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Tesis Doctoral

Obtención de extractos secos deObtención de extractos secos deyerba mate con alto contenido deyerba mate con alto contenido de

polifenoles y alta capacidadpolifenoles y alta capacidadantioxidanteantioxidante

Hartwig, Vanessa Graciela

2015-09-23

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Hartwig, Vanessa Graciela. (2015-09-23). Obtención de extractos secos de yerba mate con altocontenido de polifenoles y alta capacidad antioxidante. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires.

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Hartwig, Vanessa Graciela. "Obtención de extractos secos de yerba mate con alto contenido depolifenoles y alta capacidad antioxidante". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.Universidad de Buenos Aires. 2015-09-23.

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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Departamento de Industrias

Obtención de extractos secos de yerba mate con alto contenido de polifenoles y alta capacidad antioxidante

Tesis presentada para optar por el título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área Química Industrial

Vanessa Graciela Hartwig

Directores de tesis: Dra. Stella Maris Alzamora

Dr. Miguel Eduardo Schmalko

Consejero de estudios: Dra. Stella Maris Alzamora

Lugar de trabajo: Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales de la Universidad

Nacional de Misiones.

Buenos Aires, 2015

Obtención de extractos secos de yerba mate con alto contenido de polifenoles y alta capacidad antioxidante

El objetivo de la tesis fue obtener un producto en polvo para consumo con elevada capacidad antioxidante a partir de yerba mate. Para ello se abordaron una serie de objetivos particulares: seleccionar y adaptar técnicas de evaluación del contenido de polifenoles y de la capacidad antioxidante de los extractos; evaluar la influencia de la materia prima mediante la comparación de diferentes fracciones y procedencias geográficas; y optimizar la obtención de los extractos y su posterior secado.

El contenido de polifenoles y la capacidad antioxidante se determinaron mediante los métodos de Folin-Ciocalteu y del radical DPPH, usando principalmente ácido clorogénico y Trolox como estándares.

El uso de la fracción de hojas del material cosechado durante el inicio del periodo de cosecha permitió obtener extractos con alto contenido de polifenoles y alta capacidad antioxidante, ya que la fracción hojas posee mayor concentración de polifenoles totales que la fracción palos.

En cuanto a las soluciones extractivas, tanto el agua como soluciones acuosas binarias de metanol y de etanol mostraron ser eficaces en la extracción de dichos compuestos fenólicos, lográndose extracciones cercanas al 55 % del valor máximo posible.

La pérdida de polifenoles durante el secado spray usando maltodextrinas como agentes de secado fue despreciable, sugiriéndose que los compuestos que contribuyen al valor del contenido de polifenoles del producto en polvo son muy estables a las temperaturas ensayadas, o sus posibles productos de hidrólisis durante el proceso de secado mantienen su capacidad antioxidante.

Los resultados confirman la potencialidad del mate soluble como un alimento funcional.

Palabras Claves: yerba mate; antioxidantes; extracción; mate soluble; Illex paraguariensis

Production of dried yerba mate extracts with high polyphenol content and antioxidant capacity

This thesis was aimed to obtain a powder for human consumption with high antioxidant capacity from yerba mate. Specific objectives included the selection and adaptation of techniques to measure phenol content and antioxidant capacity of the extracts; choosing the more adequate raw material by comparing different fractions and geographical origins; and finally optimizing the extraction and drying conditions.

Total polyphenol content and antioxidant capacity were measured by Folin-Ciocalteu method and DPPH assay respectively, using mainly chlorogenic acid and Trolox as standards.

The use of leaf fraction harvested during the early harvest was found to be the most convenient for obtaining yerba mate extracts rich in polyphenols with high antioxidant capacity, due to the higher polyphenol content of this fraction compared with the stick one.

Water and aqueous binary solutions of methanol and ethanol were found to be suitable for extraction of total polyphenols, reaching around 55% of the maximum value possible to achieve.

Loss of polyphenolic compounds during spray-drying was negligible, suggesting that polyphenols compounds present in maté extracts were stable during spray drying or their hydrolysis products were still reactive to the Folin–Ciocalteu reagent.

These results confirmed the potentiality of the soluble mate as a functional food.

Keywords: yerba mate; antioxidants; extraction, soluble mate; Illexparaguariensis

Agradecimientos

A mis directores de tesis Stella Alzamora y Miguel Schmalko y al doctor Luis

Brumovsky por la oportunidad brindada, por su dedicación y conocimiento, por su

constante apoyo, colaboración y comprensión; sin los cuales no hubiese sido posible el

trabajo.

Al Instituto Nacional de la Yerba Mate por la financiación parcial de este trabajo de

investigación, a la fundación DINCYT y al Laboratorio de Yerba Mate de la Universidad

Nacional de Misiones por el uso de sus equipos e instalaciones.

A los integrantes del laboratorio: Paola, Raquel, Gustavo, Hernán y Nicolás. por su

colaboración en los análisis de laboratorio.

Y a mi familia por su incesante apoyo, tolerancia y contención.

Vanessa

1

INDICE

SECCION I .......................................................................................................................................... 7

OBJETIVOS Y JUSTIFICACIÓN .................................................................................................... 7

CAPITULO 1 ....................................................................................................................................... 8

1.1. Objetivo general ........................................................................................................................ 9

1.2. Objetivos específicos ................................................................................................................. 9

1.3. Organización de la tesis ............................................................................................................. 9

SECCION II ....................................................................................................................................... 11

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 11

CAPITULO 2 ..................................................................................................................................... 12

2.1. Descripción de la planta .......................................................................................................... 13

2.2. Cosecha y procesamiento ........................................................................................................ 13

2.2.1. Cosecha ........................................................................................................................... 13

2.2.2. Procesamiento ................................................................................................................. 14

2.2.3. Escaldado o “zapecado” ................................................................................................. 14

2.2.4. Secado ............................................................................................................................. 16

2.2.5. Canchado ......................................................................................................................... 16

2.2.6. Estacionamiento .............................................................................................................. 16

2.2.7. Molienda .......................................................................................................................... 17

2.2.8. Envasado ......................................................................................................................... 17

2.3. Tipos de producto y normativa vigente ................................................................................... 17

2.4. Formas de consumo ................................................................................................................. 20

2.4.1. Principales formas de consumo ....................................................................................... 20

2.4.2. Otros usos ........................................................................................................................ 21

2.5. Composición nutricional de la yerba mate .............................................................................. 22

CAPITULO 3 ..................................................................................................................................... 25

3.1. Definición de términos generales ............................................................................................ 26

3.2. Antioxidantes y salud ............................................................................................................. 26

3.2.1. Antioxidantes y patologías asociadas .............................................................................. 26

3.2.2. Mecanismos internos contra la acción de los radicales libres ......................................... 28

3.2.3. Principal sistema enzimático de defensa antioxidante .................................................... 30

3.2.3.1. Antioxidantes no enzimáticos .................................................................................... 32

3.3. Antioxidantes y reacciones de oxidación en alimentos ........................................................... 32

3.3.1. Tipos de deterioro en lípidos ........................................................................................... 33

3.3.2. Oxidación lipídica por lipoxidasas .................................................................................. 36

3.3.3. Oxidación lipídica fotosensibilizada ............................................................................... 37

2

3.3.4. Pro-oxidantes en sistemas lipídicos ................................................................................. 38

3.3.5. Efectos de la oxidación de lípidos en el alimento ........................................................... 38

3.3.5.1. Sabores oxidados ........................................................................................................ 38

3.3.5.2. Pérdidas de vitaminas liposolubles y pigmentos ........................................................ 39

3.3.5.3. Efecto sobre las proteínas ........................................................................................... 39

3.3.6. Estrategias de control y retardo de la oxidación .............................................................. 40

3.3.6.1. Concentración de oxígeno y oxidación de lípidos ...................................................... 41

3.3.6.2. Actividad acuosa y oxidación de lípidos .................................................................... 42

3.3.6.3. Temperatura y oxidación de lípidos ........................................................................... 43

3.3.6.4. Aditivos antioxidantes y oxidación de lípidos ............................................................ 43

3.3.7. Clasificación de antioxidantes alimenticios .................................................................... 44

3.3.8. Sinergismo entre antioxidantes ....................................................................................... 45

3.3.9. Sustancias potenciadoras de antioxidantes/agentes quelantes ......................................... 47

3.3.10. Antioxidantes sintéticos .................................................................................................. 48

3.3.11. Antioxidantes naturales ................................................................................................... 49

3.4. Breve descripción de algunos antioxidantes naturales ............................................................ 50

3.4.1. Tocoferoles (vitamina E) ................................................................................................. 50

3.4.2. Carotenoides .................................................................................................................... 53

3.4.3. Ascorbato ........................................................................................................................ 56

3.4.4. Antioxidantes fenólicos ................................................................................................... 57

3.4.4.1. Clasificación general de compuestos fenólicos ........................................................... 58

3.5. Polifenoles en yerba mate........................................................................................................ 65

SECCION III ..................................................................................................................................... 67

DESARROLLO ................................................................................................................................. 67

CAPITULO 4 ..................................................................................................................................... 68

4.1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 69

4.1.1. Complejidad en la estandarización de una metodología universal .................................. 69

4.1.2. Mecanismos de reacción de los antioxidantes ................................................................. 69

4.1.3. Pruebas químicas in vitro de medida de la actividad antioxidante en sistemas alimenticios ..................................................................................................................................... 71

4.1.3.1. Métodos basados en mecanismos de transferencia de átomos de hidrógeno ............. 72

4.1.3.2. Métodos basados en mecanismos de transferencia de electrones ............................... 76

4.1.3.3. Métodos basados en mecanismos HAT y SET ........................................................... 78

4.1.4. Objetivos ......................................................................................................................... 82

4.2. MATERIALES Y METODOS .............................................................................................. 83

4.2.1. Adaptación del método de Folin-Ciocalteu (FC) ............................................................ 83

4.2.1.1. Materia prima ............................................................................................................. 83

3

4.2.1.2. Reactivos .................................................................................................................... 83

4.2.1.3. Equipos ....................................................................................................................... 83

4.2.1.4. Determinación de humedad ........................................................................................ 83

4.2.1.5. Preparación del material de vidrio .............................................................................. 83

4.2.1.6. Preparación de soluciones y patrones ......................................................................... 84

4.2.1.7. Obtención de los extractos y diluciones ..................................................................... 84

4.2.1.8. Determinación de polifenoles totales ......................................................................... 85

4.2.1.9. Estabilidad del acido clorogénico como patrón estándar ........................................... 85

4.2.2. Adaptación del método de DPPH .................................................................................... 86

4.2.2.1. Materia prima ............................................................................................................. 86

4.2.2.2. Reactivos .................................................................................................................... 86

4.2.2.3. Equipos ....................................................................................................................... 86

4.2.2.4. Determinación de humedad ........................................................................................ 86

4.2.2.5. Preparación del material de vidrio .............................................................................. 86

4.2.2.6. Preparación de soluciones y patrones ......................................................................... 86

4.2.2.7. Obtención de los extractos y diluciones ..................................................................... 87

4.2.2.8. Determinación de polifenoles totales ......................................................................... 87

4.2.2.9. Elección de la longitud de onda para el ensayo .......................................................... 87

4.2.2.10. Determinación del perfil de absorbancia .................................................................... 88

4.2.2.11. Determinación de la capacidad antioxidante .............................................................. 88

4.2.2.12. Efecto de la temperatura de incubación en la reacción del DPPH ............................. 88

4.2.2.13. Evaluación de repetibilidad y reproducibilidad .......................................................... 89

4.2.2.14. Análisis estadístico ..................................................................................................... 89

4.3. RESULTADOS Y DISCUSION ............................................................................................. 89

4.3.1. Adaptación del método de Folin Ciocalteu ..................................................................... 89

4.3.2. Adaptación del ensayo de reducción del radical DPPH .................................................. 91

4.4. CONCLUSIONES DEL CAPITULO ..................................................................................... 98

CAPITULO 5 ................................................................................................................................... 100

5.1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 101

5.1.1. Estudios sobre composición fisicoquímica y manejo agronómico de yerba mate ........ 101

5.1.2. Cosecha y procesamiento de yerba mate ....................................................................... 102

5.1.3. Estudios sobre composición fisicoquímica y procesamiento ....................................... 105

5.1.4. Objetivos y justificación ................................................................................................ 108

5.2. MATERIALES Y METODOS ............................................................................................. 108

5.2.1. Selección de las zonas productoras y de los establecimientos yerbateros ..................... 108

4

5.2.2. Materia prima ................................................................................................................ 109

5.2.3. Reactivos ....................................................................................................................... 110

5.2.4. Equipos .......................................................................................................................... 110

5.2.5. Determinación de humedad ........................................................................................... 110

5.2.6. Preparación del material de vidrio ................................................................................. 111

5.2.7. Preparación de soluciones y patrones ............................................................................ 111

5.2.8. Obtención de los extractos y diluciones ........................................................................ 111

5.2.9. Determinación de polifenoles totales ............................................................................ 111

5.2.10. Determinación de la capacidad antioxidante ................................................................. 111

5.2.11. Análisis estadístico ........................................................................................................ 112

5.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................... 112

5.4. CONCLUSIONES DEL CAPITULO ................................................................................... 118

CAPITULO 6 ................................................................................................................................... 119

6.1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 120

6.1.1. Extracción de compuestos fenólicos ............................................................................. 120

6.1.2. Extracción de polifenoles a partir de yerba mate .......................................................... 121

6.1.3. Objetivos y justificación ................................................................................................ 122


6.2.1. Materia prima ................................................................................................................ 123

6.2.2. Reactivos ....................................................................................................................... 123

6.2.3. Equipos .......................................................................................................................... 124

6.2.4. Determinación de humedad ........................................................................................... 124



6.2.7. Planeamiento factorial y análisis de datos ..................................................................... 124

6.2.8. Extracciones adicionales ............................................................................................... 126

6.2.9. Obtención de los extractos y diluciones ........................................................................ 126

6.2.10. Modelado de la extracción acuosa ................................................................................. 128

6.2.11. Determinación del contenido de polifenoles totales ..................................................... 129


6.2.13. Determinación del contenido de cafeína ....................................................................... 129



6.3.1. Experiencias preliminares y modelado de la extracción acuosa .................................... 130

6.3.2. Análisis de correlación .................................................................................................. 133

6.3.3. Análisis de superficies de respuesta .............................................................................. 134

6.3.4. Extracciones adicionales ............................................................................................... 142


5

CAPITULO 7 ................................................................................................................................... 145

7.1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 146

7.1.1. Alimentos funcionales ................................................................................................... 146

7.1.2. Extractos en polvo ......................................................................................................... 150

7.1.3. Secado spray .................................................................................................................. 151

7.1.4. Actividad acuosa, isotermas de adsorción, y temperatura de transición vítrea - Conceptos y aplicaciones. ............................................................................................................................... 152

7.1.5. Objetivos ....................................................................................................................... 154


7.2.1. Materia prima ................................................................................................................ 155

7.2.2. Reactivos ....................................................................................................................... 155

7.2.3. Equipos .......................................................................................................................... 155



7.2.6. Preparación de las muestras y condiciones de secado ................................................... 156

7.2.7. Planeamiento factorial y análisis de datos ..................................................................... 156

7.2.8. Diluciones ...................................................................................................................... 157

7.2.9. Determinación de polifenoles totales ............................................................................ 158


7.2.11. Determinaciones analíticas del jarabe ........................................................................... 159

7.2.11.1. Sólidos solubles ........................................................................................................ 159

7.2.12. Determinaciones analíticas de los polvos ...................................................................... 159

7.2.12.1. Determinación de humedad ...................................................................................... 159

7.2.12.2. Densidad ................................................................................................................... 159

7.2.12.3. Solubilidad en agua .................................................................................................. 159

7.2.12.4. Actividad acuosa ...................................................................................................... 160

7.2.12.5. Color ......................................................................................................................... 160

7.2.12.6. Cinética de adsorción e higroscopicidad .................................................................. 160

7.2.12.7. Isotermas de adsorción ............................................................................................. 161

7.2.12.8. Temperatura de transición vítrea .............................................................................. 162



7.3.1. Propiedades antioxidantes y solubilidad ....................................................................... 163

7.3.2. Contenido de humedad .................................................................................................. 170

7.3.3. Densidad ........................................................................................................................ 171

7.3.4. Color .............................................................................................................................. 172

7.3.5. Cinética de adsorción e higroscopicidad ....................................................................... 176

6

7.3.6. Isotermas de adsorción .................................................................................................. 179

7.3.7. Temperatura de transición vítrea ................................................................................... 184

7.3.8. Discusión de criterios de estabilidad ............................................................................. 187


SECCION IV ................................................................................................................................... 195

CONCLUSIONES FINALES ......................................................................................................... 196

SECCION V ..................................................................................................................................... 200

REFERENCIAS .............................................................................................................................. 201

7

SECCION I

OBJETIVOS Y JUSTIFICACIÓN

8

CAPITULO 1

“Objetivos y organización de la tesis”

9

1.1. Objetivo general

El objetivo del presente trabajo fue obtener un producto en polvo para consumo con

elevada capacidad antioxidante a partir de yerba mate.

Para cumplir estos objetivos generales fue necesario abordar una serie de objetivos

particulares que se mencionan a continuación.

1.2. Objetivos específicos

• Adaptar la técnica de evaluación del contenido de polifenoles totales (CPT)

para extractos de yerba mate.

• Proponer una metodología para estandarizar la determinación de capacidad

antioxidante (CAO) en extractos de yerba mate.

• Evaluar los efectos del origen, tipo de procesamiento y época de cosecha

sobre el CPT y la CAO de la yerba mate canchada.

• Optimizar la extracción de polifenoles totales (PT) a partir de yerba mate.

• Optimizar el secado por aspersión de extractos de yerba maximizando el CPT

y su CAO.

• Caracterizar los polvos obtenidos mediante la evaluación de la densidad bruta,

el contenido de humedad, la actividad acuosa, la cinética de adsorción e higroscopicidad, el

color y la temperatura de transición vítrea.

1.3. Organización de la tesis

El desarrollo de la tesis se expone en seis secciones y a su vez cada sección incluye

capítulos independientes para cumplir cada uno de los objetivos particulares. La sección I

comprende al capítulo 1 y en el se presentan los objetivos y la justificación del presente

trabajo. La sección II se refiere a capítulos introductorios a la temática del trabajo; incluye

dos capítulos, el primero introduce en forma general al lector en temas relacionados

exclusivamente a la yerba mate como su procesamiento, formas de consumo y valor

nutricional; el segundo introduce en forma general al lector en temas relacionados a los

10

antioxidantes y su importancia. La sección III comprende el desarrollo del trabajo, consta de

cuatro capítulos dependientes que incluyen introducción, materiales y métodos, resultados y

discusión y conclusiones: el capítulo 4 expone la puesta a punto de las técnicas analíticas de

CPT y CAO; el capítulo 5 expone las comparación de CPT y CAO de diferentes fracciones

y procedencias geográficas; el capítulo 6 expone la optimización de la extracción de

polifenoles y finalmente el capítulo 7 expone la optimización del secado y la caracterización

de los polvos obtenidos. La sección IV comprende las conclusiones generales del trabajo. En

la sección V se presentan las referencias bibliográficas. Finalmente se adjunta un archivo en

formato digital en el cual se presentan los anexos donde pueden constatarse los datos

experimentales y los análisis estadísticos.

11

SECCION II

INTRODUCCIÓN

12

CAPITULO 2

“Yerba Mate”

13

2.1. Descripción de la planta

La planta pertenece a la especie Ilex paraguariensis Saint Hilaire y vulgarmente es

denominada “yerba mate”. Es un árbol de porte erecto y copa redondeada, con follaje

persistente compuesto por hojas gruesas y coriáceas, y pertenece a la familia botánica de

las Aquifoliaceas. En su hábitat natural puede alcanzar un desarrollo de hasta 20 metros de

altura, aunque bajo cultivo se realizan podas para que su porte arbustivo sea de 3-6 m de

altura a fin de facilitar la cosecha. Las flores son pequeñas, tetrámeras, dioicas,

blanquecinas, dispuestas en cimas auxiliares muy cortas. El fruto es carnoso, globoso, de

5-7 cm de diámetro y color pardusco (Parra, 2005). Florece en primavera y fructifica en

verano. Es nativa de las regiones subtropicales de Argentina (región noreste), Brasil

(región sur) y Paraguay (región oriental); su área de distribución natural está delimitada

por la costa atlántica de Brasil por el este y por el río Paraguay al oeste, entre los 21 y 30 °

de latitud sur y entre 48° 38´ y 56° 10´de longitud oeste, abarcando un área total de 540

mil km2 (Da Croce, 2002).

2.2. Cosecha y procesamiento

2.2.1. Cosecha

La entrada en producción del yerbal ocurre entre el 4° y 6° año de la implantación,

alcanzando su máximo rendimiento entre el 8° y 10° año, con un período productivo entre

25 y 30 años, llegando en algunos casos a los 60 años, dependiendo del cuidado del suelo.

La cosecha “o tarefa” se realiza anualmente extendiéndose desde enero hasta octubre

pero el período más adecuado comprende los meses de abril-octubre (Parra, 2005).

Durante este período la planta disminuye la circulación de su sabia y cuenta con mayor

porcentaje de hojas maduras y además se evitan las épocas de florescencia, brotación o

fructificación. Se realiza en forma manual con tijeras o serruchos, retirando alrededor del

75% del follaje maduro. Durante la cosecha, el material recolectado se deposita sobre

paños de arpillera, que con sus cuatro extremos ligados forman un atado los cuales son

pesados in situ y transportados a las playas de recepción en tractores y/o camiones, con un

tiempo entre cosecha e ingreso al procesamiento inferior a las 12 h.

14

2.2.2. Procesamiento

Su procesamiento comprende cinco etapas: 1) Zapecado o Escaldado; 2) Secado; 3)

Molienda Gruesa o Canchado; 4) Estacionamiento y 5) Molienda Fina, Tipificación y

Envasado. Las tres primeras etapas se llevan a cabo en establecimientos denominados

“secaderos” y la quinta etapa en establecimientos industriales denominados “molinos”. El

estacionamiento se realiza indistintamente en los secaderos o en los molinos. En general, los

molinos procesan yerba mate proveniente de diferentes secaderos, ya sean propios o de otras

empresas. En Brasil, el procesamiento de la yerba mate no incluye la etapa de

estacionamiento.

2.2.3. Escaldado o “zapecado”

Esta operación consiste en exponer durante 20 o 30 segundos las ramas a la acción

directa de llamas y luego a gases de combustión provenientes del quemado de leña (y en

algunos casos chips de madera) por 2-3 minutos, lo que genera vapor de agua en el

parénquima foliar, formándose así pequeñas ampollas que rompen la epidermis de las hojas,

además se inactivan las enzimas responsables de los procesos biológicos de degradación.

Esto impide la oxidación enzimática de ciertas sustancias contenidas en la hoja por

inactivación de enzimas (peroxidasa y polifenoloxidasa), asegurando la conservación de su

color verde. En esta etapa la yerba mate adquiere su aroma característico (Parra, 2005) y se

produce una pérdida importante de humedad de las hojas de tal forma que cuando las

mismas se disponen en el lecho de secado, éste tenga una porosidad alta para facilitar el flujo

del gas de secado; además se logra una disminución de la carga microbiológica y la

pérdida de probables residuos de agroquímicos (por ejemplo cipermetria y dimetoato)

(Escalada, 1999; Schmalko, 2005), como así también, parte de algunos compuestos como la

vitamina C, la cafeína y la clorofila (Bertoni et al., 1991, 1992, 1993; Ramallo et al., 1998b;

Schmalko y Alzamora, 2001). Debe realizarse dentro de las 24 h de efectuada la cosecha.

Esta operación se lleva a cabo en un equipo similar a un secadero rotatorio. El equipo

consiste en un cilindro metálico con pequeñas perforaciones que gira por medio de un

engranaje a bajas revoluciones (unas 10 rpm). Las ramas se introducen en el extremo del

cilindro en que se produce el quemado de la leña (o de chips de madera), recibiendo de la

misma calor por radiación de la llama y convección. Luego, el aire y las ramas se desplazan

hacia el extremo opuesto en corrientes paralelas. El desplazamiento del sólido es producido

15

por a) una serie de aletas dispuestas en forma discontinua y con una ligera inclinación para

favorecer el desplazamiento y b) por el arrastre de los gases de combustión (Esmelindro et

al., 2002; Schmalko, 2005) (Figura 2.1).

El flujo de los gases de combustión es producido por una chimenea ubicada en el

extremo de salida y es regulado por un deflector ubicado en su interior. De acuerdo con

Esmelindro et al. (2002), la temperatura media del aire al ingreso al zapecador ronda los 400

°C y a la salida 120 °C.

Figura 2.1. Diagrama general de un zapecador

Núñez y Känzig (1995) realizaron un relevamiento de las condiciones de operación

de zapecadores en 6 establecimientos, encontrando las siguientes dimensiones y condiciones

de trabajo: longitud: 6,5-7,5 m; diámetro: 1,6-2,5 m; tiempo de residencia: 2-4 min;

contenido de humedad de salida: 29-34 % (base húmeda); capacidad de procesamiento:

1.500-3.000 kg de hoja verde/h.

Cabe mencionar que el contenido de humedad de las ramas a la entrada es de

aproximadamente un 60 % (base húmeda).

Se debe destacar la gran uniformidad de diseño y operación de los zapecadores que

existen en los diferentes establecimientos industriales.

El control que se realiza en los zapecadores es bastante deficiente y se basa en la

experiencia de los operarios, ya sea en la alimentación de la leña o el material, la que en la

mayoría de los establecimientos es cargada con horquillas sobre una cinta transportadora que

a su vez alimenta el zapecador. En algunos establecimientos, se mide la temperatura de

salida de los gases y ésta y la velocidad de los gases son reguladas con la apertura o cierre de

un deflector localizado en la chimenea. Un operario con experiencia controla, en forma

manual, que las ramas a la salida tengan el tratamiento adecuado, es decir, que las hojas no

estén quemadas (excesivo tratamiento) ni tengan una excesiva humedad que produciría

16

inconvenientes en la etapa de secado (en la industria se denomina a ésta “yerba cruda” y es

consecuencia de un tratamiento térmico defectuoso) (Schmalko, 2005).

2.2.4. Secado

Dentro de las 24 horas siguientes al zapecado, el material zapecado debe ser sometido

a un proceso de secado para reducir su contenido en humedad, hasta un valor entre 3-6 %

(Parra, 2005). En Argentina actualmente se utilizan tres tipos de secado: barbacuá (lecho de

ramas en contacto directo durante 9 y 24 h con gases de combustión de leña alcanzando

temperaturas entre 60 y 90 °C); cinta (lecho móvil de baja velocidad en contacto con aire

caliente y gases de combustión de leña, durante 2-5 h, temperaturas entre 80 y 130 ºC);

rotatorio o tubular (tambores rotatorios, en algunos modelos las ramas no toman contacto

directo con los gases de combustión sino únicamente con aire caliente (secaderos

neumáticos) con tiempos de residencia entre 10-20 min y temperaturas superiores a 200 ºC).

En el capítulo 5 se presenta una descripción más profunda y detallada de los tipos de secado.

2.2.5. Canchado

Consiste en un proceso de molienda gruesa para disminuir el volumen de la hoja (lo

cual facilita su embolsado y transporte) y para aumentar la superficie expuesta al contacto

con la atmósfera y la humedad ambiente (lo cual favorece el inicio de reacciones que se

ocurren durante el estacionamiento) (Gómez Vara et al., 1979). En general, la relación

volumen de hoja verde: volumen de yerba mate canchada es de 3:1 (Parra, 2005). Los

rendimientos industriales después de este proceso, varían entre 34 y 38 g peso seco/peso

verde) en yerbas cosechadas al final del invierno.

2.2.6. Estacionamiento

Tras el canchado, la yerba se coloca en bolsas de arpillera de 40-50 kg y entra en un

período de estacionamiento que puede ser natural o acelerado a fin de que el producto

adquiera las características de sabor, aroma y color requeridas por los consumidores.

En el estacionamiento natural, la yerba canchada se mantiene almacenada en depósitos

cerrados por un lapso que oscila entre 6 y 24 meses; durante ese tiempo, se controla la

evolución del producto y se ventila el depósito, a través de la apertura de puertas y ventanas

en días secos y soleados. En el estacionamiento acelerado la yerba canchada se mantiene

17

almacenada por un período de 30 a 60 días en depósitos cerrados especialmente

acondicionados, donde se regula la temperatura, la humedad y la circulación interna del aire.

2.2.7. Molienda

Una vez canchada y estacionada, la yerba pasa a la etapa de molienda. Esta comprende

sucesivas operaciones de trituración, zarandeo y mezcla, que arrojan como resultado final la

yerba mate adecuada al gusto de diferentes regiones y grupos de consumidores.

La materia prima se coloca sobre cintas transportadoras que la conducen hacia una

zaranda circular de alambre, conocida como "zaranda de limpieza", que elimina posibles

cuerpos extraños, palos y ramas excesivamente gruesas. El proceso continúa con un

zarandeo primario de clasificación que separa las hojas muy grandes y el palo.

Estas hojas se someten a una trituración más o menos intensa en un molino o bien en el

"trapiche" (tanque de hierro en el que giran dos pesados rodillos de hierro, de forma cónica

truncada y superficie estriada) y luego son zarandeadas nuevamente. En este punto se

utilizan zarandas vibradoras que permiten obtener distintos productos según su grado de

trituración, que se almacenan en silos.

Concluida la clasificación se puede proceder a una mezcla con "palos" (cortados

previamente en trozos uniformes mediante un “corta palos"), en distintas proporciones,

según características deseadas de acuerdo a calidad, origen y sabor, entre otras. Del proceso

y de la granulometría de la mezcla depende el sabor que diferencia las distintas yerbas.

(Kotik, 1994)

2.2.8. Envasado

Para preservar las características organolépticas de la yerba mate, los envases cuentan

con varias capas de diversos materiales. Las presentaciones más usuales son de medio y de

un kilogramo, aunque también se comercializan envases de un cuarto y de dos kilogramos

(Parra, 2005).

2.3. Tipos de producto y normativa vigente

El 75 % del total de la yerba mate que egresa de la zona productora (74 % molida y

envasada y 1 % en saquitos) lo hace en su último proceso de industrialización. El 25 %

18

restante está integrado por yerba mate canchada (12 %) y molida a granel (13 %), con

destino a sucesivos procesos de elaboración y fraccionamiento.

La yerba mate debe cumplir con las siguientes normativas obligatorias vigentes:

• Dadas por el Código Alimentario Argentino

La normativa específica vigente para la yerba mate se halla en los Artículos 1193 al

1198 del Código Alimentario Argentino (2008); los mismos definen los siguientes

productos:

a- yerba mate canchada: es la yerba mate zapecada, secada y groseramente triturada.

Constituye la materia prima de los molinos.

b- yerba mate elaborada: es la yerba mate canchada que ha sido sometida a los

procesos de zarandeo, trituración, molienda y estacionamiento.

b1- yerba mate elaborada o yerba mate elaborada con palos: es la yerba mate

elaborada que contiene más de 65 % de hojas y menos del 35 % de palos. Debe además

cumplir ciertos requisitos de tamizado.

b2- yerba mate elaborada despalada o despalillada: es la yerba mate elaborada que

contiene más de 90 % de hojas y menos del 10 % de palos. Debe además cumplir ciertos

requisitos de tamizado.

c- yerba mate tostada: es la yerba mate elaborada sometida posteriormente a un

proceso de tostación.

d- yerba mate soluble ( o mate instantáneo, extracto de mate en polvo,

concentrado de mate): es el producto en polvo resultante de la deshidratación de los

extractos acuosos de yerba mate canchada despalada.

e-yerba mate compuesta o yerba mate aromatizada: es la yerba mate elaborada

(con palos o despalillada) adicionada de una o varias hierbas sápido-aromáticas de

reconocida inocuidad fisiológica en la forma habitual de su uso (cedrón, menta, tomillo,

etc.). Estas hierbas pueden adicionarse hasta en un 40 %.

19

Además de los límites impuestos al porcentaje máximo de palos, las características que

deben reunir los productos están mencionadas en los artículos 1195 y 1198 (Tabla 2.1).

• Dada por la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca de la Nación; en la

Resolución 20/95 (1995); referida al contenido máximo de plaguicidas (Tabla 2.2).

• Existen también otras normas de aplicación referidas a la higiene y seguridad

de los establecimientos industriales, rotulado, tipo de envases, etc.

Tabla 2.1 Características exigidas por el CAA

Productos

Componente yerba mate elaborada

yerba mate soluble

yerba mate compuesta

Humedad (100-105 °C) Max. 9,5 % Max. 7,5 % Max. 9,5 %

Cenizas totales (500-550 °C), método de la AOAC (sobre producto seco)

Max. 9,0 % Max. 9,0 % --------------

Cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10 % p/v, método de la AOAC (sobre producto seco)

Max. 1,5 % -------------- Max. 2,0 %

Cafeína, método de Cortés (sobre producto seco)

Min. 0,6 % -------------- --------------

Extracto Acuoso, método de la AOAC (sobre producto seco)

Min. 25 % -------------- --------------

Sustancias vegetales extrañas Max. 1,0 % -------------- --------------

Semillas de yerba mate Max. 1,0 % -------------- --------------

Nitrógeno total -------------- Max. 3,0 % --------------

Hidratos de carbono totales (como glucosa)

-------------- 18-24 % --------------

Bases purínicas totales, método de Bailey-Andrew

-------------- Min. 2,5 % --------------

Alcalinidad de las cenizas (en ml de ácido /g de cenizas

-------------- 25-30 --------------

pH de una solución al 2% p/v en agua destilada

-------------- 5,0-6,0 --------------

Observaciones No deberá estar ardida, agotada o alterada

Se prohíbe el agregado de hidratos de carbono y aromatizantes artificiales

--------------

20

También se dispone de normativas de aplicación voluntaria referidas a la calidad de la

yerba mate, elaboradas por el Instituto Argentino de Normalización y Certificación (IRAM).

Estas normas se caracterizan por ser voluntarias. Las empresas adheridas deben pagar un

canon para ser controladas (generalmente el control es realizado por el INTA) y como

contrapartida incluyen en su producto el sello de IRAM de certificación de calidad.

Actualmente existen más de 25 normas aprobadas o en estudio. Estas normas tratan

cuestiones relacionadas a las definiciones sobre los diferentes tipos de yerba mate, análisis

físico-químicos, de muestreo, preparación de muestra y buenas prácticas de manufactura.

Tabla 2.2 Contenido máximo de plaguicidas

Producto Nivel de tolerancia (mg/kg sólido seco)

Oxifluorfen 0,01

Paraquat 0,1

Tiometon 0,1

Dimetoato 0,5

Glifosato 0,5

Mirex 0,01

2.4. Formas de consumo

2.4.1. Principales formas de consumo

La yerba mate se consume en un 99 % como infusión. El término infusión abarca cinco

formas de consumo: el mate caliente (o simplemente mate), mate frío (o tereré) y en tazas en

forma similar al té (mate cocido o en saquitos; y mate soluble) (Schmalko, 2005).

Mate: Cuando se consume en forma de mate, entre 20 y 100 g de yerba “elaborada” y

en menor medida la denominada “yerba mate compuesta” con otras hierbas es colocada en

un recipiente “o mate” sobre el cual se vierten porciones de agua (aprox. 25 mL; entre 65-90

°C) que son succionadas con una bombilla metálica.

Los recipientes utilizados varían mucho según la región. El recipiente tradicional es

una calabaza; pero también se utilizan vasos de vidrio, tazas de cerámica, metal, etc. El agua

caliente es generalmente mantenida en termos durante el consumo del mate. La norma

IRAM 20540-1 (1997) normalizó la degustación de yerba mate a ser utilizada en las

21

transacciones comerciales. Esta norma sugiere la utilización de un recipiente de vidrio con

50 g de yerba mate con una bombilla lisa de acero inoxidable y agua a 70 °C.

Mate frío: El mate frío “o tereré” se consume generalmente en el verano y en algunas

zonas cálidas durante todo el año. La forma de preparar es similar a la del mate; pero se

utiliza agua fría, jugos o bebidas carbonatadas (5-10 °C). En algunas regiones de Argentina y

Paraguay es muy común adicionar hierbas (por ejemplo menta o cedrón) por considerárselas

refrescantes.

Yerba Mate en saquitos: La yerba mate en saquitos se consume en tazas en una forma

similar al té. Los saquitos contienen 3 g de yerba mate y están contenidos en una bolsita de

papel de filtro tissue, ensobrados con papel común. La bebida se prepara con

aproximadamente 250 mL de agua caliente (aprox. 95°C).

Mate cocido: El mate cocido es preparado en forma similar al caso anterior; pero en

este caso la yerba mate elaborada es vertida sobre el agua caliente, se mantiene en el

recipiente hasta ebullición y después es filtrada. En algunos casos, la infusión es saborizada

con cáscara de naranja o azúcar quemada.

Mate soluble: o “yerba mate soluble” es el polvo resultante de la deshidratación de los

extractos acuosos obtenidos exclusivamente de la yerba mate. Es preparado en forma similar

al café instantáneo. También se le conoce con el nombre de mate instantáneo, extracto de

mate en polvo, concentrado de mate, o yerba mate soluble en forma sólida. Su elaboración se

resume en cuatro etapas: extracción de los solubles, concentrado por evaporación, secado por

atomización y envasado.

El consumo per capita en Argentina y Uruguay ronda los 5-7 kg/año de yerba mate

lista para consumir mientras que en Brasil alcanza a 1,2 kg/año (Pagliosa et al., 2010).

2.4.2. Otros usos

Concientes de la dificultad que representa que los compradores de otros países

consuman la Ilex paraguariensis a través del mate y la bombilla, los exportadores locales

avanzaron en el desarrollo de diferentes productos elaborados en base al producto. La yerba

mate se utiliza en la elaboración de bebidas energizantes, gaseosas, aguas saborizadas,

preparados de leche, y hierbas exóticas; como saborizante de cervezas amargas, té helado,

22

chocolates, barritas de cereales y helados. En general para bebidas se elabora un concentrado

partiendo de yerba mate canchada (estacionada o verde) que se utiliza como base o como

ingrediente en la elaboración de bebidas. A partir de éste concentrado se elaboran bebidas

refrigerantes, carbonatadas y licores. También se la destina para productos cosméticos

(elaboración de jabones, perfumes, cremas, entre otros productos) (De Paula y Chociai,

2000). Las hojas de la yerba mate podrían ser utilizadas para la obtención de clorofila y

cafeína. Esta propuesta se debe al elevado contenido de clorofilas (6 mg/100 g sólido seco) y

cafeína (1,6 g/100 g sólido seco), pero hasta el presente no se tiene conocimiento que se haya

realizado un estudio técnico-económico de este proceso. Maccari y Rodriquez Pinto (2000)

mencionan la aplicación de la yerba mate en productos de higiene y tratamiento de residuos

aprovechando su contenido de saponinas. Se están realizando estudios a escala piloto para

este uso, ya que las saponinas normalmente utilizadas son obtenidas de otras fuentes (por

ejemplo semillas de té).

2.5. Composición nutricional de la yerba mate

En algunos sectores de la población, la yerba mate es uno de los principales productos

alimenticios. Su aporte de nutrientes puede ser importante debido a su forma particular de

consumo, el mate, en el que se utiliza una porción relativamente grande (aproximadamente

50 g de material sólido).

Respecto al contenido de nutrientes en la yerba mate, se pueden citar tres trabajos

realizados en los últimos tiempos: el primer trabajo se realizó sobre el producto seco y

comprendía el análisis de azúcares, cafeína, proteína, vitaminas y minerales (Schmalko et al.,

1995); el segundo trabajo se realizó a partir de una solución de yerba mate y comprendía

los minerales presentes (Tenorio Sanz y Torija Isasa, 1991); y el tercero simuló las formas

tradicionales de consumo (Tabla 2.3) (Ramallo et al., 1998a).

En la tabla 2.4 se presenta el aporte de nutrientes que representa el consumo diario de

100 g de yerba mate (2 porciones) en forma de mate caliente, con respecto a la Dosis Diaria

Recomendada (DDR); se puede observar que existen aportes importantes únicamente de

tiamina y piridoxina (B6).

El contenido de polifenoles totales (CPT) presente en las bebidas de yerba mate

habituales depende de la forma de consumo (p ≤ 0,0001), decreciendo en el orden: infusión

23

de mate en saquitos > mate caliente > mate frío. El CPT promedio en cada tipo de bebida y

el porcentaje de los sólidos solubles que dicho valor representa, se pueden apreciar en la

tabla 2.5 (Brumovsky et al., 2009).

El hábito de consumo del mate caliente y frío involucra el consumo diario de grandes

volúmenes: más de 1,5 L en el caso de los consumidores fuertes y menos de 0,5 L en el caso

de los consumidores suaves (Castellsague et al., 2000).

Tabla 2.3 Contenido de nutrientes en el extracto acuoso de yerba mate obtenido con tres formas diferentes de extracción.

Composición general

Infusión de mate en saquitos

Mate caliente Mate frío

Glucosa (g) 0,54±0,54 0,59±0,41+ 0,15±0,04 Sacarosa (g) 2,97±1,41 2,77±0,53+ 1,19±0,50 Proteínas (g) 3,69±3,26 2,14±0,39+ 1,24±0,52 Cafeína (g) 1,27±2,90 0,85±0,08+ 0,44±0,35

Cenizas totales (g) 3,80±1,38 3,23±0,37+ 1,86±0,75 Extracto acuoso (g) 40,22±1,34* 27,02±3,09+ 15,60±6,38

Vitaminas Vitamina C (mg) 4,89±3,04 5,11±2,78 2,35±0,13 Tiamina (B1) (mg) 1,59±1,38 1,48±1,86 0,15±0,10 Niacinamida (mg) 4,38±4,89 1,27±0,68+ n.d Piridoxina (B6)(mg) 0,54±0,51 0,94±0,97 n.d Minerales

Calcio (mg) 107,25±9,42* 80,94±9,78+ 43,90±19,45 Fósforo (mg) 60,5±7,25 45,89±6,31+ 21,27±8,70 Hierro (mg) 2,54±0,36 2,22±0,34+ 1,10±0,46 Magnesio (mg) 86,96±7,25* 58,58±7,57+ 33,17±13,64 Potasio (mg) 99,64±13,40 100,59±18,32+ 41,63±16,85 Sodio (mg) 27,54±5,43* 14,04±2,45 11,07±4,11 Valores expresados como media ± DE a partir de cinco muestras comerciales; referidos a % ms. n.d : No detectado * Denota diferencias significativas entre la infusión de saquitos y el mate caliente (p < 0,05) + Denota diferencias significativas entre el mate caliente y el mate frío (p < 0,05) Fuente: Ramallo et al. (1998a)

24

Tabla 2.4 Aportes nutricionales que representa el consumo de 100 g de yerba mate en forma de mate caliente con respecto a la Dosis Diaria Recomendada

Aportes nutricionales del mate

Valor medio DDR % de la DDR

Proteínas (g) 2,14 50 4,3

Vitamina C (mg) 5,11 60 8,5

Tiamina (mg) 1,48 1,4 100

Niacinamida (mg) 1,27 18 7,1

Piridoxina (mg) 0,94 2 47

Calcio (mg) 80,94 800 10,1

Hierro (mg) 2,22 14 15,9

Magnesio (mg) 58,78 300 19,5

Fuente: Ramallo et al. (1998a)

Tabla 2.5 Contenido de polifenoles totales (CPT) en el extracto acuoso de yerba mate obtenido por simulación de las tres formas de consumo.

Forma de consumo CPT Porcentaje de sólidos

solubles Infusión de mate en saquitos

19,25 g EAC %ms

10,52 g EAG %ms

50 %

Mate caliente 11 g EAC %ms

6,25 g EAG %ms

48 %

Mate frío 4,03 g EAC %ms;

2,32 g EAG %ms

36 %

EAC: equivalentes a ácido clorogénico; EAG: equivalentes a ácido gálico; %ms: por 100 g de muestra seca. Fuente: Brumovsky et al. (2009)

25

CAPITULO 3

“Antioxidantes”

26

3.1. Definición de términos generales

El término radical libre se refiere a cualquier especie química capaz de existir

independientemente de otras especies (por ello el término “libre”), y que posee uno o más

electrones desapareados. Son especies químicas altamente inestables y muy reactivas. Para

estabilizarse reaccionan rápidamente con moléculas adyacentes mediante reacciones de

oxido-reducción. Especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxigen Species, ROS en inglés) es

un término colectivo referido no solo a compuestos radicales que contienen oxígeno como el

radical hidroxilo (OH°); el radical superóxido (O2°-) y el radical óxido nítrico (NO°), sino

también a los compuestos derivados del oxígeno no radicales que son oxidantes y/o que se

convierten fácilmente en radicales libres como el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el ozono

(O3). La producción de ROS es una consecuencia normal de una serie de reacciones

bioquímicas esenciales para el organismo (propias del metabolismo biológico) y resulta en

daños biológicos cuando estas especies se hallan en concentraciones normalmente elevadas o

cuando las concentraciones de antioxidantes se hallan disminuidas (estrés oxidativo). El

término antioxidante hace referencia a cualquier sustancia que, estando presente a una

concentración más baja comparada con la de un sustrato susceptible al ataque de radicales

libres, es capaz de retrasar o prevenir la oxidación de dicho radical libre. Una especie

oxidante es aquella capaz de aceptar electrones y reducirse. Los agentes antioxidantes

exógenos son aquellos que se ingieren a través de la dieta. El estrés oxidativo es una

condición del organismo en la cual hay un desequilibrio oxidantes/antioxidantes, ya sea por

elevada concentración de ROS o porque las concentraciones de antioxidantes se hallan

disminuidas.

3.2. Antioxidantes y salud

3.2.1. Antioxidantes y patologías asociadas

Se estima que las células humanas producen por día 10.000 situaciones probables para

generar radicales libres o ROS (Ames, 1983), pero que en general estos son eliminados por

mecanismos que dispone el organismo, los que al fallar pueden dar lugar a que dichos

radicales libres ejerzan sus acciones nocivas sobre ciertas moléculas o procesos biológicos

generando diversas patologías (Figura 3.1). Los efectos biológicos de las ROS (disminución

de las defensas, daño celular con la posibilidad de producir cáncer, arteriosclerosis y

envejecimiento) son controlados en los seres vivos por una gama de mecanismos fisiológicos

27

de defensa antioxidante, que involucran a un complejo grupo de procesos, todos

encaminados a evitar el exceso de oxidación a nivel celular, que es en definitiva el causante

de los trastornos de salud. “Cuando predominan los compuestos agresores, se rompe el

equilibrio a favor de las sustancias pro-oxidantes, desencadenándose alteraciones en la

estructura celular y cambios en las reacciones metabólicas” (Cabrera-Silva, 2005). Con el

paso del tiempo, el proceso se hace crónico y se produce entonces el deterioro de los tejidos,

los órganos y luego del organismo, con lo que deviene la enfermedad.

Figura 3.1. Relación entre estrés oxidativo y enfermedad

Existen varios procesos patológicos atribuibles razonablemente al estrés oxidativo en

el organismo (Figura 3.2) como cáncer (Rao y Berk, 1992), diabetes (Kashiwagi et al.,

1996), enfermedades neurodegenerativas (Astley, 2003; Jiménez-Jiménez et al., 2006),

enfermedades cardiovasculares (Astley, 2003; Delgado Roche et al., 2009), enfermedades

relacionadas a la edad (Astley, 2003), entre otras (Atoui et al., 2005). Entre las enfermedades

neurodegenerativas se pueden nombrar alteraciones frecuentes y debilitantes como la

enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Huntington y la

esclerosis lateral amiotrófica.

Entre las principales alteraciones celulares y metabólicas producidas por el estrés

oxidativo se pueden nombrar: 1-destrucción de compuestos protectores del estrés oxidativo

(vitamina E, grupos tioles de péptidos o proteínas, vitamina C); 2-modificación de la

estructura del ADN celular produciendo mutaciones y daño celular; 3-alteraciones de las

reacciones enzimáticas a través de la destrucción de nucleótidos: cambios en el grupo tiol de

las enzimas y cambios en el

lipoperoxidación (o peroxida

debido a la presencia de ácido

radicales, dando lugar a reacc

celulares y sub-celulares (C

generado cerca de las membra

fosfolípidos de la membrana

el cual por lo general reaccio

(Figura 3.3). El radical peroxi

originar hidroperóxidos lípid

las membranas pudiendo prov

dañan a las proteínas de mem

y proteínas de transporte (Mo

Figura 3.

3.2.2. Mecanismos

La acción de los radic

mecanismos internos y para

RIÑONInsuficienrenal crón

PULMÓNAsma

ARTICULAReumatism

el estado redox de las coenzimas; 4-iniciación

idación de lípidos) principalmente en las me

idos grasos poli-insaturados, que reaccionan co

acciones en cadena que alteran la funcionalidad

(Cabrera-Silva, 2005). Por ejemplo cuando

branas celulares, ataca las cadenas laterales de

na originando un radical centrado en un carbon

ciona con oxígeno generando al radical peroxil

oxilo puede reaccionar con otra cadena lateral d

idos (Figura 3.3), los cuales son capaces de a

rovocar su ruptura además de producir product

embrana, inactivan receptores, dañan mecanism

ora, 2002).

.2. Patologías asociadas al estrés oxidativo

os internos contra la acción de los radicales l

dicales libres genera enfermedades que puede

ara fortalecer estos mecanismos, se deben pr

RL

CEREBROShock,

ParkinsonCORAZONCardiopatías,

trombosis,infarto

INTESTPancreatitis,

Sistema VasEsteroescle

hipertens

Sistema OcularCataratas,

retinopatías

MULTIORGANICADiabetes, HIV, intoxicaciones, inflamaciones

ONiencia rónica

ÓN

ACIÓNismos

PIELCancer

28

ión y desarrollo de la

membranas celulares

con facilidad con los

ad de las membranas

o el radical OH° es

de ácido grasos de los

ono de la membrana,

xilo (o peroxiradical)

del ácido graso para

e alterar la fluidez de

uctos cito-tóxicos que

smos de transducción

s libres

den ser frenadas por

proveer hábitos que

STINOtis, ulcera

a Vascularsclerosis, ensión

29

lleven a la formación de menor cantidad de radicales libres y una dieta que aporte nutrientes

esenciales antioxidantes (Tabla 3.1) y otros compuestos bioactivos denominados

fitoquímicos que, si bien no son esenciales para el organismo, presentan propiedades

saludables (Cabrera-Silva, 2005).

Figura 3.3. Formación de radicales

Tabla 3.1 Nutrientes protectores del estrés oxidativo y fitoquímicos con capacidad antioxidante

Nutrientes protectores del estrés oxidativo

Directos Vitamina E y C; β-caroteno

Indirectos Vitamina B2 (glutatión reductasa), Selenio

(glutatión peroxidasa), aminoácidos

azufrados (glutatión), cobre

(superoxidismutasa), manganeso

(superoxidismutasa), zinc

(superoxidismutasa)

Fitoquímicos con capacidad antioxidante presentes en los alimentos

Fitatos (cereales integrales, leguminosas), taninos (leguminosas, frutas), flavonoides

(frutas, verduras, leguminosas, infusiones de té), alilcisteína (ajos), compuestos azufrados

presentes en la familia de las crucíferas (coles, mostaza, coliflor, rábanos), licopeno

(tomates, sandias)

Fuente: Cabrera-Silva (2005)

30

La Sociedad Española de Ciencias de la Alimentación propone como recurso didáctico

una “rueda de los alimentos” (Figura 3.4) con el objetivo de informar sobre los alimentos

más ricos en antioxidantes y sus porciones diarias recomendadas. Existen diversos sistemas

de defensa para mantener el equilibrio ROS-antioxidantes y en diferentes niveles.

Básicamente existen dos líneas defensivas basadas en mecanismos antioxidantes: la primera

está compuesta por enzimas protectoras y el secuestro de iones metálicos y la segunda línea

está constituida por varias sustancias no enzimáticas como los tocoferoles, los carotenoides o

el ácido ascórbico (Cabrera-Silva, 2005; Mora, 2002). Las células poseen además otros

mecanismos no antioxidantes para remover el exceso de radicales libres del organismo,

como los mecanismos de reparación de ADN, de degradación de proteínas dañadas y de

metabolización de hidroperóxidos en las membranas (Gil, 2010a).

Figura 3.4. Rueda de los Alimentos (Fuente: web 1)

3.2.3. Principal sistema enzimático de defensa antioxidante

El principal sistema enzimático de defensa antioxidante está compuesto por un sistema

antioxidante enzimático integrado por las enzimas superoxidismutasa (SOD), catalasa (CAT)

y glutatión peroxidasa (GP). Para que este sistema sea eficiente es necesario que la SOD se

31

halle integrada a la acción de peroxidasas y catalasas que permitan la eliminación del agua

oxigenada (Cabrera-Silva, 2005).

La enzima SOD está presente en el organismo y actúa como inhibidora preventiva de

la oxidación lipídica catalizando la dismutación del anión superóxido (O2°-) en peróxido de

hidrógeno (H2O2) y O2, mediante el mecanismo descripto en la ecuación 3.1. Si bien el

peróxido de hidrógeno no es especialmente reactivo por sí solo, es un importante precursor

de otras sustancias radicales mas reactivas como el radical hidroxilo (°OH).

