OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS A TRAVS

DEL MICROSCOPIO

El Microscopio

El microscopio (de micro-, pequeo, y scopio, observar) es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeos para ser vistos a simple vista.

El tipo ms comn y el primero que se invent es el microscopio ptico.

UNIDAD

1 TIPOS DE MICROSCOPIOS Clasificacin:

Segn la fuente de emisin.

Segn el nmero de lentes.

Los microscopios, segn la fuente de emisin son:

MICROSCOPIO PTICO MICROSCOPIO ELECTRNICO

Microscopios

Estereoscpicos o lupas

Compuestos

M. ptico, corriente

M. contraste de fases

M. de fluorescencia

M. Electrnico

M. E. de transmisin

M. E. de barrido

Tipos de microscopios,

segn el nmero de lentes

Microscopio estereoscpico

Este microscopio hace posible la visin tridimensional de los objetos.

Ofrece ventajas para observaciones que requieren pequeos aumentos.

El ptimo de visin estereoscpica se encuentra entre 2 y 40X.

Microscopio ptico compuesto

Poseen dos lentes que producen una imagen ampliada, vertical e invertida al objeto

Tiene un lmite de resolucin de cerca de 200 nm (0.2 m). Aumenta las imgenes hasta 1000 veces. El microscopio ptico puede ser monocular, binocular, o triocular. Las clulas observadas bajo el microscopio ptico pueden estar vivas o fijadas y teidas

UNIDAD

1 Partes del microscopio ptico .

Sus principales componentes son:

Oculares. Lentes a travs de las que se

observa la preparacin ampliada.

Objetivos. Lentes que aumentan el tamao

de la imagen.

Platina. Sobre ella se coloca la

preparacin, que se sujeta con una pinza.

Tornillos de enfoque. Mueven la platina arriba

o abajo para enfocar la imagen.

Iluminacin. Espejo o lmpara que ilumina la

preparacin.

Partes

Partes Fuente. Se trata clsicamente de una lmpara incandescente de tungsteno sobrevoltada Lente Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y ampla la imagen formada en los objetivos. Los oculares son intercambiables y sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de potencias mayores a 20X y otros que poseen una escala micromtrica; estos ltimos tienen la finalidad de medir el tamao del objeto observado Lente Objetivo: lente situada cerca del especimen.

Objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la preparacin. En la cara externa llevan ndices que indican el aumento, la abertura numrica y otros datos. Un objetivo con estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que es planacromtico, su aumento 40 y su apertura numrica 0,65, con tubo de longitud 160 mm. Los aumentos de los objetivos secos ms frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X. El objetivo de inmersin est compuesto por un complicado sistema de lentes. Para observar a travs de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparacin, de manera que la lente frontal entre en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, son de 100X y se distingue por uno o dos crculos negros en su extremo inferior.

Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. Diafragma: regula la cantidad de luz que llega al condensador. Tubo: es una cmara oscura unida al brazo mediante una cremallera. Revlver: Sistema que agarra los objetivos, y que rota para utilizar un objetivo u otro. Tornillos macro y micromtrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macromtrico lo hace de forma rpida y el micromtrico de forma lenta. Llevan un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura. Platina: Plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparacin, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminacin situada por debajo. Base: Es la parte inferior del microscopio que permite el sostn del mismo.

Partes

Ocular

Objetivo

Diafragma

Efecto del diafragma

Dependiendo del objetivo escogido obtendremos mayor o menor campo de visin y, en

correspondencia, mayor o menor profundidad de campo

Objetivo menor mayor campo, mayor profundidad de campo o

de enfoque

Objetivo mayor menor campo, menor profundidad de campo o de enfoque

Si cerramos el diafragma mayor profundidad de

campo, pero menos luz

Si abrimos el diafragma menor profundidad de

campo, pero ms luz

Efecto del micromtrico

Moviendo el tornillo micromtrico (nunca ms de una vuelta)

alternativamente hacia delante o hacia atrs, podremos apreciar

nuevos detalles en la preparacin

Aqu, por ejemplo, logramos ver los cloroplastos de

estas clulas vegetales al mover ligeramente hacia

atrs o hacia delante el tornillo micromtrico

Microscopio de campo claro

Fuente

Muestra

Condensador

Ocular ( X 10)

Objetivo ( X 20, X 40 o X 100) ( X 100 con aceite de inmersion)

Para observar las

muestras es necesario

realizar tinciones para

aumentar la diferencia de

contraste entre los

microorganismos y el

medio.

