Observación de los microorganismos en el microscopio
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Universidad de Guadalajara Departamento de Microbiología y Patología Microbiología y Parasitología Profesor: Dr. Luis Daniel Meraz Rosales
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Universidad de Guadalajara
Departamento de Microbiología y Patología
Microbiología y Parasitología
Profesor: Dr. Luis Daniel Meraz Rosales
OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
1.- El microscopio
El microscopio (de micro-pequeño y scopio observar) es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista.
Microscopio óptico Microscopio electrónico
1.1 Introducción
1.2 Microscopio óptico
Sistema de soporte: Base Brazo Tubo o cabezal Platina Revolver
Sistema de ajuste: Tornillo
macrométrico Tornillo
micrométrico
PARTES DEL MICROSCOPIO
Parte óptica: Fuente de
iluminación Condensador y
diafragma Lentes: oculares (10x
y 12x) y objetivos (4x, 10x, 40x y 100x).
En los microscopios antiguos tenía forma de herradura o de trípode pero en la actualidad suele ser una plataforma rectangular.
Tiene un peso suficiente para dar estabilidad al aparato.
En él se integra la fuente luminosa.
BASE O PIE
Es una columna perpendicular al pie.
Puede ser arqueado o vertical y une la base con el tubo.
BRAZO
Es una cámara oscura unida al brazo mediante una cremallera.
Tiene el revolver con los objetivos en su parte inferior y los oculares en el extremo superior.
TUBO
Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparación.
PLATINA
Permite el paso de los rayos de la fuente de iluminación situada por debajo.
Tiene 2 pinzas y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento.
Es un sistema en el que se encuentran los objetivos, y que gira para utilizar un objetivo u otro.
REVOLVER
Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo.
TORNILLOS MACRO Y MICROMÉTRICOS
El macrométrico lo hace de forma rápida y el micrométrico de forma lenta.
Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura.
Se trata de una lámpara halógena de intensidad graduable.
Esta situada en el pie del microscopio.
En su superficie externa puede tener una especie de anillo para colocar filtros que facilitan la visualización.
FUENTE DE ILUMINACIÓN
El condensador es un sistema de lentes situadas bajo la platina su función es la de concentrar la luz generada por la fuente de iluminación hacia la preparación.
CONDENSADOR Y DIAFRAGMA
En el interior del condensador existe un diafragma (iris) cuya función es limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados.
Están colocados en la parte superior del tubo.
Su función es la de captar y ampliar la imagen formada en los objetivos.
Permite ajustar la distancia interpupilar.
OCULARES
Están colocados en la parte inferior del tubo insertados en el revolver.
Generan una imagen real, invertida y aumentada.
OBJETIVOS
Los mas frecuentes son los de 4, 10, 40 y 100 aumentos.
Este último se llama de inmersión ya que para su utilización se necesita utilizar aceite de cedro sobre la preparación.
En la superficie de cada objetivo se indican sus características principales, aumento, apertura numérica y llevan dibujado un anillo coloreado que indica el número de aumentos : 10x o seco débil 40x o seco fuerte 100x o de inmersión
1.2 Microscopio electrónico
Utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar las imágenes.
Permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior.
Funciona con un haz de electrones generados por un cañón electrónico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnéticas.
Los electrones atraviesan la muestra y se amplifican por lentes magnéticas que forman la imagen sobre una placa fotográfica o una pantalla sensible al impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la pantalla de un ordenador.
Hay dos tipos: Microscopio electrónico de transmisión Microscopio electrónico de barrido
Emite un haz de electrones, que rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra.
La muestra debe cortarse en capas finas, < de un par de miles de ángstroms.
Pueden aumentar la imagen hasta 1 millón de veces.
MICROSCOPIO ELECTRÓNICODE TRANSMISIÓN
La muestra es recubierta con una capa de metal delgado y es barrida con electrones enviados desde un cañón.
Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una TV.
MICROSCOPIO ELECTRÓNICODE BARRIDO
Su resolución está entre 3 y 20 nm. Permite obtener imágenes de gran
resolución en materiales pétreos, metálicos y orgánicos.
La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie.
Es la capacidad que tiene un microscopio de percibir por separado dos puntos pequeños, adyacentes y cercanos.
Es la capacidad para percibir detalles.
El poder resolutivo aumenta a medida que disminuye la distancia que separa dichos puntos.
1.3 Poder resolutivo
OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
2. Preparación de la muestra
Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a observar o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra.
El hisopo ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo.
Se puede diluir el material en una gota de solución salina.
2.1 Examen en fresco
Se deja secar al aire. Sirve para observar microorganismos
vivos: Trofozoítos móviles de parásitos
intestinales como Giardia, Entamoeba. Huevos y quistes de parásitos, larvas y
gusanos adultos. Trichomonas. Hifas.
Cándida sp.
Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos.
2.2 Frotis
Se siguen los mismo pasos que para el examen en fresco. Muestra de cultivo sólido se diluye. Muestra de cultivo líquido no se diluye.
Fijación de la muestra: hace que las células queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología bacteriana y las agrupaciones de células y permite continuar con los procesos de tinción.
La fijación se puede realizar: Por calor: pasando algunas veces el
portaobjetos por la llama, se deja enfriar el porta entre los pases.