2O�°� + 2H

�� H�O� +O� 3.1

La remoción del radical superóxido (O2°-) y del H2O2 es importante por cuanto el

radical superóxido acelera por vía de la reacción de Fenton (Ec. 3.2a y 3.2b) la producción

del radical hidroxilo (°OH) a partir de moléculas de H2O2 e iones ferrosos (generados por la

acción del radical anión superóxido) (Cabrera-Silva, 2005; Gil, 2010a; Mora, 2002).

O�°� +Fe��X�

→ Fe��X� +O� 3.2a

Fe��X� +H�O�→ Fe��X� + OH° + OH� 3.2b

Las peroxidasas intervienen como primera estrategia defensiva cuando las

concentraciones de H2O2 son bajas y las catalasas (CAT) actúan cuando las concentraciones

de H2O2 son mayores. En las ecuaciones 3.3a y 3.3b se describen los mecanismos de

actuación de las nombradas enzimas, donde “D” corresponde a una molécula donadora de

átomos de hidrógeno (es decir representa a alguna molécula que se oxidó).

La peroxidasa más efectiva en este sistema de protección es la glutatión peroxidasa

(GP). Esta enzima cataliza la reducción del hidrógeno de los peróxidos lipídicos (LOOH) y

al peróxido de hidrógeno por medio del antioxidante glutatión (GSH) (GSH es el medio

reductor) el cual es convertido a glutatión oxidado (GSSG). El GSSG luego es nuevamente

reducido a GSH, reacción que es catalizada por la enzima glutatión reductasa en presencia de

la NADPH como agente reductor.

2H�O�� O� + 2H�O�Catalasa� 3.3a

H�O� + DH� ! � D + 2H�O�Peroxidasa� 3.3b

32

El secuestro de iones metálicos (potenciales catalizadores de oxidación) como

mecanismo de defensa se refiere principalmente al secuestro de los iones de hierro y cobre,

los cuales están ligados a las proteínas ceruloplasmina y transferrina respectivamente. Estas

proteínas actúan manteniendo los metales de transición en su estado de oxidación mas

inactivo, ya sea secuestrados o ligados de forma que en condiciones normales no existan

iones de hierro o de cobre libres en circulación (Mora, 2002).

3.2.3.1. Antioxidantes no enzimáticos

La segunda línea de defensa antioxidante está representada por una gama de

compuestos antioxidantes no enzimáticos los cuales intervienen directamente en la cadena de

formación de radicales libres, inactivándolos o dando lugar a la formación de un radical de

baja energía (Ec. 3.4). Su efectividad depende de sus propiedades químicas como las

energías de enlace, la posibilidad de formación de distintas formas resonantes del radical

formado y la susceptibilidad a la oxidación; esta última viene dada por el valor de su

potencial de reducción. Otro aspecto importante es la solubilidad en distintos medios ya que

los radicales responsables del deterioro lipídico se forman tanto en la parte lipofílica de las

células (ruptura de peróxidos o hidroperóxidos lipídicos) como en el citosol (peróxido de

hidrógeno, superóxido, etc) (Iglesias Neira, 2009)

R°+ AH→ RH + A° 3.4

Entre los antioxidantes de tipo hidrofílicos se destacan el ascorbato, los tioles y varios

tipos de compuestos nitrogenados mientras que los tocoferoles, la ubiquinona y los

carotenoides son los más importantes entre los de tipo lipofílico.

3.3. Antioxidantes y reacciones de oxidación en alimentos

En tecnología de alimentos, los antioxidantes son definidos como sustancias que

previenen o retardan la oxidación de las grasas responsable de la formación de compuestos

químicos que pueden afectar negativamente la calidad del alimento. Entre los principales

aspectos relacionados a la calidad del alimento que tienen relación directa con la oxidación

de lípidos están: calidad nutricional, toxicidad, “flavors” anómalos, textura y color (Finley y

Given, 1986; Huang et al., 2005). Es importante mencionar que la oxidación y la necesidad

de antioxidantes no está limitada a alimentos de alto tenor lipídico (aceites vegetales, grasas

33

animales, saborizantes, productos cárnicos procesados y productos snack) sino que incluye a

alimentos de bajo contenido lipídico como los cereales (Finley y Given, 1986).

3.3.1. Tipos de deterioro en lípidos

La oxidación de los lípidos constituye una de las principales causas de deterioro de los

alimentos. Tiene como consecuencias las alteraciones en el aroma, en el sabor

(enranciamiento), en el color (especialmente en el caso de los carotenos) y la textura, la

pérdida de determinados nutrientes (por ejemplo la vitamina E) y la formación de sustancias

potencialmente nocivas (Frankel, 1996). El grado de deterioro depende del tipo de grasa o

de aceite; en terminos generales, los lípidos que más fácilmente se afectan son los de origen

marino, seguidos por los aceites vegetales y finalmente por las grasas animales. El término

rancidez se usa para describir diferentes mecanismos de alteración de lípidos. Existen tres

mecanismos principales:

a-rancidez hidrolítica o lipólisis: se debe a la hidrólisis de grasas con liberación de

glicerol y ácidos grasos libres (R) (Ec. 3.5). Se origina generalmente por presencia de

humedad y de altas temperaturas, aunque también puede tener origen enzimático por acción

de las enzimas lipolíticas (lipasas) sobre el enlace éster (-(C=O)-R) de los triglicéridos. Si los

ácidos grasos generados son de cadena corta (como en la leche: ácido butírico (también

responsable del deterioro en manteca), ácido caproico, ácido caprílico y ácido láurico) se

producen olores peculiares y representan un deterioro sensorial del alimento. Si bien en

general la lipólisis es indeseable, hay alimentos donde es totalmente deseable, tal es el caso

de algunos quesos en los cuales se añaden lipasas microbianas o algunos microorganismos

con fuerte actividad lipolítica. Este tipo de deterioro también puede ocurrir en granos

almacenados que han sufrido calentamiento moderado o sostenido crecimiento de hongos

productores de lipasas capaces de producir rancidez hidrolítica en éstos. La forma usual de

prevenir este tipo de deterioro es mediante la inactivación de las enzimas mediante calor o

evitando el contacto del alimento con la humedad y el calor. La medición de este tipo de

deterioro se realiza mediante el índice de acidez de grasas (FFAV).

34

3.5

b-autoxidación o rancidez oxidativa: se refiere fundamentalmente a la acción del

oxígeno atmosférico (reacción espontánea) y de las lipoxigenasas (ver siguiente ítem) sobre

las insaturaciones de los ácidos grasos liberando compuestos peróxidos y compuestos

carbonilos volátiles (que luego pueden participar en reacciones de pardeamiento no

enzimático) de “flavor rancio”. Es la principal forma de oxidación de los lípidos. Recibe el

nombre de auto-oxidación pues es un mecanismo que genera compuestos que a su vez

mantienen y aceleran la reacción; entre los productos sintetizados se encuentran aldehídos,

cetonas y alcoholes; algunos de peso molecular bajo que le confieren el olor característico a

las grasas oxidadas, y otros cuya toxicidad todavía se halla en estudio. La presencia de hierro

y cobre (aun en concentraciones menores al 1 ppm) favorecen el inicio de la reacción; los

ácidos grasos libres solubilizan estos iones y facilitan su acción catalizadora pues provocan

un mayor contacto con el lípido. Los peróxidos provenientes de grasas oxidadas también

producen esta reacción, por lo que no es conveniente mezclar grasas usadas con grasas

frescas; la energía radiante del ultravioleta es también un importante agente que favorece

estos cambios.

Entre los compuestos formados por la oxidación de los lípidos los más abundantes son

los aldehídos, cuya composición cuali y cuantitativa está influenciada por la composición de

los ácidos grados originales. Gran parte de los aldehídos formados son muy volátiles y

poseen un bajo umbral de olfatación, por lo que provocan modificaciones importantes en el

aroma de los alimentos donde se forman, siendo los principales responsables del “flavor”

característico de muchos de ellos y en otros casos desencadenando la aparición de sabores y

aromas desagradables a rancio o a fritura, etc.

El proceso más importante por el cual el oxígeno atmosférico y los ácidos grasos

insaturados interactúan es por medio de un mecanismo de radicales libres caracterizado por

tres fases: iniciación, propagación y terminación (Barreiro et al., 2006).

35

i. reacciones de iniciación: Esta fase ocurre cuando el hidrógeno es removido de la

molécula de los ácidos grasos insaturados, por ruptura homolítica del enlace C-H dando

lugar a un radical libre lipídico (Ec. 3.6a y 3.6b). Los radicales libres lipídicos tienden a

estabilizarse mediante reordenamiento interno originando dienos conjugados.

ii. reacciones de propagación: Los radicales formados en la etapa de iniciación (L°)

pueden reaccionar con el oxígeno para formar radicales peróxido (LOO°) los cuales

inmediatamente forman hidroperóxidos (LOOH) y un nuevo radical lipídico al abstraer otro

hidrógeno a un ácido graso y propagando así la reacción en cadena (Ec. 3.6c).

Los hidroperóxidos generados también pueden fragmentarse por acción térmica o

descomponerse por la catálisis de metales de transición, lo que genera nuevos radicales que

autocatalizan el proceso de oxidación (Ec. 3.6d).

LH→ L°+ H° 3.6a

LH +O� → LOO° + H° 3.6b

LH +LOO°→ L° + LOOH 3.6c

LOOH→ LO° + °OH 3.6d

Este tipo de interacciones ocurren entre 10 y 100 veces antes de que se combinen dos

radicales para terminar el proceso. Se caracterizan por una cierta acumulación de peróxidos

lipídicos. Se crean tantos radicales libres como se consumen. Es la etapa de oxidación de los

ácidos grasos insaturados.

Los hidroperóxidos generados en esta etapa se caracterizan por ser insípidos e inoloros

y son denominados “productos primarios” de la oxidación lipídica.

iii. reacciones de terminación: Los radicales libres provenientes de la descomposición

de hidroperóxidos se asocian para formar productos no-radicales que no pueden formar parte

en las reacciones de la etapa de propagación (aldehídos, alcoholes, cetonas de bajo peso

molecular responsables del olor a rancio) (Ec. 3.7a y 3.7b) y son comúnmente denominados

“productos secundarios”.

36

L° +L°→ LL 3.7a

LOO° +L°→ LOOL 3.7b

Salvo al comienzo de la autoxidación, las reacciones de iniciación, propagación y

terminación se desarrollan simultáneamente (Graciani Constante, 2006).

Las pruebas de laboratorio más usuales para determinar la rancidez oxidativa son el

número de peróxidos, la prueba de Kreis y la prueba del ácido tiobarbitúrico.

c- reversión: se debe generalmente a la autoxidación del ácido linoleico; su

mecanismo es poco conocido. Es característico en aceites vegetales con un contenido

relativamente alto de ácidos no saturados (semilla de lino, soja, colza). Los sabores

"revertidos" se deben a aldehídos no saturados. Este tipo de deterioro tiene menos

importancia que los dos anteriores.

3.3.2. Oxidación lipídica por lipoxidasas

Las lipoxigenasas (en un principio conocidas como lipoxidasas) son un grupo de

enzimas muy heterogéneas presentes en algunos alimentos (legumbres, trigo, papas, rábanos,

carne de cerdo y pescado, oleaginosas etc), que poseen efecto prooxidante sobre algunos

ácidos grasos (Gutiérrez, 2000). Estas enzimas poseen en su estructura un átomo de Fe(II) y

catalizan en forma altamente específica la oxidación de los sistemas 1,4 pentadieno cis-cis

existentes en los ácidos linoleico, linolénico y araquidónico. Tambien puede afectar a los

estructuras carotenoides con la consigiente pérdida de valor nutricional y de propiedades

sensoriales. En su forma activa (en forma férrica) es capaz de remover un electrón de un

doble enlace no conjugado para convertirse nuevamente en su forma natural liberando un

radical catiónico. Se cree que su acción se inicia con la formación de radicales libres y luego

tienen lugar reacciones en cadena similares a las descriptas en el caso de la autoxidación.

Los mecanismos de formacion de hidroperóxidos serían diferentes a los mecanismos de

autooxidacion estudiados, ya que los productos secundarios que se originan son muy

distintos (Gutiérrez, 2000). Aun no se conocen con exactitud los mecanismos implicados en

el enranciamiento de lípidos por enzimas lipoxidasas.

Las lipoxigenasas son

Representan un factor de imp

a bajas temperaturas.

3.3.3. Oxidación lip

La formación de prod

posible mediante la adición d

acción del oxígeno es su form

pero para que esta vía ocurra

Una de las formas m

fotosensibilización, que consi

absorbedoras de luz (fotos

pigmentos naturales present

mioglobina.

La irradiación con luz

(sens) que pasan desde el est

3.8.a y 2.8.b). Luego las espe

energía directamente al oxíge

vez que alcanza el estado sing

una especie muy electrofílica

con los lípidos que el oxígeno

cadenas de los ácidos graso

2006; Cabrera-Silva, 2005).

on capaces de permanecer activas aun a b

mportancia en el deterioro de productos congela

lipídica fotosensibilizada

roductos de oxidación de lípidos (hidroperóx

n directa del oxígeno al doble enlace de los lípi

orma más estable, triplete, sobre la molécula li

ra es necesaria la excitación previa del oxígeno

s más comunes de generación del oxígeno

nsiste en un proceso activado por la luz en pres

tosensibilizadores) (Ec. 3.8.d). Los fotosen

entes en los alimentos tales como clorofila,

z visible produce la excitación electrónica del

estado fundamental a los estados excitados (1se

species del sensibilizador en estado triplete ex

ígeno triplete convirtiéndolo en oxígeno single

inglete mediante excitación electrónica, el oxíge

ica y excepcionalmente reactiva (reacción 1500

eno triplete) y se adiciona directamente a los do

sos dando lugar a hidroperóxidos alílicos (G

3.8a

3.8b

3.8c

3.8d

37

bajas temperaturas.

elados y conservados

róxidos) es también

ípidos (en lugar de la

a lipídica insaturada);

no al estado singlete.

eno singlete es por

resencia de sustancias

sensibilizadores son

la, feofitina, flavina,

del fotosensibilizador

sens° y 3sens°) (Ec.

excitado transfiere la

glete (Ec. 3.8.c). Una

ígeno se convierte en

500 veces más rápido

dobles enlaces de las

(Graciani Constante,

38

3.3.4. Pro-oxidantes en sistemas lipídicos

Para que la oxidación lipídica se inicie es necesaria la presencia de iniciadores que

catalicen el proceso: como energía (proporcionada por la luz o por calentamiento), y/o

presencia de metales o enzimas.

Los pro-oxidantes poseen la habilidad de reducir la estabilidad de los lípidos.

Muchas sustancias usadas como aditivos antioxidantes pueden ejercer un efecto

prooxidante. Ejemplos de ellos son la vitamina C, la cual ejerce un efecto antioxidante o pro-

oxidante según sea su concentración (Bradshaw et al., 2003; Rietjens et al., 2002; Yen et al.,

2002) o dada la presencia de metales pesados, los β carotenos a altas presiones de oxígeno

(Rietjens et al., 2002), los flavonoides en presencia de iones Cu+2 y Fe+3 (Rietjens et al.,

2002) y la quercetina, la miricetina y el kaemferol en presencia de metales de transición en

carnes curadas.

El hierro en presencia de peróxido cataliza la descomposición de los hidroperóxidos

dando lugar a la formación de nuevos radicales libres (Ec. 3.9a y 3.9b). En un sistema libre

de peróxidos, el Fe+2 reacciona con el oxígeno molecular dando lugar a nuevas especies

reactivas de oxígeno (Ec. 3.9c).

LOOH +Fe� → LO° + OH° +Fe� 3.9a

LOOH +Fe� → LOO° + H +Fe� 3.9b

O� +Fe�

→Fe� + O°�

� 3.9c

3.3.5. Efectos de la oxidación de lípidos en el alimento

3.3.5.1. Sabores oxidados

El efecto inmediatamente reconocible de la oxidación de los lípidos en los alimentos es

el desarrollo de olores y sabores indeseables. Los productos "rancios" de la oxidación de lí-

pidos son en su mayoría compuestos carbonílicos de cadena corta, formados como resultado

de la descomposición de los peróxidos. La aparición de “flavors” rancios en productos

lácteos se debe fundamentalmente a la auto-oxidación; por ejemplo en el caso de la leche

líquida, el sustrato está representado por los fosfolipidos y la reacción es catalizada por

vestigios de hierro o de cobre, en cambio en la leche en polvo la auto-oxidación afecta

fundamentalmente a los ácidos grados de los triglicéridos. Según Jayathilakan et al. (2007),

39

las papas, cuando son cocidas en agua a ebullición y luego almacenadas en frío, desarrollan

rápidamente un sabor no agradable como resultado de la actividad de la lipoxigenasa.

3.3.5.2. Pérdidas de vitaminas liposolubles y pigmentos

La oxidación de lípidos en alimentos ricos en vitaminas liposolubles (A, D, E y K)

suele ir acompañada de pérdidas en dichos compuestos por reacciones catalizadas que

involucran la presencia de radicales libres. La vitamina E, por ejemplo, actúa como

antioxidante y es consumida durante el período de inducción de las reacciones de auto-

oxidación (Pokorny, 1991). La oxidación de los lípidos puede afectar indirectamente el

color de los alimentos; un típico ejemplo lo constituyen los pigmentos carotenoides y

clorofilas por reacción con los hidroperóxidos.

3.3.5.3. Efecto sobre las proteínas

Los productos de la oxidación lipídica pueden reaccionar con las proteínas presentes

en el alimento provocando la polimerización de las proteínas con un significativo aumento

del peso molecular da las mismas (Berlett y Standtman, 1997; Zayas, 1997).

El mecanismo de interacción entre los lípidos oxidados y las proteínas implica la

propagación de la cadena de radicales libres al sistema proteico. Existen varios grupos en la

molécula de proteína capaces de convertirse en radicales libres mediante la pérdida de un

átomo de hidrógeno ante la acción de un radical libre de origen lipídico. Los radicales libres

de la proteína así formados tienden a combinarse por entre-cruzamiento. Se ha atribuido la

dureza en el pescado congelado a la agregación de moléculas de miosina como resultado del

ataque de radicales libres de lípidos oxidados. El sitio más vulnerable a dicho ataque, en la

molécula de proteína, parecería ser el grupo NH.

La interacción entre lípidos oxidados y proteínas afecta negativamente al valor

nutricional y a la funcionalidad de las proteínas en sistemas alimenticios debido a la

desnaturalización de las proteínas con la consiguiente disminución de su solubilidad y de su

capacidad de retención de agua, también es responsable de cambios texturales (“hardening

texture”). Entre los aminoácidos más vulnerables a los productos de la oxidación lipídica se

encuentran la metionina, la histidina, la cistina y la lisina (Richardson y Finley, 1985).

40

Mottram y Edwards (1983) sugieren que el flavor característico a carne tostada se debe

a la reacción entre las proteínas y los compuestos carbonílicos derivados de la oxidación de

los fosfolipidos.

La interacción entre las proteínas y los productos de la oxidación de los lípidos puede

determinar cambios en la textura. Según Decker (2000) los productos preparados con carne

que exhiben claros signos de rancidez oxidativa tienden a mostrar una baja habilidad para

moldearse y baja retención de agua.

3.3.6. Estrategias de control y retardo de la oxidación

Actualmente el diseño de estrategias de control de la oxidación lipidica en alimentos

constituye un aspecto muy importante desde el punto de vista comercial y de calidad

organoléptica (Iglesias Neira, 2009). Posibles estrategias a combinar son: reducción de la

actividad acuosa, uso de materiales pobres en lípidos poli-insaturados (las moléculas se

tornan más reactivas cuando existe un carbono metilénico entre dobles enlaces), protección

del alimento del contacto con el oxígeno (eliminación de la mayor parte del aire disuelto y en

el caso de aceites, disminución del espacio de cabeza del envase para limitar la entrada de

aire a través de su superficie, reemplazo del aire por gases no reactivos como nitrógeno o

dióxido de carbono, o finalmente realizando vacío; siempre acompañada esta estrategia por

un empaque que limite el ingreso de oxígeno) (Formanek et al., 2001; Lund et al., 2007),

inactivación de enzimas (especialmente lipoxigenasas), reducción de temperatura y agregado

de aditivos inhibidores de la oxidación (antioxidantes solos, combinados o en combinación

con agentes sinérgicos de la oxidación como el ácido cítrico o polifosfatos); eliminación de

trazas de elementos metálicos como Cu e Fe (propios del alimento, provenientes de aguas no

tratadas correctamente o de los equipos) por agregado de agentes quelantes (Frankel, 1996);

evitar la presencia de luz VIS-UV o IR (usando envases opacos) (Kim et al., 2002). En la

tabla 3.2 se presenta un resumen de los principales factores que influyen en la oxidación de

lípidos.

El agregado de aditivos antioxidantes a productos alimenticios ricos en grasas de

origen animal (excepto productos de la pesca) puede ser una estrategia muy útil dado que no

poseen (o poseen trazas) antioxidantes naturales (o endógenos); en cambio los aceites

vegetales comestibles, debido a la presencia de tocoferoles, disponen de una protección

41

natural frente a la auto-oxidación (siempre que el almacenamiento no sea demasiado

prolongado).

La autoxidación de lípidos en pescados puede ser una alteración muy importante

debido al alto grado de insaturación de sus lípidos (de 4 a 8 dobles enlaces) y a la presencia

de mioglobina muscular, la cual cataliza la auto-oxidación.

Tabla 3.2 Factores que influyen en la oxidación de lípidos

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Temperaturas bajas

Metales: Cu, Fe Agentes quelantes (o secuestradores)

Contacto con oxígeno atmosférico Atmosfera modificadas o controladas. Vacío

Presencia de luz VIS, UV o IR Empaque opaco

Peróxidos de lípidos oxidados Antioxidantes

Peroxidasas Tratamiento térmico

Poli-insaturaciones Hidrogenación de las insaturaciones

3.3.6.1. Concentración de oxígeno y oxidación de lípidos

En un sentido estricto la ausencia de oxígeno impediría la oxidación de los lípidos, ya

que el oxígeno es un reactivo imprescindible para la propagación de la reacción (Graciani

Constante, 2006). Estudios basados en cinética de absorción de oxígeno demostraron la

presencia de dos etapas características en el desarrollo de la oxidación: i- un período de

inducción, de duración variable, donde el consumo de oxígeno es muy bajo y tiene lugar la

formación de los hidroperóxidos a través de las reacciones de propagación, y ii- un período

caracterizado por un aumento brusco del consumo de oxígeno en el que se da un desarrollo

acelerado de la formación de nuevos compuestos de terminación. Desde el punto de vista de

la conservación del alimento, se debe aumentar al máximo el período de inducción (Graciani

Constante, 2006).

42

3.3.6.2. Actividad acuosa y oxidación de lípidos

La reducción de la actividad acuosa como método de conservación contempla otras

metas más allá del punto de vista microbiológico, ya que ejerce influencia en otras

reacciones de deterioro de alimentos tanto químicas como bioquímicas, entre ellas la

oxidación de lípidos.

Cuando la actividad acuosa (aw) es menor a 0,2 la velocidad de oxidación es muy

elevada. La sucesión de reacciones comienza con la generación de radicales libres y continúa

con la fijación de oxígeno sobre ellos dando lugar a peróxidos, los cuales se degradarán

formando compuestos carbonilo. A valores de aw muy bajos, al aumentar el contenido de

agua se evidencia un efecto antioxidante del agua, ya que las moléculas de agua se unen

mediante enlaces de puentes de hidrógeno a los peróxidos y además compiten con el oxígeno

por los lugares de adsorción en los lípidos.

A partir de valores de aw de aproximadamente 0,2 (cuando la interfase lipídica está

saturada de agua), el efecto antioxidante del agua ya no aumenta. La velocidad de los

procesos de oxidación presenta un mínimo en el rango 0,2 < aw < 0,5, ya que en este rango

gran parte de los peróxidos están unidos al agua e imposibilitados para continuar con las

reacciones de oxidación; la hidratación de los átomos metálicos dificultaría su acción

catalizadora sobre las reacciones de oxidación.

A valores de aw superiores a 0,5 la oxidación se acelera, ya que el efecto antioxidante

del agua se ve superado por el efecto catalizador de la oxidación de los metales, los cuales al

haber más agua disponible, difunden más fácilmente hacia los otros compuestos implicados

en la oxidación.

Cuando la aw es muy alta la velocidad de oxidación se lentifica un poco debido a un

efecto de dilución (Labuza, 1971)

En la figura 3.5 se puede observar la velocidad de oxidación de lípidos en función de la

actividad acuosa.

43

Figura 3.5. Velocidad de oxidación en alimentos según actividad acuosa y contenido de humedad (Fuente: adaptado de Labuza, 1971)

3.3.6.3. Temperatura y oxidación de lípidos

La disminución de temperatura reduce las tasas de oxidación de acuerdo a la ecuación

de Ahrrenius.

3.3.6.4. Aditivos antioxidantes y oxidación de lípidos

Además del rol de los antioxidantes como benefactores de la salud, estos se

desempeñan como aditivos alimentarios para prevenir o retrasar el desarrollo de

rancidez de grasas u otros deterioros de “flavor” debidos a la oxidación durante el

almacenamiento (exposición del alimento a factores como: aire, luz, temperatura, etc) o

durante el procesamiento (Pokorny, 1991). Sin embargo, se debe contemplar que la

utilización de antioxidantes, si bien retrasa la alteración oxidativa del alimento, no la

evita de una forma definitiva (Jacobsen et al., 2008).

En la elección de un aditivo antioxidante se deben considerar aspectos

económicos, de salud y normativos, entre los que se destacan:

1-capacidad de inhibir la oxidación lipidica, 2-inocuidad: el uso de antioxidantes

sintéticos está sujeto a normativas, por ejemplo el Código Alimentario Argentino (CAA)

especifica 200 mg/kg como límite máximo de los antioxidantes butil-hidroxianisol (BHA) y

butil-hidroxitolueno (BHT) agregados a aceites comestibles (CAA, 2000), 3-modificaciones

44

organolépticas del alimento (color, aroma, sabor), 4-deben ser efectivos a bajas

concentraciones para eludir sus niveles de toxicidad, 5-modo de incorporación del

antioxidante al alimento, pues su actividad no depende exclusivamente de las propiedades

químicas del mismo sino también de su accesibilidad o difusión hacia los puntos sensibles a

la oxidación (interfase aire/lípido si es un sólido graso o interfase lípido/agua si es una

emulsión); además la solubilidad del AO debe ser compatible con el estado físico del

sustrato lipídico sobre el que actuara (Iglesias Neira, 2009), 6-estabilidad del antioxidante

durante el almacenamiento y procesamiento y 7-el costo del antioxidante y su aplicación, ya

que no deben encarecer significativamente el precio del producto sobre el que se adiciona.

3.3.7. Clasificación de antioxidantes alimenticios

Según el mecanismo general de acción se clasifican en:

Antioxidantes de tipo I: Estas sustancias son capaces de interrumpir y detener la

reacción de propagación en cadena al reaccionar con los radicales libres, cediendo un radical

hidrógeno a un radical lipídico libre. Su forma de actuación puede representarse

esquemáticamente en la ecuación 3.10 donde el radical del ácido graso o del hidroperóxido

(R°) se transforma en una molécula y el antioxidante AH se transforma en el radical libre

(A°). La diferencia fundamental es que el radical libre del antioxidante no es lo

suficientemente reactivo para seguir dando lugar a reacciones de propagación, y se destruye

o se une a otro radical libre, dando entonces una molécula estable.

R° + AH→ RH + A° 3.10

Los antioxidantes de tipo I pueden ser fenólicos (artificiales: galato de propilo,

butilhidroxianisol y butilhidroxitolueno; o naturales) o no fenólicos (carotenoides; a su vez

pueden ser carotenoides o xantinas). En la tabla 3.3 se presentan algunas características de

los antioxidantes de tipo I.

Antioxidantes de tipo II: Son compuestos que impiden o disminuyen la formación de

radicales libres (Ec. 3.11). Su acción depende del pH y de la temperatura. Dentro de este

grupo se puede mencionar aminoácidos como la histidina y la cisteína y fosfatos. Son

secuestrantes de metales o reaccionan con el oxígeno. Potencian la acción de antioxidantes

de tipo I. Ejemplos: ácidos ascórbico, cítrico, láctico y sus derivados, EDTA (ácido

45

etilendiaminotetraacético y sus derivados: etilendiamono tetracetato cálcico disódico y

etilendiamono tetracetato disódico).

Tabla 3.3 Antioxidantes de tipo I

Antioxidantes tipo I fenólicos

Lipofílicos: tocoferoles y tocotrienoles Solubles en grasas y aceites, inestables a

altas temperaturas

Hidrofílicos: ácidos fenólicos, flavonoides

(antocianos) y taninos

Solubles en medios polares, inestables a

altas temperaturas

Antioxidantes tipo I no fenólicos: carotenoides

Carotenos Hidrocarburos formados únicamente por

átomos de carbono e hidrógeno

Xantofilas Presentan grupos oxigenados: alcoholes,

cetonas, aldehídos, ácidos carboxílicos y

ésteres

M� +H�Y + e�

→ MHY +H 3.11

Antioxidantes tipo III : están definidos como procedimientos destinados a proteger el

producto alimenticio frente a la oxidación estableciendo condiciones físicas adecuadas, en

especial en lo que respecta al contenido de oxígeno, luz, humedad y temperatura. Entre los

ejemplos que podrían citarse se destacan los embalajes impermeables al oxígeno y el

envasado al vacío o en atmosferas inertes con N2 o CO2. Se suelen asociar con antioxidantes

de tipo I y II.

3.3.8. Sinergismo entre antioxidantes

Para que exista un efecto sinérgico entre antioxidantes es necesario que el efecto

antioxidante de la combinación de ellos sea mayor a la suma de los efectos causados por

dichos compuestos por separado. Simbólicamente: (A + B) > A + B.

Para que exista un efecto antagónico entre antioxidantes es necesario que el efecto

antioxidante de la combinación de ellos sea menor a la suma de los efectos causados por

dichos compuestos por separado. Simbólicamente: (A + B) < A + B.

46

Para que exista un efecto de potenciación de un antioxidante, es necesario que el efecto

de dicho antioxidante en combinación con su potenciador sea mayor al efecto causado por

dicho antioxidante sin combinación. Simbólicamente: (A + P) > A.

Para que exista un efecto de inhibición de un antioxidante, es necesario que el efecto

de dicho antioxidante en combinación con su inhibidor sea menor al efecto causado por

dicho antioxidante sin combinación. Simbólicamente: (A + P) < A.

En muchas ocasiones, pero no en todas, la combinación de dos o más antioxidantes

presenta un efecto sinérgico (Miranova et al., 2008); por ejemplo el agregado de mezclas de

carotenoides resultan más efectivas que el agregado de dichos compuestos en forma

individual.

En algunas ocasiones el papel del compuesto sinergista consiste en regenerar el

antioxidante oxidado mediante una reacción redox que cataliza su paso al estado reducido

original. Esto es lo que ocurre entre la vitamina C y la vitamina E, cuando la primera

regenera a la segunda, así como entre el β-caroteno y la vitamina C.

La figura 3.6 ilustra el sinergismo típico entre los antioxidantes sintéticos BHA y BHT

en una grasa animal (Allen y Hamilton, 1994).

Figura 3.6. Sinergismo en una grasa animal típica, con (a) 0,02% de BHA, (b) 0,02% de BHT, (c) 0,01% de BHA + 0,01% de BHT (Fuente: adaptado de Allen y Hamilton,

1994)

47

3.3.9. Sustancias potenciadoras de antioxidantes/agentes quelantes

Los sinérgicos (SH) son sustancias que no tienen actividad antioxidante por si mismas,

pero benefician la actividad de los antioxidantes (AH) eliminando los radicales oxidantes

(A°) formados durante la reacción entre el radical peróxido (ROO°) y el antioxidante (AH) y

dando lugar a un nuevo radical libre S° menos reactivo. Las sustancias sinérgicas previenen

la descomposición de los peróxidos, retrasando así la aparición de los productos secundarios

de la oxidación lipidica responsables del deterioro sensorial del alimento. También pueden

actuar como secuestrantes o complejantes de iones metálicos, inhibiendo su acción pro-

oxidante (Cubero et al., 2002).

La concentración máxima permitida por el CAA para los sinergistas ácido cítrico,

ácido fosfórico, citrato de monoisopropilo y ésteres de monoglicéridos con ácido cítrico, en

aceites comestibles es de 100 mg / kg, aislados o mezclados (CAA, 2000).

A continuación se nombran los principales compuestos sinergistas de uso alimenticio:

Acido cítrico y citratos

Estos compuestos se desempeñan como sinérgicos de otros antioxidantes y como

agentes complejantes de iones metálicos catalizadores de la auto-oxidación lipídica. La

cantidad que se puede agregar es limitada dada su baja solubilidad en grasas y aceites

(Cubero et al., 2002).

Polifosfatos

Los polifosfatos se hallan representados en su mayoría por moléculas de carácter

alcalino. Si bien poseen poder secuestrante de iones metálicos, su eficacia está limitada por

el pH, siendo más eficiente en medios de baja acidez (Cubero et al., 2002).

Etilen-diamin-tetracetato de calcio y disodio

Este compuesto, más conocido por su sigla EDTA, presenta interés como sinérgico por

su acción complejante de iones metálicos altamente estables. En forma de sal sódica es más

soluble en agua que en su forma de ácido. Se usa como secuestrante con alta afinidad por el

hierro, plomo, cobre, zinc, etc.

3.3.10. Antioxidantes

Algunos de los antioxid

el butil-hidroxianisol (BHA),

(o ter-butilhidroquinona, TBH

(PG); sus estructuras química

Figura 3.7. Estru

El BHA y el BHT son

parafinas. Son considerados

aceites vegetales (Amerling, 2

como protectores del color y

no es volatilizable como el

horneado) por lo que suelen

con contenido graso (hornea

combinación debido al efecto

antimicrobiano frente a bacte

bacterias Gram negativas mie

(Cubero et al., 2002).

La TBHQ es muy poco

mejor antioxidante para las

vegetales (Pokorny, 2001),

horneado. Su uso no está auto

En los ésteres del ácido

dodecilo) la presencia de tre

responsables de su capacida

tes sintéticos

xidantes sintéticos más usados son compuesto

A), el butil-hidroxitolueno (BHT), la butil-hidr

BHQ) y los ésteres del ácido gálico como el

icas se muestran en la figura 3.7.

tructuras de los principales antioxidantes sin

on muy poco solubles en agua, pero solubles e

dos más efectivos en las aplicaciones a gras

g, 2001; Cubero et al., 2002), encontrándose tam

r y del aroma de aceites esenciales (Cubero et a

el BHT. Ambos son estables al calor (temper

en usarse como protectores de lípidos en prod

neados y fritos) (Cubero et al., 2002) y adem

cto sinérgico resultante (Pokorny, 1991). El BH

cterias Gram positivas y hongos y un efecto a

mientras que el BHT lo ejerce frente a C. botu

oco soluble en agua y muy soluble en lípidos.

las aplicaciones de fritura (Cubero et al., 2

), pero resulta poco eficaz en los procesos

utorizado en la UE, pero si en Estados Unidos.

ido gálico (como galato de propilo, galato de

tres grupos fenólicos los hace muy activos,

dad para formar complejos intensamente colo

48

stos fenólicos como

idroquinona terciaria

el galato de propilo

sintéticos

s en etanol, aceites y

rasas animales que a

también aplicaciones

et al., 2002). El BHA

peraturas de fritura y

oductos de confitería

emás son usados en

BHA ejerce un efecto

algo menor frente a

otulinum y S. aureus.

os. Es considerado el

2002) y en aceites

os de panificación u

de octilo y galato de

s, pero también son

oloreados (negruzco-

49

azulados) con algunos metales (especialmente hierro y cobre). Son poco estables a altas

temperaturas por lo que no son aptos para la protección del contenido lipídico de productos

de fritura y horneado. Al aumentar el peso molecular aumenta su solubilidad en grasas y

disminuye su solubilidad en agua. Presentan el fenómeno de reversión cuando superan

concentraciones de aplicación del 0,1% (Cubero et al., 2002). En la tabla 3.4 se presenta un

listado de los principales antioxidantes sintéticos de uso industrial.

Tabla 3.4 Listado de principales antioxidantes sintéticos de uso industrial

Nombre Origen Uso habitual en

Galato de propilo Síntesis artificial

Copos de cereales, chicles, purés de papa instantáneos, aperitivos, grasas y

aceites vegetales

Ácido eritorbico Síntesis artificial

Carnes en conserva

Eritorbato sódico Síntesis artificial

Carnes en conserva, mermeladas, confituras, jaleas, productos con huevos

Butilhidroxianisol (BHA) Síntesis artificial

Galletas, dulces, arroz aromatizado.

Butilhidroxitolueno (BHT) Síntesis

Artificial Chicles

3.3.11. Antioxidantes naturales

Al contrario de los antioxidantes sintéticos, los cuales se encuentran disponibles como

sustancias puras de composición perfectamente conocida y de aplicación directa, los

antioxidantes naturales se obtienen a partir de materias primas cuya composición varia con

diversos factores (manejo agronómico, variedad de la materia prima, condiciones climáticas,

grado de madurez, etc) y por lo tanto su contenido de sustancias bioactivas no es homogéneo

en el tiempo; se requeriría de determinaciones analíticas de cada lote para dosificar dicho

antioxidante antes de agregarlo al alimento. Además, al trabajar con antioxidantes naturales

se debe considerar que se trata de una mezcla de compuestos bioactivos y no bioactivos, y no

de sustancias puras.

La gran mayoría de los compuestos antioxidantes naturales que se usan actualmente en

la industria alimenticia no son estrictamente naturales, sino “idénticos al natural”. Esta nueva

denominación “idéntico al natural” significa que la estructura química del compuesto es la

misma que la del compuesto natural pero que dicho compuesto ha sido preparado por

50

síntesis, lo cual posibilita su presentación con un estado de relativa pureza, como cualquier

otro antioxidante sintético y su aplicación directa. A este grupo pertenecen aditivos como el

ácido ascórbico, los α-tocoferoles, los β-carotenos, etc (Ohlsson y Bengtsson, 2002).

Por otro lado muchos componentes con capacidad antioxidante son agregados como

ingredientes al alimento en su forma natural (o con pretratamientos mínimos: secado,

molido, etc) como es el caso de las hierbas (salvia, menta, romero, etc) y las especias

(orégano, nuez moscada, etc.), las cuales son reconocidas como sustancias GRAS

(“generally regarded as safe” o sustancias generalmente conocidas como inocuas). Especias

es el nombre dado a ciertos aromatizantes de origen vegetal, que se usan para sazonar los

alimentos. Técnicamente se considera una especia a las partes duras, como las semillas o

cortezas, de ciertas plantas aromáticas, aunque por similitud, muchas veces también se

engloba a las fragantes hojas de algunas plantas herbáceas, cuyo nombre real es hierbas. Al

ser ingredientes alimenticios aromáticos, su uso está restringido a alimentos que admitan ser

condimentados, tales como productos cárnicos y de confitería. El clavo de olor, el romero

(Rosmarinus officinalis L.) y la salvia (Salvia officinalis) resultan ser muy efectivos como

inhibidores de la rancidez oxidativa en productos cárnicos (Georgantelis et al., 2007;

Johnston et al., 2003; Nassu et al., 2003). En la tabla 3.5 se presenta un listado de los

principales antioxidantes naturales de uso industrial.

3.4. Breve descripción de algunos antioxidantes naturales

3.4.1. Tocoferoles (vitamina E)

La vitamina E pertenece al grupo de las vitaminas liposolubles y está conformada por

un grupo de 8 vitámeros. Su estructura consta de 2 partes primarias: un anillo complejo

cromano y una larga cadena lateral. Los 8 vitámeros se dividen en 2 grupos fundamentales

según sea la saturación de la cadena lateral: los tocoferoles (TF; poseen cadena saturada) y

los tocotrienoles (TT; poseen una cadena insaturada con 3 dobles enlaces) (Rodríguez,

1997) (Figura 3.8).

Dentro de cada grupo los vitámeros difieren en el número y posición de los grupos

metilo enlazados al anillo fenólico, designándose como α, β, δ y γ (Figura 3.9). Su acción

antioxidante disminuye de la forma delta a la forma alfa (Cubero et al., 2002).

51

Tabla 3.5 Antioxidantes naturales

Nombre Origen Uso habitual en Ácido láctico Bacteriano Arvejas, pepinos, alimentos infantiles,

bebidas carbonatadas, salsas de ensaladas, margarinas ligeras.

Ácido L-ascórbico

Síntesis artificial Bebidas frutales, productos congelados con huevos, derivados de papa deshidratada, jugos instantáneos deshidratados.

Ascorbato sódico Síntesis artificial Comidas preparadas. Ascorbato cálcico Síntesis artificial Embutidos. Palmitato de ascorbilo

Síntesis artificial Embutidos, extractos de caldo de pollo.

Tocoferoles de origen natural

Extractos de aceite de soja, germen de arroz y trigo, semillas de algodón

Postres preparados, aceites vegetales.

Tocoferol sintético

Síntesis artificial Embutidos.

Lecitina Granos de soja, maíz, maní y huevos

Postres cremas, yogurt, leche en polvo, chocolates, margarina, productos de pastelería.

Lactato de sodio Sal sódica de ác. Láctico Quesos. Lactato de calcio Sal cálcica de ác. Láctico Pasteles rellenos, empanadas, merengues. Ácido cítrico Frutas y hortalizas en conserva, sopas,

helados, pescado y mariscos congelados, bollería.

Citrato de sodio Síntesis artificial Quesos loncha, helados, bebidas carbónicas, vino, dulces.

Citrato de calcio Síntesis artificial Quesos, confiterías, vino, bebidas carbónicas.

Ácido L (+) tartárico

Síntesis artificial Confitería, jaleas, mermeladas, bebidas carbónicas.

Tartrato de sodio Síntesis artificial Confitería, jaleas, mermeladas, bebidas carbónicas.

Tartrato de potasio

Síntesis artificial Mermeladas, merengue de limón, pasteles variados.

Inicialmente el radical tocoferilo se forma al ceder a otro radical el hidrógeno

perteneciente al grupo fenólico (Figura 3.10). Su actividad antioxidante se debe a su

estructura fenólica, la cual permite estabilizar al radical tocoferilo resultante por

deslocalización electrónica a lo largo del anillo del electrón desapareado (estabilización por

resonancia).

Figura 3.8. Est

Figura 3

Los TF y TT son impo

las plantas verdes. Los TT so

tienen una actividad biológi

nutricional (Rodríguez, 1997)

Estructuras químicas generales de los tocofer

3.9. Estructura química de los tocoferoles

portantes constituyentes de las membranas de

son productos menos ampliamente distribuido

ógica más baja que los TF y, por lo tanto, m

7).

52

feroles

de los cloroplastos en

idos en la naturaleza;

, menor importancia

Constituyen el princi

mayoritariamente en la fase

bloqueadores de la reacción

También estabilizan a las RO

Dentro de los agentes

principalmente, el ascorbato

(regenera a la vitamina E po

selenio dependiente).

Figura 3.10. Estabilizació

3.4.2. Carotenoides

Constituidos por un gr

lipofílicos producidos por veg

licopeno y β-caroteno, zeaxan

encontrarse en sistemas acuos

ncipal antioxidante lipídico y en el orga

se lipídica de las membranas y lipoproteínas d

ón oxidativa en cadena, inhibiendo la lipopero

OS, como el radical superóxido y el oxígeno si

es reductores (regeneradores) de la vitamina

to (regenera a la vitamina E por vía no enzimá

por vía enzimática, enzima: hidroperóxido gl

ción por resonancia de un radical libre de tocDecker et al. (2000)

es

grupo que comprende alrededor de 600 comp

vegetales y algas. Algunos carotenoides dietari

xantina, astaxantina, cantaxantina y luteína (Fi

uosos enlazados a proteínas.

53

rganismo se hallan

s donde actúan como

eroxidación (LOO°).

singlete.

a E se han descrito,

mática) y el glutatión

glutatión peroxidasa

tocoferol. Fuente:

mpuestos coloreados

arios importantes son

(Figura 3.11). Pueden

Fig

Los carotenos así como

grupos oxidrilos) poseen un

dobles enlaces conjugados) q

de ROS y de otros agentes

peroxilo. Además son efect

cuales están involucradas en

singlete.

En el caso de la desac

diferente al mecanismo antio

no es capaz de abstraer un hi

une por adición al sistema c

carotenoide pierde su activ

reaccionar con otro radical

molécula de β-caroteno, o ata

el β-caroteno puede actuar co

muy sensible a la presión

presiones de oxígeno se pres

radical peroxil-lipídico, y RO

poco reactivo; ROO-Car-OO

radicales y ROO-Car-OO° es

Figura 3.11. Estructuras de carotenos

mo también sus oxi-derivados (xantofilas: carot

un sistema de deslocalización electrónica (sis

) que los hace muy efectivos en la desactivaci

es electrófilos, especialmente del oxígeno sing

ectivos desactivando moléculas excitadas ele

en la generación tanto de radicales como d

sactivación de radicales peroxilo, el mecanism

tioxidante de los compuestos fenólicos, ya que

hidrógeno de los carotenoides. Se cree que el

a conjugado de la molécula del carotenoide, l

ctividad (Ec. 3.12a). El radical formado (R

al para formar un producto estable (Ec. 3.1

atacar a un sustrato lipídico para generar otro r

como antioxidante o como prooxidante y su c

n de oxígeno. Los mecanismos propuestos p

resentan en las ecuaciones 3.12a-c y 3.12d,

ROO-Car° es un radical muy estabilizado por r

OOR es un precursor de oxidaciones con pro

es el radical peroxil-carotenoide.

54

rotenos que presentan

sistema extendido de

ación (“scavenging”)

singlete y del radical

electrónicamente, las

del propio oxígeno

ismo antioxidante es

ue el radical peroxilo

el radical peroxilo se

, luego de la cual el

(ROO-Car°) puede

3.12b), atacar a otra

o radical. Por lo tanto

u comportamiento es

s para bajas y altas

donde ROO° es el

r resonancia, es decir

productos finales no

Su efecto pro-oxidan

(mayores a 150 torr; Gil, 201

formación del radical peroxil

Los caroteonoides tam

atrapamiento (“quenching”) f

con mayor energia y se form

En el “quenching” físico, l

carotenoide produciendo oxíg

En este proceso el caroteno

fundamental o basal disipand

varios ciclos sobre otras m

química (“quenching” quím

carotenoides resulta ser de m

tasa total de “quenching” (Ec.

ante es observado ante presiones parciales

010a) mediante reacciones en cadena (Ec. 3.1

xil -carotenoide (Decker et al., 2000).

también pueden desactivar al oxígeno single

”) físico o químico. El oxígeno singlete es el e

rma en sistemas biologicos por reaciones de fo

, la energía del oxígeno singlete es transferid

xígeno molecular en su estado basal y caroten

no conserva su estructura química (es decir re

ndo la energia en forma de calor) y puede volv

moléculas de oxígeno singlete (Ec. 3.13a-b

ímico) por reacción química ente el oxíge

menor importancia, contribuyendo con meno

Ec. 3.13c).

55

3.12.a

3.12.b

3.12.c

3.12.d

es de oxígeno altas

.12d) y conlleva a la

glete a través de un

el estado del oxígeno

fotosensibiliazación.

erida directamente al

teno triplete excitado.

r regresa a su estado

olver a actuar durante

b). La inactivación

ígeno singlete y los

enos del 0,05% de la

3.13a

3.13b

3.13.c

3.4.3. Ascorbato

La vitamina C (o acido

fisiológicas se encuentra en

antioxidante se convierte en

(reducida) por el glutatión red

El ascorbato es un exc

procesos redox con radicales

ascorbato, que es relativamen

Las propiedades antioxidante

peróxidos lipídicos, en su cap

y en su capacidad para ne

superóxido) (Iglesias Neira, 2

de la vitamina E.

Figura 3

Dado que el ácido ascó

ésteres del ácido ascórbico co

Además de su capacida

dependiendo de su concentrac

iones férrico y cúprico, los cu

de oxígeno la formación de ra

acerca de cuál es la concent

ido o ascórbico) es una molécula hidrosoluble q

en su forma desprotonada (ascorbato). Una ve

en dehidroascorbato y es nuevamente llevado

reducido (Figura 3.12).

excelente agente reductor, ya que la pérdida

ales lipídicos da lugar a la formación del rad

ente estable debido a la deslocalización del ele

ntes del ascorbato se basan en su capacidad r

capacidad para quelar y neutralizar la acción ca

neutralizar ROS (especialmente oxígeno si

, 2009). También interactúa en la regeneración

3.12. Algunas estructuras de la vitamina C

scórbico como tal no es soluble en grasas, se u

con el ácido esteárico o con el ácido palmítico,

idad como antioxidante también puede actuar c

tración. Al ser un potente agente reductor es cap

cuales en su estado reducido (Fe+2 y Cu+1) cata

e radicales libres. Hay mucha controversia en la

entración a la cual el ascorbato actúa como

56

le que en condiciones

vez que actúa como

do a su forma activa

da de un electrón en

radical semi-dehidro-

electrón desapareado.

d reductora sobre los

catalítica de metales

singlete y radical

ión de la forma activa

e utilizan también los

co, que sí lo son.

r como pro-oxidante,

capaz de reducir a los

catalizan en presencia

la bibliografía hacer

o pro-oxidante (Gil,

57

2010a). Su actuación como pro-oxidante ocurre si la concentración de ascorbato es baja y la

concentración de metales en el medio es elevada.

3.4.4. Antioxidantes fenólicos

Los compuestos fenólicos son sustancias que presentan uno o más anillos aromáticos

(Figura 3.13), con al menos un sustituyente hidroxilo como elemento común en sus

estructuras moleculares, pudiendo incluir grupos funcionales como ésteres, metil ésteres,

glicósidos, etc (Duthie et al., 2000). Debido a su actividad antioxidante, representan uno de

los grupos de mayor interés desde un punto de vista tecnológico y nutricional (Berra et al.,

1995; Matos-Chamorro et al., 2010).

Figura 3.13. Ejemplos de estructuras fenólicas

La actividad antioxidante de los compuestos fenólicos se atribuye a su facilidad para

ceder átomos de hidrógeno de un grupo hidroxilo aromático a un radical libre y a la

posibilidad de deslocalización de cargas en el sistema de dobles enlaces del anillo aromático

(Duthie et al., 2003) (Figura 3.14). Poseen además una estructura química ideal para captar

iones metálicos (principalmente hierro y cobre) y por tanto para inhibir la formación de

radicales libres a través de reacciones de Fenton (Rice-Evans et al., 1997).

Los compuestos fenólicos constituyen una de las principales clases de metabolitos

secundarios de las plantas, en las que desempeñan diversas funciones fisiológicas, tales

como el crecimiento y reproducción de la planta y procesos defensivos frente a patógenos,

depredadores o radiación solar (Friedman y Jürgens, 2000). Sus cantidades y tipos varían en

función de la especie vegetal y variedad, parte de la planta considerada (frutos, semillas,

hojas, tallos, etc.), horas de exposición solar, grado de madurez, condiciones de cultivo,

58

procesamiento y almacenamiento, etc. En los alimentos, los compuestos fenólicos

habitualmente se presentan conjugados con azúcares como la glucosa, galactosa, arabinosa,

ramnosa, xilosa, o los ácidos glucurónico y galacturónico. También pueden unirse a ácidos

carboxílicos, ácidos orgánicos, aminas y lípidos (Duthie et al., 2003).

Figura 3.14. Deslocalización de cargas de los compuestos fenólicos

3.4.4.1. Clasificación general de compuestos fenólicos

Se han descripto más de 8000 estructuras fenólicas diferentes (Gil, 2010b). Dada su

diversidad estructural, no es posible una clasificación perfecta y exhaustiva. Se pueden

clasificar de varias maneras; una de las más usuales los clasifica en dos grandes grupos:

flavonoides y no flavonoides (Tabla 3.6).

A continuación se describen los principales grupos de compuestos fenólicos presentes

en los alimentos vegetales.

a-No flavonoides: Los compuestos fenólicos no flavonoides incluyen dos grandes

familias: los ácidos fenólicos y los estilbenos.

Ácidos fenólicos: Los ácidos fenólicos se caracterizan por la presencia de un solo

anillo bencénico en su estructura. A su vez se subdividen en dos grupos: los derivados del

ácido p-hidroxibenzoico y los derivados del ácido cinámico (Figura 3.15 y Tabla 3.7).