UNIDAD

1 Imgenes con el microscopio ptico

Este tipo de microscopio permite observar clulas

vivas y los movimientos

que realizan

mantenindolas en su

medio.

Protozoos

UNIDAD

1

Tambin permite observar tejidos en finos cortes, pero en este caso hay

que fijar las muestras, de manera que

las clulas estn muertas.

Para ver mejor las muestras pueden teirse con colorantes especficos que

destaquen estructuras como el ncleo

o la pared celular.

CLULAS ANIMALES

CLULAS VEGETALES

Imgenes con el microscopio ptico

Microscopio ptico de campo oscuro

El microscopio de campo oscuro utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen.

El objeto iluminado dipersa la luz y se hace as visible contra el fondo oscuro que tiene detrs, como las partculas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitacin cerrada.

Microscopio de campo oscuro

-Se coloca una placa opaca entre el

condensador y la muestra.

-Solo los rayos reflejados o difractados

entran al objetivo.

-Se obtiene una imagen con fondo

oscuro y la muestra iluminada.

-No es necesario fijar las muestras.

Condensador

Placa opaca

Muestra

Objetivo

Chlamydomonas

Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminacin normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla. Las porciones transparentes del espcimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partculas se ven brillantes. Tambin es bastante utilizado en la observacin de muestras metalogrficas para la observacin de detalles en superficies con alta reflectancia.

Fuente

Muestra

Condensador

Anillo de fase

Anillo transparente

Objetivo

-Convierte pequeas

diferencias en indices de

refraccion en variaciones

detectables por el ojo. - Mediante un condensador y un objetivo especial se controla la iluminacin de tal manera que vaya en diferentes rutas a travs de las distintas partes de una clula. - El resultado es una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad.

-Permite observar

estructuras sin necesidad

de fijar las muestras.

Microscopio de contraste de fases

-1/4 rayos

en

fase

anillo de fase

Los rayos desviados se cancelan con los no desviados

objetivo

-1/4

Contraste de fase

Se observan imgenes con el fondo claro

(rayos no desviados) y las muestras

oscuras con limites bien definidos.

Se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las clulas sin colorear. Es ideal para espcimenes delgados, o clulas aisladas

Con este mtodo, el material denso aparece brillante, mientras que las partes de la clula que tienen una densidad cercana al agua (citoplasma) aparecen oscuras.

Contraste de fase

Microscopio de fluorescencia Usa luz U.V. con una longitud de onda (100 y

380 nm) menor que la luz blanca (380 a 750 nm). Esta luz excita ciertas sustancias que emiten radiaciones (mayor a 380 nm) que las hace visibles.

Algunos materiales no requieren colorantes pues tienen fluorescencia propia y otros deben ser teidos con colorante fluorescente, es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energa absorbida como rayos luminosos.

La imagen observada es el resultado de la radiacin electromagntica emitida por las molculas que han absorbido la excitacin primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda.

Para dejar pasar slo la emisin secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo

Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A).

Clulas epiteliales , triple coloracin: ncleo

(azul), microtubulos (verdes), actina (rojo).

Microscopio de fluorescencia

Lampara

Muestra

Condensador de campo oscuro

Filtro de excitacion

Filtro de emision

-Las muestras deben estar teidas

con fluoroforos

-Las muestras son excitadas a una

longitud de onda y fluorescen

emitiendo a una longitud de onda

mayor.

-Anticuerpos conjugados

-Hoecht (tie DNA)

-Expresion de proteinas

de fusion fluorescentes

(GFP)

Operacin del microscopio

Coloque el objetivo de menor aumento en posicion de empleo, y baje la platina completamente. Colocar la preparacion sobre la platina, y sujetela con las pinzas. Realizar el enfoque: Acercar al maximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macrometrico. Eso debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacion. Mirando a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo, con el macrometrico, y cuando se observe ntida la muestra, girar el micromtrico, hasta obtener un enfoque fino.

Pasar al siguiente objetivo. La imagen deber estar ya casi enfocada, y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino.

Mantenimiento y precuaciones

Al finalizar el trabajo, dejar puesto el objetivo de menor aumento

Cuando no se usa mantenerlo cubierto para evitar que se ensucien los lentes.

