El alumno... Conoci-

miento

Compren-

sión

Aplica-

ción

V.

METABOLISMO

DEL DNA

Revisará los diferentes procesos metabólicos en los

que el DNA es la molécula central, i.e., la replicación, la

reparación y la recombinación. Describirá la

enzimología de los diferentes procesos y destacará la

importancia de la fidelidad de la replicación y de la

necesidad de conservar la estructura y función del

DNA.3. Reparación del

DNA

3.1. Describirá los daños que causan agentes químicos y físicos

al DNA.

X

3.2. Comprenderá los mecanismos que conducen a una

mutación cuando el DNA dañado no es reparado.

X

3.3. Describirá los principales mecanismos de reparación del

DNA (fotoreactivación, reparación por escisión de bases,

reparación por escisión de nucleótidos).

X

3.4. Reconocerá la importancia de la síntesis de DNA y de las

enzimas replicativas en los procesos de reparación del DNA.

X

3.5. Conocerá la respuesta SOS en bacterias y la función de la

reparación sujeta a errores.

X

3.6. Distinguirá los mecanismos generales de reparación

(reparación global del genoma y reparación acoplada a

transcripción) en eucariontes.

X

3.7. Conocerá algunas enfermedades asociadas a defectos en

los sistemas de reparación del DNA.

X

Objetivos del tema

El DNA puede ser dañado de muchas maneras, pero este daño

solamente conduce a una mutación cuando NO es reparado.

• Daño: cambios químicos en el DNA

• Mutación: cambios en la secuencia de bases del DNA

Reparación del DNA

MUTACIONES EN EL DNA

Mutaciones espontáneas (105 – 108)

Mutaciones inducidas (por mutágenos)

Mutaciones puntuales

Mutaciones: Adiciones o deleciones de bases

Substitución de base:

transición (AG; GA)transversión (CG; CA; TG; TA)

Tipos de mutaciones de pares de bases

CATTCACCTGTACCA

GTAAGTGGACATGGT

CATGCACCTGTACCA

GTACGTGGACATGGT

CATCCACCTGTACCA

GTAGGTGGACATGGT

Transición (T-A por C-G) Transversión (T-A por G-C)

CATGTCACCTGTACCA

GTACAGTGGACATGGT

Inserción

Sustituciones de pares de bases transición: pirimidina por pirimidina o purina por purina transversión: pirimidina por purina o purina por pirimidina

Secuencia silvestre

Deleción o eliminaciónCATCACCTGTACCA

GTAGTGGACATGGT

Repercusión a nivel de proteína

Mutación sinónima

Mutación de error

Mutación sin sentido

Mutación de marco

Conservativa

No conservativa

Tipos de Daño al DNA. Rayos X y rayos gamma.

Ionizan moléculas que rodean al DNA generando radicales libres, algunos de estos contienen oxígeno que tienen un electrón desapareado. Son especies altamente reactivas y pueden atacar la molécula del DNA causando rupturas en una o en las dos cadenas.

También pueden modificar quimicamente una base, como la guanina.

Generación de 8-oxo-guanina. Causa transversiones: GC -> TA

Tipos de Daño al DNA. Radiación UV. Formación de dímeros de timina.

Entrecruzamiento covalente de pirimidinas adyacentes en la misma cadena de DNA. Generalmente son timinas.

Dímeros de timina

Exposición a radiacionesultravioleta

Tipos de daño: Alteraciones espontáneas en el DNA

Depurinación y desaminación de bases

100 al día

5000 al día

Desaminaciones

Tipos de Daño al DNA. Desaminación por ácido nitroso.

Desaminación de citosina genera uracilo

Desaminación de 5-metil citosina genera

timina

Depurinaciones

Introduction to Genetic AnalysisAnthony Griffiths, VIII Ed.

Etil Metano Sulfonato:

MutágenoAgente alquilanteTransición de base

Mutágenos

Tipos de Daño al DNA. Alquilación.

Metilación o acetilación de las bases en los átomos (O/N) que participan en la formación de puentes de H, desestabiliza la doble hélice de DNA y hace esa zona susceptible a mutación.

La presencia de estas regiones dañadas puede causar detención de la replicación, o si ésta continúa, está sujeta a errores.