59

Tabla 3.6 Clasificación de compuestos fenólicos

Compuestos

fenólicos

No

flavonoides

Ácidos fenólicos y

sus derivados

Derivados del ácido benzoico

Derivados del ácido cinámico

Estilbenos

Flavonoides

Flavanoles

Flavonoles

Flavonas

Flavononoles

Antocianidinas

Flavanonas

Isoflavonas

Leucoantocianidinas

Taninos

Figura 3.15. Estructuras químicas de los ácidos fenólicos

Tabla 3.7 Estructura química de los ácidos fenólicos

Principales ácidos hidroxibenzoicos R1 R2

Principales ácidos hidroxicinámicos R1 R2

Ác. p-

hidroxibenzoico H H Ác. p-cumárico H H

Ác. gálico OH OH Ác. Cafeico OH H

Ác. siríngico OCH3 OCH3 Ác. Ferúlico OCH3 H

Ác. protocatecuico H OH

Ác. vaníllico H OCH3

60

Los ácidos benzoicos o derivados del ácido p-hidroxibenzoico tienen una estructura

básica C6-C1. Los principales son los ácidos gálico, salicílico, p-hidroxibenzoico,

protocatécuico, vaníllico y siríngico. Generalmente se presentan de forma conjugada en los

vegetales, aunque pueden ser detectados en forma libre en algunas frutas o tras su liberación

como consecuencia del procesamiento. El ácido gálico se puede encontrar conjugado como

tal o como sus dímeros (ácido elágico), trímeros (ácido tergálico) o tetrámeros (ácido

galágico), los dos últimos menos frecuentes. Generalmente los contenidos en estos ácidos

son bajos a excepción de las frutas rojas (Manach et al., 2004).

Los ácidos de la serie cinámica, los ácidos cinámicos, tienen una estructura básica C6-

C3 y raramente se hallan en su forma libre, en general se presentan predominantemente en

forma esterificada con ácido quínico, tartárico o glucosa (ésteres hidroxicinámicos): así el

ácido cafeico se halla esterificado con el acido quínico para dar lugar a los ácidos:

clorogénico, isoclorogénico, neoclorogénico y criptoclorogénico (Figura 3.16) (Castillo

García y Martínez Solís, 2007). Los ácidos cinámicos más comunes son los ácidos cafeico,

ferúlico, sinápico y p-cumárico. El ácido cafeico, libre o esterificado, constituye el ácido

fenólico más abundante en muchas frutas (Manach et al., 2004).

Figura 3.16. Estructuras químicas del ácido quínico, de ácidos hidroxicinámicos y de mono-ésteres hidroxicinámicos

Estilbenos: Se caracter

conformado por dos ciclos

eventualmente etileno. Su e

distribución en alimentos veg

con mayor interés nutriciona

(resveratrol-3-O-b-D-glucósi

Figura 3

Tabla 3.8

Principales

Resve

Astrin

Picet

b-Flavonoides

Este gran grupo supone

conformados por una gran div

y solubles en agua. Los flavo

libres o unidos a azúcares form

como sulfatos y algunas vece

con más frecuencia a las geni

glucosa, D-galactosa, L-ram

pueden ser de dos clases: c

(enlace hemiacetal) como O

C-C, como C-glicósidos. Las

veces se encuentran varias cla

Su estructura se caracte

fenil-benzopirona (Figura 3.1

terizan por poseer un esqueleto básico de 14 car

s bencénicos unidos generalmente por una c

estructura química general se presenta en l

vegetales no es muy amplia (Scalbert et al., 200

onal son el resveratrol (3, 5, 4’-trihidroxiestilb

sido), presentes en uvas y vinos (Figura 3.17 y

a 3.17. Estructura química de los estilbenos

8 Estructuras de los principales estilbenos

les estilbenos R1 R2

sveratrol OH H

tringina O-glucosa OH

cetanol OH OH

ne la mitad de los compuestos fenólicos prese

diversidad de compuestos, siendo todos compu

vonoides se encuentran en los tejidos vegetales

formando glicósidos (la mayoría de las veces, co

ces como dímeros y polímeros. Los azúcares qu

eninas (estructura no glucídica, también llamad

amnosa, L-arabinosa, D-xilosa y D-glucurónic

: con los carbohidratos ligados a través de á

O-glicósidos; o con los carbohidratos ligados

as antocianinas por su parte se encuentran com

clases de flavonoides en un mismo tejido veget

acteriza por un esqueleto de 15 carbonos (C6

.18); es decir formada por dos anillos bencénic

61

carbonos (C6-C2-C6)

cadena de etanol o

n la figura 3.17. Su

2000). Los estilbenos

tilbeno) y el piceido

y Tabla 3.8).

R3

OH

OH

OH

sentes en las plantas,

puestos polifenólicos

les como flavonoides

, como O-glicósidos),

que aparecen unidos

ada aglicona) son D-

nico. Los glicósidos

átomos de oxígeno

os a través de enlaces

mo sales. Muy pocas

getal.

6-C3-C6) de tipo 2-

nicos (A y B) ligados

a través de un anillo hetero

posición 4; Figura 3.19). Los

y los del anillo B desde el 2 a

patrones de sustitución (es de

el anillo C.

Figura

Figur

.

Figura 3.20.

Tal como se muestra en

de su estructura química en:

Flavanoles: poseen un g

Flavonoles: poseen un

anillo C y un doble enlace ent

rocíclico C de pirano o pirona (si tiene un d

os átomos de carbono en los anillos C y A se n

2 al 6 (Figura 3.20). Esta estructura básica perm

decir múltiples adiciones de grupos funcionale

ra 3.18. Estructura de 2-fenil-benzopirona

ura 3.19. Estructura del anillo de pirano

. Numeración de los anillos de los flavonoid

en la figura 3.21, los flavonoides pueden clas

n grupo hidroxilo en posición 3 del anillo C. Ej

un grupo carbonilo en posición 4, un grupo -OH

entre los carbonos 2 y 3 del anillo C. Ejemplo: q

62

n doble enlace en la

e numeran del 2 al 8,

rmite una multitud de

ales) y variaciones en

oides

lasificarse en función

. Ejemplo: catequina.

OH en posición 3 del

o: quercetina.

63

Figura 3.21. Estructuras de flavonoides y ejemplos

Un derivado frecuente

agrupada como flavonol glic

rutinosa, formado por una ra

enlace glicosídico de tipo (1

quercetina.

Figur

Flavonas: poseen un g

hidroxilo en posición C3. Eje

Flavononoles: poseen

posición 3 del anillo C y no p

Flavanonas: poseen un

hidroxilo en posición C3 y no

Isoflavonas: poseen el

de tenerlo en la posición 2.

anillo C. Existen 230 tipos de

Antocianidinas: posee

poseen un doble enlace ent

glicosidadas, los azúcares se

menos frecuencia puede apar

galactosa, ramnosa o arabinos

nte de la quercetina es la rutina (Figura 3.2

glicosidado cuya glicona es un disacárido red

ramnosa (6-desoxi-L-manosa) unida a una glu

(1β-α6) y cuya aglicona o genina es un flav

gura 3.22. Estructura química de rutina

grupo carbonilo en posición 4 del anillo C y

jemplo: luteolina.

en un grupo carbonilo en posición 4 y un

o presentan doble enlace entre los carbonos 2 y

un grupo carbonilo en posición 4 del anillo C,

no presentan el doble enlace entre los carbonos

el anillo bencénico B en la posición 3 del anill

2. Además poseen un doble enlace entre los c

de isoflavonas.

een un grupo hidroxilo en posición 3 del ani

entre los carbonos 3 y 4 del anillo C. En

se unen generalmente al hidroxilo en posición 3

arecer unida en posición 5 ó 7. Los azúcares p

nosa, y pueden presentar diversas acilaciones .

64

.22); químicamente

reductor denominado

glucosa mediante un

flavonol denominado

y carecen del grupo

n grupo oxidrilo en

y 3 del anillo C.

C, carecen del grupo

os 2 y 3 del anillo C.

illo central C, en vez

s carbonos 2 y 3 del

anillo C pero además

n las antocianidinas

n 3 de la genina. Con

s pueden ser glucosa,

65

Leucoantocianidinas: poseen estructura equivalente a la de los flavanoles pero con un

grupo hidroxilo adicional en la posición 4 del anillo C (Gil, 2010b).

Taninos: representados por los polímeros fenólicos de pesos moleculares

comprendidos entre 500 y 3000 daltons. Además de presentar propiedades típicas de

polifenoles, precipitan a los alcaloides, y a ciertas proteínas como la gelatina. Según si la

polimerización es entre moléculas elementales y otras, se tienen los taninos hidrolizables y

los taninos condensados. El nombre de taninos condensados tiende a ser sustituido en la

actualidad por el de procianidinas o proantocianidinas según liberen, respectivamente,

antocinidinas o cianidinas por hidrólisis ácida (Gil, 2010b).

3.5. Polifenoles en yerba mate

Los compuestos polifenólicos presentes en los extractos de yerba mate se hallan

representados mayoritariamente por compuestos del grupo de los ácidos hidroxicinámicos,

principalmente derivados de ácidos hidroxicimanoilquínicos (Figura 3.23, Tabla 3.9): i-

Mono-ésteres de ácido quínico con ácido cafeico: específicamente isómeros del ácido

cafeoilquínico: ácido 5-o-cafeoilquínico (ácido clorogénico), ácido 3-o-cafeoilquínico (ácido

neoclorogénico) y ácido 4-o-cafeoilquínico (ácido criptoclorogénico); ii- Di-ésteres de ácido

quínico con ácido cafeico: específicamente isómeros del ácido di-cafeoilquínico

representados por los ácidos 3,4 dicafeoilquínico, 3,5 dicafeoilquínico (ácido

isoclorogénico) y 4,5 dicafeoilquínico y es posible pero no está confirmada la presencia del

ácido 1,5 dicafeoilquínico (cinarina) (Bravo y Angus, 2007; Cardozo et al., 2007; Carini et

al., 1998; Filip et al., 2001; Heck y Mejía Gonzalez, 2007).

Entre los isómeros hidroxicimanoilquínicos minoritarios se encuentran algunos

isómeros del ácido feruloilquínico, y del ácido p-coumarilquínico; y no se reportó ácido

cafeico libre.

En promedio según Bravo y Angus (2007), los isómeros del ácido cafeoilquínico

representan el 53 % del contenido de polifenoles totales (CPT) en yerba mate elaborada

mientras los isómeros del ácido di-y tri-cafeoilquínico representan el 37,5% representando

en forma conjunta el 90 % del CPT y aproximadamente 77 mg por g de materia seca. La

gran mayoría de los estudios de yerba mate se basan en yerba mate elaborada.

El grupo de los ácid

derivados del ácido gálico

antioxidante.

A la presencia de los m

atribuye una probada activida

Gonzalez, 2004), igual o

antioxidante como el ácido a

compuestos del grupo de los á

más antioxidantes de la serie,

Figura 3.23. Estruc

Tabla 3.9 Estructura de lo

Principales

Ácido 3,4 dic

Ácido 3,4 dic

Ácido 3,4 dic

Entre los flavonoides p

derivados de la quercetina (ru

CPT (Bravo y Angus, 2007; C

Es posible que los com

contribuyan al sabor del mate

los principales compuestos re

que el ácido cafeico contribuy

cidos hidroxibenzoicos únicamente se halla

co y del ácido siríngico, reconocidos por s

s mencionados isómeros del ácido hidroxicin

idad antioxidante in vitro (Bravo y Angus, 2007

o superior a la de sustancias reconocidas

o ascórbico y la vitamina E. Según Liu et al

s ácidos hidroxicinámicos, los derivados del ác

ie, tanto en sistemas biológicos como alimentic

ructura de los principales di-ésteres hidroxic

los principales compuestos di-ésteres hidroxácido caféico)

es compuestos R1 R2

dicafeoilquínico CA CA

dicafeoilquínico CA H

dicafeoilquínico H CA

s presentes se destacan dos grupos de flavonole

(rutina) y los derivados de kaempferol, represe

; Carini et al., 1998; Cardozo et al., 2007; Filip

ompuestos fenólicos conjuntamente con las xa

ate (Schneider et al., 2006). En el caso del café

s responsables de la astringencia es el ácido clo

buye al sabor amargo (Variyar et al., 2003).

66

lla representado por

r su baja capacidad

cinamoilquínico se le

007; Chandra y Mejía

as por su actividad

al. (2009), entre los

ácido cafeico son los

ticios.

xicinámicos

oxicinámicos (CA:

R3

H

CA

CA

oles glicosidados: los

esentando el 5 % del

lip et al., 2001).

xantinas y saponinas

fé se sabe que uno de

clorogénico mientras

67

SECCION III

DESARROLLO

68

CAPITULO 4

“Adaptación de técnicas analíticas”

69

4.1. INTRODUCCIÓN

4.1.1. Complejidad en la estandarización de una metodología universal

En los últimos años se publicaron varias revisiones sobre métodos de medición de

capacidad antioxidante (CAO) (Joon-Kwan y Takayuki, 2009; Niki, 2002; Prior et al., 2005;

Sanchez-Moreno, 2002). No existe un método simple y universal para cuantificar la CAO

con precisión (Prior et al., 2005) dado que el tema de antioxidantes es un tópico de alta

complejidad y cada alimento particular es una matriz compleja en la que generalmente se

hallan involucrados sistemas multi-fases.

Dentro de un mismo sistema alimenticio, un determinado antioxidante puede actuar

por múltiples mecanismos o por mecanismos específicos diferentes según sean las

condiciones del medio de reacción (matriz alimenticia + condiciones ambientales) y además

su respuesta no es la misma para todas las fuentes oxidantes. Un ejemplo citado por Prior et

al. (2005) lo constituyen los carotenos, los cuales, comparados con los (poli)fenoles, son

pobres antioxidantes ante radicales peróxidos pero son excepcionales agentes atrapadores

(“quenching agents”) de oxígeno singlete (ver apartado 3.4.2).

Hay quienes sostienen que el enfoque in vitro es insuficiente, siendo indispensable

realizar evaluaciones biológicas.

Entre las diversas propuestas que apuntan a solucionar este problema, una de las que

goza de bastante aceptación es la de combinar varios ensayos in vitro y crear luego algún

tipo de escala que refleje con mayor precisión el poder antioxidante real de las sustancias o

productos (Sun, 2007).

4.1.2. Mecanismos de reacción de los antioxidantes

Según revisiones relacionadas (Huang et al., 2005; Prior et al., 2005), un antioxidante

puede actuar mediante dos principales mecanismos principales: de transferencia de átomos

de hidrógenos o protones (HAT, Hydrogen Atom Transfer, por sus siglas en inglés) (Ec. 4.1)

y de transferencia de electrones (SET, Single Electron Transfer, por sus siglas en inglés) (Ec.

4.2a - 4.2d).

En los métodos basados en la transferencia de hidrógeno se mide la habilidad de un

compuesto antioxidante (AH) de atrapar radicales libres por donación de un átomo de

70

hidrógeno, basándose en competiciones de tipo cinéticas. Estos métodos generalmente

involucran a una sustancia antioxidante, a un generador de radicales libres y a una sustancia

oxidable (Huang et al., 2005). De acuerdo con Prior et al. (2005), las reacciones que

involucran transferencia de átomos de hidrógeno son independientes del solvente y del pH y

por lo general son rápidas; además la presencia de agentes reductores incluidos los metales,

representa una complicación para este tipo de métodos.

X° + AH→ XH + A° 4.1

X° + AH→X� + AH° 4.2a

AH°-.� �� A° + H�O°

4.2b

X� +H�O

→ XH +H�O 4.2c

M�III� + AH→ AH + M�II� 4.2d

Los métodos basados en la transferencia de electrones detectan la habilidad de una

sustancia para transferir un electrón y provocar la reducción de un compuesto (metálicos,

carbonílicos y radicales). Las reacciones basadas en la transferencia de electrones son

generalmente lentas y requieren tiempo para lograr el estado estable; por esta razón la

cuantificación de CAO se realiza por lo general en porcentajes de productos más que por

consideraciones cinéticas (Prior et al., 2005).

Los mecanismos HAT y SET ocurren en simultáneo en todos los casos, con la balanza

determinada por el pH y la estructura del compuesto antioxidante (Prior et al., 2005). Las

condiciones en que predominan cada tipo de mecanismos se detallan en la tabla 4.1.

Tabla 4.1. Condiciones para cada tipo de mecanismos de reacción

Mecanismo prevalente

∆ potencial de ionización

Energía de disociación de enlace del grupo donador de H

HAT < - 36 Kcal/mol ~ - 10 Kcal/mol

SET > - 45 Kcal/mol

Fuente: Prior et al. (2005).

71

4.1.3. Pruebas químicas in vitro de medida de la actividad antioxidante en

sistemas alimenticios

Existen numerosos métodos de medición de la actividad antioxidante total en muestras

biológicas y alimentos; los mismos difieren en términos de sustratos, patrones, fuentes de

radicales libres, condiciones de reacción y metodología de cuantificación. Generalmente se

basan en la captación o secuestro de radicales libres generados en la mezcla de reacción

mientras que otros están basados en la reducción de iones metálicos tales como el Fe(III) o el

Cu(II) (Prior et al., 2005; Sánchez-Moreno, 2002; Schlesier et al., 2002). Los generadores de

radicales peroxilo más usados son los compuestos azo termolábiles: i- 2,2´-azobis (2-

amidinopropano) dihidrocloruro (AAPH) y ii -el azo-compuesto 2,2'-azobis-(2-

amidinopropano) hidrocloruro (ABAP), ambos solubles en agua y el 2,2´-azobis (2,4-

dimetilvaleronitrilo) (AMVN), liposoluble; los cuales por calentamiento generan los

radicales libres en cuestión a una velocidad constante.

Como se puede apreciar en muchos estudios relacionados a la temática, los datos a

menudo son cruzados con el contenido de polifenoles totales de las muestras, determinados

como equivalentes de ácido gálico, ya que la respuesta de este compuesto representa la

respuesta media de los principales compuestos polifenólicos en frutas y vegetales (Georgé et

al., 2005).

Sin embargo, cada vez es más frecuente recurrir a técnicas de separación acopladas a

sistemas de detección como el arreglo de diodos (DAD) o la espectrometría de masas (LC-

MS). Dichas técnicas permiten medir de mejor manera la actividad antioxidante y asignarla a

un grupo específico de compuestos (Bravo y Angus, 2007).

En las siguientes secciones se describen brevemente algunos de los métodos más

comúnmente utilizados para la medición de la CAO in vitro de compuestos químicos,

alimentos y muestras biológicas puntualizando el mecanismo de reacción, el tipo de radical

evaluado, y sus principales ventajas y desventajas (Tabla 4.2). Estos métodos no son

alternativos, sino más bien complementarios.

72

Tabla 4.2 Comparación de métodos para medición de capacidad antioxidante

Ensayo Simplicidad Equipos Mecanismo Relevancia biológica

ORAC ++a --- HAT +++

TRAP ---b --- HAT +++

FRAP +++ +++ SET --

CUPRAC +++ +++ SET

TEAC + +++ SET -

DPPH + +++ SET - a +, ++, +++ = nivel de puntuación positiva de la característica; b -, --, --- = nivel de puntuación negativa de la característica.

4.1.3.1. Métodos basados en mecanismos de transferencia de átomos de

hidrógeno

Los métodos basados en mecanismos de transferencia de átomos de hidrógeno por lo

general consisten en poner en contacto un generador sintético de radicales más moléculas

oxidables que actúen como sonda, más un antioxidante.

Entre los métodos más usados, basados en un mecanismo de tipo HAT, se destacan los

métodos: i- método de la capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC), ii-

método del potencial antioxidante total (TRAP) y iii-método de decoloración del β-caroteno.

Los dos primeros miden la habilidad de un antioxidante para secuestrar radicales peroxilos

por transferencia de un átomo de hidrógeno.

Capacidad de absorción de radicales de oxígeno

Este método conocido como ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity, por sus

siglas en inglés) consiste en mezclar un sustrato oxidable fluorescente con algún generador

de radicales peroxilos (generalmente compuestos iniciadores azo, por ejemplo el AAPH) y

medir la pérdida de fluorescencia. La intensidad de la fluorescencia disminuye a medida que

avanza la oxidación. Los antioxidantes protegen al compuesto fluorescente de la oxidación.

Los tiempos de monitoreo usuales rondan los 35 min luego del agregado del generador de

radicales. El grado de protección antioxidante se mide en un fluorímetro disponible

comercialmente. La capacidad antioxidante se calcula como el área entre las dos curvas de

73

decaimiento de la fluorescencia (intensidad de fluorescencia vs tiempo) (con y sin

antioxidante; Figura 4.1), y los resultados de este método suelen ser expresados en unidades

de Trolox equivalentes (TE).

Figura 4.1. Actividad antioxidante de una muestra mediante el ensayo ORAC expresada como el área neta debajo de la curva (AUC). (Fuente: adaptado de Prior et

al. (2005))

Este método ha sido adoptado por el Departamento Federal de Agricultura de

Norteamérica para medir el potencial antioxidante total de alimentos y suplementos

nutricionales. Con el tiempo se han propuesto varias modificaciones y variantes, como por

ejemplo el método ORAC-EPR (Kohri et al., 2009), que utiliza la resonancia paramagnética

electrónica.

Entre los sustratos oxidables fluorescentes más usados están la fluoresceína (FL; 3´,6´-

dihidroxispiro [isobenzofuran-1[3H],9´[9H]-xanten]-3-ona) (ORAC-FL), el rojo de

pirogalol (ORAC-PGR) o la diclorofluoresceína (H2DCF-dA; diacetato de 2´,7´-

diclorodihidrofluorescein) (ORAC-H2DCF-dA). Inicialmente se usaba como sustrato

oxidable una proteína denominada ficoeritrina (PE) pero la misma presenta ciertos

inconvenientes: varía de lote a lote, no es fotoestable y se puede decolorar tras su exposición

a una luz de excitación, es capaz de interaccionar con polifenoles dando lugar a valores

74

erróneos; actualmente es reemplazada por la FL la cual no interacciona con polifenoles, es

fotoestable y reduce los costos del experimento.

En el ensayo ORAC-FL, los tiempos de inducción están fuertemente influenciados por

el número de grupos fenólicos presentes en la muestra, mientras que en el ensayo ORAC-

PGR, dichos tiempos prácticamente no se observan y el decaimiento de la absorbancia se ve

influenciado principalmente por la reactividad de los fenoles de la muestra. Recientemente,

se ha planteado que ambos índices ORAC (FL y PGR) son complementarios y su relación es

un mejor indicador de la calidad promedio de los antioxidantes de una muestra (Poblete et

al., 2009).

Este método es especialmente útil para alimentos, suplementos alimentarios y sistemas

biológicos que contienen varios ingredientes con capacidad antioxidante rápida y lenta, y

puede ser adaptado para medición de antioxidantes tanto hidrofílicos como lipofílicos

variando el generador de radicales y el solvente (Davalos et al., 2004; Huang et al., 2002;

Prior et al., 2003). Además en él se han introducido modificaciones que permiten medir el

efecto de antioxidantes sobre otras especies reactivas del oxígeno y nitrógeno dando origen a

variantes para los radicales hidroxilo (HORAC), peroxinitrito (NORAC) y anión superóxido

(SORAC).

Numerosos estudios consideran que ciertos ensayos como el ORAC poseen ventajas

comparativas en relación al resto (Ou et al., 2001). Es un método que actualmente se

encuentra automatizado aunque requiere de equipo relativamente sofisticado y es muy

sensible a la temperatura.

Potencial antioxidante total

Este método conocido como TRAP (Total Radical-Trapping Parameter, por sus siglas

en inglés) fue desarrollado para medir el estado antioxidante del plasma humano contra

radicales peroxilo.

Mide la capacidad de un antioxidante de interferir en la reacción entre radicales

peroxilos (ROO°) y un sustrato oxidable (usualmente: el compuesto fluorescente R-

ficoeritrina, o el compuesto ABTS (ácido 2,2-azinobis-(3-etilbenzotioazolín-6-sulfónico));

hidrosoluble y químicamente estable; cuyo radical catiónico es cromógeno.

75

La oxidación y su inhibición se miden mediante monitoreo de absorbancia, monitoreo

de fluorescencia (Pineda Alonso et al., 1999) o por monitoreo de absorción de oxígeno (u

oxígeno consumido) (Wayner et al., 1985), dependiendo de cuál sea el sustrato oxidable

empleado.

La capacidad antioxidante se determina de tres maneras posibles: i-como el tiempo

necesario para consumir todo el antioxidante, ii-como porcentaje de disminución de la

reacción a un determinado tiempo o iii-como el período de inducción, en el que la oxidación

se inhibe, usando Trolox como estándar.

No hay uniformidad en cuanto al tiempo de detección (end-point), al sustrato oxidable

ni al método de monitoreo; por ende las comparaciones son impracticables. Cuando la

reacción se basa en el tiempo de inducción (tiempo lag) existe el inconveniente de que no

todos los antioxidantes presentan un tiempo lag evidente, y en estos casos se subestimaría la

CAO de dichos antioxidantes ya que se ignora el efecto del antioxidante fuera de dicho

tiempo lag.

Este método ha sido aplicado a alimentos y extractos vegetales (Pellegrini et al., 2003;

Pineda Alonso et al., 1999).

Método de decoloración de crocina o del β-caroteno

Los carotenoides se pueden blanquear por tres vías principales: i-autoxidación, ii-

oxidación inducida por calor o luz o iii- oxidación inducida por radicales peroxilos

(generados por el generador AAPH o por la oxidación de lípidos). Esta decoloración (o

blanqueo) puede ser prevenida o disminuida por el agregado de algún compuesto

antioxidante capaz de donar átomos de hidrógeno para neutralizar radicales libres (Ec. 4.3a y

4.3b).

crocina_H�naranja� + ROO°→ crocina°�decolorado� + ROOH 4.3a

crocina_H�naranja� + ROO°+ AH→ crocina°�decolorado� + ROOH + A°+ H 4.3b

Se destacan dos métodos de decoloración: el método CBA (Crocin Bleaching Assay,

por sus siglas en inglés) o el β-CBA (β-Carotene Bleaching Assay); se diferencian en el

sustrato oxidable utilizado (crocina y β-caroteno respectivamente).

76

Se recomienda el uso de crocina como sustrato oxidable ya que su decoloración se da

únicamente por vía de oxidación por radicales libres; mientras que el β-caroteno que

usualmente se usa como sustrato oxidable en este método puede decolorarse por varios

mecanismos alternativos, lo cual complica la interpretación de resultados.

Este método mide la capacidad de un antioxidante para proteger a un derivado

carotenoide natural (crocina) del blanqueo por radicales libres empleando como generador

AAPH y monitoreando su decoloración a 443 nm.

Es un método simple y rápido (Bors et al., 1984; Fukumoto y Mazza, 2000), no

requiere equipos sofisticados, pero posee la desventaja de que la crocina no está disponible

comercialmente y por ello debe ser extraída. La crocina es una mezcla de pigmentos

naturales extraídos del azafrán y por ende está sujeta a variaciones lote-a-lote, lo cual limita

su aplicación como método cuantitativo industrial. No hay estándares en la forma de

expresar los resultados ni en el modo de cálculo de las cinéticas.

4.1.3.2. Métodos basados en mecanismos de transferencia de electrones

Los métodos basados en mecanismos de transferencia de electrones por lo general siguen la

siguiente ecuación genérica:

Entre los métodos más usados basados en este mecanismo se destacan los métodos FRAP y

CUPRAC.

Método del poder antioxidante del ion férrico

También conocido como ensayo FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power, por sus

siglas en inglés). Fue desarrollado por Benzie y Strain (1996) para cuantificación de

capacidad antioxidante en plasma; posteriormente fue aplicado a muestras botánicas. El

método determina la capacidad de la muestra para reducir iones ferricos presentes en la

molécula tripiridil-s-triazina (TPTZ) a su forma ferrosa (producto intensamente coloreado,

593 nm); se realiza en condiciones de pH ácido (3,6) para asegurar la solubilidad del Fe+3.

Según Prior et al. (2005) éste método no detecta capacidad antioxidante de compuestos que

actúen por mecanismo HAT de neutralización de radicales libres. Es un método sencillo,

77

fácilmente automatizable y generalmente rápido (4-8 min para completar la reacción),

aunque en algunos casos sobre todo en muestras ricas en polifenoles se describieron

reacciones más lentas (desde 30 min hasta varias horas para completar la reacción) (Puertas-

Mejía et al., 2009; Pulido et al., 2000) y puede presentar interferencias ante la presencia de

ácido cítrico y azúcares.

Método del poder antioxidante del ion cúprico

Este método posee dos variantes: el ensayo CUPRAC y el ensayo Bioxytech AOP-

490. Ambos métodos consisten en una modificación del método FRAP, al reemplazar el ion

férrico por iones cúpricos. El método determina la capacidad de la muestra para reducir los

iones cúpricos presentes en las moléculas de neocuproína (2,9-dimetil-1,10-fenantrolina) en

el ensayo CUPRAC o de batocuproína en el ensayo AOP-490, a iones cuprosos por

formación de un complejo cromóforo de Cu+1 con máximos de absorción a 450 nm

(CUPRAC) o 490 nm (AOP-490). El ensayo se ha adaptado para al análisis de antioxidantes

hidrofílicos y lipofílicos (Apak et al., 2010; Celik et al., 2007) y en la determinación de la

capacidad captadora de radical hidroxilo (Bektasoglu et al., 2008).

Este ensayo ha sido empleado para la determinación de la capacidad antioxidante de

polifenoles, ácido ascórbico y tioles (Apak et al., 2004; Cekic et al., 2009). El ensayo AOP-

490 requiere solo 3 min de reacción mientras que la duración del ensayo CUPRAC varía

desde pocos minutos para el caso de compuesto sencillos como los ácidos gálico, ascórbico o

la quercetina hasta 30-60 min para moléculas más complejas (Prior et al., 2005), por lo que

requiere la determinación experimental del tiempo de reacción en el caso de mezclas

complejas de antioxidantes.

Los valores obtenidos por el ensayo CUPRAC son considerablemente mayores a los

obtenibles con el ensayo FRAP (Prior et al., 2005). Frente al ensayo FRAP, este ensayo

presenta menores interferencias para todos los tipos de antioxidantes incluyendo a los tioles;

además las reacciones cinéticas del cobre son más veloces que las del hierro (Prior et al.,

2005). Comparada con técnicas de detección HPLC/electroquímica, este método resulta una

alternativa conveniente, eficiente y menos costosa.

78

4.1.3.3. Métodos basados en mecanismos HAT y SET

Entre los métodos más usados basados en mecanismos combinados HAT y SET se destacan

los métodos TEAC-ABTS, DPPH y Folin-Ciocalteu.

Capacidad antioxidante expresada en equivalentes Trolox (Ensayo TEAC-ABTS)

Este método es conocido comúnmente por método TEAC (Trolox Equivalent

Antioxidant Capacity, por sus siglas en inglés) o por método del secuestro del radical

catiónico de ABTS (ácido 2,2-azinobis-(3-etilbenzotioazolín-6-sulfónico); se basa en la

captación o secuestro del radical catión ABTS°+ (que pasa a ABTS, no coloreado) por parte

de los antioxidantes monitoreado por la decoloración del medio (inhibición de la

absorbancia).

El radical catiónico del ABTS (ABTS°+) posee una coloración verde-azulada con un

máximo de absorción a 415 nm y una serie máximos secundarios de absorción a 645, 660,

734, 815 y 820 nm (Sánchez-Moreno, 2002; Re et al., 1999). Dependiendo de la variante del

método TEAC utilizada se emplean distintas longitudes de onda, aunque las más frecuentes

son 415 y 734 nm (Prior et al., 2005).

Para el desarrollo del método se suelen emplear dos estrategias: i-inhibición y ii-

decoloración. En la estrategia de inhibición los antioxidantes se añaden previamente a la

generación del radical ABTS, y se determina la inhibición en la formación del radical,

evidenciada por el retraso en la aparición de la coloración verde-azulada (también conocida

como estrategia de la fase lag). En esta estrategia la CAO se cuantifica según a la duración

de dicha fase lag. En la estrategia de decoloración, los antioxidantes se añaden una vez que

el ABTS°+ se ha formado y se determina entonces la disminución de la absorbancia debida a

la reducción del radical, es decir a la decoloración de éste (Sánchez-Moreno, 2002). Cuando

se emplea esta estrategia, la CAO se cuantifica como porcentaje de inhibición de la

absorbancia. El agregado del antioxidante luego de la generación del radical catiónico

previene interferencias en la formación de dicho radical y evita la sobreestimación de la

CAO (Sánchez-Moreno, 2002).

El radical ABTS°+ puede ser generado: i-por reacción química (reacción química entre

el ABTS y persulfato de potasio, dióxido de manganeso o cloruro de 2,2’-azo-bis-(2-

amidinopropano) (ABAP); ii-por reacción enzimática (incubando el ABTS con peróxido de

79

hidrógeno y con metamioglobina o hemoglobina). La generación del radical ABTS°+ por

reacción química generalmente requiere largos períodos de incubación (mayor a 16 h en el

caso del persulfato de potasio) (Leong y Shui, 2002; Prior et al., 2005) o altas temperaturas

(60ºC en el caso del ABAP) (Prior et al., 2005).

La denominación de este método como método TEAC deriva del patrón que se suele

emplear, el Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametil-cromán-2-carboxílico), un análogo

sintético hidrosoluble de la vitamina E. Los resultados del ensayo se expresan como

equivalentes a Trolox, es decir la concentración de una solución de Trolox que posee un

potencial antioxidante equivalente a 1 mmol/L de la solución de la sustancia en estudio.

Como el radical ABTS°+ es soluble en agua y en soluciones etanólica acidificadas, este

método resulta apto para determinar la capacidad antioxidante de compuestos tanto

hidrofílicos como lipofílicos (Sánchez-Moreno, 2002).

Es un método aplicable al estudio de antioxidantes puros o en extractos alimenticios

(Leong y Shui, 2002).

Este método, ensayado como método de inhibición y generando el radical ABTS°+ por

reacción enzimática, es un método ampliamente utilizado en ensayos clínicos, al ser rápido,

sencillo y automatizable. Incluso existen kits comercializados por Randox Laboratories Ltd.

(Reino Unido) para su uso.

Los valores obtenidos por el ensayo TEAC son comparables a los valores del ensayo

CUPRAC en compuestos polifenólicos (Prior et al., 2005).

Reducción del radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (Ensayo DPPH)

Este método se basa en la habilidad del antioxidante de neutralizar al radical libre

DPPH°, el cual se reduce tras aceptar un átomo de hidrógeno.

El radical DPPH° es un radical orgánico nitrogenado, intensamente coloreado

(púrpura), estable y disponible comercialmente. No requiere ser generado in situ como el

radical ABTS°+.

80

El ensayo puede ser monitoreado por espectroscopía de resonancia paramagnética

electrónica (EPR, Electron Spin Resonance, por sus siglas en inglés) pero la forma más

frecuente de realizar el ensayo es monitoreando la inhibición de absorbancia en presencia

del antioxidante como una técnica espectrofotométrica de decoloración. Esta última consiste

en medir la pérdida de color del radical DPPH a una determinada longitud de onda

comprendida entre 515 y 528 nm (Sánchez-Moreno, 2002) luego de iniciada la reacción

entre el radical y la muestra antioxidante en un medio hidro-alcohólico (etanol o metanol)

hasta alcanzar el estado estable (Brand-Williams et al., 1995) usando un espectrofotómetro

UV-VIS habitual.

Desde el punto de vista metodológico es un ensayo simple, preciso, de bajo costo y

rápido, lo cual sumado a que no requiere equipos de medición complejos, hace de este

método uno de los más ampliamente usados; sin embargo a pesar de ello; su aplicación no

está estandarizada (Tabla 4.3). Según Sánchez-Moreno (2002) sus resultados son altamente

reproducibles y comparables a los obtenibles por otros métodos de neutralización de

radicales como el método ABTS.

Este método ha sido ampliamente aplicado tanto a compuestos puros como a extractos

vegetales (Diallo et al., 2001), a frutos y vegetales comestibles (Du Toit et al., 2001; Leong y

Shui, 2002; Bennett et al., 2010), a compuestos polifenólicos (Hayes et al., 2011), ácidos

fenólicos y sus derivados (Silva et al., 2000), a compuestos derivados de ácidos

hidroxicinámicos (Kumar Maurya y Asir Devasagayam, 2010), a flavonoides (Sansone et al.,

2011), a té (Macedo et al., 2011), etc.

Como desventajas adicionales a la falta de estandarización, la reacción en que se basa

este método puede estar influenciada por impedimentos estéricos: las moléculas pequeñas al

presentar mejor accesibilidad al centro activo del radical mostrarían una mayor actividad

antioxidante (Prior et al., 2005). Además, según Prior et al. (2005), el radical DPPH no

presenta similaridad estructural con los radicales peroxilos involucrados en las reacciones de

peroxidación lipidica, por lo que ciertos sustancias antioxidantes que neutralizan

rápidamente a los radicales peroxilo pueden ser inertes (por impedimento estérico) o bien

reaccionar lentamente con el radical DPPH°. No resulta adecuado para medir CAO en

plasma o suero ya que el medio alcohólico provocaría la precipitación de proteínas

(Sánchez-Moreno, 2002).

81

Tabla 4.3 Resumen de publicaciones representativas de la aplicación del ensayo del radical DPPH

Referencias

Concentración del DPPH (µM) 4 Pineda Rivelli et al., (2007) 25 Göktürk Baydar et., (2007) 60 Brands-Williams et al., (1995) 190 Kevers et al., (2007) 500 Elzaawely et al., (2007), Chen et al., (2005)

Medio de reacción Metanol Pineda Rivelli et al., (2007); Kevers et al., (2007) Etanol Lo Scalzo, (2000); Karioti et al., (2004) Tolueno Wettasinghe y Shahid, (2000) Metanol buffer (pH: 5,5) Chen et al., (2005) Tiempo de incubación (min)

5 Kevers et al., (2007) 15 Meda et al., (2005) 30 Chen et al., (2005) 60 Paixao et al., (2007) 120 Pineda Rivelli et al., (2007) 1440 Thaipong et al., (2006)

Longitud de onda (nm) 515 Paixao et al., (2007; Brands-Williams et al., (1995);

Thaipong et al., (2006; Saito et al., (2007) 517 Pineda Rivelli et al., (2007); Chen et al., (2005); Meda et

al., (2005)

Ensayo del contenido de fenoles totales

El método del contenido de fenoles totales, más conocido como método de Folin-

Ciocalteu, que se utiliza actualmente es una modificación efectuada por Singleton y Rossi

(1965) de un método empleado para la determinación de tirosina, el cual se basaba en la

oxidación de los fenoles por un reactivo de molibdeno y wolframio (tungsteno).

La presencia de (poli)fenoles contenidos en una muestra es determinada

colorimétricamente usando el reactivo de Folin-Ciocalteau. El principal constituyente del

reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser

reducido por los grupos fenólicos (reacciona con los grupos oxidrilos de los fenoles)

82

presentes en la muestra da lugar a la formación de sales complejas de color azul intenso, las

cuales presentan un máximo de absorción a 765 nm. El mecanismo básico del método es una

reacción redox, por lo que puede considerarse como otro método de medida de la actividad

antioxidante total (Prior et al., 2005).

Los resultados se obtienen por espectrofotometría en base a una recta patrón;

generalmente de ácido gálico, aunque también se reporta el uso de otros patrones como ácido

cafeico, ácido clorogénico, ácido ferúlico, catequina, etc. Según George et al. (2005), la

respuesta del ácido gálico representa la respuesta media de todos los compuestos

polifenólicos principales en frutas y vegetales, ya sea como agliconas o conjugados.

Entre las sustancias de naturaleza no fenólica que pueden interferir en las

determinaciones se destacan las proteínas, el ácido ascórbico, el ácido úrico, algunos

aminoácidos y nucleótidos, azúcares y algunas sales inorgánicas (Prior et al., 2005).

Si bien el reactivo de Folin-Ciocalteu no es específico para polifenoles, en condiciones

básicas reacciona con un amplio rango de ellos, y con la utilización de patrones apropiados,

representa una medida adecuada del contenido total de polifenoles. El ensayo de Folin-

Ciocalteu también se ha empleado en estudios in vivo para la determinación de los niveles de

compuestos fenólicos totales en plasma/suero tras la ingesta de vino (Duthie et al., 1998;

Serafini et al., 1998) y zumos de frutas ricos en compuestos fenólicos (Pedersen et al., 2000).

4.1.4. Objetivos

Los objetivos del presente estudio fueron:

• Adaptar el método de Folin-Ciocalteu para la determinación del contenido de

polifenoles totales (CPT) en extractos de yerba mate.

• Proponer una metodología para estandarizar la determinación de capacidad

antioxidante (CAO) en extractos de yerba mate.

Objetivos particulares:

• Determinar el contenido de polifenoles totales (CPT) en extractos de yerba

mate y su CAO.

83

• Verificar cuestiones inherentes a la metodología de cuantificación de CAO, a

saber: verificar los valores de CAO de dos sustancias reconocidas por su acción frente al

DPPH; verificar la no interferencia de la cafeína en la determinacion de CAO y evaluar la

repetibilidad y reproducibilidad del método propuesto.

4.2. MATERIALES Y METODOS

4.2.1. Adaptación del método de Folin-Ciocalteu (FC)

4.2.1.1. Materia prima

Se muestrearon al azar 10 marcas comerciales de yerba mate elaborada (YME). El

contenido de cada paquete comercial se mezcló por cuarteos sucesivos antes de tomar la

muestra.

4.2.1.2. Reactivos

Para la determinación de polifenoles totales se utilizaron los siguientes reactivos: ácido

clorogénico (MP Biomedicals, Argentina), ácido gálico (MP Biomedicals, Argentina),

reactivo de Folin-Ciocalteu (Fluka, Argentina), carbonato de sodio (Anedra, Argentina).

4.2.1.3. Equipos

Las mediciones de absorbancia se realizaron en un espectrofotómetro UV/VIS

(Espectro SP-21029; Estados Unidos) usando cubetas de cuarzo de 10 mm de camino óptico.

Se utilizó un agitador de tubos (Vortexer VWR mini; Estados Unidos), una centrifuga, y

estufas de aire de convección natural.

4.2.1.4. Determinación de humedad

El contenido de agua se determinó por triplicado por el método gravimétrico: la

muestra (aproximadamente 2,5 g) se secó en estufa de aire con convección natural (6 h; 103

± 2 º C; IRAM 20503, 1995).

4.2.1.5. Preparación del material de vidrio

Debido a la sensibilidad del ensayo de Folin-Ciocalteu a trazas de impurezas

orgánicas, todo el material fue lavado con una solución diluida de detergente no iónico; se

84

enjuagó con agua destilada al menos tres veces consecutivas y seguidamente fue sumergido

en una solución de ácido nítrico (15 %v/v) durante algunos minutos. Finalmente se enjuagó

con agua destilada siete veces (adaptado de ISO 14502-1, 2004).

4.2.1.6. Preparación de soluciones y patrones

Para la preparación de la solución del reactivo de Folin-Ciocalteau diluido (10 %v/v),

se trasfirió el reactivo Folin-Ciocalteau (10 mL) a un matraz aforado (100 mL), se enrazó

con agua y se mezcló.

Para la preparación de la solución de carbonato de sodio (7,5 %p/p), se pesó y disolvió

una porción de carbonato de sodio anhidro (37,50 ± 0,01 g) y se enrazó (500 mL). Esta

solución es estable a temperatura ambiente por un mes.

Para la preparación de la solución estándar de ácido clorogénico (1000 µg/mL) se pesó

y disolvió una porción de ácido clorogénico (0,100 ± 0,001 g) y se enrazó (100 mL).

Para la preparación de la solución estándar de ácido gálico (1000 µg/mL) se pesó y

disolvió una porción de ácido gálico monohidratado (0,100 ± 0,001 g) y se enrazó (100 mL).

Para la dilución de las soluciones de ácido clorogénico y de ácido gálico se trasfirieron

diferentes volúmenes de las soluciones estándar de ácido clorogénico y de ácido gálico (1, 2,

3, 4, 5 y 6 mL) y se enrazó cada matraz aforado a 100 mL; obteniéndose las respectivas

concentraciones nominales (10, 20, 30, 40, 50 y 60 µg/mL).

4.2.1.7. Obtención de los extractos y diluciones

Se mezcló la muestra sólida por duplicado (0,2 ± 0,001 g) con metanol (5 mL; 70

%v/v; en baño agitado a 70 °C) en un tubo usando un agitador de tubos (10 min; 1800 rpm).

Se enfrió a temperatura ambiente y se centrifugó (10 min; 1800 rpm). El sobrenadante se

recolectó. El paso de extracción se repitió una vez sobre el residuo sólido. Los sobrenadantes

se combinaron y se ajustó el volumen (10 mL; metanol; 70 %v/v; 70 °C) (ISO 14502-1,

2004).

Para la determinación de CPT, los extractos de yerba mate se diluyeron 1:100 (v/v).

85

4.2.1.8. Determinación de polifenoles totales

El contenido de polifenoles totales (CPT) se determinó espectrofotométricamente por

duplicado por el método de Folin-Ciocalteu (ISO 14502-1, 2004): una alícuota de muestra

(1 mL de extracto diluido, de soluciones estándar del ácido clorogénico, del ácido gálico o

de agua) se mezcló por duplicado con la solución del Reactivo de Folin-Ciocalteu diluido (5

mL; 10 %v/v). Transcurrido un tiempo (3-8 min) se agregó la solución de carbonato de sodio

(4 mL; 7,5 % p/v), se mezcló y se dejó en reposo (60 min). Se determinó su absorbancia

(765 nm; espectrofotómetro UV/VIS calibrado con agua).

El CPT se expresó como gramos equivalentes a ácido clorogénico por 100 g de

muestra seca (gEAC %ms) y como gramos equivalentes a ácido gálico por 100 g de muestra

seca (gEAG %ms) a partir de las respectivas curvas de calibración.

Para la lectura del blanco de reactivos, se realizó el mismo procedimiento descripto es

este ítem, pero reemplazando la alícuota de muestra por agua destilada. Dicha lectura debió

en todos los casos mostrar una absorbancia menor o igual a 0,01 ya que valores mayores

indicarían problemas de contaminación que pidrían deberse a una pobre calidad del agua y/o

de los reactivos o a suciedades del material de vidrio utilizado.

El cálculo del contenido de polifenoles totales equivalentes a ácido clorogénico en 100

g de yerba mate seca (EAC %ms) cuando de usa la extracción descripta en el ítem 4.2.1.7 es

presentado en el Anexo 1-Nota 1.

4.2.1.9. Estabilidad del acido clorogénico como patrón estándar

Se evalúo la estabilidad del acido clorogénico como patrón estándar. Para ello se

preparó el patrón y sus correspondientes diluciones y se determinó el CPT; el remanente de

las diluciones se almacenó en matraces aforados cubiertos con papel de aluminio (24 h, a

temperatura ambiente; en oscuridad) y se procedió a una segunda determinación.

86

4.2.2. Adaptación del método de DPPH

4.2.2.1. Materia prima

Se utilizó la fracción de hojas manualmente separada, molida (malla de 4 mm) y

tamizada (40 mesh) obtenida a partir de un lote de yerba mate canchada y estacionada

producido en Apóstoles, Argentina.

4.2.2.2. Reactivos

Para la determinación de CAO se utilizaron los siguientes reactivos: DPPH (Sigma),

metanol (Merck; grado HPLC, Argentina), ácido ascórbico (Sigma Ultra, Argentina), Trolox

(Aldrich, Argentina), cafeína (Sigma, Argentina), etanol 96º (Sigma Aldrich, Argentina).

4.2.2.3. Equipos

Los equipos utilizados se mencionan en el ítem 4.2.1.3.


El contenido de humedad se determinó acorde a la metodología descripta en el ítem

4.2.1.4.

4.2.2.5. Preparación del material de vidrio

El material de vidrio se preparó acorde al protocolo descripto en el ítem 4.2.1.5.

4.2.2.6. Preparación de soluciones y patrones

Para la preparación de la solución stock del radical DPPH° (1 mM) se pesó y disolvió

una porción de DPPH° en polvo (0,0986 g; PM: 394,32 g/mol) y se enrazó (250 mL;

metanol). La misma fue almacenada por períodos no mayores a 10 días a -18 ± 1 °C hasta

ser utilizada.

La solución de DPPH de trabajo (100 µM) se preparó diariamente por dilución con

metanol de la solución stock de manera de lograr en la lectura del blanco de reactivos una

absorbancia de 1 ± 0,05 unidades a 517 nm.

Para la preparación diaria de la solución estándar de ácido ascórbico (1000 µg/mL) se

pesó y disolvió una porción de ácido ascórbico (0,100 ± 0,001 g) y se enrazó (100 mL).

87

Para la preparación diaria de la solución estándar de Trolox (1000 µg/mL) se pesó y

disolvió una porción de Trolox (0,100 ± 0,001 g) y se enrazó con metanol (100 mL).

Para la dilución de las soluciones de ácido ascórbico y de Trolox, se transfirieron

diferentes volúmenes de las soluciones estándar respectivas y cada matraz aforado se enrazó

con agua (100 mL), obteniéndose las respectivas concentraciones nominales (de 0 a 1,2

mM).

Para la preparación de la solución de cafeína (0,1 p/v so/sn) se pesó y disolvió una

porción de cafeína (0,100 ± 0,001 g) y se enrazó (100 mL) con una solución etanol/agua (1/4

v/v).

4.2.2.7. Obtención de los extractos y diluciones

Para la obtención de los extractos, la muestra (fracción hojas, 30 ± 0,001 g ms) se

mezcló por duplicado con etanol (75 %p/p; 180 mL) en erlenmeyer (500 mL) y se mantuvo

en baño (60 ± 1 °C; 30 min; 120 rpm). Luego el sobrenadante se filtró (diámetro de poro: 1

mm) y se registró el volumen recolectado. Para la determinación de CPT, los extractos se

diluyeron (1:5; luego 1:100). Para la determinación de CAO, los extractos se diluyeron en la

relación 1:75, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:400 y 1:500 (v/v).

Los extractos para estudiar el efecto de la temperatura de incubación sobre la

capacidad de neutralizar radicales libres por parte de los extractos y para la validación del

ensayo, se obtuvieron acorde a la metodología descripta en el ítem 4.2.1.7. La dilución usada

fue 1:30 (v/v).

4.2.2.8. Determinación de polifenoles totales

El CPT se determinó acorde a la metodología descripta en el ítem 4.2.1.8.

4.2.2.9. Elección de la longitud de onda para el ensayo

Para la elección de la longitud de onda de trabajo se monitoreó la absorbancia del

radical. Para ello se mezcló metanol absoluto (100 µL) con una solución metanólica de

DPPH (3 mL, 100 µM) y se midió inmediatamente a diferentes longitudes de onda (350-900

nm; temperatura ambiente).

88

4.2.2.10. Determinación del perfil de absorbancia

Para el perfil de absorbancia del radical, se mezcló metanol absoluto (100 µL) con una

solución metanólica de DPPH (3 mL, 10-200 µM) y se midió la absorbancia inmediatamente

(517 nm; temperatura ambiente).

4.2.2.11. Determinación de la capacidad antioxidante

La CAO se determinó por duplicado con el ensayo del radical DPPH: se mezcló la

muestra, la cafeína o los patrones (100 µL) con una solución metanólica de DPPH (3 mL,

100 µM). La absorbancia se midió a varios intervalos de tiempo hasta que la reacción

alcanzó el equilibrio siempre a temperatura ambiente (25 ± 2 ºC). Se midió en oscuridad a

temperatura ambiente (517 nm) con metanol como blanco. Para la lectura del blanco de

reactivos se realizó el mismo procedimiento descripto es este ítem, pero reemplazando la

alícuota de muestra por metanol.

Los resultados se expresaron como equivalentes de ácido ascórbico (EAA) y

equivalentes de Trolox (ET) por 100 g de muestra seca (g %ms) y se calculó como el

porcentaje de radical remanente en el equilibrio (%DPPHR, Ec. 4.4), donde DPPHee la

concentración del radical DPPH en el estado estable y DPPHo la concentración inicial de

dicho radical (ambas en µM).

R (%)= %DPPHR= DPPHee*100/ DPPHo 4.4

La concentración del radical en el medio se calculó con una curva de calibración (10-

100 µM).

4.2.2.12. Efecto de la temperatura de incubación en la reacción del DPPH

La mezcla de reacción (100 µL de muestra; 3 mL de solución metanólica de DPPH,

100 µM) se incubó durante 120 min en oscuridad en estufas a cuatro temperaturas (20 ± 2ºC,

25 ± 2ºC, 30 ± 2ºC y 40 ± 2ºC °C) y luego se determinó la absorbancia (517 nm; temperatura

ambiente).

89

4.2.2.13. Evaluación de repetibilidad y reproducibilidad

Las condiciones para la evaluación de la repetibilidad fueron tales que los resultados

de ensayos independientes de una misma muestra fueron obtenidos con el mismo método,

sobre ítems de ensayo idénticos, en el mismo laboratorio, por el mismo operador usando el

mismo equipo, dentro de un intervalo corto de tiempo (ISO 14502-1; 2004). Los valores de

repetibilidad se expresaron como el promedio de cinco determinaciones independientes.

Las condiciones para la evaluación de la reproducibilidad fueron tales que los

resultados de ensayos independientes de una misma muestra fueron obtenidos con el mismo

método, sobre ítems de ensayo idénticos, en diferentes laboratorios con diferentes

operadores usando distintos equipos (ISO 14502-1; 2004). Participaron tres laboratorios,

obteniéndose cuatro resultados por muestra; usando dos muestras en total.

4.2.2.14. Análisis estadístico

Los datos se evaluaron mediante los siguientes análisis: regresión lineal, análisis de

varianza y correlación (Pearson) usando Statgraphics Centurion XVI Académico. Los datos

se expresaron como media ± error estándar (ee) a partir de experimentos independientes

realizados por duplicado.