Nunca tocar los lentes con las manos

Despues de usar el objetivo de inmersion, limpiar el aceite con pauelos para ptica, con una mezcla alcphol acetona ( 7:3) o con xilol

En el, la luz se sustituye por un haz de electrones que pasan por un tubo (con vaco

para mejorar el paso de los electrones).

Aumenta la imagen con lentes magnticas.

Aumenta las imgenes hasta un milln de veces.

Las imgenes que se producen son en blanco y negro y muchas veces tienen

colores falsos.

Objetivos. Lentes que aumentan el

tamao de la imagen (internos).

Iluminacin. Can de electrones que

genera un haz que puede atravesar la

muestra o rebotar en ella (interno).

Oculares. Lentes a travs de las que

se observa la preparacin ampliada

(externos).

El microscopio electrnico

Microscopio electrnico

Los electrones chocan con la muestra y se desvan, y estas desviaciones son recogidas por la pantalla.

Observamos la imagen a travs de una pantalla que es excitada por los electrones que llegan a ella (mecanismo similar a la televisin).

Las imgenes se recogen en una placa fotogrfica que es impresionada directamente por los electrones.

El Microscopio Electrnico de Transmisin(MET)

Un MET mira a replicas de clulas muertas , despus de haber sido fijadas y teidas con ones de metales pesados.

Los electrones son dispersados cuando pasan a travs del espcimen, y luego detectados y proyectados hacia una imagen sobre una pantalla fluorescente.

El microscopio electrnico de transmisin (MET) tiene un limite de resolucin de cerca de 2 nm.

Microscopio electrnico de transmisin

UNIDAD

1 Slo permite observar clulas muertas, pero la ventaja es que permite estudiar las estructuras internas de los

orgnulos celulares.

En este caso las muestras deben ser muy finas para que puedan ser

atravesadas por los electrones y

tienen que estar deshidratadas.

Imgenes en el MET

El Microscopio Electrnico de Barrido (MEB)

Al igual que el MET, el MEB permite mirar a clulas muertas, despus de haber sido fijadas y teidas con ones de metales pesados.

Con esta tcnica los electrones son reflectados sobre la superficie del espcimen.

Sirve para examinar la superficie de los objetos y muestra la forma real de los objetos.

Microscopio electrnico de barrido

Microscopio de Campo Claro Alga verde (eucariota)

Microscopio de Fluorescencia Bacteria filamentosa Teida con naranja de acridina

Microscopio de Contraste de Fases Saccharomyces cerevisiae

Observa detenidamente las siguientes fotos tomadas

mediante microscopio (micrografas) y seala qu tipo de

microscopio se utiliz en cada caso. Justifica

a. Ameba, organismo

formado por una sola

clula (unicelular), que

mide cerca de 50

micrones

b. Clulas del interior de una

trompa de Falopio. Cada uno

de los pelitos que se ven mide 10 micrones de largo y

se llaman cilios

c. Espermio

acercndose a un

vulo. El vulo

humano es una

clula que mide

poco ms de 100

micrones

EJERCICIO

d. Ncleo de una

clula animal, de

alrededor de 5

micrones de

dimetro

e. Corte transversal de una

hoja, espesor 1 mm

f. Poros de salida de

glndulas gstricas.

Por una de ellas sale

un chorro de jugo

gstrico. Diametro de

poro, 5 micras

g. Corteza cerebral

humana, que tiene un

espesor de unos pocos

milmetros

h. Glbulo blanco

deformado al atravesar

por un capilar

sanguneo. Este capilar

tiene un dimetro de

unos 10 micrones

i. Capilar sanguneo

cortado

transversalmente,

por el que asoma un

glbulo rojo, clula

que mide 7 micrones

de dimetro

TINCION Una tincin o coloracin es una tcnica utilizada en microscopa para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Para mejor aprovechar la observacin microscpica, debe relacionarse el comportamiento del tinte con la composicin qumica de las partes de la anatoma bacteriana. Los colorantes utilizados son compuestos orgnicos con grupos cromforos y auxocromos unidos a anillos aromticos. Cromforos son los grupos funcionales de la molcula responsables de la absorcin. Principalmente son: dobles y triples enlaces carbono-carbono, sistemas aromticos, grupo carbonilo, imino (C=N), diazo (N=N), nitro y enlaces C-Y (Y es un tomo con pares libres). Auxocromos es un grupo funcional que no absorbe por si solo pero que tiene los efectos de desplazar picos de los cromforos hacia longitudes de onda larga adems de aumentar sus intensidades: metilo, halgenos, hidroxi, alcoxi, amino.