Metabolismo

celular

Exposición

Luz UV

Radiación

ionizante

Exposición

Química

Errores en

replicación

Activación

Punto de control

Ciclo celular

Activación

Programa

transcripcional

Reparación de DNA:

Reversión directa

Excisión de base

Excisión de nucleótido

Reparación de error

Reparación por

Recombinación homóloga

Apoptosis

Cuando los daños no son reparados, se pueden generar cambios en las secuencia de las bases durante la replicación, produciendo una mutación.

REPARACIÓN

• Corrección directa del DNA dañado.

• Eliminación de la región dañada del DNA y relleno con DNA recién sintetizado.

MECANISMOS DE REPARACIÓN

1. Fotoreactivación: ruptura de dímeros de pirimidinas por acción de

una fotoliasa (phr) activada mediante luz visible.

2. Reparación por Escisiónde bases (BER): DNA glicosilasa (fpg) reconoce el nt dañado,intervienen exo III (xth), endo IV (nfo),

de nucleótidos (NER): necesita la otra hebra como molde (hasta 30bp), intervienen las endonucleasas uvrA,B,C y la helicasa uvrD

3. Reparación post- replicativa

Reparación de apareamiento erróneo de bases (“mismatch”): unametilasa reconoce DNA recientemente replicado (dam) e intervienenlas proteínas “mut” (helicasas, etc)

Reparación por recombinación

Reparación Directa de Daños al DNA

Fotoreactivación

Sistema de reparación que se activa en presencia de luz.

Fotoliasa. Detecta al DNA dañado y se une a éste. La enzima absorbe luz azul y se activa. Rompe los enlaces covalentes entre los dímeros de timina.

La enzima se disocia y se separa del DNA.

Reacción dependiente de FADH

Acción de la fotoliasa (fotoreactivación)

Reversión directa dímeros de pirimidinas

Solo se activa por luz visible

Reparación de DNA por Escición

Implica la remoción del DNA dañado incluyendo algunas secuencias adyacentes.

BER: “Base excision repair”

NER: “Nucleotide excision repair”

Reparación de DNA por Escición de Bases (BER)

Cuando una base dañada en el DNA es reconocida, una glicosilasa actúa y rompe el enlace N-glicosídico entre la base y el azúcar. Esto deja un sitio AP (apurínico/ apirimidínico). Una endonucleasa AP reconoce este “hueco” e hidroliza los enlaces fosfodiéster adyacentes.

La DNA pol I repara degradando el DNA (5’->3’) y sintetiza DNA nuevo.

DNA ligasa sella el último enlace.

Las DNA glicosilasas reconocen bases dañadas

Reparación por escisiónde base BER

Reparación de DNA por Escición de Nucleótidos (NER)

Escinucleasa uvrABC realiza este tipo de reparación en dímeros de timina, otros fotoproductos y bases dañadas.

Escinucleasa (246 kDa) está compuesta por tres subunidades (A, B y C)

UvrA se une al DNA en la región dañada.

UvrB/UvrC tienen actividad de endonucleasa y corta en los lados adyacentes de la cadena liberando un oligonucleótido de unos 12-13 nts de largo.

La región “vacía” es rellenada por una DNA polimerasa I y sellada por una DNA ligasa.

Reparación por escisiónde nucleótido

uvrABC: exinucleasa

NER

uvrD: helicasa

Reparación por escisión de nucleótidos en bacterias y en humanos

BER NER

¿Cómo se

identifica a la

cadena molde

cuando se

repara un error?

MutSMutL

MutH

MutH corta la cadena NO metilada

Mismatch repair

Mismatch repair

(NER) “Mismatch Repair”

A pesar de la alta fidelidad que exhiben las DNA polimerasas y de su actividad correctora, pueden cometer errores, dejando las dos cadenas desapareadas.

¿Cómo distingue el sistema de reparación cuál de las dos cadenas debe reparar? Las cadenas parentales

están metiladas (-GATC-). Sistema de

reparación MUTATOR:

Identificación del sitio de desapareamiento y unión al DNA.

Corte de la cadena de DNA no metilada.

Eliminación del DNA de cadena sencilla.

DNA pol III rellena el “hueco”

DNA ligasa sella el último enlace.