4.3. RESULTADOS Y DISCUSION

4.3.1. Adaptación del método de Folin Ciocalteu

El análisis y cuantificación de los compuestos polifenólicos presentes en un producto

vegetal dado está influenciado por numerosos factores, tales como su naturaleza química, el

método de extracción utilizado (polaridad de la fase extractiva, tamaño de las partículas de

las muestras, tiempo y temperatura de extracción, etc.), el tiempo y condiciones de

almacenamiento tanto de las muestras como de los extractos, el método de ensayo empleado,

los estándares elegidos, y la presencia de sustancias que interfieren en las determinaciones

(Huang et al., 2005; Kuskoski et al., 2005).

Los datos de la primer experiencia de obtención de la curva de calibración de ácido

clorogénico como patrón estándar del CPT se presentan en anexo 1- Cuadro A1. Los mismos

se ajustaron a una ecuación lineal: Abs=a*x+b, siendo a= 0,0067 (error estándar=9,1x10-5) y

b= -0,0104 (error estándar=3,3x10-3) con un R² = 0,9977 (análisis estadístico en Anexo 1-

90

Cuadro A2) siendo x = concentración del patrón y Abs = absorbancia. Las diluciones del

patrón de ácido clorogénico pueden usarse hasta 24 horas desde su preparación (prueba de

hipótesis disponible en Anexo 1 - Cuadro A3).

Los datos de la primer experiencia de obtención de la curva de calibración de ácido

gálico como patrón estándar del CPT se presentan en el Anexo 1-Cuadro A4; los mismos se

ajustaron a una ecuación lineal: Abs=a*x+b, siendo a= 0,0122 (error estándar=1,3x10-4) y b=

-0,009 (error estándar=4,8x10-3;) con un R² = 0,998 (análisis estadístico- Anexo 1-Cuadro

A5) siendo x = concentración del patrón.

Se encontró que el contenido de polifenoles totales (CPT) expresado en equivalentes a

ácido clorogénico (EAC) es mayor al expresado en equivalentes de ácido gálico (EAG), lo

cual coincide con lo reportado por González de Mejía et al. (2005). La expresión del

contenido de polifenoles totales como equivalentes a ácido clorogénico sería más adecuada

para la yerba mate debido a que el ácido gálico se halla en menor proporción que el ácido

clorogénico.

Los resultados de CPT se presentan en la tabla 4.4 según su marca comercial

codificada (los datos sin procesar se presentan en el Anexo 1 - Cuadros A6 y A7).

Tabla 4.4 Cuadro comparativo del CPT por marca

Marca CPT-EAC CPT-EAG

1 19,32±0,41 10,56±0,22

2 15,84±0,29 8,66±0,16

3 16,50±0,14 9,02±0,08

4 17,10±0,63 9,35±0,35

5 17,45±0,13 9,56±0,07

6 16,87±0,37 9,22±0,20

7 17,31±0,08 9,46±0,05

8 18,24±0,10 9,97±0,06

9 17,45±0,05 9,54±0,03

10 17,91±0,07 9,79±0,04

Los datos se presentan como media ± ee de dos determinaciones por muestra y se expresan como g equivalentes al patrón % ms

El CPT varió entre 15

Angus (2007) reportaron un

(1,5 g de YME molida en

Ciocalteu).

Dudonné et al. (2009)

extractos de plantas con mayo

4.3.2. Adaptación de

La reacción del ensayo

nitrógeno del radical DPPH

antioxidante o por algún rad

monitorea por el descenso

Williams et al., 1995) a algu

máximo de absorción. Dicho

4.2; Anexo 1-Cuadro A8), co

Moreno (2002).

DPPH° + AH → DPPH-H + A

DPPH° + R° → DPPH-R

Figura 4.2. Absorban

15,8 y 19,3 gEAC %ms y entre 8,7 y 10,7 gE

un valor promedio de 8 gEAG %ms obtenido

n 150 mL de agua en ebullición por 5 min;

9) posicionan a los extractos acuosos de YM

ayor capacidad antioxidante de 30 plantas selecc

del ensayo de reducción del radical DPPH

ayo DPPH se basa en el cambio de color cu

PH, que posee un electrón desapareado, es

radical (Ec. 4.5a y 4.5b; Huang et al., 2005

o en la absorbancia hasta alcanzar el estad

lguna longitud de onda en la cual el radical D

ho rango de longitud de onda resultó entre 515

coincidiendo con el rango 515 - 528 nm repor

+ A°

ancia del radical DPPH a diferentes longitud

91

gEAG %ms. Bravo y

idos como infusiones

in; método de Folin

YM entre los cinco

eccionadas.

cuando el átomo de

es reducido por un

05). Este método se

tado estable (Brand-

l DPPH° presente un

15 y 520 nm, (Figura

portado por Sánchez-

4.5a

4.5b

tudes de onda

El perfil de absorbancia

con Sharma y Bhat, (2009),

concentración del radical dur

encuentre dentro del rango de

< 0,9), ya que para absorb

absorbancias menores se difi

eligió 100 µM como concentr

Figura 4.3. Absorbancia de

La concentración del r

estimó a partir del perfil de

concentración del radical DPP

1- Cuadros A9 y A10).

La duración del ensayo

en oscuridad y a temperatur

(ácido ascórbico, Trolox y ex

ascórbico y de Trolox ensaya

las diluciones del extracto de

1:250, 1:300, 1:400 y 1:500 (v

cia del radical resultó lineal en el rango 10-200

), (Figura 4.3; Anexo 1-Cuadro A9). Como

durante el ensayo varíe en un intervalo tal que

de precisión de la mayoría de los espectrofotó

rbancias mayores resultaría difícil medir la

dificultaría la diferenciación entre la muestra

ntración de trabajo.

de diferentes soluciones del radical DPPH dipuro

l radical DPPH en el medio de reacción a di

de absorbancia del radical, Abs = 0,0103 x -

PPH (µM) (R2 = 0,999) válida para el rango 1

yo se estimó como el tiempo necesario para alc

tura ambiente entre el radical DPPH y la sust

extractos diluidos de yerba mate). Las concen

yadas estuvieron comprendidas entre 0 y 1,2 m

de yerba mate se realizaron en relación 1:75, 1

0 (v/v).

92

00 µM; coincidiendo

o es deseable que la

ue su absorbancia se

otómetros (0,4 < Abs

la intensidad y para

ra y su referencia, se

disuelto en metanol

distintos tiempos se

0,0013 siendo x =

o 10-100 µM (Anexo

alcanzar el equilibrio

ustancia antioxidante

entraciones del ácido

2 mM/L mientras que

, 1:100, 1:150, 1:200,

Las curvas cinéticas de

DPPH y µg Trolox / µg de D

cocientes másicos se present

1- Cuadros A11 a A13). El

disponible en el Anexo 1- Cu

Figura 4.4. Curvas cinéti

Los patrones ácido ascó

y 20 min, mientras que los e

tiempo de reacción obtenido

con lo reportado por Pineda

extractos acuosos e hidroalco

DPPH. Acorde a lo esperado

tiempos de reacción.

Los datos de las curva

(disuelto en metanol y dilui

presentan en la figura 4.7 y e

modelo lineal: y =a*x+b, sien

agregada (µg patrón). Los c

99,99 (error estándar=0,640)

de la reacción del radical DPPH con los estánd

µ e DPPH) y con los extractos (µgEAC / µg de D

entan en las figuras 4.4, 4.5 y 4.6 (datos dispon

El cálculo de los mencionados cocientes má

uadro A14.

éticas de la reacción del radical DPPH con á

scórbico y Trolox alcanzaron el equilibrio de l

s extractos de yerba mate requirieron un tiem

do experimentalmente para los extractos de yer

eda Rivelli et al. (2007) para la determinaci

lcohólicos de Ilex paraguariensis mediante el

do, los extractos más diluidos alcanzaron el eq

rvas de calibración de los estándares ácido a

iluido en agua) para el rango de concentracio

y en el Anexo 1 (Cuadro A15 y A16). Los mism

iendo y = % R en el equilibrio y x = cantidad d

s coeficientes resultaron a= -3,98 (error está

0) (R² = 0,998; Anexo 1- Cuadro A15) para áci

93

ándares (µAA / µg de

µ e DPPH) para varios

ponibles en el Anexo

másicos se encuentra

n ácido ascórbico

e la reacción a 3 min

empo de 120 min. El

yerba mate concuerda

ación de la CAO de

el ensayo del radical

equilibrio a menores

ascórbico y Trolox

ciones 0-1,2 mM se

ismos se ajustaron al

d del patrón estándar

stándar=0,049;) y b=

ácido ascórbico y a =

-2,77 (error estándar=0,036

Cuadro A16). Coincidiendo c

que el Trolox frente al radic

natural y el Trolox es una su

ambos son comúnmente usad

Bhat, 2009).

Figura 4.5. Curvas c

Figura 4.6. Curvas

36) y b= 99,05(error estándar=0,6590) (R² =

o con Dae-Ok et al. (2002), el ácido ascórbico m

dical DPPH (Figura 4.7). El ácido ascórbico

sustancia sintética soluble en agua equivalent

sados como estándares para CAO (Chan et al

s cinéticas de la reacción del radical DPPH c

as cinéticas de la reacción del radical DPPH diluciones de extracto

94

² = 0,999; Anexo 1-

o mostró mayor CAO

o es un antioxidante

ente a la vitamina E,

t al., 2010; Sharma y

con Trolox

H con diferentes

Figura 4.7. Curvas de

El CPT de los extracto

fue 19,75 ± 0,55 mgEAC / mL

de 10 ± 0,255 gEAA %ms y 1

A18). La relación entre CA

másicos 0 - 0,168 µgEAC / µ

ello se sugiere diluir los extra

el cociente másico extracto/r

si el extracto se obtiene según

µgEAC / mL.

Figura 4.8. Relación entre Cco

de calibración de los estándares ácido ascórb

tos resultó 8,10 ± 0,22 gEAC %ms, y su con

mL (datos disponibles en el Anexo 1- Cuadro A

y 14,1 ± 0,35 gET %ms (datos disponibles en e

CAO y CPT fue lineal (R2 = 0,987) en el r

µgradical DPPH (Figuras 4.8 y 4.9; Anexo 1

tractos hasta que la CoPT se halle entre 90 -105

o/radical DPPH se hallaría entre 0,075-0,088 (

gún la Norma ISO 14502, la CoPT debería hall

e CAO y CPT de diferentes diluciones del excomo % de DPPH remanente (%R)

95

órbico y Trolox

oncentración (CoPT)

o A17) y su CAO fue

n el Anexo 1- Cuadro

l rango de cocientes

1- Cuadro A18). Por

105 µgEAC / mL, así

8 (Figuras 4.8 y 4.9);

allarse entre 130-150

extracto expresadas

Figura 4.9. Rango lineal deextracto exp

Coincidiendo con Pined

los extractos no interfiere en l

Figura 4.10. Ciné

Los datos de CAO

temperaturas y sus respectivo

A21c). Se observó que a m

estable se alcanzaba a menor

sobreestimando la CAO (Fig

l de la relación entre CAO y CPT de diferentxpresadas como % de DPPH remanente (%R

neda Rivelli et al. (2007), se comprobó que la c

n la determinación (Figura 4.10; Anexo 1-Cuad

inética de reacción entre el radical DPPH° y

de los extractos obtenidos tras la incuba

ivos análisis estadísticos se hallan en el Anexo

mayores temperaturas de incubación de la r

nores concentraciones del radical (p ≤ 10-3) con

Fig. 4.11). Se recomienda una temperatura de

96

entes diluciones del %R)

la cafeína presente en

uadro A20).

y cafeína

ubación a diferentes

exo 1 (Cuadro A21a-

a reacción, el estado

con lo cual se estaría

de incubación de la

reacción de 37 °C. Esta tem

Benzie y Strain, (1996); Dudo

Figura 4.11. Ef

En las tablas 4.5 y 4.

diferencia absoluta entre dos

obtenidos con el mismo méto

por el mismo operador usand

deberá superar en el 95% de

(ISO 14502-1; 2004). La dife

una misma muestra, obtenido

diferentes laboratorios con d

mayor al valor de la reprodu

(ISO 14502-1; 2004).

emperatura ya ha sido usada por numerosos

udonné et al. (2009); Pulido et al. (2000); Serafi

. Efecto de la temperatura de incubación de la

4.6 se presentan los estadísticos de precisió

os resultados de ensayos independientes de un

étodo, sobre ítems de ensayo idénticos, en el m

ndo el mismo equipo, dentro de un intervalo c

de los casos, el valor de repetibilidad presenta

diferencia absoluta entre resultados de ensayos

idos con el mismo método, sobre ítems de en

n diferentes operadores usando distintos equi

ducibilidad presentado en la Tabla 4.6; en el 95

97

s autores entre ellos

afini et al. (2000).

e la reacción

sión calculados. La

una misma muestra,

el mismo laboratorio,

o corto de tiempo, no

ntado en la tabla 4.5

os independientes de

ensayo idénticos, en

uipos no deberá ser

l 95% de las muestras

98

Tabla 4.5 Evaluación de la repetibilidad del ensayo

CAO g EAA %ms g ET %ms Muestra 1 Muestra 2 Muestra 1 Muestra 2

N° de resultados aceptados 5 5 5 5

Promedio (x) 18,12 16,32 25,46 22,89

Desvío Estándar (DS) 0,255 0,370 0,367 0,497 DS de los resultados (Sr = DS*m-0,5)

0,180 0,261 0,259 0,352

Repetibilidad (r = 2,77*Sr)

0,499 0,724 0,719 0,974

Repetibilidad en % (%r = 100*r/x)

2,8 4,4 2,8 4,3

Repetibilidad promedio en % 3,6 3,5

m: número de muestras; EAA: equivalente a ácido ascórbico; ET: equivalente a Trolox, ms: masa seca

Tabla 4.6 Evaluación de la reproducibilidad del ensayo

CAO g EAA %ms g ET %ms Laboratorio Media DS Media DS 1 16,90 0,29 23,68 0,42 2 16,75 0,25 23,48 0,36 3 17,11 0,31 24,00 0,45 Promedio 16,92 0,29 23,72 0,41 DS entre laboratorios; Sn 0,181 0,260 DS entre laboratorios corregido; SR 0,231 0,332 Reproducibilidad (entre laboratorios); R = 2,77*SR

0,639 0,919

Reproducibilidad (entre laboratorios) en %

3,8 3,9

DS: desvío estándar; EAA: equivalente a ácido ascórbico; ET: equivalente a Trolox, ms: masa seca

4.4. CONCLUSIONES DEL CAPITULO

• Se recomienda incorporar como parámetro de calidad en las muestras de yerba mate

la determinación de polifenoles totales basada en la Norma ISO 14502 y expresar los

resultados en equivalentes de ácido clorogénico. El CPT de extractos de yerba mate

elaborada, obtenidos por la metodología descripta en la norma ISO 14502 (2004), varió entre

15,8 y 19,3 g equivalentes a ácido clorogénico por 100 g de masa seca con un promedio

99

global de 17,4 ± 0,3 gEAC %ms y entre 8,6 y 10,5 g equivalentes ácido gálico por 100 g de

masa seca.

• Los resultados de la aplicación del ensayo del radical DPPH para determinación de

capacidad antioxidante tanto para extractos vegetales como para compuestos puros depende,

entre otros factores, de la concentración final de los extractos, de la concentración inicial del

la solución de DPPH, de las alícuotas de extractos y de soluciones de DPPH, del tiempo y

temperatura de incubación. Para asegurar estandarización en la determinación de CAO de

extractos de yerba mate mediante este ensayo, el protocolo sugerido consiste en mezclar por

duplicado el extracto (100 µL) convenientemente diluido con la solución metanólica de

DPPH (3,0 mL; 100 µM) durante 2 h a 37 ± 1 °C en oscuridad, y medir la absorbancia a 517

nm con metanol puro como blanco de calibración. En la lectura del blanco de reactivos,

reemplazar la porción de extracto por metanol puro de manera de lograr una absorbancia de

1,05 ± 0,05 unidades a 517 nm. Los resultados deberían ser expresados como equivalentes a

ácido ascórbico o Trolox en porcentaje másico (peso seco), para facilitar posteriores

comparaciones.

• Los extractos etanólicos de yerba mate deberían ser diluidos de forma que la CoPT se

halle entre 90 y 105 µg EAC / mL, en cambio si el extracto se obtiene según la Norma ISO

14502-1 (2004) la CoPT debería estar comprendida entre 130 y 150 µg EAC / mL. Ambos

estándares (ácido clorogénico y ácido gálico) mostraron sencillez de manejo y gran

estabilidad en las condiciones del ensayo. La presencia de cafeína en los extractos no

interfiere en la determinación de CAO. El protocolo propuesto es apropiado para la

determinación de la capacidad antioxidante in vitro de los extractos de I. paraguariensis y

podría contribuir al control de calidad de productos. Su uso podría extenderse a otros

extractos vegetales como té o café.

100

CAPITULO 5

“Efectos del orígen y del procesamiento sobre el contenido de polifenoles”

101

5.1. INTRODUCCIÓN

5.1.1. Estudios sobre composición fisicoquímica y manejo agronómico de yerba

mate

La materia prima de la yerba mate puede proceder de dos manejos culturales: cultivos

naturales (típicos de Brasil y algunas regiones de Paraguay) y plantaciones denominadas

“rosados o yerbales” (típicas de Argentina y Paraguay). En los cultivos naturales (“bajo

cubierta”) los árboles de yerba mate crecen como arboles nativos preferentemente en sub-

bosques de araucarias (Araucaria angustifolia), con poca disponibilidad de luz solar (hasta

60-70% de sombra; Scarminio et al., 2011), limitados en su proceso de fotosíntesis (de allí

su baja producción de biomasa), desde donde son cosechados manualmente. En cambio en

las plantaciones (“monocultivos”), las plantas de yerba mate crecen en grandes extensiones

de terrenos abiertos, en condiciones de exposición solar; este sistema es por lejos más

productivo y consistente que el anterior tanto en calidad como en cantidad.

En el área de la fitoquímica es conocido el hecho de que las condiciones de

crecimiento juegan un importante rol en la producción de estos compuestos en las plantas

(Meyer et al., 2006). El crecimiento en condiciones adversas o “crecimiento bajo stress”,

como la presencia de insectos o incluso la alta exposición a rayos ultravioletas, puede

desencadenar la producción de compuestos destinados a la protección de la planta (Meyer et

al., 2006). Dichos compuestos son generalmente compuestos fenólicos y compuestos

alcaloides. Por ejemplo la cafeína y la teobromina son compuestos alcaloides que resultan

tóxicos para ciertos insectos y hongos, cuya producción en ciertas plantas tolerantes a la

sombra se ve incrementada bajo condiciones de sombra, tal vez como un mecanismo de

protección de la longevidad foliar, pudiendo además jugar un rol como agente químico de

defensa (Hoft et al., 1996; Hoft et al., 1998; Itoyama y Bicudo, 1992).

La especie Ilex es considerada de baja selectividad en cuanto a exigencias nutricionales

(Oliva et al., 2006); en tanto que su composición química, como la de todo producto

agrícola, puede variar significativamente con el tipo de suelo, clima, época, edad de la planta

y las hojas, dimorfismo sexual y características genéticas. En la literatura se reportan

diferencias significativas en el contenido de minerales (N, P, Ca y Mg) en hojas de yerba

mate de diferentes procedencias geográficas en Brasil (Ivaí, PR y Barao de Cotegipe, RS)

(Oliva et al., 2006). Se han encontrado mayores contenidos de polifenoles y menores

102

contenidos de minerales en extractos de yerba mate provenientes de plantas que crecen

expuestas a la luz solar (típicas condiciones dadas en los cultivares de yerba mate,

“yerbales”) que en los provenientes de plantas que crecen a la sombra (típicas condiciones

dadas en plantas nativas) (Heck et al., 2008; Jacques et al., 2007).

Da Croce (2002) evaluó el efecto de la época de cosecha y de las regiones geográficas

de procedencia en Brasil (Regiones: Chapeco, Canoinhas, Irani y Concordia; todas con

suelos y climas bien diferenciados entre sí) sobre varias características físico-químicas de

extractos de yerba mate. El hallazgo más relevante fue un efecto significativo de la época de

cosecha sobre el contenido de cafeína (p ≤ 0,05): siendo éste más bajo en los meses de

brotación (meses de mayor crecimiento vegetativo, septiembre a diciembre) y aumentando a

medida que las hojas maduran. El efecto de la procedencia geográfica brasileña sobre el

contenido de metilxantinas (específicamente cafeína y teobromina) y sobre los ácidos

clorogénico y cafeico también fue reportado por Cardozo et al. (2010).

Streit et al. (2007) evaluaron la composición química asociada al perfil sensorial de

infusiones de yerba mate usando hojas provenientes de dos regiones diferentes del sur de

Brasil (estados de Rio Grande do Sur y Santa Catarina) y dos prácticas culturales (cultivos

nativos y plantaciones) encontrando que existía un efecto significativo tanto de la región

geográfica de procedencia como de la práctica cultural. Las infusiones a partir de plantas

provenientes de cultivos nativos respecto de las provenientes de plantaciones mostraron un

contenido de ácido cafeico significativamente menor y contenidos significativamente

mayores de ácido clorogénico, cafeína, catequina y ácido gálico. Las infusiones a partir de

plantas provenientes del estado de Santa Catarina mostraron un contenido significativamente

mayor de cafeína y ácido gálico que las provenientes del estado de Rio Grande do Sur.

5.1.2. Cosecha y procesamiento de yerba mate

La densidad foliar de la yerba mate tiene variaciones significativas en el año

calendario; sin embargo los niveles de densidad más altos se obtienen a mediados de

septiembre pero decaen bruscamente al comenzar el período de brotación; en la figura 5.1 se

muestran las variaciones de densidad durante el transcurso de dos años (Silva y Rakocevic,

2010).

103

La cosecha de la yerba mate (denominada zafra) se extiende generalmente por un

período de aproximadamente 6 meses. La zafra comienza entre los meses de abril y mayo

(inicio de zafra; IZ) y culmina en el mes de septiembre (fin de zafra; FZ). Como regla

general se evita cosechar cuando la planta se encuentra en etapa de brotación, floración o

fructificación. Este cultivo presenta un crecimiento monopodial y rítmico con dos ciclos de

brotación, que se dan en los meses de marzo a mayo y de septiembre a diciembre (Silva y

Rakocevic, 2010). De acuerdo con Da Croce (2002), el período de mayor brotación se da

entre los meses de septiembre a diciembre; entre enero y marzo las hojas se hallan en una

etapa de maduración intermedia en la que una parte de las hojas han alcanzado su ciclo de

crecimiento y otra parte aun no lo ha alcanzado, mientras que durante los meses de junio a

julio las hojas se encuentran prácticamente maduras, es decir con su ciclo de crecimiento

completo.

Figura 5.1. Crecimiento promedio de plantas de yerba mate bajo dos prácticas culturales (MO, monocultivo, y FUS, bajo cubierta); i corresponde al inicio de mes y f

al final de mes; GU son períodos de crecimiento diferenciados entre si durante un período de dos años (2003-2005). Fuente: Silva y Rakocevic, 2010

De acuerdo a lo mencionado en el capítulo 1, el proceso de industrialización primario

consta de tres etapas: el zapecado, el secado y una molienda gruesa (denominada canchado)

con la que se obtiene la yerba mate canchada.

104

En general existe un alto grado de uniformidad en el tipo de zapecado llevado a cabo

(Nuñez y Känzig, 1995) (Ver ítem 1.2.3).

El secado es la etapa que sigue a la etapa del zapecado; tiene por objetivo reducir el

contenido de humedad de la yerba mate desde el 29-34 % (base húmeda) hasta valores donde

el producto se vuelve estable y puede ser estacionado. En la yerba mate este valor es menor

al 5 % (base húmeda) o actividad de agua de 0,3 (correspondiente a los valores de contenido

de humedad de la monocapa) (Schmalko, 2005). En general en Argentina las condiciones de

trabajo en los establecimientos industriales difieren mucho entre sí, ya sea en el tipo de

secadero utilizado, la temperatura del aire y/o el tiempo de residencia. Sin embargo el

contenido de humedad del producto a la salida es bastante uniforme, encontrándose valores

entre el 2 y el 4 % (base húmeda) (Nuñez y Känzig, 1995). Actualmente se utilizan tres

tipos de secado: i-secado tipo barbacuá, ii-secado tipo cinta y iii- secado rotatorio o tubular.

(Prat Krikum, 1994):

Secado “tipo barbacuá” (también conocido como secadero de catre): en este tipo de

secadero la materia prima se seca durante un período comprendido entre 6 y 24 h sobre un

lecho de ramas. Se trata de secaderos discontinuos con flujo de gases de combustión de leña

a través de dicho lecho, con temperaturas entre 60 y 90 °C. Los secaderos de “catre” tienen

paredes de mampostería y una malla metálica sobre la cual se colocan las ramas en un lecho

de 0,8 a 1,2 m de altura. El gas para el secado (generalmente gas de combustión de leña y

aire) se introduce por tubos, ubicados en la parte inferior y homogéneamente distribuidos,

teniéndose una altura de 2-3 m entre los conductos de alimentación de los gases y la cinta

con el material (Prat Krikum, 1994; Schmalko, 2005).

Secado tipo cinta: este tipo de secado se realiza en secaderos de flujo cruzado continuos. El

material es transportado de un extremo al otro sobre una malla o lecho móvil perforado de

baja velocidad en contacto con aire caliente y gases de combustión de leña, con un tiempo de

residencia que varía entre 2 y 6 h y con temperaturas entre 80 y 130 ºC. Estos secaderos de

cinta son construidos de mampostería pudiendo alcanzar longitudes de hasta 30 m y 5 m de

ancho. Pueden existir secaderos de hasta 3 cintas superpuestas, o en otros casos

consecutivas. El gas de secado (generalmente gas de combustión de leña y aire) se introduce

en la parte inferior por conductos uniformemente distribuidos, pasa a través del lecho de

ramas y sale por chimeneas ubicadas en el techo. El tiro puede ser natural o inducido,

105

utilizándose en este caso ventiladores ubicados a la salida. El lecho de hojas tiene alturas que

varían de 0,7 a 1 m (Prat Krikum, 1994; Schmalko, 2005). El contenido de humedad y la

temperatura del producto y del aire varían a lo largo y alto del lecho. La velocidad de secado

depende de la velocidad y temperatura del aire, el flujo de material, la altura y porosidad del

lecho y el tipo de material (Khankari y Patankar, 1999; Sturgeon, 1995).

Secado rotatorio : en este tipo de secado las ramas se secan en tambores rotatorios, con la

salvedad de que en algunos modelos las ramas no toman contacto directo con los gases de

combustión sino únicamente con aire caliente (secaderos neumáticos). Los tiempos de

residencia en los secaderos rotatorios varían entre 10 y 20 min y las temperaturas son

superiores a los 200 ºC (Prat Krikum, 1994; Schmalko, 2005). Los secadores rotatorios o

tubulares consisten en cilindros giratorios alimentados en un extremo con la materia prima y

los gases de combustión (corrientes paralelas) y son muy similares a los zapecadores.

5.1.3. Estudios sobre composición fisicoquímica y procesamiento

Entre los cambios físico-químicos se citarán estudios referidos a la degradación de

compuestos que guardan relación con la calidad y el valor nutritivo de la yerba mate a lo

largo del procesamiento.

Ramallo et al. (1998b) midieron las modificaciones de la vitamina C durante el

procesamiento, encontrando que en las etapas de zapecado y secado se degradaba el 79 % de

su contenido inicial y además concluyeron que el contenido de vitamina C en los palos era

mucho menor que en las hojas y durante el procesamiento, el contenido de vitamina C en las

hojas disminuía un 90 %.

La degradación durante el procesamiento de dos plaguicidas utilizados en el cultivo de

la yerba mate (cipermetrina y dimetoato) fue estudiada por Escalada et al. (1999) y

Schmalko et al. (1999). En ambos trabajos se concluyó que los plaguicidas sufrían un gran

deterioro durante el zapecado y el secado. La cipermetrina se degradaba un 63,4 % en el

zapecado y un 18,2 % en el secado, mientras que el dimetoato se degradaba un 33 % en el

zapecado y un 52 % en el secado. Además, en el estacionamiento (acelerado) sufrían

degradaciones que reducían la concentración por debajo del límite de detección de los

equipos. Por lo tanto, las concentraciones de salida de estos plaguicidas se encontraban muy

por debajo de los valores máximos permitidos.

106

Paredes et al. (2000a) estudiaron las modificaciones en el contenido de azúcares

(glucosa, fructosa y sacarosa) en las etapas de zapecado y secado y encontraron que durante

el zapecado se producía una disminución del contenido de los azúcares simples y un

aumento de la sacarosa. Además encontraron que las concentraciones de los azúcares

dependían de la época de cosecha y de si las hojas eran jóvenes o maduras. También

estudiaron las variaciones de los azúcares durante el secado cuando el mismo se realizaba

por circulación transversal en condiciones controladas. Encontraron que las variaciones de

tiempo y temperatura no producían variaciones tan importantes como las que se producían

en el zapecado (Paredes et al., 2000b).

Esmelindro et al. (2002) realizaron una caracterización fisicoquímica de yerba mate en

función de las etapas de procesamiento industrial (zapecado, secado y molienda)

encontrando que las etapas de zapecado y secado no afectan significativamente a los

contenidos de cenizas y fibras pero si provocan reducciones en los contenidos de grasas,

proteínas, glucosa, sacarosa y cafeína. En dicho trabajo, que se realizó en Brasil, se

ensayaron dos tipos de secaderos, (rotatorio y cinta), pero las temperaturas y tiempos de

residencia aplicados no fueron especificadas.

Valerga et al. (2011) evaluaron el contenido de polifenoles totales en hojas de yerba

mate (método de Folin Ciocalteau) a lo largo del procesamiento, encontraron que el único

tratamiento que tuvo una incidencia significativa fue el zapecado, ya que las muestras

zapecadas presentaron un contenido de polifenoles totales (98,86 ± 12,15 mg EAG / g ms)

aproximadamente 22 veces mayor respecto al de las hojas frescas, y el mismo se mantuvo

sin variaciones significativas en las etapas sucesivas al zapecado, no aclarando los tipos de

secado y estacionamiento a que fueron sometidas las muestras.

López et al. (2006) analizaron extractos acuosos de Ilex paraguariensis en las distintas

etapas del procesamiento industrial. Hallaron que la capacidad antioxidante disminuyó

significativamente durante el zapecado, pero luego se mantuvo constante durante el secado y

el estacionamiento acelerado.

Los ácidos clorogénicos forman parte de la composición de diversas especies vegetales

y sus frutos. El contenido total de derivados del cafeoil (ácido clorogénico, ácido cafeico, y

107

ácidos mono y dicafeoilquinicos) en hojas frescas de Ilex paraguariensis reportado por

Isolabella et al. (2010) es de aproximadamente 6 % en peso seco (determinado por HPLC).

El único informe encontrado sobre la variación cuantitativa de derivados del cafeoil

durante cada una de las etapas del proceso de industrialización de yerba mate (Isolabella et

al., 2010) informa un aumento del contenido de metilxantinas (cafeína y teobromina) luego

del zapecado y una disminución del mismo luego del secado para mantenerse constante

durante el estacionamiento. Parte de estos resultados concuerdan con Schmalko y Alzamora,

(2001) quienes informaron que la pérdida más significativa de cafeína (alrededor del 20 %)

ocurre durante la etapa de secado.

En el mismo informe (Isolabella et al., 2010) también se reporta un aumento del

contenido totales de compuestos derivados del cafeoil (ácido clorogénico e isómeros del

ácido isoclorogénico: 3,2 DCQ, 3,5 DCQ y el 4,5 DCQ) durante el zapecado respecto de la

hoja fresca (no tan evidente como en el trabajo de Valerga et al. (2011) antes mencionado) y

otro aumento aunque menos pronunciado durante el secado para mantenerse constante

durante el estacionamiento; mientras que el contenido de ácido cafeico se mantuvo

constante a lo largo de dichas etapas. La disrupción celular y al impacto mecánico al que son

expuestas las hojas influyen positivamente sobre la extracción de cafeína y de acido 5-

cafeoilquínico (Bastos et al., 2006).

En la figura 5.2 se muestran los resultados obtenidos por Isolabella et al., (2010) para

el contenido total de derivados cafeoílicos durante las diferentes etapas del procesamiento

industrial; los valores fueron obtenidos por HPLC y representan la media ± error estándar de

tres experimentos llevados a cabo por duplicado.

Murakami et al. (2004) analizaron la estabilidad de diferentes polifenoles frente al

tratamiento térmico y encontraron que el ácido clorogénico era el más estable dentro de los

compuestos analizados. Al tratar térmicamente este compuesto a 100 ºC, luego de 6 h, los

valores de contenido de polifenoles totales y de actividad antioxidante permanecieron

prácticamente constantes; al repetir la experiencia térmica a 180º C luego de 15 minutos, la

actividad antioxidante disminuyó un 20 % y el contenido de polifenoles totales permaneció

cercano al 100 %, a pesar de que el contenido de ácido clorogénico disminuyó (30 %). Esto

implicaría que a 180º C parte del ácido clorogénico se descompone, pero sus productos de

108

descomposición siguen siendo reactivos al reactivo de Folin-Ciocalteau y algunos de ellos

también poseen actividad antioxidante.

Figura 5.2. Contenido total de derivados cafeoílicos durante el procesamiento. Letras diferentes representan diferencias significativas entre las muestras (p < 0,05). Etapas: H: cosecha, Z: zapecado; D: Secado; FA: almacenamiento acelerado; NA:

almacenamiento natural. Fuente: Isolabella et al., (2010).

5.1.4. Objetivos y justificación

El cultivo de la yerba mate se halla ampliamente distribuido en la provincia de

Misiones.

Por lo expuesto la zona de procedencia de la materia prima (dentro de la provincia de

Misiones), el tipo de secado y la época de cosecha podrían afectar tanto al contenido de

polifenoles totales (CPT) como a la capacidad antioxidante (CAO) de los extractos de yerba

mate.

En esta etapa se empleó yerba mate canchada en lugar de yerba mate elaborada como

material vegetal de estudio, como una medida para evitar la confusión de efectos; ya que tal

y como se expuso en el capítulo II, la yerba mate elaborada posee dos etapas industriales

posteriores al secado, que son la molienda y el estacionamiento.

Los objetivos del presentecapítulo fueron evaluar los efectos del origen de la materia

prima, del tipo de secado y de la época de cosecha, sobre el CPT y la CAO de la yerba mate

canchada.


5.2.1. Selección de las zonas productoras y de los establecimientos yerbateros

109

En base a la distribución geográfica de los establecimientos productores de yerba mate,

en la Provincia de Misiones (Figura 5.3) se definieron cuatro orígenes: i- Zona sur:

departamentos de Apóstoles, Concepción de la Sierra y San Javier. Banda latitudinal: S28°

08’ 17’’ - S27° 45’ 00’’; ii- Zona centro: departamentos de Candelaria, Alem, Oberá, San

Ignacio, 25 de Mayo, Cainguás, Guaraní, y parte de Gral. San Martín. Banda latitudinal:

S27° 45’ 00’’- S26° 55’ 00’’; iii- Zona centro-norte: departamentos de Montecarlo, San

Pedro y parte de Eldorado. Banda latitudinal: S26° 55’ 00’’- S26° 22’ 00’’; iv- Zona norte:

departamentos de Iguazú y Gral. Manuel Belgrano. Banda latitudinal: S26° 22’ 00’’- S25°

30’ 00’’.

Figura 5.3. Mapa de Misiones con la ubicación de los establecimientos yerbateros existentes

La selección de los 19 establecimientos yerbateros se llevó a cabo de acuerdo a su

ubicación geográfica, el tipo de proceso de secado utilizado y la procedencia de la materia

prima que acopian (Tabla 5.1). La totalidad de los establecimientos muestreados procesan

material procedente de la misma zona geográfica en que se encuentran ubicados.

5.2.2. Materia prima

Se tomaron 2 muestras de yerba mate canchada (yerba mate seca, molido grueso) en

cada establecimiento industrial, una al inicio de la zafra (meses de abril-mayo de 2009) y

otra al final de la zafra (septiembre de 2009), cosechadas del modo convencional sin

discriminar edad de la hoja ni posición en la planta (tal y como lo realizan los cosechadores).

110

Tabla 5.1 Zonas geográficas y tipos de secado de los establecimientos muestreados.

Establecimiento Secado Orígen 1 Cinta Sur 2 Cinta Sur 3 Barbacuá Sur 4 Barbacuá Sur 5 Tubular Sur 6 Cinta Centro 7 Cinta Centro 8 Barbacuá Centro 9 Barbacuá Centro 10 Tubular Centro 11 Tubular Centro 12 Cinta Centro-Norte 13 Cinta Centro-Norte 14 Barbacuá Centro-Norte 15 Barbacuá Centro-Norte 16 Tubular Centro-Norte 17 Cinta Norte 18 Cinta Norte 19 Tubular Norte

Para cada muestra se realizó un cuarteo sucesivo y posterior remoción manual de las

fracciones de hoja y palo. Se utilizó la fracción de hoja molida que atraviesa una malla de

500 micrómetros de apertura nominal.

5.2.3. Reactivos

Para la determinación de polifenoles totales y capacidad antioxidante se utilizaron los

reactivos mencionados en los ítems 4.2.1.2 y 4.2.2.2, respectivamente.

5.2.4. Equipos

Los equipos utilizados se mencionan en el ítem 4.2.1.3.

5.2.5. Determinación de humedad

111


4.2.1.4.

5.2.6. Preparación del material de vidrio


5.2.7. Preparación de soluciones y patrones

La solución del reactivo de Folin-Ciocalteu (RFCD), la solución de carbonato de

sodio, las soluciones estándar de los ácidos clorogénico y sus respectivas diluciones para las

curvas de calibración se prepararon acordes al ítem 4.2.1.6

La solución stock del radical DPPH°, la solución de DPPH de trabajo; las soluciones

estándar de ácido ascórbico y Trolox y sus respectivas diluciones se prepararon acordes al

ítem 4.2.2.6

5.2.8. Obtención de los extractos y diluciones

Los extractos de yerba mate se obtuvieron acorde a la metodología descripta en el ítem

4.2.1.7. Las extracciones se realizaron por duplicado.

Para la determinación de CPT se utilizó una dilución acuosa 1:100. Para la

determinación de CAO se utilizó una dilución acuosa 1:25 ó 1:30 según fue necesario.

5.2.9. Determinación de polifenoles totales

El CPT se determinó acorde a la metodología descripta en el ítem 4.2.1.8.

5.2.10. Determinación de la capacidad antioxidante

El ensayo consistió en mezclar la muestra diluida, los patrones estándares o el blanco

(metanol) (100 µL) con la solución de DPPH de trabajo (3 mL). Transcurridos 120 min en

oscuridad a 37 ± 1°C se midió la absorbancia de las muestras a 517 nm usando metanol

puro como blanco.

La concentración del radical DPPH en el medio a cualquier tiempo y la capacidad

antioxidante calculada como el % de DPPH remanente fueron calculados según lo descripto

en el ítem 4.2.2.11.

112

La capacidad antioxidante se expresó en g equivalentes a ácido ascórbico (gEAA) y g

equivalentes a Trolox (gET) en 100 g ms (%ms).

5.2.11. Análisis estadístico

Para el análisis de los datos experimentales se realizó un análisis de varianza y

comparación de muestras pareadas (test t) usando Statgraphics Centurion XVI Académico.

Todas las comparaciones fueron realizadas con un nivel de confianza del 95%. Los datos

fueron expresados como media ± error estándar (ee).

5.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El CPT varió entre 19,21 y 24,28 g EAC %ms, con una media global de 21,58 gEAC

%ms. Dicho valor coincide razonablemente con el valor de 22,20 gEAC %ms reportado por

Brumovsky et al. (2009) para extractos de yerba mate elaborada comercial, obtenidos

aplicando la metodología descripta en la norma ISO 14502 (2004), tal como fue aplicada en

el presente trabajo. La CAO varió entre 29,99 y 44,8 gET %ms y entre 21,23 y 31,53 gEAA

%ms con medias globales de 37,42 gET %ms y 26,40 gEAA %ms.

Un resumen de los resultados de CPT (expresados en gEAC %ms) y CAO (expresados

en gET y gEAA en %ms) para todas las muestras analizadas se presenta en la tabla 5.2

(Datos disponibles en Anexo 2, Cuadros B1 y B2) mientras que en la figura 5.3 se visualizan

gráficos de medias con barras de error estándar para las tres variables respuesta estudiadas.

Del análisis de varianza de efectos simples realizado (Datos disponibles en Anexo B,

Cuadros B3 y B4) no surgen evidencias suficientes para afirmar que el origen y el tipo de

secado ejerzan un efecto significativo sobre el CPT y sobre la CAO. En cambio la época de

cosecha sí ejerce un efecto significativo tanto sobre el CPT como sobre la CAO. La media

global del CPT para todos los orígenes y tipos de secado fue de 22,06 gEAC %ms en el

inicio de zafra y de 21,10 gEAC %ms en el final de la zafra. La medias globales de la CAO

fueron de 39,74 gET %ms y 28,01 gEAA %ms en el inicio de la zafra y de 35,10 gET %ms

y 24,78 gEAA %ms en el final de la zafra. Los valores obtenidos permiten afirmar que el

CPT y la CAO de los extractos de yerba mate son mayores al inico de zafra que al final de la

misma. Esto podría atribuirse a las distintas condiciones climáticas (temperatura, humedad

ambiental, intensidad solar, etc.), a la fase de desarrollo de la planta (Silva y Rakocevic,

2010) y a otros factores no identificados que se dan al inicio y al final de la zafra y que

113

podrían afectar al contenido de polifenoles presentes en la planta de yerba mate, ya que

como se mencionó en el ítem 5.1.2 del presente capítulo el inicio de zafra se lleva a cabo al

en los meses de abril-mayo, y que el fin de la zafra se realiza al terminar el invierno (agosto-

septiembre). Según Rakocevic et al. (2011), las hojas de Ilex paraguariensis cultivadas en

yerbales crecen durante aproximadamente seis meses, llegando a los meses de marzo-abril

con edades foliares menores a cinco o seis meses. Uno de los factores no identificados podría

ser el grado de madurez de las hojas (o edad) ya que en abril-mayo el crecimiento foliar sería

entre intermedio y completo (es decir con hojas que completaron su crecimiento foliar y

otras que no) mientras que en septiembre la cosecha ya tendría una mayor proporción de

brotes nuevos. Este efecto de la época de mayor tasa de brotación fue observado sobre el

contenido de cafeína en muestras de yerba mate; durante meses de brotación (período de

mayor crecimiento vegetativo), el contenido de cafeína es relativamente bajo pero aumenta a

medida que la hoja madura (Da Croce, 2002).

Holovaty (2007) evaluó el CPT (Folin-Ciocalteu) y la CAO (reducción del radical

DPPH) de hojas y palos frescos, cosechados en dos épocas del año: noviembre de 2004 (mes

dentro del período de brotación con floración) y en septiembre de 2004 (mes dentro del

período de mayor madurez de las hojas), y reportó que no se encontraron diferencias en

ambas variables con la época de cosecha, tanto en las hojas como en los palos (p ≤ 0,05).

Bortoluzzi et al. (2006) reportaron un mayor contenido de compuestos fenólicos (ácido

clorogénico y ácido gálico) en muestras comerciales obtenidas en octubre (mes dentro del

período de mayor tasa de brotación) respecto de las obtenidas en abril (mes intermedio entre

los períodos de crecimiento foliar intermedio y completo) de 2004. Esta aparente

contradicción con los presentes resultados podría puede justificarse mencionando que otros

compuestos fenólicos presentes en los extractos de yerba mate, especialmente los ácidos

dicafeoilquínicos, contribuyen en la determinación del CPT. Estos autores cuantificaron

únicamente ácido clorogénico y ácido caféico, por cromatografía líquida (HPLC) en

extractos acuosos de yerba mate elaborada comercializada en la ciudad de Toledo, Brasil;

además, este último hecho hace que no se pueda confirmar la época de cosecha. Sin embargo

cabe mencionar que en Brasil, la yerba mate elaborada se comercializa sin ser sometida al

período de estacionamiento que se hace en Argentina.

114

No se hallaron evidencias de la existencia de interacciones dobles entre los factores

origen-época y entre los factores secado-época para el CPT de las muestras (Datos

disponibles en Anexo 2, Cuadro B5 y B6), por lo que la época de cosecha influye de igual

forma en el CPT de los extractos de la yerba mate de todos los orígenes y de todos los tipos

de secado.

No se hallaron evidencias de la existencia de interacción doble entre los factores

origen-época para la CAO de las muestras (Anexo 2, Cuadro B7); por lo tanto la época de

cosecha afecta a la CAO de las muestras de yerba mate independientemente del origen de las

mismas. En cambio se halló interacción significativa entre los factores época y secado para

la CAO (Anexo 2, Cuadro B8). Este resultado nos permite afirmar que los diferentes tipos de

secado inciden de distinta forma sobre la CAO según cual sea la fase de desarrollo en que se

encuentre la planta. Así, por ejemplo en el secado barbacuá no se detectaron variaciones

significativas en la CAO mientras que en los otros dos tipos de secado se halló variación

significativa de la CAO según las épocas de zafra, encontrándose valores mayores en el

inicio de la zafra, tanto para el secado en cinta como para el secado tubular (Anexo 2-Cuadro

B9). Este comportamiento podría deberse a la variación del tratamiento térmico realizado en

cada tipo de secado

115

Tabla 5.2. Valores medios ± error estándar de CPT y CAO en las muestras analizadas.

Muestra Origen Secado Época CPT CAO

ET EAA 300 Centro Cinta IZ 21,98±0,69 43,20±0,46 30,41±0,31 301 Centro Cinta IZ 23,28±0,17 42,73±3,37 30,09±2,34 302 Norte Cinta IZ 24,22±0,06 40,91±0,10 28,83±0,07 303 Norte Cinta IZ 22,74±0,18 36,84±1,95 25,98±1,35 304 Sur Tubular IZ 21,59±0,25 35,79±0,19 25,27±0,13 305 Centro Barbacuá IZ 19,73±0,08 37,22±1,39 26,26±0,97 306 Centro Tubular IZ 21,31±0,20 39,75±2,70 28,02±1,87 307 C-N Cinta IZ 22,79±0,02 44,31±1,22 31,19±0,85 308 Centro Tubular IZ 21,91±0,50 40,46±0,46 28,51±0,32 309 Norte Tubular IZ 23,20±0,20 39,1±0,25 27,64±0,12 310 C-N Tubular IZ 23,08±0,62 44,81±0,29 31,53±0,20 311 C-N Barbacuá IZ 22,55±1,53 37,62±0,69 26,54±0,48 312 Sur Cinta IZ 21,73±0,55 42,99±0,24 30,27±0,17 313 C-N Cinta IZ 21,77±0,41 37,84±2,34 26,69±1,63 314 Sur Barbacuá IZ 21,87±0,28 37,93±0,84 26,75±0,59 315 C-N Barbacuá IZ 21,65±0,24 35,94±0,05 25,37±0,04 316 Sur Cinta IZ 20,91±0,04 41,53±0,12 29,25±0,08 317 Centro Barbacuá IZ 21,28±1,25 38,46±0,54 27,12±0,38 318 Sur Barbacuá IZ 22,09±0,62 37,69±0,03 26,58±0,02 319 C-N Cinta FZ 21,90±0,51 33,54±0,88 23,69±0,61 320 Sur Cinta FZ 20,94±1,08 32,43±0,80 22,93±0,55 321 C-N Barbacuá FZ 20,12±0,57 34,70±1,10 24,50±0,77 322 Sur Barbacuá FZ 20,79±0,60 37,01±0,02 26,12±0,02 323 C-N Barbacuá FZ 20,08±1,53 37,26±0,59 26,29±0,41 324 C-N Cinta FZ 20,46±0,59 35,78±0,40 25,25±0,27 325 Centro Cinta FZ 20,43±0,20 35,20±0,98 24,85±0,68 326 Centro Cinta FZ 20,14±0,20 30,97±0,88 21,91±0,61 327 Norte Tubular FZ 20,50±0,80 39,70±0,61 27,98±0,42 328 Norte Cinta FZ 21,12±0,15 37,90±0,19 26,72±0,13 329 Norte Cinta FZ 20,92±0,10 31,22±1,97 22,08±1,37 330 Centro Barbacuá FZ 22,48±1,37 40,52±0,28 28,55±0,19 331 C-N Tubular FZ 23,82±0,20 37,01±0,51 26,11±0,35 332 Sur Tubular FZ 21,91±0,32 33,63±0,86 23,75±0,60 333 Centro Tubular FZ 21,49±0,05 34,18±2,35 24,15±1,63 334 C-N Cinta FZ 24,28±0,66 32,67±1,18 23,09±0,82 335 Centro Tubular FZ 20,10±0,71 30,98±0,08 21,23±0,06 336 sur Barbacuá FZ 21,51±0,96 37,83±0,62 26,67±0,43 337 centro Barbacuá FZ 19,65±0,43 35,41±0,41 24,99±0,28

CPT: Contenido de polifenoles totales (g EAC % ms); EAC: equivalentes a ácido clorogénico; ms: masa seca; CAO: Capacidad antioxidante (g ET %ms y g EAA %ms); ET: equivalente a Trolox; EAA: equivalente a ácido ascórbico. IZ: Inicio de zafra; FZ: Final de zafra. C-N: Centro-norte.Datos expresados como media ± error estándar.

116

Figura 5.3. Gráfico de medias y barras de error estándar .CPT: Contenido de polifenoles totales, en g EAC %ms; CAO: Capacidad antioxidante, en g ET %ms y

g EAA %ms (EAC: equivalentes a ácido clorogénico; ET: equivalente a Trolox; EAA: equivalente a ácido ascórbico; ms: masa seca; FZ: fin de zafra; IZ: inicio de zafra)

117

Tabla 5.3. Estadísticos descriptivos de las variables

Variable respuesta: CPT (gEAC %ms) Recuento Media Error estándar ORÍGEN Centro 12 21,69 0,426 Centro-Norte 11 21,28 0,404 Norte 6 22,17 0,534 Sur 9 21,42 0,304 SECADO Barbacuá 12 21,04 0,384 Cinta 16 21,61 0,309 Tubular 10 22,18 0,350 EPOCA FZ 19 21,10 0,298 IZ 19 22,06 0,250

Variable respuesta: CAO (gET %ms) Recuento Media Error estándar ORIGEN Centro 12 37,34 1,240 Centro-Norte 11 37,40 1,177 Norte 6 37,61 1,403 Sur 9 37,42 1,121 SECADO Barbacuá 12 37,29 0,434 Cinta 16 37,50 1,155 Tubular 10 37,44 1,333 EPOCA FZ 19 35,10 0,673 IZ 19 39,74 0,652

Variable respuesta: CAO (gEAA %ms) Recuento Media Error estándar ORIGEN Centro 12 26,34 0,862 Centro-Norte 11 26,38 0,819 Norte 6 26,54 0,979 Sur 9 26,40 0,780 SECADO Barbacuá 12 26,31 0,302 Cinta 16 26,45 0,803 Tubular 10 26,42 0,927 EPOCA FZ 19 24,78 0,468 IZ 19 28,01 0,453 CPT: Contenido de polifenoles totales (gEAC %ms); EAC: equivalentes a ácido clorogénico; ms: masa seca; CAO: Capacidad antioxidante (gET %ms y gEAA %ms); ET: equivalente a Trolox; EAA: equivalente a ácido ascórbico. IZ: Inicio de zafra; FZ: Final de zafra

118


• No se encontró efecto del orígen ni del tipo de secado sobre el CPT de los extractos

de la yerba mate.

• El efecto de la época de cosecha influye sobre el contenido de polifenoles totales

(CPT) de los extractos de la yerba mate independientemente del origen y del tipo de secado

al que fuera sometida la hoja verde. El CPT para el inicio de zafra es 4,5 % mayor respecto

del valor para el final de zafra correspondiente al año 2009; esto podría deberse a la

distribución de edades foliares en el material cosechado.

• La época de cosecha (la cual guarda relación con la fase de desarrollo del cultivo)

afecta a la CAO de los extractos de yerba mate independientemente del origen de las

muestras.

• Los diferentes tipos de secado inciden de distinta forma sobre la CAO según se trate

del inicio o del final de la zafra. En el secado tipo barbacuá no se detectaron variaciones

significativas en la CAO mientras que en los otros dos tipos de secado (cinta y tubular) se

halló variación significativa de la CAO según las épocas de zafra, encontrándose valores

mayores en el inicio de la zafra, tanto para el secado en cinta como para el secado tubular.

• EL CPT varió entre 19,21 y 24,28 gEAC %ms con un valor medio de 21,58 gEAC %

ms.

• La CAO varió entre 21,23 y 31,53 gEAA %ms (29,99 y 44,8 gET %ms) con valor

medio de 26,40 gEAA %ms (o 37,42 gET %ms).

• Los resultados encontrados demostraron que si se quiere obtener extractos de yerba

mate con altos CPT y CAO se debe trabajar con materia prima cosechada al inicio de zafra.

