigella flexneriShigella flexneri a PulseNet a PulseNet

Necesidades de un protocolo diferenteNecesidades de un protocolo diferente

a) Shigella flexneri especie mas frecuente en América Latina y en Asia b) PFGE de Shigella sonnei estandarizado en PulseNet

c) Resultados de PFGE de aislamientos de Shigella flexneri con el protocolo de Shigella sonnei

d) Pedido de PN-AL a PN-Internacional de estandarizar protocolo de PFGE para Shigella flexneri aceptación

ObjetivoObjetivo

• Utilizar las mismas condiciones de corrida para dos enzimas

• Simple, económico, reproducible y epidemiológicamente discriminatorio

Objetivos específicos

AntecedentesAntecedentes

Serotipos Serotipos de Shigellade Shigella

Condiciones de Condiciones de corridacorrida

Enzimas Enzimas Conclusiones Conclusiones

CDC 1,2,3 Shigella sonnei vs

Campylobacter vs

Yersinia pestis vs

Yersinia modificado

XbaI

NotI

Yersinia

Modificado

XbaI / NotI

InstitutoMalbrán

1 a 6 Shigella sonnei vs

Campylobacter

XbaI

NotI

SfeI

Campylobacter

XbaI / NotI

Grupo de trabajo en PFGE y Grupo de trabajo en PFGE y BioNumerics de BioNumerics de Shigella flexneriShigella flexneri

• Reunión Comité Directivo de PN Internacional Providence, USA - 16 de Abril 2007 • Presentación de resultados preliminares (CDC e Instituto Malbrán)

• Integrantes CDC NAMRU (US Naval Medical Rescarch Unit INEI – Malbrán

Protocolo de trabajoProtocolo de trabajo

• Condiciones de corrida

• Enzimas XbaI y NotI • Aislamientos seleccionados - 7 de cada serotipo de Shigella flexneri - de brotes

Campylobactervs

Yersinia modificado

Conclusiones preliminaresConclusiones preliminares1º etapa1º etapa

• Condición de corrida protocolo Yersinia modificado

• Enzimas XbaI y NotI 1ª enzima NotI 2ª enzima XbaI

• Buena discriminación de aislamientos asociados a brotes

Ventajas y Desventajas

?

Ejemplos: Ejemplos: XbaXbaI-PFGEI-PFGEShigella flexneri 1, digeridas con XbaI con el protocolo de Campylobacter sp vs Yersinia modificado

Protocolo Campylobacter

6,8 a 35,4 seg

Protocolo Yersinia modificado

1,8 a 25 seg

2 1 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7

Ejemplos: Ejemplos: NotNotI-PFGEI-PFGE

Shigella flexneri 1, digeridas con NotI, con el protocolo de Campylobacter sp vs Yersinia modificado

1 2 3 4 5 6 71 2 3 4 5 6 7

Protocolo Campylobacter

6,8 a 35,4 seg

Protocolo Yersinia modificado

1,8 a 25 seg

Desarrollo deDesarrollo deprotocolo estandarizado de PFGEprotocolo estandarizado de PFGE

para incorporación de para incorporación de Enterobacter sakazakiiEnterobacter sakazakii a PulseNet a PulseNet

Enterobacter sakazakiiEnterobacter sakazakii

Antecedente

2006: PFGE de 22 aislamientos con la condición de corrida de Shigella sonnei enzima XbaI

Resultados a mejorar

Condición de corrida: Yersinia modificado enzima XbaI

Protocolo Shigella sonnei

2,2 a 54,2 seg

XbaI-PFGE

Protocolo Yersinia modificado

1,8 a 25 seg

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Enterobacter sakazakiiEnterobacter sakazakii 2007 2007Resultados preliminaresResultados preliminares

Enterobacter sakazakiiEnterobacter sakazakii Plan de trabajo 2007-2008 Plan de trabajo 2007-2008

• Continuar el estudio de todos los aislamientos existentes en la colección de cultivos del INEI (n=22) - condiciones Yersinia modificado - enzimas XbaI y otra a elegir

• Realizar el análisis y comparación de los resultados con los dos protocolos (Shigella sonnei y Yersinia modificado)

• Discutir los resultados en el Comité Ejecutivo de PN-Internacional

• Seleccionar método • Validar

Modificaciones del Modificaciones del protocolo estandarizado de PFGEprotocolo estandarizado de PFGE

para para Salmonella Salmonella sp., sp., Shigella sonneiShigella sonnei y y E. coliE. coli O157 O157

23 al 25 de octubre 200723 al 25 de octubre 2007

Angela Salve

Principales Modificaciones Principales Modificaciones

• DO de las suspensiones bacterianas

DO de 1.0 a 610 nm

• NO AGREGAR SDS al 1% en la agarosa utilizada en la preparación de los “plugs”.

• Se puede usar una menor cantidad de enzima por “plug” (20 - 30 U)

Utilización de Tiourea en cepas Utilización de Tiourea en cepas No TipificablesNo Tipificables

Cepas No Tipificables Cepas No Tipificables

• Hay aislamientos que muestran ADN degradado en el gel y se consideran no tipificables por PFGE Ejemplos: algunas cepas de E. coli O157 y no O157; ciertas serovariedades de Salmonella, como Derby, Livingston, Ohio, Panama, Saintpaul y Cerro (donde todos los aislamientos pueden ser no tipificables) o algunas cepas de ciertas serovariedades tales como Newport, Miami y otras, que generalmente se pueden tipificar por PFGE

El agregado de El agregado de 50 50 μμMM de tiourea de tiourea en el buffer de en el buffer de corrida previene la degradación de ADNcorrida previene la degradación de ADN

Ejemplo de la Utilización de Tiourea Ejemplo de la Utilización de Tiourea Salmonella Cerro

Con TioureaSin Tiourea