Mecanismos de reparación postreplicativos

La respuesta SOS en E. coli

En células sin daño en el DNA, LexA reprime la síntesis de LexA, recA, uvrABC y de otras proteínas involucradas en la respuesta SOS.

LexA es una proteína de 22 kDa que se une a las regiones operadoras.

La respuesta SOS en E. coli

Cuando hay daño en el DNA, se activa RecA al unirse al DNA de cadena sencilla y estimular la auto-proteólisis de LexA en un enlace Ala-Gly.

Ocurre transcripción de los genes de las proteínas encargadas de la reparación del DNA.

Algunos de los mecanismos de reparación regulados por SOS son susceptibles a errores (“error prone”).

Genes y proteínas que participan en la Respuesta SOS

Nombre del gen Proteína o función en la reparación de DNA

Genes de función conocida

polB (dinA)

uvrA

uvrB

umuC

umuD

sulA

recA

dinB

Subunidad polimerasa de la DNApol II requerida para comenzar la replicación durante la reparación del DNA en recombinaciónSubunidades UvrA y UvrB en ABC de la excinucleasaDNA pol VProteína que inhibe la división celular para dar tiempo a reparación del DNAProteína RecA requerida para la reparación en recombinaciónDNA pol IV

Genes involucrados en metabolismo de DNA pero de función desconocida en reparación

ssbuvrDhimA

recN

Proteína SSBDNA helicasa IIRecombinación sitio específica, replicación, transposición, regulación de la expresiónReparación en recombinación

• Cuando se expone E. coli a altos niveles de radiación o a un mutágeno, ocurre un daño extensivo en el DNA. La célula responde induciendo la vía SOS de reparación.

• Se activan los genes umuC yumuD cuyos productos componen las subunidades de la DNA polimerasa V.

• DNA PolV replica el DNA, aún en regiones donde hay daño y es muy propensa a cometer errores.

• Se observa una alta tasa de mutación

• Cepas de E. coli nulas en umuC son inmutables.

Reparación sujeta a errores

Reparación de DNA por Recombinación

+

+

I. Durante la replicación, se brinca la región frente al dímero.

II. Ocurre intercambio entre las cadenas y recombinación

III. Se completa la síntesis de la cadena que sufrió intercambio. El dímero se quedó sin reparar.

Reparación por escición de nucleótidos en eucariontes

1. Reparación global de genoma. El heterodímero XPC-hHR23B localiza lesiones que distorsionan a la doble hélice de DNA.

2. Reparación acoplada a la transcripción. La RNA polimerasa identifica el daño en el DNA. Se detiene la transcripción.

Reparación por escición de nucleótidos en eucariontes

Una vez que se ha reconocido el daño, participan las mismas proteínas en la reparación.

• TFIIH (XPB + XPD) que tiene actividad de helicasa es reclutado.

• XPA y RPA contribuyen a mantener abierta la doble hélice de DNA.

• XPA guía a las endonucleasas para realizar el corte del DNA.

• Endonucleasa XPG corta el DNA en el lado 3’.

• El complejo ERCC1-XPF corta del lado 5’ de la cadena dañada.

• El oligonucleótido (24-32nts) con la región dañada es liberado.

• El hueco es rellenado por la DNA

polimerasa o .

Enfermedades humanas asociadas con defectos en la replicación o reparación del DNA

Asociadas con una alta frecuencia de mutaciones en cromosomas y genes. Algunas se asocian a una alta predisposición a tumores. • Xeroderma pigmentosum

•Mutaciones en genes involucrados en reparación por escición de nucleótidos. Melanoma

• Ataxia telangiectasia• Mutaciones en genes que detectan daño al DNA.• Riesgo incrementado a rayos X.

•Anemia de Fanconi• Mutación en gene involucrado en reparación al DNA.

•Síndrome de Bloom • Mutación en una helicasa de DNA. • Hipersusceptibilidad a rayos X y a la luz solar.

•Síndrome de Cockayne (CSA/CSB)• Defecto en reparación acoplada a transcripción. • Susceptibilidad a luz solar.

• Síndrome de Werner• Mutación en un gen de DNA helicasa. • Envejecimiento prematuro.