119

CAPITULO 6

“Optimización de la extracción”

120

6.1. INTRODUCCIÓN

6.1.1. Extracción de compuestos fenólicos

Existen numerosos trabajos publicados que comprueban que ciertos factores como la

temperatura de extracción (Wettasinghe y Shahidi, 1999), la polaridad del solvente

(Turkmen y Sari, 2006), y la relación sólido/solvente (Cacace y Mazza, 2003) pueden influir

en forma directa sobre la extracción de polifenoles. Por citar ejemplos para la extracción de

polifenoles, soluciones extractivas de metanol absoluto (en té; Yao et al., 2006) y de acetona

al 50 % (en trigo; Zhou y Yu, 2004) resultaron ser más efectivas que el agua. En cambio

Khokhar y Magnusdotti´r (2002) encontraron al agua como el mejor solvente para extraer

catequinas de té, en comparación con metanol al 80 % y etanol al 70 %. Hayouni et al.

(2007) reportaron que tanto agua como diferentes solventes usados en forma individual o en

mezclas tales como acetona/agua/ácido acético (90/9,5/0,5) y acetato de etilo/metanol/agua

(60/30/10) afectaban significativamente el CPT de extractos frutales de Quercus coccifera

L. y Juniperus phoenicea L. Yu et al. (2005) reportaron que para la extracción de

compuestos fenólicos totales a partir de la piel de maní, tanto soluciones metanólicas como

etanólicas al 80 % resultan más efectivas que el agua.

Hay evidencias de la efectividad del etanol en la extracción de polifenoles a partir de

varios tejidos vegetales: granos de soja (Jokić et al., 2010), té negro y verde (Astill et al.,

2001), salvia (Durling et al., 2007), semillas de uvas (Shi et al., 2003; Yilmaz y Toledo,

2006) y arándanos (Dragović-Uzelac et al., 2010). Spigno et al. (2007) encontraron que a

mayores proporciones de agua en soluciones extractivas etanol:agua (concentraciones de

etanol inferiores al 50 %) se reduce la extracción de polifenoles a partir de uvas. Rostango et

al. (2004) encontraron que es necesario el agregado de cierta cantidad de agua (30-40 %) en

la solución extractiva para aumentar la extracción de compuestos fenólicos a partir de granos

de soja (ricos en isoflavonas); mientras que si el contenido de agua es mayor al 60 % la

eficiencia de extracción de los mismos compuestos se ve reducida.

Es sabido que la reducción del tamaño de partículas contribuye a mejorar la velocidad

y la eficiencia de extracción de cualquier compuesto bioactivo. Dos formas de lograrlo son

mediante la molienda (reducción a escala macromolecular) y el agregado de enzimas

(reducción a escala micromolecular). Varios estudios reportaron un incremento en la

eficiencia de extracción de polifenoles por el agregado de pectinas (Furhman et al., 2001;

121

Landbo y Meyer, 2001); sin embargo este incremento no siempre fue traducido en un

aumento de la capacidad antioxidante.

6.1.2. Extracción de polifenoles a partir de yerba mate

En referencia a la extracción de polifenoles a partir de yerba mate, se han empleado

varios solventes: agua (Dudonné et al., 2009; Markowicz Bastos et al., 2006; Schinella et al.,

2000; Turkmen y Sari, 2006), acetona, metanol y etanol en diferentes soluciones

hidroalcohólicas (Pineda Rivelli et al., 2007; Turkmen y Sari, 2006). Sin embargo la

literatura sobre la evaluación de diferentes sistemas de extracción de polifenoles a partir de

yerba mate es muy escasa.

Hasta la fecha únicamente en dos trabajos se comparó el CPT a partir de diferentes

soluciones extractivas (Pagliosa et al., 2010; Turkmen y Sari, 2006).

Turkmen y Sari (2006) analizaron el efecto de diferentes soluciones extractivas a

temperatura ambiente (agua y acetona, metanol, etanol en concentraciones 50 %, 80 % y 100

%) sobre el CPT y la CAO a partir de té negro y yerba mate. Todos los extractos preparados

con 50 % de solvente mostraron los niveles de CPT más altos, seguidos por aquellos con 80

y 100 %. Los contenidos más bajos se obtuvieron con acetona y etanol al 100 %,

concluyéndose que con incrementos en la polaridad de la solución extractiva (reduciendo la

proporción de alcohol o acetona) utilizada se logran mayores valores de CPT. En la tabla 6.1

se presenta un resumen parcial de los resultados obtenidos en dicho trabajo.

Pagliosa et al. (2010) compararon los contenidos de metilxantinas y compuestos

fenólicos además de la capacidad antioxidante de hojas y cortezas de ramas (diámetro mayor

a 10 mm; descartadas como residuo durante la cosecha) de yerba mate cosechadas (Brasil,

agosto de 2007) a partir de 30 árboles maduros (más de 20 años) usando dos soluciones

extractivas a 85 ± 1 °C: metanol/agua (80/20 v/v) y agua destilada. Los extractos acuosos de

las cortezas presentaron menores CPT que los metanólicos (12,5 y 17,5 g equivalentes a

ácido gálico (gEAG) en 100 g de muestra seca (%ms), respectivamente; p ≤ 0,05), mientras

que en el caso de los extractos de hojas, la relación se invirtió (7,01 y 5,21 gEAG %ms,

respectivamente; p ≤ 0,05); sugiriendo que la solubilidad de los compuestos fenólicos

presentes en ambos materiales vegetales es diferente.

122

Tabla 6.1 Efecto de diferentes solventes sobre el contenido de polifenoles totales y la capacidad antioxidante

Solvente CPT

(mg EAG / g ms)

CAO (%)

Agua 64,2 ± 1,36 61,2 ± 0,89

Acetona

50% 120,4 ± 1,49 93,7 ± 0,18

80 % 113,4 ± 1,00 94,2 ± 0,30

100% 2,6 ± 0,44 Nd

Etanol

50% 106,1 ± 3,24 94,3 ± 0,53

80 % 83,5 ± 2,66 78,7 ± 1,13

100% 4,8 ± 0,06 4,7 ± 0,75

Metanol

50% 96,6 ± 2,63 89,6 ± 0,17

80 % 85,6 ± 1,60 82,0 ± 1,20

100% 35,5 ± 0,36 40,0 ± 1,73

Datos expresados como media ± desvío estándar de tres experiencias. nd = no detectado. EAG: equivalentes a ácido gálico; ms: masa seca. Adaptado de Turkmen y Sari (2006)

6.1.3. Objetivos y justificación

El objetivo del presente trabajo fue evaluar diferentes mezclas etanol-agua y

diferentes relaciones líquido/sólido para maximizar la extracción de polifenoles totales

(CPT) a partir de yerba mate. Para ello se usaron diferentes proporciones de etanol/agua; la

elección de ambos solventes (etanol y agua) para los diferentes ensayos se basó en las

conclusiones de Pagliosa et al. (2010) y de Turkmen y Sari (2006). En principio la

extracción acuosa presentaría la desventaja competitiva de ser inadecuada para la extracción

123

de compuestos antioxidantes de baja polaridad o liposolubles; sin embargo estos compuestos

no representan grupos importantes entre los compuestos antioxidantes de la yerba mate. Por

otro lado, la elección de etanol en lugar de acetona se respaldó en que este alcohol es un bio-

solvente generado a partir de fermentación de azúcares o almidones, con posibilidades de ser

reciclado, constituyendo un elemento básico para el desarrollo de procesos sustentables.

También se consideró el uso potencial en alimentos y nutracéuticos de los extractos en polvo

de yerba mate.

Un segundo objetivo fue comparar los valores de CPT extraíbles al emplear ambos

solventes puros (agua y etanol) en sus puntos de ebullición normales y con metanol, dado

que éste último es el solvente usado en la normativa ISO referente a extracción de

polifenoles en té.



Se utilizó un lote de yerba mate canchada obtenido en un establecimiento industrial en

Apóstoles, Argentina.

Cada fracción (hojas y palos) fue manualmente separada y molida (malla de 1 mm). Se

utilizó la fracción de hoja molida retenida en un tamiz de 40 mesh. La fracción de palos

retenida en un tamiz de 40 mesh se utilizó únicamente durante la comparación del CPT de

cada fracción.

6.2.2. Reactivos

Para las extracciones se utilizó etanol (Bioalcohol, Argentina; 96°) y metanol (Merck,

Argentina; grado HPLC).

Para la determinación de polifenoles totales y de capacidad antioxidante se utilizaron

los reactivos mencionados en el ítem 5.2.3.

Para la determinación de cafeína se utilizaron los siguientes reactivos: cafeína (Sigma

Ultra, Argentina; 99 % de pureza-catálogo C8960) y metanol (Merck, Argentina; grado

HPLC).

124

6.2.3. Equipos

Las determinaciones de cromatografía HPLC se realizaron utilizando un detector

espectrofotométrico UV-Vis (Waters, modelo 481). El baño termostatizado usado fue un

Dubnoff Metabolic Shaking Incubator (GCA Corporation; Precision Scientic Group; USA).

Los demás equipos utilizados en el presente trabajo se detallan en el ítem 4.2.1.3.

6.2.4. Determinación de humedad


4.2.1.4.




La solución del reactivo de Folin-Ciocalteau diluido, la solución de carbonato de

sodio, las soluciones estándar de los ácidos clorogénico y sus respectivas diluciones para las

curvas de calibración se prepararon acordes al ítem 4.2.1.6.

La solución stock del radical DPPH°, la solución de DPPH de trabajo, las soluciones

estándar de ácido ascórbico y Trolox y sus respectivas diluciones se prepararon acordes al

ítem 4.2.2.6.

6.2.7. Planeamiento factorial y análisis de datos

La extracción se optimizó siguiendo un diseño de superficie de respuesta incompleto

de dos factores con cuatro repeticiones en el punto central, constituido por 12 ensayos por

duplicado, ejecutados en orden aleatorio. Las variables respuesta fueron: contenido de

polifenoles totales (CPT), contenido de cafeína (CC), capacidad antioxidante (CAO) y

concentración de polifenoles totales (CoPT) (Tabla 6.2).

Las variables de diseño fueron i-la relación líquido/sólido (X1, g líquido/g sólido seco),

en el rango 5-11 g líquido/g sólido seco y ii- la concentración de etanol (X2, % p/p so/sn) en

el rango 15-85 % p/p so/sn. Los valores codificados de las variables de diseño fueron

125

determinados como xi=(Xi-X io)/∆xi, donde xi es el valor codificado de la i-esima variable, Xi

es el valor real de la i-ésima variable y Xio es el valor real de la i-ésima variable en el punto

central y ∆xi fue el factor de incremento. Los factores de incremento (∆x1 = 2 g líquido / g

sólido seco; ∆x2 = 25 g etanol / 100 g de líquido) se estimaron en base al trabajo de

Sambiasi et al. (2002). Los valores reales seleccionados para las dos variables en el punto

central fueron X10 = 8 g líquido / g sólido seco y X20 = 50 g etanol / 100 g de líquido;

(entiéndase como líquido a la suma de las masas de etanol y agua).

Tabla 6.2 Listado de abreviaciones empleadas en el presente capítulo

Abreviación Variable Unidades Técnica analítica CPT Contenido de

polifenoles totales g equivalentes de ácido clorogénico / 100 g de sólido seco (% ms)

Punto 6.2.10

CoPT Concentración de polifenoles totales

g equivalentes a ácido clorogénico / 100 mL de extracto

Punto 6.2.10

CC Contenido de cafeína g de cafeína / 100 g de sólido seco (% ms)

Punto 6.2.12

CAO-EAA Capacidad antioxidante

g equivalentes a ácido ascórbico / 100 g de sólido seco (EAA % ms)

Punto 6.2.11

CAO-ET Capacidad antioxidante

g equivalentes a Trolox / 100 g de sólido seco (ET % ms)

Punto 6.2.11

Se eligió 60 °C como temperatura para la extracción acuosa y para las extracciones

correspondientes al diseño experimental debido a que la misma es una temperatura

relativamente alejada de los puntos de ebullición normales de ambos solventes puros (agua y

etanol); su empleo aseguraría la no ebullición de las mezclas.

En la tabla 6.3 se presenta el diseño factorial utilizado para la optimización y las demás

extracciones utilizadas a lo largo del trabajo.

El ajuste a los datos experimentales se realizó por regresión no lineal con un polinomio

de segundo orden con interacción (Ec. 6.1), usando el método de Marquardt. En la ecuación

6.1, Y representa la respuesta predicha, a0, a1, a2, a11, a22 y a12 son los coeficientes estimados

y X1 y X2 son las variables independientes no codificadas.

Y = a0+a1*X 1+a2*X 2+a11*X 12+a22*X 2

2+a12*X 1*X 2 6.1

126

Para evaluar el ajuste de los modelos de superficie de respuesta se empleó como

criterio al Error Promedio Porcentual (EMP) y al coeficiente de determinación (R2). El EMP

se calculó con la ecuación 6.2, donde N representa el número de datos experimentales. El

objetivo de los puntos centrales fue estimar el error puro y la curvatura.

∑−

=exp

exp100 EMP

Y

YY

N

pred 6.2

6.2.8. Extracciones adicionales

Adicionalmente a las extracciones correspondientes al diseño experimental, se ensayaron

cinco extracciones adicionales:

• Extracción “control” (sistema extractivo 1): Se realizó por considerarla la extracción

control.

• Extracción acuosa (sistema extractivo 2): Su elección se basó en la hipótesis inicial:

“el empleo de agua a 60°C constituiría el sistema extractivo menos eficiente”.

• Extracción adicional (sistema extractivo 12): Se ensayó para evaluar algún indicio

del efecto de la temperatura de extracción sobre el CPT.

• Extracción adicional (sistema extractivo 13): Se ensayó para verificar la predicción

de los modelos en base a la superposición de máximos.

• Extracción adicional (sistema extractivo 14): Se ensayó para verificar que el empleo

de etanol comercial (96°) efectivamente reduce la extracción de polifenoles.

6.2.9. Obtención de los extractos y diluciones

Para la comparación del CPT de las fracciones hoja y palo, los extractos de cada

fracción fueron obtenidos según la metodología descripta en el ítem 4.2.1.7. Las extracciones

se realizaron por duplicado. La muestra (0,2 ± 0,001 g) se mezcló con metanol (5 mL, 70 %

v/v, 70 °C) en un tubo usando un agitador de tubos (10 min). Luego se enfrió a temperatura

ambiente y se centrifugó (10 min, 1800 rpm); el sobrenadante se recolectó. El paso de

127

extracción se repitió una vez más. Los sobrenadantes se combinaron y se ajustó el volumen

(10 mL, metanol, 70 % v/v, 25°C). El extracto se diluyó en proporción volumétrica 1:100

(extracto:agua) (ISO 14502-1, 2004).

El sistema extractivo 1 considerado como el método de extracción “total”, consistió en

la extracción metanolica descripta en el párrafo anterior y empleando unicamente la fracción

de hojas.

Para la determinación del tiempo de extracción, se mezcló la muestra (fracción hojas,

30 ± 0,001 g ms) con agua (240 ± 1 g, 60 ± 2 °C) en un erlenmeyer (500 mL) y se mantuvo

en un baño (60 ± 1 °C; 10, 20, 30, 50, 60 y 120 min; 200 rpm). Luego el sobrenadante se

filtró (diámetro de poro: 1 mm) y se registró el volumen recolectado (agua; sistema 2; ver

Tabla 6.3). El sistema extractivo utilizado para la selección del tiempo de extracción se basó

en la hipótesis inicial: “el empleo de agua a 60°C constituiría el sistema extractivo menos

eficiente”.

Los extractos de yerba mate para el diseño experimental se prepararon por duplicado

acorde al sistema 2 pero reemplazando el agua por cierta cantidad de solución extractiva

(agua y etanol al 96°; acorde al diseño experimental) durante 30 min (sistemas 3 al 11; ver

Tabla 6.3).

Adicionalmente se probaron por duplicado tres sistemas extractivos: sistema 12 (idem

al sistema 2 pero a 95 ± 2 °C), sistema 13 (idem al sistema 10 pero con etanol al 40 %) y

sistema 14 (idem al sistema 10 pero con etanol al 96 %). Los sobrenadantes fueron unidos y

filtrados (diámetro de poro: 1 mm), se registró el volumen recolectado y se almacenaron a -

21 °C.

Antes de las determinaciones analíticas, los extractos fueron centrifugados (5 min) y

diluidos (1:5, 1:8 o 1:9 y luego 1:100 para determinar CPT y 1:50-1:200 para determinar

CAO y CC).

128

Tabla 6.3. Diseño de las extracciones empleadas con X1: relación líquido a sólido (g líquido/g sólido seco) y X2: concentración de etanol (% p/p).

Sistema extractivo

N° Sistema

extractivo

Variables independientes TemperaturaTiempo

Valores codificados

Valores reales

x1 x2 X1 X2 (°C) (min)

Control 1 - - * ** 70±1 10-10

Acuoso 2 - - 8 0 60±1 30

De diseño

3 -1 -1 6 25 60±1 30

4 -1 1 6 75 60±1 30

5 1 -1 10 25 60±1 30

6 1 1 10 75 60±1 30

7 1,41 0 10,82 50 60±1 30

8 -1,41 0 5,18 50 60±1 30

9 0 1,41 8 85,25 60±1 30

10 0 -1,41 8 14,75 60±1 30

11 0 0 8 50 60±1 30

Adicionales

12 - - 8 0 95±2 30

13 - - 8 40 60±1 30

14 - - 8 96 60±1 30

*X 1: 50 g líquido / g sólido; **X2: 70% v/v metanol / agua

6.2.10. Modelado de la extracción acuosa

Los modelos matemáticos para describir la curva de extracción acuosa (contenido de

polifenoles totales vs. tiempo) fueron tres: modelo de Peleg (1988) (Ec. 6.3), modelo

logarítmico (Ec. 6.4) y modelo propuesto por Pilosof et al. (1985) (Ec. 6.5).

CPT�t�=t

K1+ t*K2 6.3

CPT �t�=a* log�t�+b 6.4

CPT�t� =9∗;

<; 6.5

En la ecuación 6.3, CPT(t) es el contenido de polifenoles totales al tiempo t (expresado

en %ms); t es el tiempo de extracción (en minutos), K1 constante de velocidad de Peleg (en

129

min * %ms / g) y K2 constante de Peleg de capacidad en (100 g ms / g). La constante K1 se

relaciona con la velocidad de extracción (vo) a tiempo inicial (t=t0) (Ec. 6.6). La constante

K2 se relaciona con el máximo CPT en el equilibrio, (Ec. 6.7) esto es CPTe cuando t→∞.

vo=1

K1 6.6

CPT�t→ ∞� = CPTe =

@

A. 6.7

En la ecuación 6.4, a y b son las constantes del modelo logarítmico, CPT(t) en el

contenido de polifenoles totales al tiempo t, expresadas en g %ms y t es el tiempo de

extracción en minutos.

En la ecuación 6.5, a representa el máximo CPT alcanzado expresado en %ms y b el

tiempo necesario para lograr un CPT igual a la mitad del CPT máximo expresado en

minutos.

6.2.11. Determinación del contenido de polifenoles totales

El CPT se determinó acorde a la metodología descripta en el ítem 4.2.1.8. El CPT se

expresó como g equivalentes a ácido clorogénico (gEAC) en 100 g muestra seca (%ms) a

partir de la curva de calibración.


La CAO se determinó acorde a la metodología descripta en el ítem 5.2.10.


antioxidante calculada como el porcentaje de radical de DPPH remanente (% R) fueron

calculados según lo descripto en el ítem 4.2.2.11.

La capacidad antioxidante se expresó en g equivalentes a ácido ascórbico (EAA) y g

equivalentes a Trolox (ET) en 100 g muestra seca (EAA %ms y ET %ms) a partir de las

curvas de calibración detalladas en el apartado 4.3.2.

6.2.13. Determinación del contenido de cafeína

El contenido de cafeína (CC) se determinó por duplicado por cromatografía líquida de

alta resolución (HPLC) (IRAM 20512, 2003) y se expresó como g de cafeína/100 g ms

130

(%ms). Se usó una columna C18 (Ultrasphere; 250 mm × 4.6 mm., Beckman. USA) con un

diámetro de partícula de 5 µm, una fase móvil de metanol:agua (30:70 v/v), con un caudal de

1,1 mL / min y a 280 nm usando un detector espectrofotométrico UV-Vis. Como patrón de

referencia se utilizó cafeína.


Los datos experimentales obtenidos se expresaron como media ± error estándar (ee).

Los análisis empleados fueron: análisis de regresión múltiple no lineal (p ≤ 0,05), análisis de

correlación (Pearson) y prueba t (Student), usando Statgraphics Centurion XVI Académico.


6.3.1. Experiencias preliminares y modelado de la extracción acuosa

Para la selección de la materia prima se comparó el CPT de las fracciones de hojas y

palos de yerba mate canchada (seca, molido grueso) extraíble empleando el sistema

extractivo 1; se encontró que el CPT de los palos es 36% menor al de las hojas (14,1 ± 1,24 y

22,2 ± 0,14 %ms respectivamente; p ≤ 0,012). Los datos están disponibles en el Anexo 3-

Cuadros C1 y C2 para el sistema extractivo 1). Por esta razón se eligió la fracción hojas

como materia prima para las extracciones. Hollovaty (2007) reportó CPT de 6,6 y 17,3 %ms,

para las fracciones de palos y hojas de yerba elaborada respectivamente. Estas diferencias

entre grupos de investigación pueden atribuirse a la falta de estandarización en la extracción

y la determinación del CPT y a diferencias en el material utilizado.

La diferencia en el CPT de las hojas y de los palos podría deberse a la distinta

composición y función de los tejidos en estos materiales. Mientras que en las hojas se

realizan muchas funciones metabólicas, el tallo sirve fundamentalmente para la circulación y

transporte de los metabolitos. En las hojas, el ácido clorogénico, uno de los componentes

mayoritarios de los compuestos fenólicos en la yerba mate, participa del ciclo de Calvin de la

fotosíntesis; en cambio en los tallos prácticamente no hay cloroplastos, siendo escasa la

fotosíntesis. Se demostró con isótopos radiactivos que los ácidos clorogénicos en su mayoría

se incorporan como lignina a las hojas de papas (Taylor y Zucker, 1996).

Los compuestos fenólicos se originan principalmente a partir de carbohidratos simples

(fotosintatos), a través de la vía del ácido siquímico que genera fenilalanina (y tirosina) que

131

es transformada a ácido cinámico mediante la enzima fenilalanina liasa. Ante estímulos

externos, como ataques por insectos o por hongos, se incrementa la concentración de dicha

enzima y aumenta el contenido de compuestos fenólicos, que funcionarían como metabolitos

de defensa vegetal. Los más simples actuarían como fitotóxicos o inhibiendo el crecimiento

de otras plantas competidoras en la vecindad. Los más complejos estarían representados por

los polímeros ligninas, que unidos covalentemente a la celulosa y otros polisacáridos,

aumentarían la indigestibilidad para los herbívoros; la lignificación en los vegetales bloquea

el crecimiento de patógenos y es la respuesta frecuente a la infección (Taitz y Zieger, 1991).

El CPT de las hojas usando el sistema 1 fue considerado como el valor máximo

posible de CPT y dicha extracción se consideró como extracción control para las sucesivas

extracciones.

La curva de extracción acuosa de polifenoles totales correspondiente a los datos de la

Tabla 6.4 (CPT vs. Tiempo; Fig. 6.1) muestra un aumento de la eficiencia de extracción con

el tiempo. A partir de dichos datos se observa una velocidad de extracción inicial alta,

seguida de la velocidad de extracción menor que se aproxima asintóticamente al CPT de

equilibrio. Mas precisamente, durante los primeros 10 min se logró una extracción cercana

al 69 % del CPT de equilibrio, logrando a los 20 min una extracción cercana al 82 % del

CPT de equilibrio, bajo las condiciones dadas. El equilibrio de extracción acuosa de

polifenoles totales se alcanzaría a partir de los 30 minutos, con un valor experimental de

equilibrio de 11,3 ± 0,18 %ms (sistema 2). En la tabla 6.4 se presentan los valores medios

del CPT obtenidos a partir de diferentes tiempos de extracción (datos disponibles en Anexo

3- Cuadro C3).

En la figura 6.1 se muestra la curva de extracción basada en los valores experimentales

y los predichos por los modelos de Peleg y Pilosof. En la tabla 6.5 se presentan los valores

para las constantes de los modelos matemáticos, los coeficientes de determinación y la raíz

media de la desviación al cuadrado (RMSD) aplicados a la extracción acuosa (análisis

estadístico disponible en anexo C-Cuadro C4). En el caso de los modelos de Peleg y Pilosof,

los R2 fueron altos y las raíces medias de la desviación al cuadrado estuvieron en el rango

0,45 a 0,51, lo cual implica una buena concordancia entre los valores experimentales y los

valores predichos por ambos modelos. En realidad ambos modelos, son algebraicamente

idénticos, con K1= a*b-1 y K2=a-1.

Tabla 6.4 Contenidextracción emple

Tie

Valodos

Figura 6.1. Comparacde extracción (sistema extra

Una razón más por las q

compuestos polifenólicos es

presentes en el medio acuoso

nido de polifenoles totales obtenido a diferenpleando el sistema extractivo 2 (extracción a

Tiempo (s) CPT (%ms)

0 0 ± 0

10 8,17 ± 0,01

20 9,77 ± 0,03

30 11,39 ± 0,02

50 10,46 ± 0,04

60 11,31 ± 0,18

120 11,32 ± 0,16

alores corresponden a media ± DE de os muestras analizadas por duplicado.

ración de datos experimentales de CPT en futractivo 2) y datos obtenidos mediante el ajus

de Pilosof y de Peleg

as que las extracciones acuosas serían poco efic

es debido a la actividad de las enzimas

oso, las cuales en medios hidroalcohólicos per

132

entes tiempos de acuosa)

función del tiempo juste de los modelos

ficientes para extraer

polifenol-oxidasas

permanecen inactivas

133

(Lapornik et al., 2005); aunque al tratarse de yerba mate canchada la misma ha sido sometida

al proceso de zapecado el cual inactiva enzimas (Capítulo 2).

En un principio y en base a la bibliografía específica analizada, la extracción acuosa a

temperatura inferior a la temperatura de ebullición fue considerada como la extracción

potencialmente más ineficiente; de allí que se eligió 30 min como tiempo de extracción para

las extracciones del diseño experimental.

Tabla 6.5 Constantes de los modelos matemáticos, coeficientes de determinación y raíces medias de las desviaciones al cuadrado (RMSD) correspondientes a la extracción

acuosa de polifenoles totales

Modelo Constantes Coeficiente de

determinación

(R2; en %)

Raíz media de la

desviación al

cuadrado

(RMSD)

Peleg K1 =0,3518 (min*100 g ms/g)

K2 = (0,0837 100 g ms/g)

98,72 0,510

Logarítmico a=1,208

b=6,079 (g EAC/100 g ms)

69,74 2,449

Pilosof a=11,93 (g EAC/100 g ms)

b= 4,2 min

98,72 0,455

.

6.3.2. Análisis de correlación

En la tabla 6.6 se presenta el análisis de correlación con datos del coeficiente de

Pearson en el área triangular inferior a la diagonal de 1 y los correspondientes datos de

probabilidad en el área triangular superior a la diagonal de 1, para las variables: CPT, CAO-

EAA, CAO-ET y CC empleando extractos correspondientes a los sistemas extractivos 3 al

11 (el correspondiente análisis estadístico se halla disponible en el Anexo 3-Cuadro C10 y

134

C11). Existe una fuerte asociación lineal directa entre CPT y cualquiera de las formas de

expresar CAO, como puede apreciarse en la figura 6.2, mientras que la asociación del CPT

con el CC es una asociación lineal directa débil. No se encontró relación lineal entre CAO y

CC.

La diferencia en el CPT entre ambas fracciones (hojas y palos) y por otro lado la alta

correlación entre estos y su CAO, indican que los aportes de polifenoles totales en la yerba

mate elaborada estarán determinados fundamentalmente por la proporción hojas:palos que

contenga el producto comercial. Esta proporción normalmente es del 80:20 hojas:palos. Por

lo tanto, las yerbas elaboradas sin palo (despaladas) presentarían amplias ventajas respecto

del producto elaborado con palo, desde el punto de vista de sus propiedades antioxidantes.

Tabla 6.6 Análisis de correlación (coeficiente/probabilidad)

CPT CAO-EAA CAO-ET CC CPT 1 <10-4 <10-4 0,03 CAO-EAA 0,92 1 <10-4 0,12 CAO-ET 0,92 1 1 0,12 CC 0,45 0,32 0,32 1

Figura 6.2. Análisis de regresión entre el contenido de polifenoles totales y la

capacidad antioxidante de los extractos de yerba mate elaborada frente al radical DPPH

6.3.3. Análisis de superficies de respuesta

La metodología de superficies de respuesta es un conjunto de técnicas matemáticas y

estadísticas utilizadas para modelar y analizar casos en los que la variable de interés es

influenciada por otras. El objetivo es siempre optimizar la variable de interés y el modo de

lograrlo es determinar las condiciones óptimas de operación del sistema.

135

Dada la cantidad de datos experimentales correspondientes al diseño experimental, en

el presente capítulo se presentan únicamente los datos resumidos expresados como media ±

ee; sin embargo los datos se encuentran disponibles en el Anexo 3-Cuadros C5 al C10.

El diseño factorial y un resumen de los resultados se muestran en la tabla 6.7 (análisis

estadístico disponible en Anexo 3-Cuadro C12), mientras que en la tabla 6.8 se presentan

los coeficientes de regresión y los criterios para evaluar el ajuste de las superficies de

respuesta (Análisis disponible en Anexo 3-Cuadro C12). De las cuatro variables medidas

(CoPT, CPT, CAO y CC), ajustaron adecuadamente únicamente las variables CPT y CAO

con coeficientes de determinación mayores a 90% y con EMP menores a 5; mientras que el

ajuste de los modelos para CoPT y CC fue deficiente (R2 < 80 % a EMP > 5). En los

cuatro modelos, los coeficientes de los términos independientes y lineales (a0, a1 y a2) fueron

los más relevantes en comparación al resto de los coeficientes; siendo los valores de a0 todos

negativos y de a1 y a2 todos positivos, mientras que los coeficientes de los términos

cuadráticos fueron todos negativos.

Los gráficos de superficies de respuesta muestran el valor de la variable predicha en

función de las variables independientes seleccionadas en el modelo polinomial. En el caso de

las superficies de respuestas presentadas en el presente capítulo, éstas incluyen los valores

experimentales que dieron origen a los modelos elegidos (mostrados como puntos negros).

Los gráficos de contorno facilitan la visualización de la forma de la superficie de

respuesta; en este gráfico, las curvas de los valores iguales de respuesta se grafican en un

plano donde los ejes coordenados representan los niveles de los factores. Cada curva

representa un valor específico de la altura de la superficie, es decir un valor especifico de la

respuesta estimada.

136

Tabla 6.7. Diseño de las superficies de respuesta y resumen de los valores experimentales para la extracción etanólica con X1: relación líquido a sólido (g líquido / g sólido seco) y X2: concentración de etanol (% p/p).

Sistema

extractivo

Variables independientes Respuestas

X1 (x1)

X2(x2)

CoPT

CPT

CC

CAO-ET

CAO-EAA

3 6(-1) 25(-1) 37,9±2,10 a,c 11,0±0,00a 0,34±0,02a,b 18,6±0,07a,d 13,2±0,05a,b

4 6(-1) 75(1) 41,5±2,04 b,c 8,2±0,15d 0,35±0,01a,b,c 14,1±0,35e 10±0,26e

5 10(1) 25(-1) 34,8±0,06 a,d 13,4±0,40b 0,45±0,02e 21,8±1,49b,c 15,5±1,04c,d

6 10(1) 75(1) 23,5±1,27f 9,7±0,60c 0,37±0,01d,e 14,3±1,12e 10,1±0,79e

7 10,82(1,41) 50(0) 29,0±1,00e 12,8±0,20b 0,43±0,01b,c,d 23,1±0,46b 16,4±0,35d

8 5,18(-1,41) 50(0) 31,7±1,19 d,e 9,6±0,00c 0,29±0,01a 17,2±1,01d 12,2±0,7a

9 8(0) 85,25(1,41) 21,6±0,73f 7,0±0,15d 0,41±0,01c,d,e 12,8±0,01e 9,1±0,01e

10 8(0) 14,75(-1,41) 36,2±1,27a,d 10,0±0,25a,c 0,35±0,01a,b,c 21±1,76a,c 14,9±1,23 b,c

11 8(0) 50(0) 42,96±0,89b 12,7±0,27b 0,42±0,01d,e 22,2±0,45b 15,7±0,32d

Los datos se expresan como media ± ee. Valores de una misma columna que poseen letras diferentes son significativamente diferentes a p ≤ 0,012. CoPT: concentración de polifenoles totales (g EAC / mL); CPT: contenido de polifenoles totales (EAC %ms); CC: contenido de cafeína (%ms); CAO: capacidad antioxidante (EAA %ms y ET %ms); EAC: equivalente a ácido clorogénico; EAA: equivalente a ácido ascórbico; ET: equivalente a Trolox.

137

Tabla 6.8. Coeficientes de regresión de los términos significativos y criterios de

ajuste (variables independientes no codificadas)

CAO

Coeficiente CoPT (%)

CPT CC ET EAA

a0 -72,54 -7,90 -0,40 -17,98 -12,63

Lineal

a1 22,62 3,14 0,16 6,77 4,79

a2 1,39 0,29 0,004 0,52 0,36

Cuadrático

a11 -1,28 -0,15 -0,008 -0,33 -0,23

a22 -0,01 -0,00 -0,00 -0,00 -0,00

Cruzado

a12 -0,075 -0,00 0,00 -0,015 -0,01

R2 (%) 79,5 91,5 64,2 89,9 90,3

EMP 8,09 4,45 5,89 4,88 4,81

R2: coeficiente de determinación; EMP: error medio porcentual; CoPT: concentración de polifenoles totales (g EAC / mL); CPT: contenido de polifenoles totales (%ms); CC: contenido de cafeína (%ms); CAO: capacidad antioxidante (EAA %ms y ET %ms); EAC: equivalente a ácido clorogénico; EAA: equivalente a ácido ascórbico; ET: equivalente a Trolox; ms: muestra seca.

En la figura 6.3 se presentan los gráficos de superficies de respuesta y de contorno

para CoPT. En estas superficies de respuestas se observa que la curvatura de las isolineas X1

es mayor que la curvatura de las isolíneas X2 y además, se puede preveer que la CoPT será

baja cuando X1 y X2 sean ambos altos o ambos bajos. El valor de CoPT del punto central

experimental es 42,9 g EAC / mL; el cual coincidiría con la zona de máxima extracción

predicha por el modelo.

138


para CPT (%ms).

Figura 6.3. Superficies de respuesta y gráfico de contornos para Concentración de polifenoles totales, con X1: relación líquido a sólido (g líquido / g sólido seco) y X2:

concentración de etanol (% p/p).

Figura 6.4. Superficies de respuesta y gráfico de contornos para Contenido de polifenoles totales, con X1: relación líquido a sólido (g líquido / g sólido seco) y X2:


139


para CAO; al igual que para la CoPT, se puede observar gráficamente que dentro del rango

estudiado, la curvatura de las líneas de CAO a valores de X1 constantes es mucho mayor que

la curvatura de las líneas a valores de X2 constantes.

Figura 6.5. Superficies de respuesta y gráfico de contornos para Capacidad antioxidante, con X1: relación líquido a sólido (g líquido / g sólido seco) y X2:


En la figura 6.6 se presentan los gráficos de superficies de respuesta y de contorno para CC. La predicción del modelo de CC para el máximo de CC no coincide con el valor experimental de cafeína del extracto N° 3 con un valor de 0,455 ± 0,02 cuando X1 = 10 g líquido / g peso seco y X2 = 25 g etanol / 100 g de líquido; esta discrepancia se debe probablemente a que el modelo posee un valor relativamente bajo de R2.

En base a los gráficos de contornos, los valores predichos para cada respuesta y los

rangos óptimos de las variables controladas se presentan en la tabla 6.9.

El CPT (11,3 ± 0,18 %ms) logrado al emplear el sistema extractivo 2 (agua, 60 °C; 30

min; X1 = 8), considerado en la presente investigación como el sistema extractivo

teóricamente más desfavorable dado que usa agua a una temperatura relativamente mas baja,

representa aproximadamente el 51 % del CPT máximo posible (22,2 ± 0,14 %ms; sistema 1;

metanol 70 %; 70 °C, 10 min).

140

Figura 6.6. Superficies de respuesta y gráfico de contornos para Contenido de cafeína, con X1: relación líquido a sólido (g líquido / g sólido seco) y X2: concentración

de etanol (% p/p)

Tabla 6.9. Valores predichos para cada respuesta y rangos óptimos de las variables controladas.

Respuesta Valores Predichos Rangos Óptimos

X1 X2

CoTP 40 5,7 – 9,4 22 – 66

CPT 13 8 – 11,8 27 – 53

CAO 22 (ET) y 15,5 (EAA) 7,3 – 11,5 19 – 54

CC 0,42 8 – 12,3 19 – 55

CoPT: concentración de polifenoles totales (µg EAC / mL); CPT: contenido de polifenoles totales (%ms); CC: contenido de cafeína (%ms); CAO: capacidad antioxidante (EAA y ET en %ms); EAC: equivalente a ácido clorogénico; EAA: equivalente a ácido ascórbico; ET: equivalente a Trolox; ms: muestra seca; X1: relación líquido a sólido (g líquido / g ms); X2: concentración de etanol (g etanol / 100 g líquido)

141

El CPT máximo experimental obtenido siguiendo el diseño experimental fue 13,4 ±

0,40 %ms cuando X1 fue de 10 g líquido / g sólido seco y X2 de 25 g etanol / 100 g de

líquido (sistema 5), este valor representa el 60,4 % del valor máximo posible (22,2 ± 0,14

%ms; sistema 1; metanol 70 %; 70 °C, 10 min).

Brumovsky et al. (2009) reportaron valores de CPT en infusiones (conocidas

regionalmente como “mate cocido”) de 10 marcas diferentes de yerba mate preparadas

vertiendo 200 mL de agua destilada en ebullición sobre un saquito de aproximadamente 3 g

mantenido durante 5 minutos, de 19,40 ± 0,38 %ms. Si bien la extracción reportada en dicho

trabajo fue mayor, se debe resaltar que usaron una relación liquido a sólido (X1) de

aproximadamente 67 g líquido / g sólido seco y una temperatura de extracción próxima a los

100 °C, mientras que en el presente trabajo se utilizaron relaciones líquido a sólido

comprendidas entre 5,2 y 10,8 g líquido / g sólido seco y 60 ± 1 °C como temperatura de

extracción. La elección de los rangos de X1 bajos se fundamentó en los futuros costos de

evaporación del solvente a escala industrial.

La zona de óptimos para CPT estaría comprendida entre 8 < X1 < 12 y 27 < X2 < 53; y

en general el CPT tiene a disminuir conforme X2 (proporción de etanol) se aleja del rango

propuesto (27 < X2 < 53).

Turkmen y Sari (2006), aplicando varias extracciones sucesivas a partir de yerba mate,

al usar una solución etanólica al 50 % reportaron un valor de CPT de 10,61 g equivalentes a

ácido gálico en 100 g ms (106,1 ± 3,24 mgEAG/g ms; datos publicados) y al usar una

solución etanólica al 80 %, un valor de CPT de 8,35 gEAG %ms (83,5 mgEAG/g ms, datos

publicados), valor que condice con lo hallado en la presente investigación al emplear una

solución etanol-agua al 85,25 %. Se debe recordar que el CPT de yerba mate, cuando es

expresado como equivalentes a ácido clorogénico, es ligeramente superior a cuando es

expresado como equivalentes a ácido gálico. El incremento de concentración de etanol en

una solución acuosa, como ocurre con cualquier otro alcohol simple, provoca una reducción

de la polaridad de la mezcla.

Pagliosa et al., (2010) usando una solución metanólica (80/20 v/v; 85 °C) reportaron

diferencias en el CPT de los tallos frescos (diámetro > 10 mm) y de las hojas frescas (p ≤

0,05; 17,5 ± 0,66 y 5 ± 0,60 gEAG %ms, respectivamente); esta diferencia en el CPT de

142

ambas partes de la planta también fue encontrada usando extractos acuosos en las mismas

condiciones de extracción (p ≤ 0,05; 5,21 ± 0,31 y 7,01 ± 0,25 gEAG %ms, para los palos y

las hojas, respectivamente).

Al realizar la superposición de las zonas de máximos para las variables dependientes

estudiadas en función de las dos variables controladas, la zona de óptimos para una

extracción de 30 min estaría entre: 8 ≤ X1 ≤ 9 y 30 ≤ X2 ≤ 50 a 60 °C, siendo los valores

predichos: 40 µg EAC / mL para CoPT; con un CPT de aproximadamente 13 %ms; una

CAO de 22 gET %ms y 15,5 gEAA %ms y un CC de 0,42 %ms.

6.3.4. Extracciones adicionales

Los valores obtenidos a partir de la extracción con etanol (sistema 13; etanol, 40%; 60

ºC; 30 min; Tabla 6.10) resultaron razonablemente cercanos a los predichos (ver Tabla 6.9)

confirmando la validez y suficiencia de los modelos correspondientes a las variables CPT y

CAO.

Si bien el rendimiento de extracción de polifenoles totales usando agua a temperatura

próxima al punto de ebullición (sistema 12; agua; 95ºC; 30 min; Tabla 6.10) es

razonablemente cercano al obtenido usando etanol (sistema 13; etanol, 40%; 60 ºC; 30 min;

Tabla 6.10), la CAO resultó mayor en el primer caso (sistema 12; agua; 95ºC; 30 min; Tabla

6.10).

Bastos et al. (2006) sugieren que la solubilidad de los compuestos fenólicos presentes

en hojas de yerba mate y en yerba mate elaborada (compuesta por 80:20 hojas:palos) es

mayor en solventes polares como el agua. Además la mayor temperatura de extracción

empleada (95 ± 1 °C) provoca un incremento en la velocidad de difusión y en la solubilidad

de las sustancias extraíbles. De acuerdo con Naczk y Shaidi (2005), los compuestos

fenólicos que presentan mayor solubilidad en agua se hallan presentes principalmente en las

células vasculares, hallándose bajo la forma de glicósidos, mientras que los menos solubles

se hallan asociados principalmente al material lignocelulósico.

Los resultados obtenidos por Pagliosa et al. (2010) a partir de hojas de yerba mate

usando el método de reducción del radical DPPH revelan una CAO mayor en 1,2 órdenes de

magnitud para los extractos acuosos en comparación con los extractos metanólicos. Turkmen

143

y Sari (2006) afirman que los extractos de yerba mate y té negro obtenidos con soluciones

extractivas altamente polares (con menor proporción de alcoholes simples) muestran una

mayor eficacia como atrapadores de radicales libres que los obtenidos con soluciones

extractivas menos polares.

Empleando etanol puro como solvente extractivo (sistema 14; etanol, 96º; 60 ºC; 30

min; Tabla 6.10), la extracción de los compuestos fenólicos se vió reducida

aproximadamente en 6,4 y 5,3 veces respecto de las soluciones extractivas 12 y 13, en

concordancia con los resultados publicados por Turkmen y Sari (2006). La concentración de

etanol juega un rol clave cuando se desea extraer la mayor cantidad de antioxidantes a partir

de una matriz vegetal; el usode etanol sin el agregado de agua no permite alcanzar altos

CPT; mientras que el empleo de mezclas de agua y etanol en supone la posibilidad de extraer

compuestos antioxidantes de baja polaridad. Ademas se debe tener en cuenta que los

compuestos polifenolicos deben difundirse desde el interior de la hoja hacia el seno de la

solución extractiva, a través de caminos tortuosos y probablemente se hallan asociados

macroscópicamente entre si y/o con moléculas de cafeína.

Tabla 6.10. Datos experimentales de las extracciones adicionales

Sistema extractivo

CPT CAO-ET CAO-EAA

12 12,25 ± 0,16 26,9 ± 0,4 19,0 ± 0,3

13 12,33 ± 1,35 22,5 ± 2,8 16,0 ± 1,9

14 2,85 ± 0,10 4,2 ± 0,2 3,1 ± 0,2

Datos expresados como media ± ee; CPT: contenido de polifenoles totales (%ms); CAO: Capacidad antioxidante (EAA %ms y ET %ms); EAC: equivalente a ácido clorogénico; EAA: equivalente a ácido ascórbico; ET: equivalente a Trolox; ms: muestra seca

Si bien la extracción metanólica (sistema 1; metanol 70 %; 70 °C, 10 min; CPT = 22,2

± 0,14 %ms) fue la más eficiente, el etanol y el agua han mostrado ser eficaces en la

extracción de los compuestos fenólicos presentes en yerba mate canchada y presentan la

ventaja competitiva de ser de baja toxicidad (etanol) y alta abundancia relativa (agua).

Si se comparan los valores de CPT obtenidos al emplear agua como único solvente

extractivo a 60 ºC y 95 ºC (sistemas 2 y 12) y empleando una misma relación X1, se

144

evidencia un efecto positivo de la temperatura sobre esta variable (11,3 ± 0,18 %ms versus

12,25 ± 0,16 %ms); posiblemente por el incremento en la velocidad de difusión que suponen

los incrementos en la temperatura y por un mayor daño en la estructura del tejido que

disminuiría las barreras estructurales a la transferencia de masa.

Considerando el uso potencial en alimentos y nutracéuticos, los extractos acuosos de

vegetales presentan ventajas en relación a la certificación y seguridad, por lo que la

extracción acuosa a temperatura de ebullición sería la recomendada.


• La fracción hojas posee mayor CPT que la fracción palos, por lo que para la

extracción de polifenoles a partir de yerba mate canchada se sugiere la utilización

únicamente de la fracción de hojas.

• Existe una fuerte asociación lineal directa entre CPT y cualquiera de las formas de

expresar CAO, mientras que la asociación del CPT con el contenido de cafeína es una

asociación lineal directa débil.

• La eficiencia de extracción y la capacidad antioxidante de los extractos de yerba mate

dependen, entre otros factores, de la polaridad de la solución extractiva, la cual determina en

forma cuantitativa y cualitativa los compuestos antioxidantes extraíbles. Se recomiendan dos

sistemas extractivos: soluciones etanólicas (concentraciones 30-50 % p/p con relaciones

líquido a sólido comprendidas entre 8 y 9 g líquido / g ms durante 30 min a 60 ± 2 °C y

agua en ebullición usando la misma relación líquido a sólido (8-9) y el mismo tiempo de

extracción (30 min).

145

CAPITULO 7

“Producto en polvo”

146

7.1. INTRODUCCIÓN

7.1.1. Alimentos funcionales

El consumidor actual es un consumidor conciente del cuidado de su salud y por ende

de su cuerpo y tiende a elegir productos que contribuyan a su salud.

El concepto de alimento funcional esta mas allá de la mera cobertura de necesidades de

nutrientes; está relacionado a la prevención y tratamiento de enfermedades; son alimentos

que contienen ciertos componentes capaces de afectar de forma específica determinadas las

funciones del organismo y así promover un efecto benefico físico y/o mental.

No hay consenso en cuanto a si el término “alimentos funcionales” incluyen a los

alimentos naturales, sin procesamiento, que son una fuente superior de determinados

componentes benéficos (“alimentos saludables”) o simplemente abarcan a alimentos

procesados para lograr eliminar o modificar la concentración de algún determinado

compuesto o directamente sustituirlo o para alterar la disponibilidad metabólica de algún

determinado componente o grupo de componentes presentes en el alimento. Ejemplos de

alimentos funcionales naturales lo constituyen la soja y otras legumbres, el té y el tomate, los

cítricos, el aceite de oliva o la carne de pescado; mientras que los alimentos de bajo

contenido lipídico, los libres de gluten, los alimentos enriquecidos con minerales, folatos y/o

vitaminas y las mermeladas dietéticas son claros ejemplos de alimentos funcionales del

segundo grupo (Silveira Rodríguez et al., 2003).

Son beneficiosos para la salud, pero a la vez deben ser consumidos en una medida

justa; es decir que deben ser usados como un complemento saludable en el marco de una

dieta apropiada y ejercicio activo (Hasler, 2002; Silveira Rodríguez et al., 2003).

Según Silveira Rodríguez et al. (2003) los alimentos funcionales pueden ser

clasificados como:

Alimentos Probióticos:

Los probióticos son alimentos funcionales que se caracterizan por contener

microorganismos vivos que al ser ingeridos en cantidades suficientes, ejercen un efecto

positivo en la salud más allá de los efectos nutricionales básicos. Las bacterias ácido-lácticas

147

ejercen similares acciones saludables en el organismo: equilibran la flora intestinal y

potencian el sistema de defensas o inmunológico.

El yogur (obtenido de la fermentación de la leche por Lactobacillus bulgaricus y

Streptococcus thermophilus) y otros derivados lácteos fermentados (Bifidobacterium y

Lactobacillus casei inmunitas, etc.) son los principales representantes de este grupo de

alimentos funcionales, al que también pertenecen algunos vegetales y productos cárnicos

fermentados. No todas las cepas de bacterias ejercen efectos probióticos y existe gran

variabilidad en cuanto a sus acciones, tanto entre las distintas especies como dentro de la

misma. Para su funcionalidad, resulta esencial que los probióticos permanezcan vivos

durante su tránsito por el tracto gastrointestinal (Silveira Rodríguez et al., 2003).

Alimentos Prebióticos:

Un prebiótico es el sustrato trófico del probiótico. Son sustancias del alimento no

digeribles por el hombre, las cuales benefician al huésped estimulando de forma selectiva el

crecimiento y/o actividad de una o un número limitado de bacterias en el colon. Actúan a

nivel gastrointestinal; llegando al colon sin ser digeridos y allí son fermentados por las

bacterias colónicas, lo que favorece la selección de la flora de bifidobacterias u otras

bacterias potencialmente beneficiosas (Silveira Rodriguez et al., 2003; Gil Hernández,

2010b).

Los prebióticos son generalmente hidratos de carbono de cadena corta que pueden ser

fermentados a lo largo del tracto gastrointestinal; es por ello que un requisito clave para que

un ingrediente sea clasificado como prebiótico es que no sea hidrolizado ni absorbido en la

parte alta del tracto gastrointestinal.

Todavía hay poca experiencia en su empleo; por el momento los únicos datos

relevantes se refieren a los fructanos tipo inulina (oligosacáridos no digeribles: inulina,

hidrolizados enzimáticos de la inulina, oligofructosacáridos (C2-10), fructosacáridos

sintéticos de cadena larga) que se agregan a leches, yogures y flanes. De forma natural están

presentes en el trigo, la cebolla, los plátanos, el ajo y los puerros (Silveira Rodríguez et al.,

2003).

148

Alimentos Simbióticos:

Los alimentos simbióticos son alimentos que combinan un probiótico (generalmente

una bacteria) con un prebiótico (generalmente fructanos naturales como carbohidratos). Su

nombre alude al sinergismo entre ambos componentes. Ejemplos de este grupo de alimentos

son las leches que contienen bifidobacterias (probiótico) con galactooligosacáridos o con

fructooligosacáridos (prebióticos).

Alimentos enriquecidos en fibras:

La denominación de fibra dietética se aplica a aquellas sustancias de origen vegetal, en

su mayor parte hidratos de carbono, no digeridas por las enzimas humanas y con la

peculiaridad de ser parcialmente fermentadas por bacterias colónicas. La fibra insoluble

engloba a la celulosa, hemicelulosas y lignina; entre las acciones funcionales que se le

atribuyen se destacan la sensación de saciedad, el incremento del bolo fecal, el estímulo de la

motilidad intestinal; la mayor necesidad de masticado, el aumento de la excreción de ácidos

biliares y propiedades antioxidantes e hipocolesterolemiantes. La fibra soluble está

representada fundamentalmente por pectinas, gomas, mucílagos y algunas hemicelulosas; su

principal característica es su capacidad para atrapar agua y formar geles viscosos, lo que

determina su poder laxante. Asimismo, al incrementar significativamente la cantidad y

consistencia del bolo fecal se consigue un efecto positivo en el caso de diarreas. Además

produce un enlentecimiento del proceso digestivo, del tránsito y de la absorción de hidratos

de carbono, así como una adicional sensación de plenitud.

Ambos tipos de fibras se encuentran en proporciones variables en los alimentos,

aunque de forma genérica puede decirse que la insoluble predomina en los cereales enteros

mientras que la soluble abunda en frutas, vegetales y tubérculos. De forma industrial

numerosos productos aparecen enriquecidos con las mismas, desde panes, bollos y bebidas a

otros tan variados como fiambres, patés o embutidos (Silveira Rodríguez et al., 2003).

Alimentos enriquecidos en ácidos mono y poli-insaturados:

La mayor parte de las investigaciones encaminadas a optimizar la composición grasa

de la dieta se han centrado en los ácidos grasos mono y poli-insaturados y, más

recientemente, en una nueva familia de moléculas vegetales: los fito-esteroles.

149

El representante dietético fundamental de los ácidos grasos mono-insaturados es el

acido oleico y entre los poli-insaturados se destacan el ácido linolénico y el ácido linoleico.

La industria alimentaria fabrica alimentos que han sustituido ácidos grasos saturados o poli-

insaturados omega 6 por omega 3, como bollería, leche y derivados, embutidos o incluso

huevos (modificando la composición de los piensos de las gallinas, con adición de aceites de

pescado). Un claro ejemplo lo constituyen las leches leches enriquecidas con omega 3.