Con metanol (para bacterias procedentes de medio líquido): se añade unas gotas de metanol sobre la extensión seca, se retira de inmediato el exceso de metanol y se espera a que se evapore completamente.
La muestra esta lista para ser observada o continuar con procesos de tinción.
Es la “impresión” de un tejido solido en un portaobjetos donde se busca que los microorganismos superficiales queden expuestos para su observación al microscopio.
2.3 Impronta
OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
3. Tinciones
Sirven para: Distinguir entre tipos
diferentes de células Revelar la presencia de
determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, etc.
3.1 Generalidades
Colorantes: La mayoría son compuestos orgánicos
que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares.
Muchos colorantes utilizados con frecuencia son cationes y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.
Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
Otros colorantes son aniones y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, como las proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.
Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósítos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.
Tinciones simples Positivas (se tiñe la bacteria)
▪ Azul de metileno▪ Hidróxido de potasio (hongos)
Negativas (se tiñe el medio que rodea a la bacteria)▪ Tinta china (cápsulas)▪ Nigrosina
3.2 Tinciones simples
Hacer un frotis sobre un porta, secar y fijar.
Cubrir la preparación con el colorante elegido, durante el tiempo especificado.
Lavar con agua, arrastrando todo el exceso de colorante.
Secar al aire. Observar al microscopio. Las bacterias se verán teñidas del color
elegido.
PROCEDIMIENTO
TINCIÓN SIMPLE CON AZUL DE
METILENO
TINCIÓN CON HIDRÓXIDO DE
POTASIO AL 10%
El KOH digiere parcialmente las proteínas de las membranas celulares, pero no actúa sobre los polisacáridos de los hongos.
TINCIÓN SIMPLE CON TINTA CHINA
Los polisacáridos de la bacteria rechazan el colorante y se observa la cápsula.
Tinciones compuestas o diferenciales Tinción de Gram Tinción de Ziehl-Neelsen Tinción de Giemsa
-Se utilizan varios colorantes-Las estructuras celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su constitución química.
3.3 Tinciones compuestas
Tinción importante. Dividir las bacterias en dos grupos:
grampositivas y gramnegativas debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares.
TINCIÓN DE GRAM
Cubrir el frotis con cristal violeta y lavar para quitar el exceso de colorante.
En este estado, todas las células están teñidas de azul.
Se coloca lugol (solución yodada), el I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta, en todas las células.
Técnica
Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta.
Las bacterias grampositivas no se decoloran, mientras que las gramnegativas si lo hacen.
La mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula.
Las células gramnegativas son incapaces de retener el cristal violeta-yodo por tener poco peptidoglicano y la célula se decolora.
Las células grampositivas tienen más peptidoglicano y fijan el colorante, contienen menos lípido y no se disuelven, la mezcla alcohol-acetona deshidrata la pared celular y cierra los poros, provocando que el complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular.
Se utiliza una coloración de contraste como la safranina que es roja, que colorea todas las células restantes.
BACTERIAS GRAMPOSITIVAS
BACTERIAS GRAMNEGATIVAS
BAAR (bacilos alcohol-ácido resistentes) Las paredes celulares de ciertas
bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos.
La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana.
TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN
Hacer un frotis, secar y fijar con calor. Cubrir con fuscina fenicada por 5-10
min, calentando hasta que emita vapor, sin que hierva o se consuma y lavar.
Decolorar el frotis con alcohol ácido por 1 min y lavar.
Cubrir con azul de metileno como contraste por 1 min. y lavar.
Observar al microscopio con el objetivo 100x (inmersión).
Técnica
TINCION DE ZIEHL-NEELSEN
Observar bacterias intracelulares, como Rickettsia, parásitos sanguíneos, etc.
Se usa la solución de Giemsa, se deshidrata con alcohol y se aclara con Xilol.
TINCIÓN DE GIEMSA
También se emplea la modificación de Wright que detecta zonas con alto contenido de ADN, lo que permite distinguir los componentes celulares.
Resultados: Citoplasma: rosa Núcleos: azul Eritrocitos: rojo Gránulos de las células cebadas: púrpura Bacterias y parásitos: azul
Tinciones estructurales Tinción de cápsulas Tinción de flagelos Tinción de esporas Tinción de corpúsculos metacromáticos
Tinciones especiales: Tinciones fluorescentes Tinción de auramina-rodamina Tinción con naranja de acridina
3.4 Otras tinciones
Los ácidos micólicos de las micobacterias se tiñen con rodamina-auramina y se usa permanganato de potasio como contraste.
Las micobacterias aparecen naranjas en un fondo verde.
TINCIÓN DE RODAMINA-AURAMINA
Se une al acido nucleico nativo o desnaturalizado.
Colorante “vital” Verde = vivo Rojo = muerto
TINCIÓN NARANJA DE ACRIDINA
La paredes celulares de los hongos fijan el colorante, aumentando su visibilidad.
TINCIÓN BLANCO DE CALCOFLUOR
Observar endosporas.
Se usa verde de malaquita que tiñe las esporas en caliente y safranina como contraste.
TINCIÓN DE WIRTZ-CONKLIN
TINCIÓN DE FLAGELOS