Tipos de Colorantes

Colorantes

Cationicos: se combinan con los constituyentes celulares cargados negativamente tales como acidos nucleicos, polisacaridos

acidos y superficies celulares. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal

violeta, Safranina.

Anionicos: se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como numerosas proteinas. Ejemplos:

Eosina, Fucsina acida y Rojo congo.

Liposolubles: se combinan con las sustancias grasas. Ejemplos: Sudan negro.

Tipos de tincin

Tincin in vivo (colorantes vitales) es el proceso de teir tejidos vivos. El propsito ms comn es revelar detalles de la citoestructura. Para conseguir el efecto deseado, el colorante usualmente se utiliza en soluciones muy diluidas que van entre 1:5000 a 1:50000. A pesar de esto las tinciones son eventualmente txicas para los organismos. Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.

Tincin in vitro (colorantes no vitales). Involucra el coloreo de clulas o estructuras que han sido removidas de su contexto biolgico. Ejem: tincion Gram.

Colorantes histolgicos ms comunes

Azul brillante de Coomassie Tie en forma no especfica a todas las protenas con un fuerte color azul. Se utiliza para teir corridas de protenas en electroforesis en gel. Azul de metileno Se utiliza para teir clulas animales, para hacer ms visibles sus ncleos. Azul Nilo Tie a los ncleos de color azul. Tambin puede ser utilizado para teir clulas vivas. Bromuro de etidio (BE) se intercala en el ADN y le otorga un color rojo naranja fluorescente. A pesar de que no es capaz de teir clulas vivas ya que no atraviesa las membranas intactas, puede ser utilizado para identificar clulas que se encuentran en las etapas finales de la apoptosis, ya que tales clulas poseen unas membranas mucho ms permeables.

Carmn

Es un colorante de un intenso color rojo que puede ser utilizado como sal de litio para teir glicgeno, mientras que las sales de alumbre-carmn son colorantes que se adhieren al ncleo. Las tinciones con carmn requieren del uso de un mordiente, que usualmente es aluminio o alumbre.

Cristal violeta

El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado, tie las paredes celulares de color prpura.

Son sustancias capaces de formar complejos

insolubles con los colorantes y que ayudan al

proceso de coloracin: los mordientes.

Ejemplos de mordientes comnmente usados

son el Lugol, el cido tnico y algunas sales.

MORDIENTES

TCNICAS PARA REALIZAR UNA PREPARACIN COLOREADA

a) Frotis o pelcula (extensin)

b) La fijacin

c) Coloracin.

2 tipos de

tinciones

Positivas: se emplea el uso de colorantes que tien al

microorganismo y no al

medio.

Negativas: se emplea el uso de colorantes que no tienen afinidad por los constituyentes celulares (Ejemplo: nigrosina). Tien al medio y no a

las bacterias, sirven para ver celulas con capsulas de

mucopolisacaridos.

Simples: uso de un solo colorante. Sirven para

distinguir formas.

Diferenciales: uso de un colorante inical y luego un colorante

de contraste. Sirven para diferenciar

distintos tipos de celulas (Ejemplo:

tincion Gram)

Tinciones

Observacin en fresco y coloracin vital.

Cuando se desea observar bacterias sin afectar su viabilidad, puede realizarse una observacin en fresco (sin colorear) o utilizar colorantes diluidos como por ejemplo cristal violeta 1/5000. Con esta tcnica podr observarse la morfologa y agrupacin de las bacterias as como tambin la movilidad. Observacin en fresco. Tcnica. 1- Sobre un portaobjetos colocar con el asa una gota de agua y realizar una suspensin de la muestra en estudio. No extender. 2- Colocar un cubreobjetos. 3- Observar con poca luz. Coloracin vital. El procedimiento es similar al de la observacin en fresco pero en el paso 1, se coloca una gota de solucin diluida de colorante en lugar del agua

Tincin negativa. Se utilizan sustancias que no penetran en la clula y tie el fondo quedando los microorganismos incoloros. Normalmente el tamao de las bacterias observadas por esta tcnica es mayor que el real y no debe utilizarse para la medicin de microorganismos. Los agentes ms utilizados son la nigrosina y la tinta china. Con este mtodo pueden observarse morfologa y agrupacin as como tambin estructuras extracelulares como la cpsula. Tcnica. 1- Colocar sobre un portaobjetos, con la ayuda de un asa, una gota de una solucin acuosa de nigrosina al 10 %. 2- Tomar una porcin del cultivo, suspender en la gota de nigrosina y extender en forma de valo. 3- Dejar secar (no exponer al calor) y observar con objetivo de inmersin.