Alimentos enriquecidos en fitoesteroles:

Genéricamente la denominación de fito-esteroles engloba tanto a los fitoesteroles

como a fitoestanoles. Son propiamente esteroles que se describen como sólidos cristalinos a

temperatura ambiente y son principalmente alcoholes derivados del

ciclopentanoperhidrofenantreno con una estructura química muy similar a la del colesterol.

Los fitoestanoles son menos abundantes en la naturaleza que los fitoesteroles; pueden ser

obtenidos por reducción química de los fitoesteroles, como en el caso de sitostanol,

campestanol y estigmastanol. En la naturaleza, se han descrito más de 200 tipos diferentes de

esteroles vegetales en diferentes especies de plantas, siendo los más abundantes: el β-

sitosterol, el campesterol y el estigmasterol, constituyendo el 95-98%de los fitoesteroles

identificados. Su principal fuente natural son los aceites vegetales (de cereales, de semillas

oleoginosas, legunmbres, frutas secas, etc.). Debido a su similitud estructural con el

colesterol, compiten con éste por la solubilización en micelas; de este modo, inhiben la

absorción tanto del colesterol de la dieta como el endógeno (efecto hipocolesterolemiante).

En la industria de los alimentos se presentan por enriquecimiento en alimentos tanto grasos

(como margarinas) como poco grasos (zumos de frutas, leches descremadas). Un claro

ejemplo lo constituyen las leches “anti-colesterol” (con fitoesteroles) (Ortega al., 2006;

Simojoki et al., 2005).

Alimentos ricos en fitoestrógenos:

Los fitoestrógenos (especialmente las isoflavonas) son moléculas de origen vegetal no

esteroideas que poseen una estructura difenólica heterocíclica común, a la cual se encuentran

unidos grupos oxo, ceto, hidroxi o ésteres con una estructura química similar a los

estrógenos; se les atribuyen ciertas acciones beneficiosas como reducción de la osteoporosis,

disminución de la incidencia de cáncer de mama y de próstata, mejora de la sintomatología

150

asociada al climaterio y mejoras en el sistema cardiovascular. Su mayor fuente natural son

las legumbres (especialmente la soja), el trébol rojo, y ciertos cereales (Bacciottini et al.,

2007; Heide et al., 2004).

Alimentos ricos en compuestos (poli)-fenólicos:

Se encuentran principalmente en frutas y verduras asi como también en bebidas como

el té, la cerveza, el vino, el cacao y diferentes bebidas derivadas de productos naturales. Los

polifenoles importantes en tecnología de alimentos se clasifican según su estructura química

(generalmente en función de sus anillos fenólicos y las sustituciones presentes en dichos

anillos). Este grupo de fitoquímicos recientemente ha despertado gran interés, incluso a nivel

popular, debido a su actividad antioxidante la cual consiste en la capacidad de neutralizar

radicales libres o de quelar metales. Tambien pueden ejercer un efecto pro-oxidante como el

caso del consumo en altas dosis o ante la presencia de determinados compuestos.

La mayoría de estos compuestos confieren a los alimentos unas características

peculiares en cuanto al sabor: amargor (polifenoles de bajo peso molecular) y astringencia

(polifenoles de alto peso molecular) (Lesschaeve y Noble, 2005; Silveira Rodríguez et al.,

2003).

Otros productos:

Cabe mencionar la oferta de ciertos productos que favorecen las funciones psicológicas

y de conducta relacionadas con el rendimiento cognitivo, el humor y el manejo del estrés,

entre ellos los alimentos ricos en sustancias excitantes (cafeína, ginseng, etc.) o

tranquilizantes.

7.1.2. Extractos en polvo

El interés por compuestos fitoquímicos bioactivos se ha visto incrementado en los

últimos años debido a su poder anti-radical y a su asociación con la prevención de

enfermedades. Actualmente se producen extractos con propiedades antioxidantes a partir de

plantas comestibles y medicinales y a partir de subproductos que antiguamente constituían

desechos.

151

Los extractos de yerba mate constituyen una atractiva materia prima para la industria

alimenticia y nutracéutica debido a su alto contenido de polifenoles (principalmente

derivados de ácidos hidroxicimanoilquínicos), con buena propiedades antioxidantes (Bravo y

Angus, 2007; Heck et al., 2008) y antimicrobianas (Heck y Mejía Gonzalez, 2007).

Una manera conveniente de incrementar la vida de anaquel y mejorar las

características organolépticas de cualquier extracto vegetal es transformándolo en un polvo

seco estable por secado por atomización o spray con el agregado de los polímeros

adecuados.

Desde el punto de vista de la tecnología de alimentos, la microencapsulación, ya sea

por el agregado de algún polímero formador de película o por el atrapamiento en una matriz

polimérica, reduce el contenido de humedad y actúa como una barrera física al oxigeno y a

ciertas moléculas pequeñas, inhibiendo las reacciones de degradación oxidativas y

enzimáticas; incluso dependiendo del polímero usado, la microencapsulación puede mejorar

las características de solubilidad/dispersión y contribuir al control de las modificaciones

organolépticas del producto final.

7.1.3. Secado spray

El secado por aspersión es una operación de secado en la cual un producto líquido

(solución, emulsión o suspensión) es atomizado en una corriente de gas caliente

(normalmente aire, pero puede ser reemplazado por un gas inerte como el nitrógeno) para

convertirse casi instantáneamente en un producto en polvo.

El tamaño de las partículas de polvo depende fundamentalmente de las condiciones de

operación, entre las que se destaca la velocidad de alimentación del liquido, pudiendo

obtenerse polvos finos o polvos particulados (2-3 mm).

Este tipo de secado es muy común en la industria de alimentos, ya que permite

asegurar la estabilidad microbiológica del producto final, reducir el riesgo de degradaciones

químicas o biológicas, y reducir los costos de almacenamiento y transporte.

Para ciertas combinaciones de materiales a secar y ayudantes de secado, el secado por

aspersión puede ser considerado un método de encapsulación, como es el caso del secado de

leche: el glóbulo de grasa constituye el material encapsulado en una pared formada por una

152

mezcla de azúcares y proteínas. El secado por aspersión resulta muy apropiado en el caso de

la encapsulación de compuestos sensibles al calor como los polifenoles.

La adición de agentes de secado (“carriers”) es muy común en el secado por aspersión.

Los tipos más usados incluyen a polímeros de carbohidratos, gomas, y polímeros sintéticos y

semisintéticos derivados de la celulosa. Se pueden mencionar, entre otros, maltodextrinas,

goma arábica, proteínas de soja, cloruro de sodio, glucosa, etc. Cada agente posee sus

ventajas y desventajas en términos de propiedades, costos y eficiencia de encapsulación. Las

maltodextrinas son los materiales más empleados debido a su alta solubilidad, baja

viscosidad y bajo contenido de azúcar (Robert et al., 2010) y han mostrado ser efectivas en la

preservación de compuestos fenólicos, como carotenoides, flavonoides (Fernandes Souza et

al., 2009), antocianinas (Robert et al., 2010) y aditivos aromáticos. Poseen la desventaja de

presentar baja temperatura de transición vítrea, lo cual puede facilitar la formación de

cristales ante aumentos de temperatura, contribuyendo a la disrupción de la integridad

estructural de la cobertura y a la tendencia de aglomeración y colapso de los polvos.

7.1.4. Actividad acuosa, isotermas de adsorción, y temperatura de transición

vítrea - Conceptos y aplicaciones.

Desde hace muchos años el concepto de actividad acuosa (aw) viene siendo

considerado en lugar del contenido de humedad en lo concerniente a la calidad y estabilidad

de los alimentos. Las isotermas de adsorción constituyen una importante herramienta

termodinámica para predecir las interacciones entre el agua y los componentes del alimento;

las mismas describen la relación entre aw y el contenido de humedad de equilibrio de un

alimento a una determinada temperatura. Numerosos son los modelos propuestos para la

descripción de las isotermas de adsorción, entre ellos los más citados son los modelos de

Guggenhein, Anderson y deBoer (GAB) y de Brunauer-Emmett-Teller modificado (BET)

(Tabla 7.1). En dichas ecuaciones, Xe, Xm y aw representan el contenido de humedad en el

equilibrio en base seca (g agua/g masa seca), el contenido de humedad de la monocapa en

base seca (g agua/g masa seca), y la actividad acuosa, respectivamente, mientras que los

demás símbolos (CBET,CGAB, K, n) son constantes matemáticas de cada modelo.

Los modelos GAB y BET modificado contemplan el concepto de contenido de

humedad de la monocapa. Conceptualmente, Xm representa la cantidad de agua que se

153

encuentra fuertemente ligada a ciertos sitios activos del alimento y es considerado un valor

importante para asegurar la estabilidad del alimento.

Tabla 7.1. Modelos matemáticos usados para el modelado de las isotermas de adsorción

Modelo Expresión matemática

GAB (van den

Berg y Bruin,

1981)

BC =DEFGHIJGHIKL

�@�JGHIKL��@�JGHIKLFGHIJGHIKL� (7.1)

BET modificado

(Brunauer et al.,

1938)

BC =DEFIMNKL[@��P@��KL�

QP�KL�QRS]

�@�KL�[@�FIMN�@�KL�FIMN�KL�QRS]

(7.2)

El concepto de actividad acuosa debe ser considerado conjuntamente con el concepto

de temperatura de transición vítrea a fin de evaluar la estabilidad de un alimento

deshidratado, ya que ambos conceptos permiten un abordamiento integral del rol del agua en

los alimentos (Moraga et al., 2006; Kurozawa et al., 2009; Tonon et al., 2009). Aquellos

alimentos que posean bajos contenidos de humedad y que sean almacenados a temperaturas

inferiores a su temperatura de transición vítrea pueden ser considerados estables.

La temperatura de transición vítrea (Tg) se define como la temperatura a la cual un

sistema amorfo pasa del estado “vítreo” al estado “goma”. Cuando los alimentos de tipo

polvo amorfo son almacenados a temperaturas superiores a su Tg o cuando su contenido de

humedad se incrementa, dichos polvos pueden sufrir en cambio de estado pasando del estado

vítreo al estado gomoso. Este cambio de estado suele ir acompañado de importantes cambios

estructurales en el sistema, tales como pérdida de la naturaleza “free flowing”, pegajosidad,

aglomeración, colapso y cristalización. Estos cambios están asociados a un aumento de la

movilidad molecular y a una disminución de la viscosidad respecto del estado amorfo vítreo

(Hartmann y Palzer, 2011).

154

Ligeros incrementos de agua en el alimento provocan drásticas disminuciones en la Tg

del alimento. Este efecto plastificador del agua sobre la Tg suele ser modelado con la

ecuación de Gordon y Taylor, aunque también se encontró otro modelo empírico

desarrollado por Khalloufi et al. (2000) para alimentos (Tabla 7.2). En dichos modelos, Tg

representa la temperatura de transición vítrea, Tgs representa la temperatura de transición

vítrea de los sólidos anhidros o secos (°C); Tgw representa el valor de temperatura de

transición vítrea del agua (-135°C; Johari et al., 1987), ww es el contenido de humedad en

base seca; ws=(1-ww) representa la fracción de sólidos secos en base seca y aw representa a

la actividad acuosa. Los símbolos k, C, c, D, d y E representan constantes propias de cada

modelo.

La temperatura de transición vítrea de un sistema es proporcional al peso molecular de

sus componentes; por ello el agregado de agentes de secado de alto peso molecular tales

como maltodextrina o goma arábiga contribuye a elevar la temperatura de transición vítrea

del sistema alimenticio.

Tabla 7.2 Modelos matemáticos usados para el modelado de la variación de la temperatura de transición vítrea con el contenido de humedad y la aw

Modelo Expresión matemática

Gordon y Taylor (1952) UV =WXYVXZWLYVL

WXZWL (7.3)

Khalloufi et al. (2000) UV =[\W

� + ]\W + ^

_\W� + `\W + 1

7.1.5. Objetivos

Los objetivos del presente trabajo fueron:

• desarrollar un procedimiento adecuado de secado por aspersión para obtener

un producto final altamente soluble y con alto contenido de polifenoles totales,

a partir de extractos concentrados de yerba mate con el agregado de

maltodextrina como agente de secado.

155

• proporcionar datos experimentales de adsorción de agua y de la temperatura de

transición vítrea de mate soluble obtenido por secado spray y formulado con

tres porcentajes de maltodextrina (MD: 0; 7,05 y 14,10 % p/v) a fin de

disponer de información útil relacionada a la estabilidad de los polvos.



Se utilizó un lote de extractos concentrados de yerba mate canchada (jarabe) con un

contenido de sólidos solubles (SS) de 21 ± 1 % y un contenido de polifenoles totales (CPT)

de 9,60 ± 0,075 g equivalentes a ácido clorogénico por 100 mL de jarabe (gEAC / 100 mL) y

45,73 ± 0,35 g equivalentes a ácido clorogénico por 100 gramos de sólidos solubles (gEAC /

100 SS), obtenido en un establecimiento industrial en Apóstoles, Argentina.

7.2.2. Reactivos

Para la determinación de polifenoles totales se utilizaron los siguientes reactivos: ácido

clorogénico (MP Biomedicals), reactivo de Folin-Ciocalteu (Fluka), carbonato de sodio

(Anedra) y acetonitrilo (Merck; grado HPLC).

Para la determinación de CAO se utilizaron los siguientes reactivos: radical DPPH

(radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo; Sigma), metanol (Merck; grado HPLC), ácido

ascórbico (Sigma Ultra) y Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilico;

Aldrich).

Para la determinación de cafeína se utilizaron los siguientes reactivos: cafeína (Sigma

Ultra, 99 % de pureza, catálogo C8960) y metanol (Merck; grado HPLC).

El agente de secado utilizado fue maltodextrina (MD) (DE: 15, Globe 019150,

Argentina,).

7.2.3. Equipos

Las mediciones de los parámetros de color se realizaron usando un colorímetro Hunter

Lab modelo D25-9 de Hunter Associates Laboratory (Virginia, EEUU).

156

Las mediciones de actividad acuosa se realizaron usando un medidor de aw modelo

AquaLab PawKit (marca Decagon Devices; Pullman, Washington, EEUU).

Las mediciones de temperatura de transición vítrea se realizaron usando un calorímetro

diferencial de barrido (Equipo Mettler DSC 30 con un procesador TA 4000 y un sistema de

análisis térmico TA72). Se emplearon cápsulas de aluminio (Mettler aluminum pan).

Los demás equipos utilizados en el presente trabajo se detallan en el ítem 4.2.1.3.




La solución de reactivo de Folin-Ciocalteu diluido, la solución de carbonato de sodio,

la solución estándar del ácido clorogénico y sus respectivas diluciones para las curvas de

calibración, se prepararon de acuerdo al ítem 4.2.1.6.

La solución stock del radical DPPH°, la solución de DPPH de trabajo; las soluciones

estándar de ácido ascórbico y Trolox y sus respectivas diluciones se prepararon de acuerdo al

ítem 4.2.2.6.

7.2.6. Preparación de las muestras y condiciones de secado

La maltodextrina fue añadida directamente al jarabe, con agitación manual hasta su

completa disolución, antes del proceso de secado spray. La tabla 7.3 muestra las diferentes

formulaciones (jarabe + maltodextrina) ensayadas siguiendo el diseño experimental. Las

experiencias de secado spray se realizaron a escala piloto en un equipo modelo EQI

(ESPAQ, Argentina) provisto de un rotor atomizador de disco (120 mm de diámetro). El

caudal de alimentación fue 200 mL / min y se usó una bomba de desplazamiento positivo.

Los polvos obtenidos se mantuvieron en frascos de vidrio con cierre hermético a -20 ºC

hasta su análisis, que no tardó mas de 7 días en realizarse.

7.2.7. Planeamiento factorial y análisis de datos

Para la optimización del secado por aspersión se usó un diseño de superficie de

respuesta con cinco repeticiones en el punto central, constituido por un total de 13 ensayos

157

en orden aleatorio con temperatura del aire de entrada (X1, ºC) en el rango 192 - 240 ºC y

concentración de maltodextrina (X2, %p/v), en el rango de 0 a 14,1 g MD / 100 mL como

variables de diseño. Las variables respuesta fueron: contenido de polifenoles totales (CPTP),

capacidad antioxidante (CAO) y solubilidad del polvo a 25°C (S). Los valores codificados

de las variables de diseño fueron determinados como xi=(Xi-X io)/∆xi, donde xi es el valor

codificado de la i-ésima variable, Xi es el valor no codificado de la i-ésima variable, X io es

el valor no codificado de la i-ésima variable en el punto central y ∆xi es el factor de

incremento. El diseño experimental empleado se presenta en la tabla 7.3. Para estimar la

función respuesta, se realizó un análisis de regresión con un polinomio de segundo orden

(Ec. 7.4), donde y es la respuesta predicha, a0, a1, a2, a11, a22 and a12 son los coeficientes

estimados y x1 y x2 son las variables independientes codificadas. El grado de ajuste se

determinó utilizando los parámetros estadísticos: coeficiente de determinación (R2), valor de

Chi-cuadrado (χ2, ecuación 6.2), raíz del cuadrado medio del error (RCME, Ec. 6.3) y error

medio promedio porcentual (EMP, Ec. 6.4). Los valores de R2 proporcionan el porcentaje de

variación explicada por el modelo; el valor de χ2 considera las diferencias entre valores

experimentales (exp) y predichos (pre), el número de datos experimentales (N) y el número

de parámetros (Np) utilizados en el modelo (N-Np, o grados de libertad). La RMSE se

expresó como la diferencia media absoluta entre los valores experimentales y los predichos,

mientras que el error promedio porcentual se relaciona con la diferencia relativa. (Scipioni et

al., 2010). El propósito de los puntos centrales fue estimar el error puro y curvatura.

y = a0+a1 . x1+a2 . x2+a11 . x12+a22 . x2

2+a12 . x1 . x2 7.4

7.2.8. Diluciones

Para la determinación de contenido de polifenoles totales, las muestras de jarabe se

diluyeron (relación jarabe:agua; 1:50 v/v y luego 1:100 v/v); en el caso de los polvos, los

mismos fueron reconstituidos de acuerdo a la metodología descripta en la norma ISO-14502.

Brevemente, una porción de polvo (0,500 ± 0,001g; bh) se disolvió en agua caliente (25 mL;

temperatura inferior a 60 °C) y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Luego se agregó

acetonitrilo (5 mL) y se enrazó la mezcla (agua; 50 mL)

Para determinar la CAO, las muestras de jarabe se diluyeron (relación jarabe:agua;

1:50 v/v y luego 1:25 v/v); en el caso de los polvos, alrededor de 0,5 g (bh) se

158

reconstituyeron en agua (50 mL) y luego se diluyeron (relación reconstituido:agua; 1:25

v/v).

7.2.9. Determinación de polifenoles totales

El contenido de polifenoles totales se determinó acorde a la metodología descripta en

el ítem 4.2.1.8.

El contenido de polifenoles totales en el jarabe (CPTJ) se expresó como g EAC en 100

mL de jarabe (gEAC / 100mL) y como g EAC en 100 g de sólidos solubles (gEAC %SS).

El contenido de polifenoles totales teórico en los polvos (CPTT) se calculó como el

cociente porcentual entre el contenido de polifenoles totales del jarabe (gEAC / 100 mL) y

el peso total de los sólidos contenidos en 100 mL de la formulación ingresada al secadero

(SST; g sólidos solubles / 100 mL de formulación).

El contenido de polifenoles totales de los polvos se expresó como gEAC / 100 g de

polvo seco (CPTP) y como gEAC / 100 de polvo seco libre de maltodextrina (CPTP*).

La eficiencia de retención de polifenoles totales (EPT; en %) se calculó como el

cociente entre el CPTP y el CPTT en porcentaje.


La CAO se determinó acorde a la metodología descripta en el ítem 6.2.11.


antioxidante calculada como porcentaje de DPPH remanente fueron calculados según lo

descripto en el ítem 4.2.2.11.

La capacidad antioxidante se expresó como equivalentes de ácido ascórbico (AAE) y

equivalentes de Trolox (ET) en g / 100 g de polvo seco (CAO, g %ms) y g / 100 g de polvo

seco libre de maltodextrina (CAO*; g %ms lm).

159

7.2.11. Determinaciones analíticas del jarabe

7.2.11.1. Sólidos solubles

Para determinar los sólidos solubles del jarabe (SS), el jarabe (50 mL) se filtró y una

alícuota (10 mL) fue transferida a un vaso tarado y evaporada a sequedad. El residuo se secó

en estufa (12 h; 103 ± 2 ºC). Las determinaciones se realizaron por duplicado. Los resultados

se expresaron en unidades de concentración p/v (soluto/jarabe). Los sólidos solubles totales

(SST; g sólidos solubles / 100 mL de formulación) en cada formulación ingresada al

secadero se calcularon como la suma de los sólidos solubles aportados por el jarabe (SS, g

sólidos solubles / 100 mL) y los sólidos aportados por la maltodextrina (%MD, g sólidos /

100 mL de formulación).

7.2.12. Determinaciones analíticas de los polvos


El contenido de humedad se determinó por triplicado acorde a la metodología descripta

en el ítem 4.2.1.4. Los resultados se expresaron como porcentaje de masa (g %bh).

7.2.12.2. Densidad

La densidad (db) fue determinada por triplicado; para ello, una muestra en polvo

(aproximadamente 4 g, bh) se colocó en una probeta de 20 mL, luego se asentó el contenido

manualmente dejando caer la probeta 10 veces desde una altura de 1,5 cm, registrándose la

lectura del volumen final ocupado por el polvo. La densidad se calculó como la masa de

polvo sobre el volumen ocupado por el mismo (Goula et al., 2004).

7.2.12.3. Solubilidad en agua

Para la determinación de la solubilidad, la muestra en polvo (aproximadamente 2 g,

bh) se mezcló con agua (40 mL; 25 ºC) usando un agitador de tubos (1 min; 1800 rpm).

Luego se centrifugó (5 min; 2500 g). Una alícuota del sobrenadante (20 mL) se extrajo

cuidadosamente sin remover los sedimentos y fue secada en estufa (6 h; 105 ± 2 ºC). El

porcentaje de solubilidad se calculó como el peso de sobrenadante seco con respecto al peso

del polvo contenido en la correspondiente alícuota (Kha et al., 2010; Cano-Chauca et al.,

2005). Las mediciones se realizaron por duplicado.

160

7.2.12.4. Actividad acuosa

Los valores de actividad acuosa (aw) se determinaron usando el medidor de actividad

acuosa antes descripto calibrado con soluciones salinas saturadas a 25 ± 1 ºC (LiCl, MgCl2,

K2CO3, Mg(NO3)2) (Greenspan, 1977). Para el análisis de los datos se utilizaron los valores

medios de tres lecturas por muestra.

7.2.12.5. Color

Para la medición del color se colocó una porción de la muestra en polvo

(aproximadamente 3 g, bh) sobre un platillo de vidrio y se determinaron los parámetros de

color: luminosidad (L*), rojo-verde (a*) y amarillo-azul (b*) con un colorímetro Hunter Lab

girando el platillo 3 veces en sentido horario. Para el análisis de los datos se utilizaron los

valores medios de tres réplicas por muestra.

Para comparar dichos parámetros con datos de referencia del material de partida (yerba

mate elaborada), se calculó la diferencia absoluta de color, utilizando la ecuación 7.5 en la

cual Lo, ao y bo representan los parámetros de color de la yerba mate elaborada y los valores

L*, a* y b* representan los valores medios de los resultados de las mediciones de color de

los polvos obtenidos.

( ) ( ) ( )[ ]2

12

02

02

0 *** bbaaLLE −+−+−=∆ 7.5

7.2.12.6. Cinética de adsorción e higroscopicidad

La muestra (aproximadamente 1 g, bs) se colocó por triplicado en recipientes tarados y

se acondicionó en un recipiente cerrado sobre una solución saturada de ClK a 25 °C

(proporcionando un valor de humedad relativa de 84,34 %), (Greenspan, 1977). Se

determinó la ganancia en peso a intervalos de tiempo regulares (12, 24, 48, 72, 120, 168,

456, 480, 528 h) de acuerdo a la ecuación 7.6. En dicha ecuación, HG es la ganancia en peso

al tiempo t (en %), P(t) y P(0) son los pesos de los pocillos conteniendo los polvos

descontado el peso de cada pocillo, a tiempo t y a tiempo inicial (t=0 h) respectivamente.

HG =!�;��!�b�

!�b�∗ 100 7.6

161

Los modelos matemáticos para describir la cinética de adsorción (ganancia en peso vs.

tiempo) fueron el modelo de Peleg (1988) (Ec. 7.7) y el modelo logarítmico (Ec. 7.8).

G�t� =;

AS;∗A. 7.7

G�t� = a ∗ log �t� + b 7.8

En la ecuación 7.7, G(t) es la ganancia en peso al tiempo t en (%) calculada como la

diferencia entre P(t) y P(0); t es el tiempo de exposición a la atmosfera especificada (en h),

K1 la constante de velocidad de Peleg (en h*g ms / g agua) y K2 la constante de Peleg de

capacidad (en g ms / g agua). La constante K1 se relaciona con la velocidad de adsorción

(vo) a tiempo inicial (t=t0) (Ec. 7.9). La constante K2 se relaciona con la máxima ganancia

alcanzada en el equilibrio (Ec. 7.10) esto es G(equilibrio) cuando t→∞.

vo =@

AS 7.9

G�t→ ∞� = Gequilibrio =@

A. 7.10

En la ecuación 7.8, a (adimensional) y b (en g agua/g ms) son las constantes del

modelo logarítmico, G(t) es la ganancia al tiempo t, calculada como la diferencia entre P(t) y

P(0) y t es el tiempo de extracción en horas.

Si bien la higroscopicidad (HG) está basada en el contenido de humedad de equilibrio,

para posibilitar las comparaciones entre muestras, el incremento en peso por g de polvo

luego de estar expuesto a dicha atmosfera durante 12 h se determinó como porcentaje (Ec.

7.11) siendo P(12) y P(0) los pesos de los pocillos conteniendo los polvos descontado el

peso de cada pocillo, a un tiempo de 12 h y a tiempo inicial (t=0 h) respectivamente (Goula

et al., 2004; Goula y Adamopoulos, 2008).

HG =!�@�g��!�b�

!�b�∗ 100 7.11

7.2.12.7. Isotermas de adsorción

Las isotermas de adsorción se determinaron por el método gravimétrico. Para ello

porciones (aproximadamente 3 g, bh) de las muestras 1, 3, 7, 8 y 9 fueron pre-secados en

estufa (50 °C; 3 días). Luego se colocó una porción de muestra (aproximadamente 1 g, bs)

en un pocillo plástico pequeño y se equilibró sobre soluciones salinas sobresaturadas de

162

LiCl, MgCl2, Mg(NO3)2, BrNa, Cl2Co, NaNO3, ClNa y ClK, las cuales proporcionaban

humedades relativas ambientes de 11,3 %, 32,78 %, 52,89 %, 57,57 %, 64,92 %, 74,25 %,

75,29 % and 84,34 %, respectivamente, de acuerdo con Greenspan (1977), en recipientes

cerrados hasta lograr el equilibrio (25 ± 2 °C). Una vez logrado el equilibrio las muestras

equilibradas fueron secadas utilizando la metodología descripta en el ítem 7.2.6.1

(determinación de humedad) para determinar su contenido de humedad. También se observó

la apariencia física de los polvos para corroborar si las muestras en polvo sufrieron algún

cambio visible como colapso o aglomeración. Algunas muestras no pudieron dejarse el

tiempo necesario para lograr el equilibrio porque comenzaban a mostrar cambios visuales

(pegajosidad y apelmazamiento).

Los modelos utilizados para la descripción de las isotermas de adsorción fueron: BET

modificado (Ec. 7.1 de tabla 7.1) y GAB (Ec. 7.2, de tabla 7.1).

El grado de ajuste se determinó utilizando los parámetros estadísticos: coeficiente de

determinación (R2) y porcentaje de error promedio porcentual (MPE, Ec. 6.4).

7.2.12.8. Temperatura de transición vítrea

Para la determinación de la temperatura de transición vítrea, porciones de las muestras

1, 3, 7, 8 y 9 (aproximadamente 1 g) fueron pre-secadas en estufa (50 °C; 3 días) y luego

colocadas en desecadores (25 ± 2 °C; 3-4 días) con atmósferas de distinta humedad relativa,

utilizándose soluciones salinas saturadas de LiCl, MgCl2, Mg(NO3)2, ClNa y ClK

(humedades relativas de 11,3 %, 32,78 %, 52,89%, 75,29% y 84,34 %, respectivamente, de

acuerdo con Greenspan (1977)). Algunas muestras no pudieron dejarse el tiempo necesario

para lograr el equilibrio porque comenzaban a mostrar cambios visuales (pegajosidad y

apelmazamiento). Luego las muestras fueron aisladas herméticamente para las

determinaciones de contenido de humedad y temperatura de transición vítrea.

Para la determinación de temperatura de transición vítrea, la muestra previamente

acondicionada (aproximadamente 8-15 mg) fue colocada en una cápsula de aluminio de 40

µL herméticamente sellada en un calorímetro diferencial de barrido. Como referencia se

utilizó una cápsula vacía perforada. Luego del enfriamiento de la muestra a -20 °C, la

temperatura de transición vítrea se determinó a partir de las curvas termo-analíticas por

163

calentamiento de la muestras a 10 °C / min hasta 100 °C. Todos los análisis se realizaron por

duplicado.

Para describir el efecto plastificador del agua en los polvos, los datos de temperatura

de transición vítrea (promedios de 2 determinaciones por muestras) fueron modelados

usando el modelo de Gordon y Taylor (G-T) (Ec. 7.3 de tabla 7.2). La temperatura de

transición vítrea de la mezcla (Tg) se modeló con los valores de la temperatura de inicio de

la transición vítrea (Tgonset). La bondad del ajuste se determinó utilizando los parámetros

estadísticos: coeficiente de determinación (R2) y porcentaje de error promedio porcentual

(MPE, Ec. 6.4).


Los datos se expresaron como la media ± error estándar. Los datos experimentales se

estudiaron usando metodología de superficie de respuesta, análisis de regresión múltiple no

lineal (p ≤ 0,05), análisis de correlación de Pearson, análisis de varianza, test t-Student y

test de mínima diferencia significativa (LSD) de comparación de medias utilizando

Statgraphics Centurion XVI Académico.


7.3.1. Propiedades antioxidantes y solubilidad

Los sólidos solubles representan una forma de medir la concentración de una solución;

en el jarabe su concentración fué: 21 ± 1 g SS / 100 mL de jarabe.

El contenido de polifenoles totales en el jarabe fué de 9,6 ± 0,075 g EAC / 100 mL de

jarabe y 45,73 ± 0,35 g EAC / 100 g de SS. Un resumen de los resultados de las propiedades

antioxidantes de los polvos obtenidos se muestra en la tabla 7.3 (datos disponibles en Anexo

4 Cuadros D3 a D7).

Los contenidos de polifenoles totales en los polvos resultantes (CPTP) resultaron muy

cercanos al contenido de polifenoles totales presente en las formulaciones que fueron

alimentadas al secadero (CPTT). Consecuentemente las eficiencias de retención de

polifenoles totales (EPT; en %) resultaron más satisfactorias de lo esperado (EPT ≥ 91). En

la mayoría de los ensayos, excepto en los ensayos 1 y 3, las EPT fueron mayores a 98, lo que

indica que en la zona de operación estudiada la pérdida de polifenoles fue despreciable. Esta

164

última observación sugiere que los componentes que contribuyen al valor de CPTP son muy

estables a las temperaturas ensayadas. Las eficiencias de retención de polifenoles totales

mayores a 1 podrían ser una consecuencia de la hidrólisis de los polifenoles de yerba mate

durante el proceso de secado (Turkmen et al., 2005). Robert et al. (2010) reportan

porcentajes de recuperación de polifenoles totales de 96 y 99 % para jugo y extracto

etanólico de granada (Punica granatum) en polvo respectivamente, ambos obtenidos por

secado por aspersión usando maltodextrina (12 < DE < 20) como agente encapsulante y 153

°C como temperatura de secado, mientras que usando proteínas aisladas de soja en

reemplazo de la maltodextrina los porcentajes de recuperación fueron de 121 y 103 %

empleando 120 y 100 °C como temperatura de secado. En la encapsulación de β-carotenos

con maltodextrina (25 DE) las pérdidas fueron del 11 % (Desobry et al., 1997).

En cuanto a los resultados de solubilidad a 25 °C presentados en la tabla 7.3, puede

observarse que esta propiedad presentó valores aceptables (siempre mayores o iguales al

91%) y en las experiencias realizadas no se observaron depósitos en la preparación de

infusiones (datos disponibles en Anexo 4-Cuadro D6 y D7). Es importante que la solubilidad

de los polvos obtenidos durante la operación sea elevada, ya que esto garantiza la ausencia

de depósitos en la preparación de infusiones, contribuyendo a la buena imagen del producto.

En la tabla 7.4 se presentan los coeficientes de regresión y los criterios para evaluar el

ajuste de las superficies de respuesta de las distintas variables de respuesta (Análisis

disponible en Anexo 4-Cuadros D8 a D10) en función de las variables independientes del

proceso. Los cuatro modelos (CPTP, CAO-EAA, CAO-ET, S) se ajustaron adecuadamente

con coeficientes de determinación mayores o iguales a 93 % y con MPE menores a 2,00.

Cotejando los valores relativos de los coeficientes del modelo para para las variables

dependientes, se observó la preponderancia de los coeficientes lineales para ambas variables

independientes frente a los demás coeficientes del modelo; los demás términos presentaron

importancias relativas menores. En las figuras 7.1 a 7.4 se presentan los gráficos de

superficies de respuesta y de contorno para los cuatro modelos.

165

Tabla 7.3 Resumen de datos sobre contenido de polifenoles totales, capacidad antioxidante y solubilidad

Nº de Ensayo Condiciones Nº de

muestra CPTT CPTP EPT CPTP* CAO-EAA CAO-ET CAO*-EAA CAO*-ET S

1 200 °C(-1); 2,05 %MD(-1) 2 41,6 37,9 ± 0,37 91 ± 1 41,5 ± 0,41 48,5 ± 0,16 68,9 ± 0,24 53,3 ± 0,25 75,6 ± 0,25 93 ± 0,0

2 200 °C(-1); 12,05 %MD(+1) 2 29,0 29,3 ± 0,35 101 ± 1 46,1 ± 0,55 38,8 ± 0,34 54,9 ± 0,48 61,1 ± 0,53 86,5 ± 0,75 97 ± 0,5

3 240 °C(+1); 2,05 %MD(-1) 2 41,6 38,8 ± 0,04 93 ± 0 42,6 ± 0,04 47,3 ± 0,88 67,1 ± 1,27 51,9 ± 0,97 73,7 ± 1,39 94 ± 0,3

4 240 °C(+1); 12,05 %MD(+1) 2 29,0 28,9 ± 0,02 101 ± 0 45,5 ± 0,03 37,0 ± 0,28 52,3 ± 0,40 58,2 ± 0,44 82,4 ± 0,63 94 ± 1,1

5 248,2 °C(1,41); 7,05 %MD(0) 2 34,2 34,3 ± 0,49 101 ± 1 45,8 ± 0,66 43,8 ± 0,75 62,1 ± 1,08 58,5 ± 0,99 83,0 ± 1,44 96 ± 1,7

6 191,8 °C(-1,41); 7,05 %MD(0) 2 34,2 33,5 ± 0,97 98 ± 3 44,7 ± 1,30 44,3 ± 0,50 62,8 ± 0,72 59,2 ± 0,67 83,8 ± 0,96 97 ± 0,2

7 220 °C(0); 14,1 %MD(1,41) 2 27,4 28,2 ± 0,46 103 ± 2 47,1 ± 0,78 37,4 ± 0,57 52,9 ± 0,82 62,5 ± 0,95 88,5 ± 1,38 95 ± 0,5

8 220 °C(0); 0 %MD(-1,41) 2 45,7 44,7 ± 0,30 98 ± 1 44,7 ± 0,30 51,7 ± 0,42 73,4 ± 0,60 51,7 ± 0,42 73,4 ± 0,60 91 ± 0,1

9 220 °C(0); 7,05 %MD(0) 10 34,2 33,9 ± 0,10

99 ±

0,00 45,3 ± 0,14 42,7 ± 0,43 60,6 ± 0,63 57,1 ± 0,59 80,9 ± 0,84 95 ± 0,5

CPTT: contenido de polifenoles totales teórico (g EAC %ms); CPTP: contenido de polifenoles totales (g EAC %ms); EPT: eficiencias de retención de polifenoles totales; CPTP*(g EAC %ms lm); CAO-EAA (g EAA %ms); CAO-ET (g ET %ms); CAO*-EAA (g EAA% ms lm); CAO*-ET (g ET %ms lm); S: solubilidad (%); ms: muestra seca; lm: libre de maltodextrina

166

Tabla 7.4 Coeficientes de regresión de los términos significativos y criterios de ajuste

Respuesta

Coeficiente CPTP CAO-EAA CAO-ET S

a0 -10,804 91,018 128,181 169,742

Lineal

a1 0,455 -0,351 -0,489 -0,754

a2 -0,800 -1,004 -1,431 2,678

Cuadrático

a11 -0,001 0,001 0,001 0,002

a22 0,037 0,023 0,032 -0,035

Cruzado

a12 -0,003 -0,001 -0,002 -0,009

R2 0,96 0,94 0,94 0,93

χ2 0,96 1,35 2,80 0,36

RMSE 0,86 1,02 1,47 0,42

MPE 1,79 1,97 2,00 0,39 R2: coeficiente de determinación; χ2: Chi-cuadrado; RSME: raíz del cuadrado medio del error; MPE: porcentaje de error promedio porcentual; CPTP: contenido de polifenoles totales (gEAC %ms); CAO: Capacidad antioxidante (g EAA y g ET en %ms); S: solubilidad (%); EAC: equivalente a ácido clorogénico; EAA: equivalente a ácido ascórbico; ET: equivalente a Trolox. Variables no codificadas.

167

Figura 7.1. Superficies de respuesta y gráfico de contornos para Contenido de

polifenoles totales de los polvos (CPTP; g EAC %ms).

168

Figura 7.2. Superficies de respuesta y gráfico de contornos para Capacidad antioxidante de los polvos (CAO; g EAA %ms)

169

Figura 7.3. Superficies de respuesta y gráfico de contornos para Capacidad antioxidante de los polvos (CAO; g ET %ms).

170

Figura 7.4. Superficies de respuesta y gráfico de contornos para Solubilidad de los polvos a 25 °C (S; %).

7.3.1. Contenido de humedad

El contenido de humedad (CH) varió entre 3,2-7,7 % bh, excepto el polvo 6 (191,8 °C;

7,05 %MD), que presentó un CH del 10,6 ± 0,07 % bh (datos disponibles en Anexo 4-

Cuadro D11). Para té soluble en polvo, se reportaron CH entre 6-8 % (Sinija y Mishra,

2008).

La figura 7.5 muestra los valores de CH logrados empleando diferentes temperaturas

de entrada de aire; y se puede observar en general que con mayores temperaturas de entrada

de aire se lograron menores CH de los polvos debido a la mayor tasa de transferencia de

calor, lo cual facilita la eliminación de agua (Kha et al., 2010). A bajas temperaturas de

entrada de aire (prueba 6; 191,8 ºC), el polvo resultó demasiado húmedo.

Por lo general para una

aumentos en la concentración

humedad final, ya que las g

moléculas de agua (Adhikar

polvos obtenidos a 220 ºC.

7.3.2. Densidad

La densidad (db) prom

obtenida en el ensayo Nº6), f

0,226-0,356 g / mL respectiva

°C; 7,05 %MD), que present

disponibles en Anexo A4-Cu

entrada del aire sobre la dens

de humedad de los polvos, y

tener mayor peso bruto debid

más denso que un producto

correlación (rpearson: -0,849;

temperatura de entrada del air

Figura 7.5. Contenidtemperaturas de entrada

Mayores temperaturas d

producto final, pues mayores

na misma temperatura de entrada de aire sería e

ión de maltodextrina, se produzcan aumentos

s grandes moléculas de maltodextrina dificul

kari et al., 2005); esta observación sólo resul

romedio de todas las muestras (excepto el c

), fue de 0,279 ± 0,039 g / mL con valores min

tivamente. En el caso del polvo obtenido en el e

entó un valor de 0,45 ± 2,5x10-4 g / mL (ver

Cuadro D12). Es lógico pensar que el efecto de

nsidad está relacionado al efecto de este factor

ya que un producto con mayor contenido de h

bido a la presencia de agua, con lo cual será

to seco. Este supuesto fue respaldado por un

; análisis disponible en Anexo 4-Cuadro

aire, menor CH, menor densidad).

nido de humedad de los polvos (CH; % bh) a de aire (Ti; °C) y varias concentraciones d

(MD; %p/v)

s de entrada de aire provocarían una reducción

es temperaturas de entrada de aire implican m

171

ía esperable que, ante

os en el contenido de

cultan la difusión de

sultó válida para los

l caso de la muestra

minimo y máximo de

el ensayo Nº 6 (191,8

er Figura 7.6) (datos

de la temperatura de

tor sobre el contenido

e humedad tenderá a

rá considerablemente

n alto coeficiente de

dro D13) (a mayor

h) para diferentes s de maltodextrina

ión en la densidad del

mayor velocidad de

evaporación dando productos

todo cuando se usan “agent

como lo es la maltodextrina

obtenido por secado por asper

contener burbujas de aire, lo c

densidad.

Figura 7.6. Valores mtemperaturas de entrad

Según Goula y Adamop

mayor naturaleza pegajosa, y

espacios entre ellas y por end

Las características óptim

particulares de quien lo produ

a la existencia de un valor ópt

7.3.3. Color

El color es un atribut

parámetro de calidad desde e

consumo. El color debiera, en

este caso la yerba mate, e ince

El sistema de color H

dimensiones basado en la teo

tos con estructuras más porosas o huecas (W

ntes de secado” con características “formad

ina. Según Kwapinska y Zbicinski (2005), el

persión con agregado de materiales formadores

lo cual incrementaría el volumen de aire atrapad

s medios de densidad de los polvos (db; g/mLada de aire (Ti) y varias concentraciones de m

(%MD)

opoulos (2008), altos valores de densidad se as

, ya que las partículas que muestran esta tenden

nde resultan en un menor volumen bruto.

ptimas de densidad para el producto dependerá

oduzca, no pudiendo hacer “a priori” ninguna a

óptimo para este parámetro.

buto de suma importancia comercial, ya que

e el punto de vista del consumidor, teniendo i

, en principio, ser asociado con facilidad al prod

ncentivar al consumo.

Hunter L*, a*, b* es un espacio de color r

teoría de los colores opuestos (ver Figura 7.7) d

172

Walton, 2000); sobre

adoras de películas”

el material en polvo

res de película, suelen

pado disminuyendo la

mL) para diferentes e maltodextrina

asocian a polvos con

dencia dejan menores

erán de los objetivos

a afirmación respecto

que el mismo es un

o incidencia sobre el

roducto de origen, en

r rectangular de tres

) donde “L*” mide la

173

luminosidad o claridad y es el atributo que hace corresponder a cada color con respecto a la

escala de grises; este parámetro varía de 100 para blanco perfecto a 0 para el negro,

aproximadamente como el ojo lo evaluaría. Los ejes “a*” y “b*” permiten evaluar la

cromaticidad; y se caracterizan por carecer de límites numéricos definidos. Concretamente:

“a*” mide el componente rojo en el eje positivo, gris cuando es 0 y el componente verde en

el eje negativo y “b*” mide el amarillo en el eje positivo, gris cuando es 0 y el azul en el eje

negativo. Todos los colores que se pueden percibir visualmente se pueden mostrar en este

espacio rectangular de color (Hunter Lab., 2001).

Figura 7.7. Escala de color de Hunter Lab

Los resultados de las mediciones de color de los polvos para las diferentes condiciones

ensayadas se presentan en la tabla 7.6 (datos disponibles en Anexo 4-Cuadro D14) y los

gráficos de superficie de respuesta se presentan en la figura 7.8 (coeficientes de las

superficies de respuesta y respectivos parámetros de ajuste disponibles en Anexo 4-Cuadro

D14). Los coeficientes de la ecuación del modelo de superficie de respuesta significativos se

presentan en las ecuaciones 7.12 a 7.14 para los parámetros L*; a* y b* respectivamente (X1

representa a la temperatura del aire que entrada al secadero en ºC y X2 la concentración de

maltodextrina, en %MD).

L*= -236,8 + 2,58*X1- 0,005* X12+0,0004*X1*X 2 R

2= 69,4 % 7.12

a* = 87,9502-0,778872*X1-0,0373762*X2+0,0016868*X12 R2= 79,5 % 7.13

b*= -6,25165 + 0,28 * X1 – 0,054 *X2 -0,0006 * X12 + 0,0019* x2

2 R2=64 % 7.14

Los valores obtenidos para el parámetro “L*” presentaron un valor medio de 59,1 y un

desvío estándar de 3,1, indicando una luminosidad elevada de los polvos en las condiciones

en las que fueron obtenidos. El coeficiente importante en la ecuación del modelo de

superficie de respuesta fue el coeficiente lineal para la temperatura de entrada de aire al

174

secadero; indicando que el parámetro L* es mas influenciado por la temperatura de entrada

de aire al secadero que por la cantidad de maltodextrina empleada en la formulación (ver

Anexo 4 – Cuadro D14 y su análisis).

Figura 7.8. Superficies de respuesta para los parámetros colorimétricos L* , a* y b * para distintas temperaturas del aire de secado y distintas concentraciones de

maltodextrinas.

Los valores del parámetro “a*” se localizaron en la región central (a* ≈ 0) sin

tendencia al verde o al rojo; presentando un valor de -1,6 ± 0,91 (media ± de).

175

Tabla 7.6 Parámetros colorimétricos de los polvos para las diferentes condiciones ensayadas y valores de higroscopicidad

(HG)

Parámetro

N° de ensayo X1 (x1) X2 (x2) L* a* b* HG (%)

1 200 °C (-1) 2,05 %MD (-1) 58,50 ± 0,03 -1,12 ± 0,05 24,97 ± 0,01 6,8 ± 0,50

2 200 °C (-1) 12,05 %MD (1) 58,62 ± 0,05 -1,33 ± 0,02 24,55 ± 0,05 6,8 ± 0,41

3 240 °C (1) 2,05 %MD (-1) 60,56 ± 0,01 -1,91 ± 0,03 25,33 ± 0,01 7,8 ± 0,13

4 240 °C (1) 12,05 %MD (1) 62,46 ± 0,01 -2,26 ± 0,02 24,84 ± 0,02 7,2 ± 0,61

5 248,2 °C (1,41) 7,05 %MD (0) 58,93 ± 0,04 -1,84 ± 0,04 24,56 ± 0,04 8,7 ± 1,22

6 191,8 °C (-1,41) 7,05 %MD (0) 50,09 ± 0,06 1,09 ± 0,04 24,10 ± 0,00 4,9 ± 0,33

7 220 ° C (0) 14,1%MD (1,41) 59,76 ± 0,05 -1,96 ± 0,03 24,86 ± 0,02 7,0 ± 0,19

8 220 °C (0) 0 %MD (-1,41) 58,56 ± 0,03 -1,30 ± 0,03 24,97 ± 0,01 7,6 ± 0,07

9-13 220 °C (0) 7,05 %MD (0) 60,57 ± 0,43 -2,06 ± 0,09 24,97 ± 0,07 6,7 ± 0,49

Datos expresados como media ± desvío estándar

Los valores para “b

una media de 24,8. Los el

los polvos hacia el amarillo

concentración de maltodex

Trela et al. (2012) re

estacionada: Lo* = 41,5 ±

valores con los del polvo d

producto obtenido en el pr

producto de partida. El val

7.3.4. Cinética de

La humedad adsorb

almacenamiento ensayadas

en la figura 7.9 y en la ta

pseudo-replicas (Datos dis

humedad inicial de las mue

Figura 7.9. Valoresdiferentes temperatur

Generalmente los po

a adsorber con facilidad

precauciones necesarias la

fenómeno de apelmazamie

“b*” mostraron una desviación estándar de 0,

elevados valores hallados para “b*” indican u

rillo. Sus valores tienden a disminuir conforme s

extrina en la formulación.

reportaron los siguientes parámetros de colo

5 ± 0,5; ao*= -2,9 ± 0,4 y bo*= 15,7± 0,2. Co

o de yerba mate, dados en la tabla 7.6, se puede

presente trabajo es más claro y amarillo y men

valor de la diferencia absoluta de color fue ∆E=

de adsorción e higroscopicidad

orbida por los polvos luego de 12 h en las

das (22 ± 1 °C y 84,3 ± 2% de humedad relativ

tabla 7.6; los datos representan los valores p

disponibles en Anexo 4-Cuadro D15 y D16).

uestras no fue uniforme (ver punto 7.3.4)

res medios de higroscopicidad de los polvos turas de entrada de aire (Ti) y varias concent

maltodextrina (MD)

polvos obtenidos por secado spray son higroscó

ad humedad del aire circundante y a menos qu

s la superficie de los polvos se vuelve pegaj

miento (caking). Según Ross (1993), la higrosc

176

0,33 alrededor de

n una tendencia de

e se incremente la

lor en yerba mate

Comparando estos

ede concluir que el

enos verde que el

∆E= 19,8.

as condiciones de

tiva) es presentada

promedio de tres

El contenido de

s (HG; %) para entraciones de

scópicos y tienden

que se tomen las

gajosa y ocurre el

oscopicidad es una

177

más de las características de los polvos deshidratados que puede ser atribuida al

fenómeno de transición vítrea.

Tabla 7.7 Constantes y parámetros de ajuste del modelo de Peleg y del modelo logarítmico para la cinética de adsorción de humedad.

Modelo Condiciones Constante Parámetro

K1 K2 R2 EMA(%)

Peleg 200°C; 2,05 %MD 145,61 2,66 99,86 0,30

200°C; 12,05 %MD 55,47 2,49 98,01 1,40

240°C; 2,05 %MD 144,94 2,56 99,48 0,60

240°C; 12,05 %MD 147,85 3,12 99,05 0,70

248,2°C; 7,05 %MD 131,02 2,81 99,10 0,70

191,8°C; 7,05 %MD 194,62 2,64 99,61 0,50

220°C; 0 %MD 141,37 2,60 99,59 0,60

220°C; 7,05 %MD 152,72 2,86 98,30 1,00

220°C; 14,1 %MD 131,05 3,17 99,57 0,40

Constante Parámetro

Log A B R2 EMA(%)

200°C; 2,05 %MD 0,1674 -0,1050 99,45 0,59

200°C; 12,05 %MD 0,1398 0,0247 99,37 0,40

240°C; 2,05 %MD 0,1716 -0,1058 99,71 0,30

240°C; 12,05 %MD 0,1380 -0,0716 99,36 0,50

248,2°C; 7,05 %MD 0,1506 -0,0729 99,55 0,40

191,8°C; 7,05 %MD 0,1754 -0,1392 99,38 0,50

220°C; 0 %MD 0,1687 -0,1009 99,71 0,40

220°C; 7,05 %MD 0,1537 -0,0916 98,91 0,50

220°C; 14,1 %MD 0,1333 -0,0588 98,66 0,70

EMA: error medio absoluto; K1 (en h*g ms/g agua); K2 (en g ms/g agua); a (adimensional); b (en g agua/g ms)

Por lo general, para una misma temperatura de entrada del aire, el agregado de

maltodextrina contribuyó a disminuir la higroscopicidad de los polvos. Este efecto

puede apreciarse mejor en la figura 7.10.

178

Fig. 7.10. Cinética de ganancia de humedad (G, %) en función del tiempo-Efecto del agregado de maltodextrina

Modelado de la cinética de adsorción:

Las cinéticas de adsorción se modelaron empleando el modelo de Peleg y el

modelo logarítmico; el ajuste de los modelos fue evaluado por el coeficiente de

determinación (R2 ) y por el EMA (error medio absoluto) (Datos disponibles en Anexo

179

4-Cuadro 17). Estos valores y los parámetros de ajuste de los modelos se presentan en

la tabla 7.7. Los resultados mostraron que para las diferentes condiciones de secado

ensayadas, el modelo logarítmico presentó mejor ajuste que el modelo de Peleg, con

EMA menores a 0,7 % y R2 cercanos a la unidad.

En las figuras 7.10 y 7.11 se muestran los datos experimentales con sus

respectivos valores calculados utilizando el modelo logarítmico. Se esperaría que el

agregado de maltodextrina contribuya a disminuir la tendencia a la higroscopicidad, lo

cual puede apreciarse en la figura 7.10; mientras que para un mismo porcentaje de

maltodextrina (7,05 %MD) dentro del rango de temperaturas de entrada de aire al

secadero comprendidas entre 191 y 248 °C (Figura 7.11), la temperatura no parece

tener efecto sobre la higroscopicidad.

Figura 7.11. Cinética de ganancia de humedad (G; %) en función del tiempo-Efecto de la temperatura de entrada del aire al secadero

7.3.5. Isotermas de adsorción

El contenido de humedad de equilibrio de las muestras en polvo obtenido con

diferentes proporciones de maltodextrina y diferentes temperaturas de entrada de aire

equilibrados a seis actividades acuosas se presentan en la tabla 7.8 (datos disponibles

en Anexo 4 - Cuadro D18). Dichos datos experimentales se modelaron usando los

180

Tabla 7.8 Contenido de humedad de equilibrio del mate soluble formulado con diferentes porcentajes de maltodextrina y deshidratado a diferentes temperaturas de entrada del aire de secado

Contenido de humedad de equilibrio, CHe (g/g ms) a 25ºC.

aw 220°C; 0 %MD 220°C; 7,05 %MD 220°C; 14,1 %MD 240°C; 2,05 %MD 200°C; 2,05 %MD

0,113 0,037 ± 0,001 0,037 ± 0,001 0,048 ± 0,000 0,025 ± 0,001 0,030 ± 0,001

0,327 0,075 ± 0,000 0,062 ± 0,000 0,067 ± 0,000 0,055 ± 0,001 0,056 ± 0,004

0,528 0,103 ± 0,003 0,085 ± 0,005 0,103 ± 0,003 0,120 ± 0,005 0,118 ± 0,001

0,649 0,128 ± 0,004 0,109 ± 0,003 0,122 ± 0,003 0,158 ± 0,011 0,143 ± 0,002

0,753 0,236 ± 0,007 0,185 ± 0,005 0,168 ± 0,002 0,250 ± 0,007 0,259 ± 0,004

0,843 0,321 ± 0,012 0,295 ± 0,013 0,278 ± 0,009 0,384 ± 0,006 0,381 ± 0,005

181

modelos de GAB y BET modificado, cuyos parámetros estimados y de ajuste se

presentan en la tabla 7.9 (análisis estadístico disponible en Anexo 4 - Cuadros D19 y

D20).

Tabla 7.9 Parámetros estimados de los modelos GAB y BET modificado para mate soluble formulado con diferentes porcentajes de maltodextrina y

deshidratado a diferentes temperaturas de entrada del aire de secado

Modelo Condiciones Constante R2 MPE(%)

Xm CGAB kGAB

GAB 0 %MD; 220 °C 0,057 10,03 0,982 0,980 7,58

2,05 %MD; 200 °C 0,072 2,75 0,979 0,990 10,62

2,05 %MD; 240 °C 0,075 2,56 0,972 0,998 6,98

7,05 %MD; 220 °C 0,041 34,11 1,024 0,994 4,41

14,10 %MD; 220 °C 0,049 23,21 0,971 0,990 6,28

BET Xm CBET N

0 %MD; 220 °C 0,054 12,76 22,89 0,981 6,79

2,05 %MD; 200 °C 0,065 3,49 23,50 0,990 9,81

2,05 %MD; 240 °C 0,066 3,47 20,96 0,997 5,82

7,05 %MD; 220 °C 0,045 17,69 11,16 0,990 5,94

14,10 %MD; 220 °C 0,044 14,45 13,98 0,983 10,82

Xm: contenido de humedad de la monocapa (g agua / g de producto seco); Constantes adimensioanles de los modelos (CGAB, kGAB, CBET, n)

La figura 7.12 muestra las isotermas experimentales y el ajuste del modelo GAB

para los polvos formulados con 2,05 %MD y obtenidos a dos temperaturas de entrada

de aire al secadero (200 y 240 °C). La figura 7.13 muestra las isotermas

experimentales y el ajuste del modelo GAB para los polvos obtenidos a una

temperatura de entrada de aire de 220 °C y formulados con tres concentraciones de

maltodextrina (%MD, 0, 7,05 y 14,10 %MD). En ella se puede observar que para aw ≤

0,8 el agregado de dicho aditivo provoca la reducción del contenido de humedad final

de equilibrio; probablemente debido que se modifica el balance de los sitios

hidrofílicos/hidrofobicos (Perez-Alonso et al., 2006). Resultados similares fueron

observados por Kurozawa et al. (2009).

Figura 7.12. Isote%MD y deshidratado u

Ambas figuras mue

amorfos: se verifica la ads

incrementa la humedad

comportamiento tipo III se

de humedad es función de

de la microestructura del p

Para cada muestra

alcanzar el equilibrio, cuy

relativa. Luego de aproxim

muestras expuestas a hume

embargo cuando fueron ac

adsorbiendo humedad incl

de humedad por parte de

(2011).

Los valores prome

resultaron 0,058 ± 0,014 g

otermas de adsorción de mate soluble formulutilizando diferentes temperaturas de entra

secado (200 y 240 °C)

uestran el perfil de adsorción de agua típico

dsorción de cantidades incrementales de agua a

dad relativa a temperatura constante; p

egún la clasificación de Brunauer. La aw a un

de la composición química, de la estructura su

l polvo.

tra acondicionada, se evidenció un tiempo

cuya duración se incrementó con el aumento

ximadamente dos semanas de acondicionamien

medades relativas menores a 64 % alcanzaron e

acondicionadas a humedades relativas mayor

ncluso luego de 30 días. Este fenómeno de con

de los polvos también fue observado y reporta

medio del contenido de humedad de la m

4 g agua / g de producto seco de acuerdo al mo

182

ulado con 2,05 trada del aire de

ico de materiales

a a medida que se

presentando un

un dado contenido

supramolecular y

o necesario para

to de la humedad

iento a 25 °C, las

n el equilibrio; sin

yores continuaron

continua adsorción

rtado por Li et al.

monocapa (Xm)

modelo de GAB y

0,058 ± 0,0105 g agua / g

7.9). En la bibliografía se

producto seco; con const

isotermas a 25 °C según e

aditivos, disponibles come

partir de isotermas a 20, 30

yerba mate estacionada va

para la fracción de hojas y

fracción de palos. (Känzig

sido reportados en product

Comparando el valo

temperatura de aire de en

entre 7 y 14 % contribuye

atribuyen esta disminuci

provocaría una disminució

Figura 7.13. Isotermcon diferentes porcent

como tem

/ g de producto seco de acuerdo al modelo de

se reportan valores de Xm de 0,06029 ± 0,0055

nstantes k = 0,9618 ± 0,00735 y C = 1,417

n el modelo de GAB para muestras de té verde

mercialmente (Li et al., 2011). Los valores de X

, 30, 40 y 50ºC y usando el modelo de GAB en

varían de entre 4,11 y 5,39 kg de agua / 100 kg

s y entre 5,30 y 5,95 kg de agua / 100 kg de sól

zig et al., 1985, 1987). Valores de k cercanos

uctos vegetales en polvo en varios trabajos (Ped

alor de Xm correspondiente a los polvos obten

entrada (220°C), se aprecia que el agregado d

ye a una disminución de este parámetro. Kuroza

ución al efecto encapsulador de la maltode

ción de los sitios polares expuestos a las molécu

ermas de adsorción de mate soluble puro y mentajes de maltodextrina, deshidratados utiliz temperatura de entrada del aire de secado.

183

de BET (ver Tabla

0553 g agua / g de

417 ± 0,262 para

rde instantáneo sin

e Xm reportados a

en hojas y palos de

kg de sólido seco

sólido seco para la

os a la unidad han

edro et al., 2010).

tenidos a una dada

de maltodextrina

ozawa et al. (2009)

odextrina lo cual

éculas de agua.

mate formulado tilizando 220 ºC

184

7.3.6. Temperatura de transición vítrea

Las temperaturas de transición vítrea (onset y midpoint; Tgos y Tgmp

respectivamente) de los polvos de mate soluble acondicionados en ambientes con 53,

33 y 11 % de humedad relativa y de los sólidos secos (Tgs) presentes en los mismos se

presentan en la tabla 7.10 (datos disponibles en Anexo 4 - Cuadros D21 y D22). Los

datos experimentales de Tgos (datos disponibles en Anexo 4 - Cuadro D23) se ajustaron

a la ecuación de Gordon y Taylor (G-T; ecuación 7.3 en tabla 7.2). Los parámetros

obtenidos por regresión no lineal (la constante empírica k y la temperatura de

transición vítrea de los sólidos secos o anhidros (Tgs) se presentan en la tabla 7.11

(análisis estadístico disponible en Anexo 4 - Cuadros D24 y D25); mientras que las

curvas predichas por el modelo de G-T aplicadas a Tgos se presentan en la figura 7.14.

Tabla 7.10 Temperaturas de transición vítrea de mate soluble puro y formulado con diferentes porcentajes de maltodextrina y obtenidos con una

temperatura de aire de entrada de 220 ºC

Condiciones Muestra aw muestra Tgos(°C) Tgmp (°C)

0 %MD

8 0,53 15,4 35,9

8 0,44 30,8 37,3

8 0,41 39,2 43,6

7,05 %MD

9 0,55 14,8 28,4

9 0,46 31,4 37,1

9 0,41 42,9 47,3

14,1 %MD

7 0,52 27,6 39,8

7 0,47 36,2 41,2

7 0,44 52,1 60,5

Para un sistema binario, el parámetro k del modelo de G-T controla el grado de

curvatura de la linea Tg-CH, y puede ser relacionado a la fuerza de la interacción entre

los componentes del sistema. En la bibliografía se reportan casos en los que la adición

de maltodextrina incrementa el valor de k (Silva et al., 2006); sin embargo en la

185

presente investigación dicho incremento no se verificó. Los valores de k estimados se

encuentran en el rango de valores reportados en la bibliografía para productos en polvo

formulados con y sin maltodextrina (3,9≤ k ≤ 5,5; Silva et al.; 2006). Li et al. (2011)

reporta una k de 2,946 para muestras comerciales de té verde instantáneo sin aditivos.

Tabla 7.11 Parámetros estimados del modelo de G-T para mate soluble formulado con diferentes porcentajes de maltodextrina y deshidratados a una

temperatura de entrada del aire de secado de 220 °C

Condiciones Constantes R2 MPE (%)

Tgs (ºC) k

0 %MD 63,2 2,466 0,902 10,50

7,05 %MD 62,0 2,514 0,993 2,76

14,1 %MD 70,0 2,428 0,969 5,39

Figura 7.14. Temperatura de transición vítrea en función del contenido de sólidos para mate soluble formulado con 0; 7,05 y 14,10 %MD) y deshidratado

utilizando una temperatura de aire de entrada al secadero spray de 220 °C

186

Los polvos obtenidos empleando una temperatura de aire de entrada al secadero

de 220 °C, formulados con 0 y 7,05 %MD, presentaron temperaturas de transición

vítrea (Tgos) a humedades relativas comprendidas entre 53-55 % de 14,8 y 15,4 °C,

ambas inferiores a la temperatura ambiente. Cuando se formularon con 14 %MD, su

Tgos se elevó a 27,6 °C para una humedad relativa del 52%, confirmando que el

agregado de maltodextrina en un 14 % eleva la Tgos de los polvos hasta la zona estable.

Dicho comportamiento es esperable, dado que al aumentar el porcentaje de

maltodextrina se está provocando un incremento del peso molecular medio de los

sólidos solubles de los polvos. Para los polvos obtenidos empleando 220 °C como

temperatura de entrada de aire, se encontró un efecto significativo sobre la temperatura

de transición vítrea de los sólidos secos (Tgs) por parte de la variable concentración de

maltodextrina (p ≤ 0,0926; ANOVA disponible en Anexo 4 - Cuadro D26) (Figura

7.15). Sin embargo no se encontraron diferencias significativas en los valores de Tgs

de los polvos formulados con 0 y 7 %MD, pero si entre la Tgs de estos últimos y la Tgs

de los polvos formulados con 14 % MD (Anexo 4 - Cuadro D26). Esto podría

interpretarse considerando que el agregado de maltodextrina de 0 a 7 % no implica un

incremento suficiente en el peso molecular medio de los sólidos en el producto final

como para provocar un aumento en escala práctica de la temperatura de transición

vítrea, mientras que el agregado de un 7 % más de dicho aditivo hasta lograr un 14 %

MD resulta suficiente.

Figura 7.15. Medias e intervalos de mínima diferencia significativa (p ≤0,05) para temperaturas de transición vítrea de los sólidos secos en mate soluble formulado con 0; 7,05 y 14,10 %MD y deshidratado utilizando una temperatura de aire de

entrada al secadero spray de 220 °C

187

7.3.7. Discusión de criterios de estabilidad

El enfoque basado en el concepto de aw sugiere que un producto a una

determinada temperatura posee su mayor estabilidad química cuando su contenido de

humedad corresponde al contenido de humedad de la monocapa a dicha temperatura, el

cual depende de la composición química y la temperatura a la que se encuentra el

material. Este enfoque si bien es aun ampliamente aceptado, posee algunas

limitaciones tales como: i- que el alimento puede no encontrarse en un estado de

equilibrio, ii- que la naturaleza de los solutos presentes puede desempeñar un rol

importante en el desarrollo de reacciones químicas, iii- no indica acerca del estado del

agua presente en el alimento y en como sus moléculas están interactuando con las

moléculas de los sustratos, iv-que los valores de aw límites estipulados para

determinados cambios pueden ser influenciados por niveles altos o bajos de otros

factores presentes tales como pH, sales, agentes antimicrobianos, tipos de tratamientos,

etc (Rahman, 2006). Por ejemplo, este enfoque postula que los cambio debidos a

actividad microbiológica estarán restringidos si la aw del alimento es menor a 0,6; sin

embargo, la tecnología de efecto valla (“hurdle effect”) que se basa en la combinación

inteligente de varios factores de preservación para lograr la estabilidad microbiológica

de un alimento, postula que dicha aw límite puede incrementarse si se contempla el

efecto de otros factores de preservación tales como el pH del producto.

En la tabla 7.12 se presentan los valores de contenido de humedad

correspondientes al valor de la monocapa predichos por el modelo de GAB y sus

correspondientes valores de aw obtenidos gráficamente a partir de las isotermas para

polvos obtenidos a una temperatura del aire de entrada de 220 ºC.

Tabla 7.12 Valores del contenido de humedad y de actividad acuosa de la monocapa (Xm y aw) para las formulaciones de mate soluble a 25ºC.

MD (%)

Xm (GAB)

(g agua / g sólidos secos) aw (GAB)

0 0,057 0,23

7,05 0,041 0,11

14,10 0,049 0,11

188

De acuedo con Rahman (2006) existen alimentos cuya estabilidad no se explica

únicamente con el concepto de aw siendo necesario un abordaje multienfoque

(actividad acuosa + transición vítrea) para el estudio de la estabilidad del alimento.

Durante la deshidratación por aspersión, la eliminación de agua normalmente se da en

un tiempo menor al que fija la cinética de cristalización de los solutos presentes en el

extracto inicial. Por ello en este tipo de proceso es frecuente llevar a los solutos

solubles y a los insolubles compatibles con el agua a un estado amorfo,

molecularmente desordenado, de no equilibrio termodinámico, que exhibe cambios

dependientes del tiempo aproximándose al equilibrio (Roos et al., 1996). El problema

con el manejo de los alimentos en polvo es que usualmente se hallan en un estado

amorfo inestable, por lo que su estado físico puede cambiar de un estado de sólido

amorfo vítreo a un estado de sólido amorfo viscoso una vez que el producto alcanza su

Tg, ya sea como consecuencia de una ganancia de humedad o por su exposición a una

temperatura de almacenamiento superior a su Tg. Por ello, el enfoque de aw,

empleando Xm como único criterio de estabilidad del producto, no resultaría

suficiente.

El concepto de transición vítrea postula que un producto será estable siempre que

se halle en estado amorfo vítreo, es decir que se halle a una temperatura por debajo de

su temperatura de transición vítrea. En alimentos deshidratados en polvo, ciertos

cambios tanto estructurales como fisicoquímicos se correlacionan más con el

fenómeno de transición vítrea a través del efecto de plastificación del agua o de la

temperatura que con el contenido de humedad de la monocapa. Entre dichos cambios

se pueden mencionar los fenómenos de pegajosidad (pérdida del “free flowing”),

colapso, apelmazamiento y sinterizado de la superficie del material (Lievonen y Roos,

2002; Miao y Roos, 2006; Slade y Levine, 1991).

El fenómeno de caking es un fenómeno indeseable, por el cual los polvos “ free

flowing” de bajo contenido de humedad, con el transcurso del tiempo, al ser expuestos

a altas humedades relativas o altas temperaturas, se van transformando en partículas

pegajosas que luego se van adhiriendo unas a otras, lo cual reduce la capacidad de los

polvos de dispersarse libremente (estadío de apelmazamiento y pegajosidad). Con el

progreso del fenómeno de caking, se comienzan a formar bultos quebradizos tipo

terrones que luego se transforman en masas aglomeradas comúnmente denominadas

“tortas”. En la fase más avanzada de este fenómeno, las partículas pierden su estructura

189

interna estabilizadora, por lo que la estructura de los polvos colapsa y desaparecen los

poros abiertos que presentaban dichas estructuras, obteniéndose una masa amorfa

altamente viscosa, (Hartmann y Palzer, 2011). Estos cambios resultan en pérdidas de

funcionalidad y calidad (Aguilera et al., 1995) (Figura 7.16). La principal causa de

dicho fenómeno es la plastificación de la superficie de la partícula sólida debida a la

ganancia de humedad. La figura 7.17 presenta, a los fines de ilustración, los “puentes”

entre partículas de polvo de tomate obtenido por secado spray que sufrieron el

fenómeno de caking.

Figura 7.16. Diferentes fases del proceso de coalescencia de las partículas. Adaptado de Hartmann y Palzer (2011)

Figura 7.17. “Puentes” entre partículas de polvo que sufrieron el fenómeno de caking. Hartmann y Palzer (2011)

En relación a la apariencia de los polvos luego de ser equilibrados sobre

soluciones salinas saturadas, las muestras correspondientes a los ensayos 1(200 ºC;

2,05 %MD), 3 (200 ºC; 12,05 %MD), 7 (220 ºC; 14,1 %MD), 8 (220 ºC; 0 %MD) y 9

(220 ºC; 7,05 %MD) sufrieron el fenómeno de caking. El mismo incluyó los estadios

de apelmazamiento, pegajosidad, colapso y melting (Figura 7.16), todos observables

190

macroscópicamente cuando fueron almacenadas a 25 ± 2°C en ambientes de

humedades relativas superiores a 64 % (soluciones salinas saturadas de Mg(NO3)2,

ClNa y ClK).

Ross (1993), evaluando ambos conceptos (aw y Tg) en relación al peso molecular

de una serie de compuestos homólogos, definió un contenido de agua crítico (CHC)

que provocaba una caída de la temperatura de transición vítrea del producto hasta

igualarse a la temperatura ambiente (25 °C). Dicho contenido crítico de agua podría

relacionarse a un valor de actividad acuosa crítica (aWC) obtenible a partir de la

isoterma a 25 °C.

Ambos conceptos arriba mencionados (CHC y aWC) fueron relacionados

gráficamente en la figura 7.18, en la cual se combinaron los datos experimentales de

temperatura de transición vítrea con los datos correspondientes a las isotermas

(experimentales y calculadas mediante el modelo GAB) para las muestras

deshidratadas empleando una temperatura de aire de entrada de 220 °C y formuladas

con 0; 7,05 y 14,10 % MD (muestras 8, 9 y 7). A partir de estos gráficos combinados

(Figura 7.18) se ha evaluado, para una determinada temperatura de almacenamiento

(25 ºC), cual será la aWC y el contenido de humedad critico (CHC) que delimitan la

transición vítreo-goma y por lo tanto la humedad relativa ambiente límite de

almacenamiento del producto a esa temperatura para las tres formulaciones antes

citadas. Los valores críticos encontrados se presentan en la tabla 7.13.

Tabla 7.13 Valores críticos para contenido de humedad (CHC) y actividad

acuosa (aWC) para las formulaciones de mate soluble

MD (%)

CHC

(g agua / g sólidos secos)

aWC (GAB)

0 0,082 0,42

7,05 0,075 0,42

14,10 0,110 >0,55 (experimental) o = 0,603 (predicho por GAB)

191

El CHC resultó muy similar para el mate soluble puro y el mate soluble

formulado con 7,05 % MD. Cuando estos productos son almacenados a una humedad

relativa ambiente del 42%, presentarán un contenido de humedad cercano al 7-8 % bs

y su Tg será de 25 °C, por lo tanto si estos productos se almacenan y comercializan a

una temperatura menor a 25 °C, el nivel máximo de humedad relativa ambiente que

permitiría asegurar el estado vítreo sería del 42% (es decir sin signos deteriorativos

gobernados por fenómenos difusionales). Este valor de CHC es 1,4 y 1,7 veces superior

a los correspondientes Xm a 25ºC predichos por el modelo de GAB.

La transición vítrea en condiciones ambientales (25 °C) para la formulación con

14 %MD ocurriría cuando la humedad relativa ambiente ronde el 58-60 %, por lo que

dicha formulación puede ser considerada la más estable desde el punto de vista de los

deterioros gobernados por fenómenos difusionales. Esta formulación presentaría una

aWC probablemente mayor a 0,55 (de acuerdo a la extrapolación de la línea de Tg en la

figura 7.18c) (o de 0,6 según predicciones del modelo de G-T y modelo de GAB

combinados). Esto significa que las muestras formuladas con 14,1 % MD pueden ser

almacenadas a temperaturas hasta 25 °C a una humedad relativa máxima de

aproximadamente 60 % sin presentar cambios físicos deteriorativos asociados a la

transición de su estado vítreo con un CHC cercano al 11 % bs. Este CHC es

aproximadamente 2,2 veces mayor al contenido de humedad de la monocapa a 25ºC

predicho por el modelo de GAB (ver Tabla 7.12).

El agregado de maltodextrina en dicho porcentaje permitiría elevar la tolerancia

del producto a HR de almacenamiento del 60%, por lo que su uso resultaría apropiado

para prolongar la vida útil del mate soluble desde el punto de vista de su estabilidad

estructural. Sin embargo, si se consideran otras reacciones químicas de deterioro que

no están limitadas por la difusión de los reactantes, el valor de humedad de monocapa,

menor que los valores de CHC determinados para los polvos formulados con las

distintas concentraciones de maltodextrina, debe tomarse en consideración para

mantener la estabilidad de los polvos. Dichos valores de Xm implican valores de aw en

el rango 0,11-0,23 (Tabla 7.12) para polvos deshidratados a 220 ºC.

Figura 7.18. Relahumedad de equilibrio y

(a) puro

elación entre la actividad acuosa (a 25 °C), el io y la temperatura de transición vítrea para uro; (b) con 7,05 %MD; (c) con 14,1 %MD

192

el contenido de ra mate soluble:

193


• La adsorción de agua por parte de los polvos de mate soluble

ensayados pudo ser descripta adecuadamente por los modelos de GAB y BET

modificado. La temperatura de transición vítrea disminuyó conforme aumentó el

contenido de humedad de los productos, confirmando el efecto plastificador del agua

sobre esta propiedad.

• El efecto simultaneo de la temperatura de entrada al secadero y

y del porcentaje de maltodextrina agregado previamente al secado ha podido

modelarse adecuadamente; y permitiría la predicción del contenido de polifenoles

totales y de la capacidad antioxidante de los polvos.

• El mate soluble constituye un material amorfo, ya que las

moléculas de sus solutos fueron inmovilizadas por la rápida deshidratación durante su

secado spray. El problema de la perdida de fluidez y del apelmazamiento del producto

es un problema omnipresente por lo que para lograr su estabilidad (tanto física como

química) se deben considerar los conceptos de actividad acuosa y de transición vítrea

combinados. Un ligero aumento en la aw de las muestras, provocado por una leve

humectación o aumento en la temperatura de almacenamiento, provocaría fenómenos

indeseables asociados al cambio de estado vítreo a estado gomoso, por lo que sería

necesario emplear envases de muy baja permeabilidad al vapor de agua para mantener

la calidad del producto y controlar la temperatura de almacenamiento.

• El secado spray de extractos concentrados de yerba mate con la

utilización de maltodextrina como agente encapsulante en concentraciones entre 0 y

14,1% p/v y con temperaturas de entrada de aire entre 192 y 248 ºC permite la

obtención de mate soluble con un contenido de polifenoles totales similar al del

extracto líquido; de coloración acorde al producto original, con valores muy

aceptables de solubilidad a 25 ºC (siempre mayores al 91%) y que al ser rehidratados

no presentan depósitos sedimentados visualmente perceptibles.

• Se recomienda como futuros rangos de operación el de las

temperaturas bajas a medias (200-220 ºC) y concentraciones de maltodextrina elevadas

(10-14 % p/v) a partir de las cuales se logra menores pérdidas de polifenoles y una

mayor estabilidad física del producto final.

• El agregado de maltodextrina en un 14% permitiría elevar la

humedad relativa crítica de almacenamiento (en relación a los cambios físicos); efecto

194

no evidenciado a menores porcentajes de maltodextrina. Sin embargo, la estabilidad de

los polvos desde el punto de vista de reacciones químicas requeriría humedades de

almacenamiento menores e iguales a las de monocapa.

Con base en lo concluido anteriormente, se presentan las siguienes recomendaciones:

1-Evaluar el tipo de empaque más adecuado para el producto.

2-Realizar un análisis sensorial de los polvos.

3-Evaluar si el producto en polvo podría ser un ingrediente de alimentos como

yogures, mermeladas, etc., por su efecto antioxidante.

4-Evaluar la ocurrencia y extensión de reacciones químicas de deterioro de polifenoles

durante su almacenamiento en ambientes a diferentes humedades relativas y en

función de la permeabilidad de los envases.

195

SECCION IV

CONCLUSIONES FINALES

196

CONCLUSIONES FINALES

197

• La metodología ISO/FDIS 14502 para la determinación del

contenido de polifenoles totales (CPT) pudo adaptarse sin inconvenientes a muestras

de yerba mate elaborada (Ilex paraguariensis). Los resultados obtenidos fueron

razonablemente cercanos a los reportados en la bibliografía y los estándares ácido

clorogénico y ácido gálico mostraron sencillez de manejo y estabilidad en las

condiciones de los ensayos.

• Los resultados obtenidos a partir del empleo de método del

radical DPPH para la determinación de capacidad antioxidante (CAO) in vitro de los

extractos de yerba mate adaptada, resultaron apropiados y podrían contribuir al control

de calidad del producto, sin embargo la temperatura de incubación es un factor que

debe ser estandarizado a lo largo de las determinaciones; el método no presentó

interferencia con la cafeína presente en los extractos. Los estándares ácido ascórbico y

Trolox mostraron sencillez de manejo y estabilidad en las condiciones de los ensayos.

• Al evaluar los efectos del origen, tipo de procesamiento y época

de cosecha, sobre el CPT y la CAO de la yerba mate, se encontró que:

• de los tres factores estudiados, el único que ejerce un efecto

significativo sobre el CPT de los extractos de la yerba mate fue la época de cosecha,

resultando el CPT promedio 4,5 % mayor al inicio de la época de cosecha que al final

de la misma, probablemente debido a distribución de edades foliares en el material

cosechado;

• la época de cosecha (la cual guarda relación con la fase de

desarrollo del cultivo) afecta a la CAO de los extractos de yerba mate

independientemente del origen de las muestras. Los diferentes tipos de secado inciden

de distinta forma sobre la CAO según se trate del inicio o del final de la época de

cosecha. En el secado tipo barbacuá no se detectaron variaciones significativas en la

CAO de los extractos provenientes de muestras cosechas en ambas épocas, mientras

que en los otros dos tipos de secado (cinta y tubular) se halló variación significativa de

la CAO según las épocas de cosecha, encontrándose valores mayores en el inicio de la

cosecha (marzo – abril), tanto para el secado en cinta como para el secado tubular. En

base a los resultados, para obtener extractos de yerba mate con altos CPT y CAO se

debe trabajar con materia prima cosechada al inicio de la cosecha.

• Al optimizar la extracción de polifenoles totales a partir de la

yerba mate se encontró que:

198

• la fracción hojas posee mayor CPT que la fracción palos (22,2 ±

0,14 y 14,1 ± 1,24 gEAC %ms respectivamente; p ≤ 0,012) por lo que para la

extracción de polifenoles a partir de yerba mate se sugiere la utilización únicamente de

la fracción de hojas;

• existe una fuerte asociación lineal directa entre CPT y

cualquiera de las formas de expresar CAO;

• si bien la extracción metanólica (metanol al 70 % en volumen, a

70 ºC durante 10 min) a partir de la fracción de hojas fue la más eficiente, el etanol y el

agua han mostrado ser eficaces en la extracción de los compuestos fenólicos presentes

en yerba mate y presentan la ventaja competitiva de ser de baja toxicidad (etanol) y

alta abundancia relativa (agua);

• se considera conveniente utilizar dos sistemas extractivos:

soluciones etanólicas (concentraciones 30-50 %p/p con relaciones líquido a sólido

comprendidas entre 8 y 9 g líquido / g ms por 30 min a 65 ± 2° C) y agua en ebullición

usando la misma relación líquido a sólido (8 - 9) y el mismo tiempo de extracción (30

min). Con ambos sistemas extractivos se logra una eficiencia de extracción cercana al

55 % del valor máximo posible (metanol al 70 % en volumen; a 70 °C por 10 min).

• El secado spray de extractos concentrados de yerba mate con la

utilización de maltodextrina como agente encapsulante en concentraciones entre 0 y

14,1% p/v y con temperaturas de entrada de aire entre 192 y 248 ºC permite la

obtención de mate soluble con un contenido de polifenoles totales similar al del

extracto líquido previo al secado; de coloración acorde al producto original, con

valores muy aceptables de solubilidad a 25 ºC (siempre mayores al 91%) y que al ser

rehidratados no presentan depósitos sedimentados visualmente perceptibles. La

adsorción de agua por parte de los polvos de mate soluble ensayados puede ser

descripta adecuadamente por los modelos de GAB y BET modificado.

• En el rango operación estudiada (temperatura del aire de

entrada entre 192 ºC y 248 ºC y porcentaje de maltodextrina (MD) entre 0 y 14,1

%p/v) la pérdida de polifenoles fue despreciable (no mayor al 9%) lo cual sugiere que

los compuestos que contribuyen al valor de CPT del producto en polvo son muy

estables a las temperaturas ensayadas o sus posibles productos de hidrólisis durante el

proceso de secado continúan presentando estructuras moleculares con grupos oxidrilos

199

unidos al anillo bencénico, es decir que mantienen su capacidad reductora (o

antioxidante).

• El problema de la perdida de fluidez y del apelmazamiento del

producto es un problema omnipresente. El mate soluble constituye un material amorfo,

ya que las moléculas de sus solutos fueron inmovilizadas por la rápida deshidratación

durante su secado spray. Por lo tanto cuando se desea lograr su estabilidad (tanto física

como química) se deben considerar ambos conceptos, tanto actividad acuosa como

transición vítrea. Un ligero aumento en la aw de las muestras, provocado por una leve

humectación o aumento en la temperatura de almacenamiento, provocaría fenómenos

indeseables asociados al cambio de estado vítreo a estado gomoso, por lo que sería

necesario emplear envases de muy baja permeabilidad al vapor de agua para mantener

la calidad del producto. El agregado de maltodextrina en un 14% porcentaje permitió

lograr un nivel máximo de HR del almacenamiento sin riesgo de aparición de signos

de deterioro asociados al paso al estado gomoso de la matriz amorfa; resultando este

porcentaje de maltodextrina el adecuado para prolongar la vida del mate soluble. Sin

embargo, la estabilidad de los polvos desde el punto de vista de reacciones químicas de

deterioro requeriría humedades de almacenamiento menores o iguales a las de la

monocapa.

• los resultados obtenidos en el rango estudiado orientan la zona

óptima (mínima pérdida de polifenoles) hacia las temperaturas bajas a medias (200 -

220 ºC) y 14,1 %p/v como concentración de maltodextrina a partir de las cuales se

logra menores pérdidas de polifenoles y una mayor estabilidad física del producto

final.

200

SECCION V

REFERENCIAS

201

REFERENCIAS

202

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ÍNDICE DE ANEXOS

ANEXO 1 ............................................................................................................................ 5

Nota 1. Modo de cálculo del contenido de polifenoles totales ............................................ 6

Cuadro A.1. Datos del ácido clorogénico como patrón estándar......................................... 6

Cuadro A.2. Análisis de regresión lineal para la curva de calibración con ácido clorogénico como estándar .................................................................................................. 7

Cuadro A.3. Contraste de hipótesis ..................................................................................... 7

Cuadro A.4. Datos del ácido gálico como patrón estándar ................................................. 8

Cuadro A.5. Análisis de regresión lineal para la curva de calibración con ácido gálico como estándar ...................................................................................................................... 8

Cuadro A.6. Datos crudos de lecturas de CPT .................................................................... 9

Cuadro A.7. Datos promediados de las lecturas de CPT del cuadro A6 ........................... 10

Cuadro A.8. Datos de lectura de absorbancia del blanco de reactivos del ensayo del radical DPPH a diferentes longitudes de onda .................................................................. 11

Cuadro A.9. Perfil de absorbancia del blanco de reactivos del ensayo del radical DPPH a diferentes concentraciones de la solución de trabajo del radical DPPH. ........................... 11

Cuadro A.10. Análisis de regresión lineal del perfil de absorbancia del radical DPPH .... 12

Cuadro A.11. Cinética de reacción entre el radical DPPH y el patrón ácido ascórbico ... 12

Cuadro A.12. Cinética de reacción entre el radical DPPH y el patrón Trolox ................. 14

Cuadro A.13. Cinética de reacción entre el radical DPPH y los extractos diluidos de yerba mate ......................................................................................................................... 15

Cuadro A.14. Planilla de cálculo de los cocientes másicos empleados ............................. 19

Cuadro A.15. Análisis de regresión lineal- Curva de calibración con Trolox ................... 20

Cuadro A.16. Análisis de regresión lineal-Curva de calibración con ácido ascórbico ...... 21

Cuadro A.17. Datos del ensayo de Folin-Ciocalteu .......................................................... 21

Cuadro A.18. Datos correspondientes al ensayo DPPH .................................................... 22

Cuadro A.19. Datos y análisis de regresión para la relación CPT-CAO de extractos de yerba mate ......................................................................................................................... 23

Cuadro A.20. Datos cinéticos correspondientes a la reacción del radical DPPH con cafeína ............................................................................................................................... 24

Cuadro A.21a. Efecto de la temperatura de incubación sobre el ensayo del radical DPPH ........................................................................................................................................... 25

Cuadro A.21b. Análisis de varianza para los efectos simples extracto (A) y temperatura (B) sobre la CAO (utilizando Trolox como patrón estándar) ............................................ 25

Cuadro A.21c. Análisis de varianza para los efectos simples extracto (A) y temperatura (B) sobre la CAO (utilizando ácido ascórbico como patrón estándar) .............................. 26

ANEXO 2 .......................................................................................................................... 27

Cuadro B.1. Datos de la determinación de contenido de polifenoles totales- Método de Folin-Ciocalteu .................................................................................................................. 28

Cuadro B.2. Datos de la determinación de Capacidad Antioxidante- Método de reducción del radical DPPH ............................................................................................................... 31

Cuadro B.3. Análisis de la Varianza para CPT (efectos simples) ..................................... 34

Cuadro B.4. Análisis de la Varianza para CAO (efectos simples) .................................... 34

Cuadro B.5. Análisis de la Varianza para CPT (efectos dobles: Orígen y época) ............. 35

Cuadro B.6. Análisis de la Varianza para CPT (efectos dobles: Secado y época) ............ 35

Cuadro B.7. Análisis de la Varianza para CAO (efectos dobles: Orígen y época)............ 35

Cuadro B.8. Análisis de la Varianza para CAO (efectos dobles: Secado y época) ........... 36

Cuadro B.9. Contrastes de hipótesis .................................................................................. 37

ANEXO 3 .......................................................................................................................... 38

Cuadro C.1. Datos de determinación de CPT- Método de Folin-Ciucalteu ...................... 39

Cuadro C.2. Resumen estadístico de CPT de las fracciones de hojas y palos y prueba t 39

Cuadro C.3. Datos correspondientes a la experiencia de determinación del tiempo de extracción .......................................................................................................................... 40

Cuadro C.4. Análisis de regresión no lineal – tiempo de extracción ................................. 41

Cuadro C.5. Planilla de cálculo de las cantidades a agregar - Experiencia correspondiente al diseño experimental ....................................................................................................... 44

Cuadro C.6. Datos de concentración y contenido de polifenoles totales ........................... 46

Cuadro C.7. Resumenes estadísticos y gráficos de dispersión .......................................... 48

Cuadro C.8. Datos de capacidad antioxidante ................................................................... 51

Nota C.3. Modo de cálculo del contenido de cafeína (CC) para extracciones del diseño . 52

Cuadro C.9. Datos de contenido de cafeína ....................................................................... 52

Cuadro C.10. Datos empleados para el análisis de regresión y de correlación ................. 54

Cuadro C.11. Análisis de correlación para los pares de variables ..................................... 55

Cuadro C.12. Análisis de mínima diferencia significativa (LSD, 95%) ........................... 58

Cuadro C.13. Análisis de regresión no lineal .................................................................... 64

ANEXO 4 .......................................................................................................................... 72

Cuadro D.1. Datos del ácido clorogénico como patrón estándar y análisis de regresión lineal .................................................................................................................................. 73

Nota D.1. Modo de cálculo de CPT para experiencias de secado .................................... 74

Cuadro D.2. Datos crudos de contenido de polifenoles totales de los polvos -Experiencia de secado ........................................................................................................................... 75

Cuadro D.3. Resúmen de datos de contenido de polifenoles totales de los polvos ........... 76

Nota D.2. Modo de cálculo de la capacidad antioxidante ................................................. 76

Cuadro D.4. Datos crudos de capacidad antioxidante de los polvos -Experiencia de secado ................................................................................................................................ 78

Cuadro D.5. Resumen de datos de Capacidad Antioxidante de los polvos ....................... 80

Cuadro D.6. Datos crudos de Solubilidad de los polvos (a 25°C)-Experiencia de secado 81

Cuadro D.7. Resumen de datos de solubilidad de los polvos ............................................ 81

Cuadro D.8. Datos usados para el análisis de superficie de respuesta (con variables independientes codificadas) ............................................................................................... 82

Cuadro D.9. Análisis de superficie de respuesta ............................................................... 82

Cuadro D.10. Estimación de errores del análisis de superficie de respuesta ..................... 86

Cuadro D.11. Datos crudos de determinación de humedad (CH, %bh) ............................ 90

Cuadro D.12. Datos crudos de determinación de densidad bruta (db; g/mL) ................... 91

Cuadro D.13. Análisis de correlación entre contenido de humedad (CH) y densidad (db) ........................................................................................................................................... 92

Cuadro D.14. Determinación de parámetros de color ....................................................... 94

Cuadro D.15. Datos crudos de determinación de ganancia de humedad de los diferentes polvos, almacenados a 22 °C y 84,34% de humedad relativa. .......................................... 95

Cuadro D.16. Planilla de cálculo de higroscopicidad (HG, %) ......................................... 96

Cuadro D.17. Valores medios de ganancia en peso........................................................... 97

Cuadro D.18. Datos obtenidos a partir de la determinación de humedad para isotermas104

Cuadro D.19. Datos de contenido de humedad de equilibrio (CHe; g agua / g ms) –Experiencia de isotermas ................................................................................................. 107

Cuadro D.20. Cálculo de errores-Modelado de las isotermas de adsorción .................... 117

Cuadro D.21. Datos de contenidos de humedad (CH), y fracciones de agua (ww) y de sólidos secos (ws), basados en nota D.3. ......................................................................... 120

Cuadro D.23. Resumen de datos empleados en el modelado de la ecuación de Gordon y Taylor .............................................................................................................................. 121

Cuadro D.24. Análisis de regresión no lineal-Modelo de Gordon y Taylor .................... 122

Cuadro D.25. Cálculo de errores-Modelado de Gordon y Taylor ................................... 125

Cuadro D.26. Datos empleados en el ANOVA de efecto simple del factor X2 (%MD) sobre la Tgs predicha por el modelo de Gordon y Taylor. .............................................. 126

ANEXO 1

Nota 1. Modo de cálculo del contenido de polifenoles totales

Cuando de utiliza la extracción descripta en el ítem 4.2.1.7, el CPT de la muestra (expresado en gramos de equivalente por 100 g de muestra seca, g E % ms) se calcula con los siguientes datos: Volumen del extracto (VO; mL), Peso de la muestra empleada (wi; g base húmeda), Volumen de dilución del extracto (VD; mL), Volumen de reacción (VR; mL), Equivalentes al patrón (E; mg equivalentes al patrón / mL) (valor obtenido de la curva de calibración del patrón elegido) y Contenido de humedad de la muestra (CH; g % base húmeda), utilizándola siguiente ecuación:

Cuadro A.1. Datos del ácido clorogénico como patrón estándar

Concentración (µg/mL)

Absorbancia (765nm)

Tiempo 0 h Tiempo 24 h

0 0,0002 0,0003

0 0,0001 0,0001

10 0,052 0,054

10 0,053 0,053

20 0,112 0,114

20 0,113 0,11

30 0,191 0,19

30 0,187 0,192

40 0,256 0,26

40 0,256 0,259

50 0,331 0,329

50 0,322 0,32

60 0,393 0,39

60 0,393 0,394

Cuadro A.2. Análisis de regresión lineal para la curva de calibración con ácido clorogénico como estándar

Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X

--------------------------------------------------- --------------------------

Variable dependiente: A(0 h; 765 nm)

Variable independiente: concentración de ácido clor ogénico(ug/mL)

--------------------------------------------------- --------------------------

Error Estadíst ico

Parámetro Estimación estándar T P-Valor

--------------------------------------------------- --------------------------

Ordenada -0,0104125 0,00330632 -3,14 928 0,0084

Pendiente 0,00667875 0,0000917007 72, 832 0,0000

--------------------------------------------------- --------------------------

Análisis de la Varianza

--------------------------------------------------- --------------------------

Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Cociente-F P-Valor

--------------------------------------------------- --------------------------

Modelo 0,249792 1 0,2497 92 5304,51 0,0000

Residuo 0,000565086 12 0,00004709 05

--------------------------------------------------- --------------------------

Total (Corr.) 0,250357 13

Coeficiente de Correlación = 0,998871

R-cuadrado = 99,7743 porcentaje

R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 99,7555 porcentaj e

Error estándar de est. = 0,00686225

Error absoluto medio = 0,00500357

Estadístico de Durbin-Watson = 1,05665 (P=0,0101)

Autocorrelación residual en Lag 1 = 0,365631

Hipótesis del presente análisis de regresión: Hnula (Ho): la variable dependiente (Absorbancia) no depende linealmente de la variable independiente (concentración). H alternativa (Ha): la variable dependiente (Absorbancia) depende linealmente de la variable independiente (concentración).

Conclusión: Se rechaza la Ho. El modelo lineal es válido.

Cuadro A.3. Contraste de hipótesis

Lecturas de absorbancia para las diluciones de ácido clorogénico a 0 y 24 h desde su preparación (A(0h)-A(24h)), (prueba t para muestras pareadas)

Media muestral = -0,000435714

Mediana muestral = -0,00005

contraste t

-----------

Hipótesis nula: media = 0,0

Alternativa: no igual

Estadístico t = -0,643842

P-valor = 0,530874

No se rechaza la hipótesis nula para alpha = 0,05.

Cuadro A.4. Datos del ácido gálico como patrón estándar

Concentración (µg/mL)

Absorbancia (765nm)

0 0,002 0 0,002

10 0,095 10 0,098 20 0,23 20 0,236 30 0,351 30 0,363 40 0,483 40 0,493 50 0,593 50 0,599 60 0,716 60 0,723

Cuadro A.5. Análisis de regresión lineal para la curva de calibración con ácido gálico como estándar


--------------------------------------------------- --------------------------

Variable dependiente: A (PATRÓN ÁCIDO GÁLICO)

Variable independiente: Concentración (ug/mL)

--------------------------------------------------- --------------------------

Error Estadíst ico


--------------------------------------------------- --------------------------

Ordenada -0,00898214 0,00481321 -1,86 615 0,0866

Pendiente 0,0121661 0,000133494 91,1 355 0,0000

--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------

Modelo 0,828874 1 0,8288 74 8305,68 0,0000

Residuo 0,00119755 12 0,00009979 61

--------------------------------------------------- --------------------------

Total (Corr.) 0,830072 13








Hipótesis del presente análisis de regresión: Hnula (Ho): la variable dependiente (Absorbancia) no depende linealmente de la variable independiente (concentración). H alternativa (Ha): la variable dependiente

(Absorbancia) depende linealmente de la variable independiente (concentración). . Conclusión: Se rechaza la Ho. El modelo lineal es válido.

Cuadro A.6. Datos crudos de lecturas de CPT

Concentración Equivalente CPT

Muestra Extracción Peso (g) CH Lectura A EAC EAG CPT-EAC CPT-EAG

1 1 0,2082 9,2 1 0,224 34,99 19,10 18,51 10,10 1 1 0,2082 9,2 2 0,226 35,28 19,26 18,66 10,19 1 2 0,2015 9,2 1 0,235 36,63 20,00 20,02 10,93 1 2 0,2015 9,2 2 0,234 36,48 19,92 19,94 10,89 2 1 0,2065 6,5 1 0,193 30,36 16,56 15,72 8,58 2 1 0,2065 6,5 2 0,184 29,01 15,82 15,03 8,19 2 2 0,2085 6,5 1 0,202 31,70 17,30 16,26 8,87 2 2 0,2085 6,5 2 0,202 31,70 17,30 16,26 8,87 3 1 0,2042 6,3 1 0,200 31,40 17,13 16,41 8,95 3 1 0,2042 6,3 2 0,196 30,81 16,80 16,10 8,78 3 2 0,2110 6,3 1 0,210 32,90 17,95 16,64 9,08 3 2 0,2110 6,3 2 0,211 33,04 18,03 16,71 9,12 4 1 0,2005 6,9 1 0,190 29,91 16,31 16,02 8,74 4 1 0,2005 6,9 2 0,189 29,76 16,23 15,94 8,69 4 2 0,2057 6,9 1 0,220 34,39 18,77 17,96 9,80 4 2 0,2057 6,9 2 0,225 35,13 19,18 18,35 10,02 5 1 0,2087 7 1 0,215 33,64 18,36 17,33 9,46 5 1 0,2087 7 2 0,220 34,39 18,77 17,72 9,67 5 2 0,2048 7 1 0,208 32,60 17,79 17,11 9,34 5 2 0,2048 7 2 0,213 33,34 18,20 17,51 9,55 6 1 0,2031 6,9 1 0,193 30,36 16,56 16,06 8,76 6 1 0,2031 6,9 2 0,197 30,96 16,89 16,37 8,93 6 2 0,2079 6,9 1 0,217 33,94 18,52 17,54 9,57 6 2 0,2079 6,9 2 0,215 33,64 18,36 17,38 9,49 7 1 0,2028 7,5 1 0,209 32,75 17,87 17,46 9,53 7 1 0,2028 7,5 2 0,204 32,00 17,46 17,06 9,31 7 2 0,2080 7,5 1 0,213 33,34 18,20 17,33 9,46 7 2 0,2080 7,5 2 0,212 33,19 18,11 17,25 9,42 8 1 0,2013 5,3 1 0,225 35,13 19,18 18,43 10,06 8 1 0,2013 5,3 2 0,223 34,84 19,02 18,27 9,98 8 2 0,2015 5,3 1 0,219 34,24 18,69 17,94 9,79 8 2 0,2015 5,3 2 0,222 34,69 18,93 18,18 9,92 9 1 0,2054 6,4 1 0,212 33,19 18,11 17,27 9,42 9 1 0,2054 6,4 2 0,215 33,64 18,36 17,50 9,55 9 2 0,2120 6,4 1 0,221 34,54 18,85 17,41 9,50 9 2 0,2120 6,4 2 0,222 34,69 18,93 17,48 9,54 10 1 0,2056 7,7 1 0,216 33,79 18,44 17,81 9,72 10 1 0,2056 7,7 2 0,215 33,64 18,36 17,73 9,68 10 2 0,2062 7,7 1 0,218 34,09 18,61 17,91 9,78 10 2 0,2062 7,7 2 0,220 34,39 18,77 18,07 9,86

CH: Contenido de humedad (g % bh); concentración equivalente (µg/mL); CTP-EAC: contenido de polifenoles totales equivalente a ácido clorogénico (g%ms); CTP-EAG: contenido de polifenoles totales equivalente a ácido gálico (g%ms)

Cuadro A.7. Datos promediados de las lecturas de CPT del cuadro A6

Muestra Extracción CPT-(EAC) CPT-(EAG) CPT -(EAC) CPT-(EAG)

1 1 18,59±0,08 10,15±0,05

19,28 ± 0,7 10,53 ± 0,38 2 19,98±0,04 10,91±0,02

2 1 15,38±0,35 8,39±0,20

15,82 ± 0,44 8,63 ± 0,24 2 16,26±0,00 8,87±0,00

3 1 16,26±0,16 8,87±0,09

16,47 ± 0,21 8,98 ± 0,12 2 16,68±0,04 9,10±0,02

4 1 15,98±0,04 8,72±0,03

17,07 ± 1,09 9,31 ± 0,6 2 18,16±0,20 9,91±0,11

5 1 17,53±0,20 9,57±0,11

17,42 ± 0,11 9,51 ± 0,06 2 17,31±0,20 9,45±0,11

6 1 16,22±0,16 8,85±0,09

16,84 ± 0,62 9,19 ± 0,34 2 17,46±0,08 9,53±0,04

7 1 17,26±0,20 9,42±0,11

17,28 ± 0,02 9,43 ± 0,01 2 17,29±0,04 9,44±0,02

8 1 18,35±0,08 10,02±0,04

18,21 ± 0,15 9,94 ± 0,08 2 18,06±0,12 9,86±0,07

9 1 17,39±0,12 9,49±0,07

17,42 ± 0,03 9,5 ± 0,02 2 17,45±0,04 9,52±0,02

10 1 17,77±0,04 9,70±0,02

17,88 ±0,11 9,76 ± 0,06 2 17,99±0,08 9,82±0,04

Datos expresados como media ± error estándar. CTP-EAC: contenido de polifenoles totales equivalente a ácido clorogénico (g%ms); CTP-EAG: contenido de polifenoles totales equivalente a ácido gálico (g%ms).

Resumen Estadístico para CPT-EAC

Frecuencia = 20

Media = 17,3663

Varianza = 1,11314

Desviación típica = 1,05506

Error estándar = 0,235918

Mínimo = 15,375

Máximo = 19,98

Rango = 4,605

Asimetría tipi. = 0,60125

Curtosis típificada = 0,762547

Resumen Estadístico para CPT-EAG

Frecuencia = 20

Media = 9,47725

Varianza = 0,335162



Mínimo = 8,385

Máximo = 10,91

Rango = 2,525

Asimetría tipi. = 0,594174

Curtosis típificada = 0,754426

Cuadro A.8. Datos de lectura de absorbancia del blanco de reactivos del ensayo del radical DPPH a diferentes longitudes de onda

λ (nm) A

350 0,651

360 0,475

370 0,39

380 0,328

390 0,292

400 0,284

410 0,301

420 0,325

430 0,412

450 0,485

460 0,7

480 0,824

490 0,956

500 1,005

505 1,038

510 1,038

511 1,038

512 1,047

513 1,049

514 1,049

515 1,052

516 1,052

517 1,053

518 1,053

519 1,051

520 1,047

521 1,031

522 1,033

523 1,027

524 1,022

525 1,02

530 0,97

540 0,862

550 0,758

570 0,607

580 0,559

600 0,487

620 0,433

640 0,379

660 0,334

675 0,297

700 0,231

725 0,17

750 0,11

775 0,071

800 0,046

825 0,022

850 0,02

875 0,012

900 0,005

925 0,004

950 0,007

975 0,006

1000 0,004

Cuadro A.9. Perfil de absorbancia del blanco de reactivos del ensayo del radical DPPH a diferentes concentraciones de la solución de trabajo del radical DPPH.

Concentración de la solución del radical (µM) A (517 nm)

10 0,103 20 0,201 40 0,408 60 0,617 80 0,82

100 1,023 150 1,602 200 1,919

Cuadro A.10. Análisis de regresión lineal del perfil de absorbancia del radical DPPH Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X

--------------------------------------------------- --------------------------

Variable dependiente: Absorbancia

Variable independiente: Concentración del radical D PPH (uM)

--------------------------------------------------- --------------------------

Error Estadíst ico


--------------------------------------------------- --------------------------

Ordenada -0,00133425 0,0018582 -0,718 033 0,5124

Pendiente 0,0102581 0,0000306176 335, 039 0,0000

--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------

Modelo 0,640139 1 0,6401 39 112251,05 0,0000

Residuo 0,000022811 40,000005702 74

--------------------------------------------------- --------------------------

Total (Corr.) 0,640161 5







Autocorrelación residual en Lag 1 = -0,176824

Hipótesis del presente análisis de regresión: H nula (Ho): la variable dependiente (Absorbancia) no depende linealmente de la variable independiente (concentración). H alternativa (Ha): la variable dependiente (Absorbancia) depende linealmente de la variable independiente (concentración).

Se rechaza la Ho. El modelo lineal es válido.