Tincin de clulas para la observacin microscpica

Extensin de una fina capa de clulas sobre el porta

Secado al aire

Fijacin por flameado del porta

Adicin del colorante lavado y secado

Se coloca una gota de aceite de inmersin sobre el porta y se observa con el objetivo de 100X

TINCIN SIMPLE

COLORACIONES ESPECFICAS.

Coloracin de Gram.

Esta coloracin fue ideada por el bacterilogo dans Christian Gram en el ao 1883

y ha demostrado ser de suma utilidad. Permite separar los microorganismos en

Gram (+) y Gram (-) lo cual reviste especial importancia taxonmica.

En esta tcnica, el preparado fijado por calor se trata primeramente con cristal

violeta, luego se agrega Lugol como mordiente, se decolora con alcohol-acetona y

finalmente se contracolorea con fucsina o safranina. Las bacterias Gram(+) sern

las que resulten violetas luego del procedimiento de coloracin de Gram mientras

que las Gram (-) se vern rojas.

La explicacin de las diferencias en el comportamiento tintorial entre bacterias G(+)

y G(-), debe buscarse en la estructura y composicin de la pared celular bacteriana.

TINCIN DE GRAM

Paso 1

Paso 2

Paso 3

Paso 4

Tincin del frotis Previamente fijado al calor, con cristal violeta Durante 1 minuto. Todas las clulas se tien de color azul-violeta.

Aadir Lugol, dejar actuar 2 minutos Todas las clulas siguen de color azul-violeta.

Decolorar con alcohol Las clulas Gram + siguen de color azul-violeta. Las Gram negativas se decoloran.

Tincin de contraste Con safranina 2 minutos. Las clulas G+ se ven azul-violeta. Las G- rosas o rojas.

Gram +

Gram -

TINCIN DIFERENCIAL

Permite distinguir dos grandes grupos de bacterias que poseen diferencias

estructurales en la pared celular.

Peptidoglicano

Polimero de N-acetilglucosamina y N-acetilmuramico unidos por peptidos.

Tincin Gram

Tincin Gram

Tincin Gram

1) Preparar un extendido

A partir de cultivos en medio liquido: Se toma un poco de

cultivo con el ansa y se desparrama sobre un portaobjeto.

A partir de cultivos en medio solido: Se apoya el ansa sobre

una colonia, luego se coloca una gota de agua sobre el

portaobjeto y se desparrama el material con el ansa..

Protocolo

2) Fijar el material Una vez que el material esta seco, pasar

el portaobjeto sobre el mechero.

Tincin Gram

3) Cubrir el portaobjeto con

Cristal violeta

Se deja el colorante durante 20

segundos.

4) Lavar con agua

Gram + Gram _

5) Agregar el mordiente (lugol) (Lugol: solucion de I2 y KI). Se deja actuar el

mordiente durante 20 segundos y luego se

lava con agua.

Tincin Gram

6) Agregar el decolorante (Decolorante: solucion de acetona y EtOH).

El agregado del decolorante produce una DESHIDRATACIN de la pared de

pptido glicano que la transforma en una barrera fsica impermeable al

solvente.

Como consecuencia se impide el lavado del cristal violeta, quedando

atrapado en el interior de las bacterias Gram +.

Gram + Gram _

Tincin Gram

7) Agregar el colorante de

contraste (safranina)

8) Lavar con agua

Gram + Gram _

Tincin Gram

Rosa (Gram -) Violeta (Gram +)

Clasificacin en funcin de su posicin

Tincin de esporas

1) Preparacion del extendido y fijacion por

calor.

2) Cubrir con verde de malaquita calentando

durante 3 minutos.

3) Lavar con agua.

4) Agregar colorante de contraste

(safranina).

5) Lavar con agua.

Protocolo:

Tincin de esporas

Tincin de acido resistencia (Ziehl-Neelsen)

Permite distinguir bacterias del genero Mycobacterium. Estas poseen en su

pared acido micolico (hidroxilipido de cadena ramificada que se encuentra

acomplejado al peptido glicano de la pared celular.