Cuadro A.11. Cinética de reacción entre el radical DPPH y el patrón ácido ascórbico

Concentración: 8 mg / 100 mL

Tiempo (min) A(517nm) %R 0 1,045 100

0,19 0,7 70,2 0,34 0,7 70,2

1 0,7 70,4 2 0,7 70,2 3 0,7 70,2 4 0,7 70,3 6 0,7 70,3


Tiempo (min) A(517nm) %R 0 1,045 100

0,21 0,7 63,0 0,29 0,7 62,8 0,45 0,7 62,8

1 0,7 63,0 1,25 0,7 63,1

2 0,7 63,5 3 0,7 63,5 6 0,7 63,1


Tiempo (min) A(517nm) %R 0 1,045 100

0,3 0,4 37,9 1,12 0,4 38,0 1,3 0,4 38,1 2,3 0,4 38,3 3,3 0,4 37,9

6 0,4 38,1 3 0,7 63,5 6 0,7 63,1


Tiempo (min) A(517nm) %R 0 1,045 100

0,25 0,257 24,7 1 0,258 24,8 6 0,258 24,8


Tiempo (min) A(517nm) %R 0 1,045 100

0,25 0,2 15,2 0,55 0,2 15,1 1,05 0,2 15,2

6 0,2 15,2

Cuadro A.12. Cinética de reacción entre el radical DPPH y el patrón Trolox

Cuadro A.13. Cinética de reacción entre el radical DPPH y los extractos diluidos de yerba mate

Dilución: 1:400 Tiempo (min) A (517nm-ee) %R

0 1,12 100 1 1,023 91,3 3 1,007 89,9 5 0,994 88,8 8 0,977 87,2 9 0,972 86,8

10 0,967 86,4 12 0,958 85,6 15 0,946 84,5 17 0,94 83,9 19 0,934 83,4 21 0,928 82,9 24 0,921 82,3 27 0,915 81,7 31 0,913 81,5 33 0,909 81,2 36 0,905 80,8 39 0,904 80,7 42 0,903 80,6 45 0,902 80,6 48 0,902 80,6 51 0,902 80,6 54 0,904 80,7 57 0,903 80,6 65 0,905 80,8

Dilución: 1: 300 Tiempo (min) A (517nm-ee) %R

0 1,05 100 1 0,897 85,4 4 0,882 84,0 7 0,87 82,9

10 0,859 81,8 13 0,849 80,9 16 0,842 80,2 19 0,834 79,5 22 0,826 78,7 25 0,82 78,1 28 0,812 77,4 31 0,805 76,7 34 0,799 76,1 36 0,796 75,8 39 0,789 75,2 42 0,784 74,7 45 0,779 74,2 48 0,776 73,9 51 0,77 73,4 54 0,766 73,0 57 0,763 72,7 60 0,759 72,3 63 0,757 72,1 66 0,754 71,8 69 0,756 72,0 72 0,752 71,7 75 0,751 71,6 78 0,749 71,4 81 0,748 71,3 84 0,747 71,2 88 0,747 71,2 90 0,744 70,9 93 0,744 70,9 96 0,743 70,8 99 0,742 70,7

102 0,744 70,9 105 0,743 70,8


0 1,038 100 1 0,845 81,4 4 0,828 79,8 7 0,815 78,5

10 0,802 77,3 13 0,79 76,1 16 0,779 75,1 19 0,768 74,0 22 0,758 73,1 25 0,749 72,2 28 0,743 71,6 31 0,734 70,7 34 0,728 70,2 37 0,721 69,5 40 0,713 68,7 43 0,709 68,3 46 0,702 67,7 49 0,699 67,4 52 0,694 66,9 55 0,689 66,4 58 0,685 66,0 61 0,684 65,9 64 0,681 65,6 67 0,678 65,4 70 0,677 65,3 73 0,673 64,9 76 0,672 64,8 79 0,668 64,4 82 0,665 64,1 85 0,664 64,0 88 0,661 63,7 91 0,661 63,7 94 0,659 63,5 97 0,656 63,2

100 0,655 63,1 103 0,652 62,9 106 0,651 62,8 109 0,65 62,7 112 0,649 62,6 115 0,648 62,5 118 0,647 62,4 120 0,647 62,4 122 0,647 62,4


0 1,038 100 1 0,805 77,6 4 0,781 75,3 7 0,759 73,2

10 0,739 71,2 13 0,72 69,4 16 0,703 67,8 19 0,686 66,1 22 0,672 64,8 25 0,657 63,3 28 0,645 62,2 31 0,633 61,0 34 0,619 59,7 37 0,606 58,4 40 0,6 57,9 43 0,591 57,0 46 0,582 56,1 49 0,573 55,3 52 0,566 54,6 55 0,558 53,8 58 0,552 53,2 61 0,544 52,5 64 0,539 52,0 67 0,534 51,5 70 0,531 51,2 73 0,527 50,8 76 0,524 50,5 79 0,521 50,3 82 0,517 49,9 85 0,516 49,8 88 0,511 49,3 91 0,509 49,1 94 0,505 48,7 97 0,502 48,4

100 0,5 48,2 104 0,498 48,0 107 0,496 47,8 110 0,495 47,8 113 0,495 47,8 116 0,495 47,8


0 1,025 100 1 0,751 73,3 4 0,716 69,9 7 0,688 67,2 10 0,662 64,6 13 0,638 62,3 16 0,618 60,3 19 0,597 58,3 22 0,577 56,3 25 0,562 54,9 28 0,544 53,1 31 0,528 51,6 34 0,514 50,2 37 0,501 48,9 40 0,49 47,9 43 0,478 46,7 46 0,465 45,4 49 0,455 44,5 52 0,445 43,5 55 0,436 42,6 58 0,427 41,7 61 0,418 40,9 64 0,41 40,1 67 0,403 39,4 70 0,397 38,8 73 0,391 38,2 76 0,385 37,6 79 0,38 37,2 82 0,374 36,6 85 0,37 36,2 88 0,366 35,8 91 0,361 35,3 94 0,357 34,9 97 0,354 34,6 100 0,35 34,2 103 0,349 34,1 106 0,343 33,5 109 0,341 33,4 112 0,339 33,2 115 0,334 32,7 118 0,333 32,6 119 0,332 32,5 120 0,332 32,5 121 0,332 32,5 122 0,332 32,5

Dilución 1:100 Tiempo (min) A (517nm-ee) %R

0 1,024 100 0,5 0,643 62,8

3 0,598 58,5 6 0,558 54,5 9 0,521 50,9

12 0,488 47,7 15 0,458 44,8 18 0,43 42,1 21 0,404 39,5 24 0,38 37,2 27 0,358 35,0 30 0,336 32,9 33 0,317 31,0 36 0,299 29,3 39 0,281 27,5 42 0,265 26,0 45 0,25 24,5 48 0,237 23,2 51 0,223 21,9 54 0,212 20,8 57 0,201 19,7 60 0,191 18,8 63 0,181 17,8 66 0,172 16,9 69 0,163 16,0 72 0,156 15,3 75 0,149 14,7 78 0,142 14,0 81 0,137 13,5 84 0,131 12,9 87 0,128 12,6 90 0,122 12,0 93 0,118 11,6 96 0,115 11,3 99 0,112 11,1

102 0,108 10,7 105 0,106 10,5 108 0,104 10,3 111 0,101 10,0 114 0,1 9,9 117 0,099 9,8 120 0,096 9,5 123 0,096 9,5


0 1,038 100 0,5 0,570 55,0

3 0,517 49,9 6 0,475 45,8 9 0,437 42,2

10 0,426 41,1 14 0,383 37,0 15 0,374 36,1 19 0,335 32,4 20 0,326 31,5 22 0,308 29,8 24 0,297 28,7 27 0,269 26,0 30 0,246 23,8 33 0,225 21,8 36 0,204 19,8 39 0,186 18,0 43 0,163 15,8 46 0,146 14,2 49 0,133 12,9 52 0,121 11,8 55 0,112 10,9 58 0,103 10,0 61 0,097 9,5 64 0,092 9,0 67 0,088 8,6 70 0,086 8,4 73 0,083 8,1 76 0,082 8,0 79 0,08 7,8 82 0,079 7,7 85 0,079 7,7 88 0,078 7,6 91 0,077 7,5 94 0,076 7,4 97 0,077 7,5

100 0,078 7,5

Cuadro A.14. Planilla de cálculo de los cocientes másicos empleados

Abs (t:0-

517 nm

C1

C2

Cantidad de

Trolox (µg)

Abs (equilibrio-

517 nm) %R

Cantidad de

DPPH (µg)

Cociente másico (µgTrolox/µgDPPH)

1,099 0,00 0,00 0 1,099 100 0

1,098 5,20 0,2 5,2 0,934 85,1 126,26 0,041

1,098 10,01 0,4 10 0,775 70,6 126,26 0,079

1,098 15,02 0,6 15 0,617 56,2 126,26 0,119

1,098 20,02 0,8 20 0,472 43,1 126,26 0,158

1,100 25,03 1 25 0,335 30,5 126,48 0,198

1,100 30,04 1,2 30 0,183 16,7 126,48 0,237

C1: Concentración del patrón (mg/100 mL); C2: Concentración del patrón (mM/L)

Lectura A (t:0-517 nm

C1 C2

Cantidad de ácido ascórbico

(µg)

Lectura A

(equilibrio-517 nm)

%R

Cantidad de

DPPH (µg)

Cociente másico (µg AA/µgDPPH)

1,045 0 0 0 1,045 100 120,168 0

1,045 8 0,45 8 0,734 70,3 120,168 0,067

1,045 10 0,56 10 0,659 63,1 120,168 0,083

1,045 16 0,90 16 0,397 38,1 120,168 0,133

1,045 20 1,10 20 0,258 24,8 120,168 0,166

1,045 21 1,20 21 0,158 15,2 120,168 0,175

C1: Concentración del patrón (mg/100 mL); C2: Concentración del patrón (mM/L); AA: ácido ascórbico

Cuadro A.15. Análisis de regresión lineal- Curva de calibración con Trolox Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X

--------------------------------------------------- --------------------------

Variable dependiente: % R

Variable independiente: Cantidad de Trolox (ug)

--------------------------------------------------- --------------------------

Error Estadíst ico


--------------------------------------------------- --------------------------

Ordenada 99,0541 0,659668 150, 157 0,0000

Pendiente -2,76757 0,0365754 -75,6 676 0,0000

--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------

Modelo 5331,25 1 5331, 25 5725,59 0,0000

Residuo 4,65564 5 0,9311 27

--------------------------------------------------- --------------------------

Total (Corr.) 5335,91 6

Coeficiente de Correlación = -0,999564









Cuadro A.16. Análisis de regresión lineal-Curva de calibración con ácido ascórbico Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X

--------------------------------------------------- --------------------------

Variable dependiente: % R

Variable independiente: Cantidad de ácido ascórbico (ug)

--------------------------------------------------- --------------------------

Error Estadíst ico


--------------------------------------------------- --------------------------

Ordenada 99,9964 0,640298 156, 172 0,0000

Pendiente -3,98081 0,0498346 -79,8 806 0,0000

--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------

Modelo 8730,3 1 8730 ,3 6380,90 0,0000

Residuo 13,6819 10 1,368 19

--------------------------------------------------- --------------------------

Total (Corr.) 8743,98 11










Cuadro A.17. Datos del ensayo de Folin-Ciocalteu

PT EXTRAIDOS CPT CoPT

Extracto Lectura A leída µgEAC (gEAC/30g hoja

seca) (gEAC/100

g ms) (mg

EAC/mL)

1 1 0,247 37,89 2,33 7,77 18,95

1 2 0,254 38,97 2,40 7,99 19,48

2 1 0,264 40,51 2,49 8,30 20,25

2 2 0,265 40,66 2,50 8,34 20,33

Dilución del extracto: 1:5; Muestra B2; PT: polifenoles totales; CPT: contenido de polifenoles totales; CoPT: concentración de polifenoles totales

Resúmenes Estadísticos para lecturas de CPT

Erro r

Extracción N° lecturas Media Están dar

--------------------------------------------------- --------------

1 2 7,88 0,11

2 2 8,32 0,02

--------------------------------------------------- --------------

Total 4 8,1 0,134 969

Resumen Estadístico para CPT

Frecuencia = 2

Media = 8,1

Varianza = 0,0968



Mínimo = 7,88

Máximo = 8,32

Resumen Estadístico para CoPT

Frecuencia = 2

Media = 19,75

Varianza = 0,605



Mínimo = 19,2

Máximo = 20,3

Rango = 1,1

Resúmenes Estadísticos para CoPT

Er ror

Extracción N° Lecturas Media E stándar

--------------------------------------------------- --------------

1 2 19,2154 0, 269231

2 2 20,2923 0, 0384615

--------------------------------------------------- --------------

Total 4 19,7538 0, 330113

Cuadro A.18. Datos correspondientes al ensayo DPPH

E DPPH

Gramos

equivalentes CAO

wi VO VD(1:xx) A

(t=0) A

(t=120) X %R gEAA gET CAO-

EAA(g%ms) CAO-

ET(g%ms)

1 31,5 116 180 1,055 0,467 45,47 44,33 13,98 19,77 9,74 13,77

2 31,5 123 200 1,030 0,517 50,32 50,26 12,49 17,63 10,25 14,46

9,99 14,12 E: extracto; Contenido de Humedad (CHbh): 4,8%; wi: peso de muestra base humeda (g); VO: volumen original (mL); VD: volumen de dilución (mL); t:tiempo (min); A: absorbancia; EAA: equivalentes a ácido ascórbico; ET: equivalentes a Trolox

Resumen Estadístico para CAO_EAA

Frecuencia = 2

Media = 9,995

Varianza = 0,13005



Mínimo = 9,74

Máximo = 10,25

Rango = 0,51

Resumen Estadístico para CAO_ET

Frecuencia = 2

Media = 14,115

Varianza = 0,23805



Mínimo = 13,77

Máximo = 14,46

Rango = 0,69

Cuadro A.19. Datos y análisis de regresión para la relación CPT-CAO de extractos de yerba mate

Dilución 1:x µg-PFT A (t=0) X µgDPPH µg-PFT / µgDPPH 75 26,337 1,038 100,90 119,364 0,221

100 19,753 1,024 99,54 117,756 0,168

150 13,168 1,025 99,64 117,871 0,112

200 9,876 1,038 100,90 119,364 0,083

250 7,901 1,038 100,90 119,364 0,066

300 6,584 1,050 102,06 120,742 0,055

400 4,938 1,120 108,86 128,781 0,038

500 3,950 1,030 100,12 118,445 0,033

0 0,000 1,118 108,66 128,552 0,000

Modo de cálculo del cociente másico: EXTRACTO B2: 19753 µgEAC/mL de extracto original

Para una dilución de 1:75 será: 1 mL de extracto original----- 19753µgEAC--------------------75mL=75000 µL 26,337 µgEAC=x--------------- 100 µL

PM del DPPH=394,32 g/mol

1 mol--1000 mM----1x106 µM

1X106 µM---------394,32 g/mol 100 µM------------x=0,039432 g DPPH

1000 mL de solución de DPPH----------------0,039432 g DPPH 3 mL (usado en la reacción)--------- x=1,18296x10-4 g de DPPH=118,296 µg de DPPH


--------------------------------------------------- --------------------------

Variable dependiente: %R

Variable independiente: cociente ug PFT/ugDPPH en el estado estacionario.

--------------------------------------------------- --------------------------

Error Estadíst ico


--------------------------------------------------- --------------------------

Ordenada 99,692 2,16345 46,0 801 0,0000

Pendiente -561,687 25,5029 -22,0 244 0,0000

--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------

Modelo 6015,76 1 6015, 76 485,07 0,0000

Residuo 74,4103 6 12,40 17

--------------------------------------------------- --------------------------

Total (Corr.) 6090,18 7








ug PFT/ ug DPPH en el estado estacionario

%R

0 0,03 0,06 0,09 0,12 0,15 0,180

20

40

60

80

100

Cuadro A.20. Datos cinéticos correspondientes a la reacción del radical DPPH con cafeína

Tiempo (min) A (517 nm) 0 1,134 1 1,133 2 1,132 3 1,132 5 1,132

10 1,133 17 1,137 20 1,140 25 1,144 30 1,140

Cuadro A.21a. Efecto de la temperatura de incubación sobre el ensayo del radical DPPH

T (°C)

E

Volumen (mL)

Abs (517nm) Cantidad de DPPH° %R

CAO (g % ms)

VO VD (t=0) (t=120) a t= 0 min a t=120 min CAO-ET CAO-EAA

20 1 10 30 1,07 0,648 104,01 63,04 60,61 20,46 14,57

20 1 10 30 1,07 0,642 104,01 62,46 60,05 20,76 14,78

25 1 10 30 1,07 0,491 104,01 47,79 45,95 28,26 19,99

25 1 10 30 1,07 0,489 104,01 47,60 45,77 28,36 20,06

30 1 10 30 1,07 0,391 104,01 38,09 36,62 33,23 23,45

30 1 10 30 1,07 0,386 104,01 37,60 36,15 33,47 23,62

40 1 10 30 1,07 0,326 104,01 31,78 30,55 36,45 25,69

40 1 10 30 1,07 0,323 104,01 31,48 30,27 36,60 25,80

20 2 10 30 1,07 0,609 104,01 59,25 56,97 22,45 15,96

20 2 10 30 1,07 0,612 104,01 59,54 57,25 22,30 15,85

25 2 10 30 1,07 0,442 104,01 43,04 41,38 30,77 21,74

25 2 10 30 1,07 0,438 104,01 42,65 41,01 30,97 21,88

30 2 10 30 1,07 0,372 104,01 36,24 34,85 34,25 24,16

30 2 10 30 1,07 0,365 104,01 35,56 34,19 34,60 24,40

40 2 10 30 1,07 0,322 104,01 31,39 30,18 36,74 25,89

40 2 10 30 1,07 0,32 104,01 31,19 29,99 36,84 25,96 T: temperatura de incubación; E: extracto; VO: volumen original; VD: Volumen de dilución; Peso de muestra empleado (wi): 0,2037 g (Extracto 1) y 0,2032 g (Extracto 2)

Cuadro A.21b. Análisis de varianza para los efectos simples extracto (A) y temperatura (B) sobre la CAO (utilizando Trolox como patrón estándar)

Análisis de la Varianza para CAO_ET - Sumas de Cuad rados de Tipo III

--------------------------------------------------- -------------------------

Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrad o Medio Cociente-F P-V

--------------------------------------------------- -------------------------

EFECTOS PRINCIPALES

A:extracto 4,6818 1 4,6818 8,39 0,

B:T 306,19 3 102,063 182,83 0,

RESIDUOS 1,6747 3 0 ,558233

--------------------------------------------------- -------------------------

TOTAL (CORREGIDO) 312,547 7

--------------------------------------------------- -------------------------

Los cocientes F están basados en el error cuadrátic o medio residual.

Cuadro A.21c. Análisis de varianza para los efectos simples extracto (A) y temperatura (B) sobre la CAO (utilizando ácido ascórbico como patrón estándar)

Análisis de la Varianza paraCAO_EAA - Sumas de Cuad rados de Tipo III

--------------------------------------------------- ----------------------------

Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrad o Medio Cociente-F P-Valo

--------------------------------------------------- ----------------------------

EFECTOS PRINCIPALES

A:extracto 2,26845 1 2,26845 8,43 0,062

B:T 147,979 3 49,3263 183,31 0,000

RESIDUOS 0,80725 3 0 ,269083

--------------------------------------------------- ----------------------------


--------------------------------------------------- ----------------------------


En ambos análisis de varianza, las hipótesis a prueba fueron:

Ho(extracto): no hay variabilidad en la CAO debida a los extractos. Ha (extractos): hay variabilidad en la CAO debida a los extractos. Como Pv:0,0623, no se rechaza Ho.

Ho(temperatura): no hay efecto de la temperatura sobre la CAO. Ha (temperatura): hay efecto de la temperatura sobre la CAO. Como Pv:0,0007, se rechaza Ho.

La temperatura de incubación afecta a las lecturas de CAO.

ANEXO 2

Cuadro B.1. Datos de la determinación de contenido de polifenoles totales- Método de Folin-Ciocalteu

Mues-tra

Ori-gen

Se- cado

Época

Peso (g)

CH (%bh)

Extracción

Lec-tura

Abs (765 nm)

CoPT (µgEAC/m

L)

CPT (gEAC/100g

ms)

300 C ci IZ 0,2021 8,74 300ª 1 0,284 39,18 21,24 300 C ci IZ 0,2021 8,74 300ª 2 0,285 39,32 21,32 300 C ci IZ 0,2037 8,74 300B 1 0,304 42,00 22,59 300 C ci IZ 0,2037 8,74 300B 2 0,306 42,28 22,74 301 C ci IZ 0,2062 8,32 301ª 1 0,316 43,69 23,11 301 C ci IZ 0,2062 8,32 301ª 2 0,316 43,69 23,11 301 C ci IZ 0,2055 8,32 301B 1 0,319 44,11 23,41 301 C ci IZ 0,2055 8,32 301B 2 0,32 44,25 23,49 302 N ci IZ 0,2074 7,73 302ª 1 0,333 46,08 24,08 302 N ci IZ 0,2074 7,73 302ª 2 0,335 46,37 24,23 302 N ci IZ 0,2057 7,73 302B 1 0,333 46,08 24,28 302 N ci IZ 0,2057 7,73 302B 2 0,333 46,08 24,28 303 N ci IZ 0,2076 8,33 303ª 1 0,316 43,69 22,96 303 N ci IZ 0,2076 8,33 303ª 2 0,315 43,55 22,88 303 N ci IZ 0,2031 8,33 303B 1 0,303 41,86 22,48 303 N ci IZ 0,2031 8,33 303B 2 0,305 42,14 22,63 304 S tu IZ 0,2001 7,72 304ª 1 0,285 39,32 21,30 304 S tu IZ 0,2001 7,72 304ª 2 0,286 39,46 21,37 304 S tu IZ 0,2007 7,72 304B 1 0,294 40,59 21,92 304 S tu IZ 0,2007 7,72 304B 2 0,292 40,31 21,76 305 C ba IZ 0,2029 9,15 305ª 1 0,264 36,37 19,73 305 C ba IZ 0,2029 9,15 305ª 2 0,266 36,65 19,88 305 C ba IZ 0,2019 9,15 305B 1 0,262 36,08 19,67 305 C ba IZ 0,2019 9,15 305B 2 0,261 35,94 19,60 306 C tu IZ 0,2021 7,43 306ª 1 0,293 40,45 21,62 306 C tu IZ 0,2021 7,43 306ª 2 0,29 40,03 21,40 306 C tu IZ 0,202 7,43 306B 1 0,287 39,61 21,18 306 C tu IZ 0,202 7,43 306B 2 0,285 39,32 21,03 307 CN ci IZ 0,2004 8,26 307ª 1 0,302 41,72 22,69 307 CN ci IZ 0,2004 8,26 307ª 2 0,305 42,14 22,92 307 CN ci IZ 0,2005 8,26 307B 1 0,305 42,14 22,91 307 CN ci IZ 0,2005 8,26 307B 2 0,301 41,58 22,60 308 C tu IZ 0,2017 7,65 308ª 1 0,287 39,61 21,26 308 C tu IZ 0,2017 7,65 308ª 2 0,291 40,17 21,56 308 C tu IZ 0,2026 7,65 308B 1 0,303 41,86 22,37 308 C tu IZ 0,2026 7,65 308B 2 0,304 42,00 22,45 309 N tu IZ 0,2050 7,4 309ª 1 0,320 44,25 23,31 309 N tu IZ 0,2050 7,4 309ª 2 0,317 43,83 23,09 309 N tu IZ 0,2057 7,4 309B 1 0,311 42,99 22,57 309 N tu IZ 0,2057 7,4 309B 2 0,308 42,56 22,35 310 CN tu IZ 0,2001 7,84 310ª 1 0,317 43,83 23,77 310 CN tu IZ 0,2001 7,84 310ª 2 0,315 43,55 23,62 310 CN tu IZ 0,2029 7,84 310B 1 0,324 44,82 23,97 310 CN tu IZ 0,2029 7,84 310B 2 0,327 45,24 24,19 311 CN ba IZ 0,2058 9,39 311ª 1 0,287 39,61 21,24 311 CN ba IZ 0,2058 9,39 311ª 2 0,281 38,76 20,79

311 CN ba IZ 0,2057 9,39 311B 1 0,286 39,46 21,17 311 CN ba IZ 0,2057 9,39 311B 2 0,286 39,46 21,17 312 S ci IZ 0,204 8,83 312ª 1 0,298 41,15 22,13 312 S ci IZ 0,204 8,83 312ª 2 0,302 41,72 22,43 312 S ci IZ 0,2025 8,83 312B 1 0,297 41,01 22,22 312 S ci IZ 0,2025 8,83 312B 2 0,296 40,87 22,14 313 CN ci IZ 0,2028 8,34 313ª 1 0,289 39,89 21,46 313 CN ci IZ 0,2028 8,34 313ª 2 0,286 39,46 21,23 313 CN ci IZ 0,2006 8,34 313B 1 0,295 40,73 22,15 313 CN ci IZ 0,2006 8,34 313B 2 0,295 40,73 22,15 314 S ba IZ 0,2022 7,76 314ª 1 0,291 40,17 21,54 314 S ba IZ 0,2022 7,76 314ª 2 0,292 40,31 21,61 314 S ba IZ 0,2041 7,76 314B 1 0,299 41,30 21,94 314 S ba IZ 0,2041 7,76 314B 2 0,23 31,58 16,77 315 CN ba IZ 0,2075 7,6 315ª 1 0,296 40,87 21,32 315 CN ba IZ 0,2075 7,6 315ª 2 0,298 41,15 21,47 315 CN ba IZ 0,2065 7,6 315B 1 0,288 39,75 20,83 315 CN ba IZ 0,2065 7,6 315B 2 0,289 39,89 20,90 316 S ci IZ 0,2051 6,17 316ª 1 0,291 40,17 20,87 316 S ci IZ 0,2051 6,17 316ª 2 0,293 40,45 21,02 316 S ci IZ 0,2057 6,17 316B 1 0,314 43,41 22,49 316 S ci IZ 0,2057 6,17 316B 2 0,315 43,55 22,56 317 C ba IZ 0,2064 9,24 317ª 1 0,271 37,35 19,94 317 C ba IZ 0,2064 9,24 317ª 2 0,273 37,63 20,09 317 C ba IZ 0,207 9,24 317B 1 0,293 40,45 21,53 317 C ba IZ 0,207 9,24 317B 2 0,291 40,17 21,38 318 S ba IZ 0,2096 9,55 318ª 1 0,312 43,13 22,75 318 S ba IZ 0,2096 9,55 318ª 2 0,311 42,99 22,67 318 S ba IZ 0,2051 9,55 318B 1 0,301 41,58 22,41 318 S ba IZ 0,2051 9,55 318B 2 0,301 41,58 22,41 319 CN ci FZ 0,2048 8,44 319ª 1 0,29 40,03 21,35 319 CN ci FZ 0,2048 8,44 319ª 2 0,291 40,17 21,42 319 CN ci FZ 0,2021 8,44 319B 1 0,296 40,87 22,09 319 CN ci FZ 0,2021 8,44 319B 2 0,294 40,59 21,94 320 S ci FZ 0,2024 9,84 320ª 1 0,271 37,35 20,47 320 S ci FZ 0,2024 9,84 320ª 2 0,255 35,10 19,23 320 S ci FZ 0,2018 9,84 320B 1 0,271 37,35 20,53 320 S ci FZ 0,2018 9,84 320B 2 0,275 37,92 20,84 321 CN ba FZ 0,2061 9,33 321ª 1 0,262 36,08 19,31 321 CN ba FZ 0,2061 9,33 321ª 2 0,268 36,93 19,76 321 CN ba FZ 0,2071 9,33 321B 1 0,277 38,20 20,34 321 CN ba FZ 0,2071 9,33 321B 2 0,273 37,63 20,04 322 S ba FZ 0,2039 9,82 322ª 1 0,285 39,32 21,39 322 S ba FZ 0,2039 9,82 322ª 2 0,285 39,32 21,39 322 S ba FZ 0,2015 9,82 322B 1 0,282 38,90 21,41 322 S ba FZ 0,2015 9,82 322B 2 0,287 39,61 21,80 323 CN ba FZ 0,2023 8,13 323ª 1 0,25 34,39 18,51 323 CN ba FZ 0,2023 8,13 323ª 2 0,251 34,54 18,58 323 CN ba FZ 0,2038 8,13 323B 1 0,27 37,21 19,87 323 CN ba FZ 0,2038 8,13 323B 2 0,27 37,21 19,87 324 CN ci FZ 0,2017 7,89 324ª 1 0,283 39,04 21,01 324 CN ci FZ 0,2017 7,89 324ª 2 0,284 39,18 21,09

324 CN ci FZ 0,2028 7,89 324B 1 0,274 37,77 20,22 324 CN ci FZ 0,2028 7,89 324B 2 0,274 37,77 20,22 325 C ci FZ 0,2005 6,78 325ª 1 0,279 38,48 20,59 325 C ci FZ 0,2005 6,78 325ª 2 0,28 38,62 20,66 325 C ci FZ 0,2004 6,78 325B 1 0,275 37,92 20,30 325 C ci FZ 0,2004 6,78 325B 2 0,276 38,06 20,37 326 C ci FZ 0,2007 8,03 326ª 1 0,266 36,65 19,85 326 C ci FZ 0,2007 8,03 326ª 2 0,268 36,93 20,01 326 C ci FZ 0,2009 8,03 326B 1 0,263 36,23 19,61 326 C ci FZ 0,2009 8,03 326B 2 0,265 36,51 19,76 327 N tu FZ 0,2016 6,29 327ª 1 0,29 40,03 21,19 327 N tu FZ 0,2016 6,29 327ª 2 0,293 40,45 21,41 327 N tu FZ 0,2005 6,29 327B 1 0,282 38,90 20,70 327 N tu FZ 0,2005 6,29 327B 2 0,289 39,89 21,23 328 N ci FZ 0,2042 8,3 328ª 1 0,287 39,61 21,15 328 N ci FZ 0,2042 8,3 328ª 2 0,29 40,03 21,38 328 N ci FZ 0,2059 8,3 328B 1 0,287 39,61 20,98 328 N ci FZ 0,2059 8,3 328B 2 0,288 39,75 21,05 329 N ci FZ 0,2029 7,19 329ª 1 0,283 39,04 20,73 329 N ci FZ 0,2029 7,19 329ª 2 0,285 39,32 20,88 329 N ci FZ 0,2044 7,19 329B 1 0,29 40,03 21,10 329 N ci FZ 0,2044 7,19 329B 2 0,29 40,03 21,10 330 C ba FZ 0,2028 7,79 330ª 1 0,32 44,25 23,66 330 C ba FZ 0,2028 7,79 330ª 2 0,325 44,96 24,04 330 C ba FZ 0,206 7,79 330B 1 0,326 45,10 23,74 330 C ba FZ 0,206 7,79 330B 2 0,328 45,38 23,89 331 CN tu FZ 0,2049 8,7 331ª 1 0,301 41,58 22,23 331 CN tu FZ 0,2049 8,7 331ª 2 0,301 41,58 22,23 331 CN tu FZ 0,2028 8,7 331B

0,289 39,89 21,54

331 CN tu FZ 0,2028 8,7 331B

0,290 40,03 21,62 332 S tu FZ 0,2012 6,47 332ª 1 0,293 40,45 21,50 332 S tu FZ 0,2012 6,47 332ª 2 0,291 40,17 21,35 332 S tu FZ 0,2029 6,47 332B 1 0,295 40,73 21,46 332 S tu FZ 0,2029 6,47 332B 2 0,297 41,01 21,61 333 C tu FZ 0,2019 8,88 333ª 1 0,331 45,80 24,90 333 C tu FZ 0,2019 8,88 333ª 2 0,332 45,94 24,97 333 C tu FZ 0,204 8,88 333B 1 0,318 43,97 23,66 333 C tu FZ 0,204 8,88 333B 2 0,317 43,83 23,58 334 S ci FZ 0,2017 7,5 334ª 1 0,262 36,08 19,34 334 S ci FZ 0,2017 7,5 334ª 2 0,263 36,23 19,42 334 S ci FZ 0,2025 7,5 334B 1 0,282 38,90 20,77 334 S ci FZ 0,2025 7,5 334B 2 0,283 39,04 20,84 335 C tu FZ 0,209 8,17 335ª 1 0,311 42,99 22,40 335 C tu FZ 0,209 8,17 335ª 2 0,313 43,27 22,54 335 C tu FZ 0,2062 8,17 335B 1 0,283 39,04 20,62 335 C tu FZ 0,2062 8,17 335B 2 0,281 38,76 20,47 336 S ba FZ 0,2096 8,39 336ª 1 0,279 38,48 20,04 336 S ba FZ 0,2096 8,39 336ª 2 0,28 38,62 20,11 336 S ba FZ 0,2086 8,39 336B 1 0,266 36,65 19,18 336 S ba FZ 0,2086 8,39 336B 2 0,267 36,79 19,25 337 C ba FZ 0,2035 8,1 337ª 1 0,288 39,75 21,25 337 C ba FZ 0,2035 8,1 337ª 2 0,288 39,75 21,25

337 C ba FZ 0,2045 8,1 337B 1 0,294 40,59 21,60 337 C ba FZ 0,2045 8,1 337B 2 0,296 40,87 21,75

C: centro, S: sur, N: norte, CN: centro-norte; ci: cinta; tu: tubular; ba: barbacuá; FZ: fin de zafra; IZ: inicio de zafra.

Cuadro B.2. Datos de la determinación de Capacidad Antioxidante- Método de reducción del radical DPPH

Mu-estra

Orí-gen

Se-cado

Épo-ca

Ex trac-to

CH (%bh)

Peso (wi; g)

VD (mL) A0 A120

DPPH t=0

DPPH t=120 %R

CAO-ET

CAO-EAA

300 C ci IZ A 8,74 0,2021 25 1,078 0,370 104,79 36,05 34,40 31,67 22,34 300 C ci IZ A 8,74 0,2021 25 1,078 0,372 104,79 36,24 34,59 31,57 22,27 300 C ci IZ B 8,74 0,2037 25 1,078 0,405 104,79 39,45 37,64 29,84 21,06 300 C ci IZ B 8,74 0,2037 25 1,078 0,395 104,79 38,48 36,72 30,29 21,38 301 C ci IZ A 8,32 0,2062 25 1,078 0,376 104,79 36,63 34,96 30,63 21,61 301 C ci IZ A 8,32 0,2062 25 1,078 0,387 104,79 37,70 35,98 30,14 21,27 301 C ci IZ B 8,32 0,2055 25 1,078 0,357 104,79 34,79 33,20 31,58 22,27 301 C ci IZ B 8,32 0,2055 25 1,078 0,352 104,79 34,30 32,73 31,80 22,42 309 N tu IZ A 7,40 0,2050 30 1,055 0,492 102,55 47,89 46,70 29,90 21,16 309 N tu IZ A 7,40 0,2050 30 1,055 0,472 102,55 45,95 44,81 30,98 21,91 309 N tu IZ B 7,40 0,2057 30 1,055 0,432 102,55 42,07 41,02 33,03 23,33 309 N tu IZ B 7,40 0,2057 30 1,055 0,460 102,55 44,79 43,67 31,52 22,28 303 N ci IZ A 8,33 0,2076 25 1,078 0,316 104,79 30,81 29,40 33,06 23,30 303 N ci IZ A 8,33 0,2076 25 1,078 0,319 104,79 31,10 29,68 32,93 23,21 303 N ci IZ B 8,33 0,2031 25 1,078 0,387 104,79 37,70 35,98 30,60 21,59 303 N ci IZ B 8,33 0,2031 25 1,078 0,385 104,79 37,50 35,79 30,69 21,66 304 S tu IZ A 7,72 0,2001 30 1,037 0,676 100,81 65,76 65,23 19,86 14,19 304 S tu IZ A 7,72 0,2001 30 1,037 0,673 100,81 65,47 64,94 20,03 14,31 304 S tu IZ B 7,72 0,2007 30 1,037 0,673 100,81 65,47 64,94 19,97 14,26 304 S tu IZ B 7,72 0,2007 30 1,037 0,669 100,81 65,08 64,56 20,19 14,42 305 C ba IZ A 9,15 0,2029 30 1,037 0,671 100,81 65,27 64,75 20,17 14,41 305 C ba IZ A 9,15 0,2029 30 1,037 0,680 100,81 66,15 65,62 19,66 14,06 305 C ba IZ B 9,15 0,2019 30 1,037 0,704 100,81 68,48 67,93 18,39 13,18 305 C ba IZ B 9,15 0,2019 30 1,037 0,702 100,81 68,28 67,74 18,51 13,25 311 CN ba IZ A 9,39 0,2058 30 1,073 0,655 104,30 63,72 61,09 22,07 15,72 311 CN ba IZ A 9,39 0,2058 30 1,073 0,654 104,30 63,62 61,00 22,12 15,76 311 CN ba IZ B 9,39 0,2057 30 1,073 0,711 104,30 69,16 66,30 19,05 13,62 311 CN ba IZ B 9,39 0,2057 30 1,073 0,710 104,30 69,06 66,21 19,10 13,66 307 CN ci IZ A 8,26 0,2004 30 1,037 0,691 100,81 67,21 66,68 19,09 13,66 307 CN ci IZ A 8,26 0,2004 30 1,037 0,670 100,81 65,17 64,65 20,28 14,49 307 CN ci IZ B 8,26 0,2005 30 1,037 0,701 100,81 68,18 67,64 18,51 13,26 307 CN ci IZ B 8,26 0,2005 30 1,037 0,665 100,81 64,69 64,17 20,56 14,68 313 CN ci IZ A 8,34 0,2010 30 1,073 0,630 104,30 61,29 58,76 23,71 16,87 313 CN ci IZ A 8,34 0,2010 30 1,073 0,629 104,30 61,19 58,67 23,76 16,90 313 CN ci IZ B 8,34 0,2017 30 1,073 0,625 104,30 60,81 58,30 23,90 17,00 313 CN ci IZ B 8,34 0,2017 30 1,073 0,626 104,30 60,90 58,39 23,84 16,96 310 CN tu IZ A 7,84 0,2007 30 1,073 0,660 104,30 64,20 61,56 21,98 15,66 310 CN tu IZ A 7,84 0,2007 30 1,073 0,659 104,30 64,11 61,46 22,03 15,70 310 CN tu IZ B 7,84 0,2033 30 1,073 0,658 104,30 64,01 61,37 21,80 15,54 310 CN tu IZ B 7,84 0,2033 30 1,073 0,657 104,30 63,91 61,28 21,86 15,57 312 S ci IZ A 8,83 0,2037 30 1,073 0,610 104,30 59,35 56,90 24,60 17,49

312 S ci IZ A 8,83 0,2037 30 1,073 0,608 104,30 59,16 56,72 24,71 17,56 312 S ci IZ B 8,83 0,2034 30 1,073 0,601 104,30 58,48 56,06 25,13 17,85 312 S ci IZ B 8,83 0,2034 30 1,073 0,600 104,30 58,38 55,97 25,18 17,89 314 S ba IZ A 7,76 0,2022 30 1,019 0,539 99,06 52,46 52,96 26,79 19,01 314 S ba IZ A 7,76 0,2022 30 1,019 0,543 99,06 52,84 53,35 26,57 18,85 314 S ba IZ B 7,76 0,2041 30 1,019 0,518 99,06 50,42 50,90 27,73 19,65 314 S ba IZ B 7,76 0,2041 30 1,019 0,552 99,06 53,72 54,23 25,81 18,32 317 C ba IZ A 9,86 0,2041 30 1,047 0,376 101,78 36,63 35,99 37,16 26,22 317 C ba IZ A 9,86 0,2041 30 1,047 0,372 101,78 36,24 35,61 37,38 26,37 317 C ba IZ B 9,86 0,2039 30 1,047 0,385 101,78 37,50 36,85 36,69 25,89 317 C ba IZ B 9,86 0,2039 30 1,047 0,380 101,78 37,02 36,37 36,97 26,09 318 S ba IZ A 9,70 0,2047 30 1,047 0,359 101,78 34,98 34,37 37,94 26,76 318 S ba IZ A 9,70 0,2047 30 1,047 0,372 101,78 36,24 35,61 37,21 26,25 318 S ba IZ B 9,70 0,2049 30 1,047 0,313 101,78 30,51 29,98 40,47 28,52 318 S ba IZ B 9,70 0,2049 30 1,047 0,350 101,78 34,11 33,51 38,40 27,08 308 C tu IZ A 7,65 0,2017 30 1,037 0,658 100,81 64,01 63,50 20,69 14,77 308 C tu IZ A 7,65 0,2017 30 1,037 0,649 100,81 63,14 62,63 21,20 15,12 308 C tu IZ B 7,65 0,2026 30 1,037 0,649 100,81 63,14 62,63 21,10 15,05 308 C tu IZ B 7,65 0,2026 30 1,037 0,655 100,81 63,72 63,21 20,77 14,82 306 C tu IZ A 7,43 0,2021 30 1,037 0,691 100,81 67,21 66,68 18,76 13,42 306 C tu IZ A 7,43 0,2021 30 1,037 0,696 100,81 67,70 67,16 18,48 13,23 306 C tu IZ B 7,43 0,2020 30 1,037 0,693 100,81 67,41 66,87 18,66 13,35 306 C tu IZ B 7,43 0,2020 30 1,037 0,692 100,81 67,31 66,77 18,71 13,39 316 S ci IZ A 6,17 0,2051 30 1,019 0,508 99,06 49,45 49,92 27,68 19,61 316 S ci IZ A 6,17 0,2051 30 1,019 0,567 99,06 55,17 55,70 24,42 17,35 316 S ci IZ B 6,17 0,2057 30 1,019 0,545 99,06 53,04 53,54 25,56 18,14 316 S ci IZ B 6,17 0,2057 30 1,019 0,540 99,06 52,55 53,05 25,84 18,33 302 N ci IZ A 7,73 0,2074 25 1,078 0,292 104,79 28,48 27,18 33,93 23,90 302 N ci IZ A 7,73 0,2074 25 1,078 0,290 104,79 28,28 26,99 34,02 23,96 302 N ci IZ B 7,73 0,2057 25 1,078 0,282 104,79 27,50 26,25 34,65 24,40 302 N ci IZ B 7,73 0,2057 25 1,078 0,285 104,79 27,80 26,53 34,52 24,31 315 CN ba IZ A 7,60 0,2075 30 1,019 0,556 99,06 54,11 54,62 25,12 17,84 315 CN ba IZ A 7,60 0,2075 30 1,019 0,552 99,06 53,72 54,23 25,34 17,99 315 CN ba IZ B 7,60 0,2065 30 1,019 0,593 99,06 57,70 58,25 23,18 16,49 315 CN ba IZ B 7,60 0,2065 30 1,019 0,593 99,06 57,70 58,25 23,18 16,49 319 CN ci IZ A 9,43 0,2032 30 1,047 0,388 101,78 37,80 37,14 36,47 25,74 319 CN ci IZ A 9,43 0,2032 30 1,047 0,390 101,78 37,99 37,33 36,36 25,66 319 CN ci IZ B 9,43 0,2031 30 1,047 0,401 101,78 39,06 38,38 35,76 25,24 319 CN ci IZ B 9,43 0,2031 30 1,047 0,408 101,78 39,74 39,04 35,36 24,97 323 CN ba IZ A 8,13 0,2023 30 1,003 0,278 97,50 27,12 27,81 41,55 29,27 323 CN ba IZ A 8,13 0,2023 30 1,003 0,279 97,50 27,21 27,91 41,50 29,23 323 CN ba IZ B 8,13 0,2038 30 1,003 0,310 97,50 30,22 31,00 39,40 27,77 323 CN ba IZ B 8,13 0,2038 30 1,003 0,303 97,50 29,54 30,30 39,81 28,05 328 N ci FZ A 8,30 0,2042 30 1,074 0,446 104,40 43,43 41,60 33,26 23,50 328 N ci FZ A 8,30 0,2042 30 1,074 0,438 104,40 42,65 40,85 33,69 23,80 328 N ci FZ B 8,30 0,2059 30 1,074 0,421 104,40 41,00 39,27 34,32 24,24 328 N ci FZ B 8,30 0,2059 30 1,074 0,418 104,40 40,71 38,99 34,48 24,35 334 CN ci FZ A 7,50 0,2017 30 1,039 0,378 101,00 36,83 36,46 36,37 25,66 334 CN ci FZ A 7,50 0,2017 30 1,039 0,375 101,00 36,53 36,17 36,54 25,78 334 CN ci FZ B 7,50 0,2025 30 1,039 0,373 101,00 36,34 35,98 36,50 25,76 334 CN ci FZ B 7,50 0,2025 30 1,039 0,376 101,00 36,63 36,27 36,34 25,64 325 C ci FZ A 6,78 0,2005 30 1,074 0,534 104,40 51,97 49,78 28,58 20,25 325 C ci FZ A 6,78 0,2005 30 1,074 0,531 104,40 51,68 49,50 28,74 20,36

325 C ci FZ B 6,78 0,2004 30 1,074 0,556 104,40 54,11 51,83 27,40 19,43 325 C ci FZ B 6,78 0,2004 30 1,074 0,551 104,40 53,62 51,36 27,67 19,62 320 S ci FZ A 10,19 0,2035 30 1,047 0,460 101,78 44,79 44,00 32,65 23,09 320 S ci FZ A 10,19 0,2035 30 1,047 0,444 101,78 43,23 42,48 33,56 23,72 320 S ci FZ B 10,19 0,2044 30 1,047 0,426 101,78 41,49 40,76 34,42 24,32 320 S ci FZ B 10,19 0,2044 30 1,047 0,413 101,78 40,22 39,52 35,16 24,83 322 S ba FZ A 9,82 0,2039 30 1,003 0,307 97,50 29,93 30,70 40,30 28,40 322 S ba FZ A 9,82 0,2039 30 1,003 0,335 97,50 32,65 33,49 38,65 27,26 322 S ba FZ B 9,82 0,2015 30 1,003 0,277 97,50 27,02 27,71 42,56 29,98 322 S ba FZ B 9,82 0,2015 30 1,003 0,288 97,50 28,09 28,81 41,91 29,52 329 N ci FZ A 7,19 0,2029 30 1,074 0,375 104,40 36,53 34,99 36,88 26,01 329 N ci FZ A 7,19 0,2029 30 1,074 0,392 104,40 38,18 36,58 35,97 25,38 329 N ci FZ B 7,19 0,2044 30 1,074 0,377 104,40 36,73 35,18 36,50 25,75 329 N ci FZ B 7,19 0,2044 30 1,074 0,390 104,40 37,99 36,39 35,81 25,27 326 C ci FZ A 8,68 0,2056 30 1,047 0,416 101,78 40,51 39,81 34,21 24,16 326 C ci FZ A 8,68 0,2056 30 1,047 0,424 101,78 41,29 40,57 33,77 23,85 326 C ci FZ B 8,68 0,2051 30 1,047 0,407 101,78 39,64 38,95 34,79 24,56 326 C ci FZ B 8,68 0,2051 30 1,047 0,412 101,78 40,13 39,43 34,51 24,37 336 S ba FZ A 8,39 0,2096 30 1,045 0,338 101,58 32,94 32,43 37,61 26,52 336 S ba FZ A 8,39 0,2096 30 1,045 0,374 101,58 36,44 35,87 35,67 25,17 336 S ba FZ B 8,39 0,2086 30 1,045 0,392 101,58 38,18 37,59 34,87 24,61 336 S ba FZ B 8,39 0,2086 30 1,045 0,397 101,58 38,67 38,07 34,59 24,42 335 C tu FZ A 8,17 0,209 30 1,045 0,363 101,58 35,37 34,82 36,28 25,59 335 C tu FZ A 8,17 0,209 30 1,045 0,340 101,58 33,14 32,62 37,52 26,46 335 C tu FZ B 8,17 0,2062 30 1,045 0,385 101,58 37,50 36,92 35,57 25,10 335 C tu FZ B 8,17 0,2062 30 1,045 0,382 101,58 37,21 36,63 35,73 25,22 332 S tu FZ A 6,47 0,2012 30 1,039 0,315 101,00 30,71 30,40 39,54 27,87 332 S tu FZ A 6,47 0,2012 30 1,039 0,338 101,00 32,94 32,62 38,27 26,98 332 S tu FZ B 6,47 0,2029 30 1,039 0,344 101,00 33,52 33,19 37,62 26,53 332 S tu FZ B 6,47 0,2029 30 1,039 0,342 101,00 33,33 33,00 37,73 26,61 324 CN ci FZ A 7,89 0,2017 25 1,003 0,275 97,50 26,83 27,51 34,79 24,50 324 CN ci FZ A 7,89 0,2017 25 1,003 0,273 97,50 26,63 27,31 34,88 24,57 324 CN ci FZ B 7,89 0,2028 25 1,003 0,292 97,50 28,48 29,20 33,78 23,80 324 CN ci FZ B 7,89 0,2028 25 1,003 0,295 97,50 28,77 29,50 33,63 23,70 321 CN ba FZ A 9,39 0,2013 30 1,047 0,412 101,78 40,13 39,43 35,44 25,02 321 CN ba FZ A 9,39 0,2013 30 1,047 0,406 101,78 39,54 38,85 35,78 25,26 321 CN ba FZ B 9,39 0,2011 30 1,047 0,412 101,78 40,13 39,43 35,47 25,05 321 CN ba FZ B 9,39 0,2011 30 1,047 0,406 101,78 39,54 38,85 35,81 25,29 330 C ba FZ A 7,79 0,2028 30 1,074 0,280 104,40 27,31 26,16 42,26 29,76 330 C ba FZ A 7,79 0,2028 30 1,074 0,263 104,40 25,66 24,58 43,17 30,39 330 C ba FZ B 7,79 0,206 30 1,074 0,299 104,40 29,16 27,93 40,59 28,59 330 C ba FZ B 7,79 0,206 30 1,074 0,293 104,40 28,57 27,37 40,91 28,81 331 CN tu FZ A 8,70 0,2049 30 1,055 0,453 102,55 44,11 43,01 32,48 22,96 331 CN tu FZ A 8,70 0,2049 30 1,055 0,433 102,55 42,17 41,12 33,57 23,72 331 CN tu FZ B 8,70 0,2028 30 1,055 0,413 102,55 40,22 39,22 35,03 24,74 331 CN tu FZ B 8,70 0,2028 30 1,055 0,422 102,55 41,10 40,07 34,53 24,39 333 C tu FZ A 8,88 0,2019 30 1,039 0,325 101,00 31,68 31,37 39,88 28,11 333 C tu FZ A 8,88 0,2019 30 1,039 0,323 101,00 31,49 31,17 40,00 28,19 333 C tu FZ B 8,88 0,204 30 1,039 0,294 101,00 28,67 28,39 41,21 29,03 333 C tu FZ B 8,88 0,204 30 1,039 0,296 101,00 28,86 28,58 41,10 28,95 327 N tu FZ A 6,29 0,2016 30 1,074 0,492 104,40 47,89 45,88 30,51 21,59 327 N tu FZ A 6,29 0,2016 30 1,074 0,418 104,40 40,71 38,99 34,46 24,33 327 N tu FZ B 6,29 0,2005 30 1,074 0,415 104,40 40,42 38,71 34,81 24,58

327 N tu FZ B 6,29 0,2005 30 1,074 0,428 104,40 41,68 39,92 34,11 24,09 337 C ba FZ A 8,10 0,2035 30 1,045 0,350 101,58 34,11 33,58 37,95 26,77 337 C ba FZ A 8,10 0,2035 30 1,045 0,387 101,58 37,70 37,11 35,90 25,34 337 C ba FZ B 8,10 0,2045 30 1,045 0,344 101,58 33,52 33,00 38,10 26,86 337 C ba FZ B 8,10 0,2045 30 1,045 0,372 101,58 36,24 35,68 36,56 25,79

Cuadro B.3. Análisis de la Varianza para CPT (efectos simples)

Análisis de la Varianza para CPT - Sumas de Cuadrad os de Tipo III

--------------------------------------------------- --------------------------

Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrad o Medio Cociente-F P-Va

--------------------------------------------------- --------------------------

EFECTOS PRINCIPALES

A:Orígen 1,51893 3 0 ,506311 0,36 0,7

B:Secado 5,25692 2 2,62846 1,89 0,1

C:Epoca 8,71243 1 8,71243 6,25 0,0

RESIDUOS 43,2063 31 1,39375

--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------


Cuadro B.4. Análisis de la Varianza para CAO (efectos simples)

Análisis de la Varianza para CAO_ET - Sumas de Cua drados de Tipo III

--------------------------------------------------- --------------------------

Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrad o Medio Cociente-F P-Va

--------------------------------------------------- --------------------------

EFECTOS PRINCIPALES

A:origen 1,11476 3 0 ,371587 0,04 0,9

B:secado 0,117774 2 0 ,058887 0,01 0,9

C:Epoca 205,489 1 205,489 21,28 0,0

RESIDUOS 299,283 31 9,65428

--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------


Análisis de la Varianza paraCAO_EAA - Sumas de Cuad rados de Tipo III

--------------------------------------------------- -----------------------------

Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrad o Medio Cociente-F P-Valor

--------------------------------------------------- -----------------------------

EFECTOS PRINCIPALES

A:origen 0,557667 3 0 ,185889 0,04 0,9892

B:secado 0,0544743 2 0, 0272371 0,01 0,9942

C:Epoca 99,7533 1 99,7533 21,38 0,0001

RESIDUOS 144,61 31 4,66485

--------------------------------------------------- -----------------------------


--------------------------------------------------- -----------------------------


Cuadro B.5. Análisis de la Varianza para CPT (efectos dobles: Orígen y época) Análisis de la Varianza para CPT - Sumas de Cuadrad os de Tipo III

--------------------------------------------------- ---------------------------

Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrad o Medio Cociente-F P-Val

--------------------------------------------------- ---------------------------

EFECTOS PRINCIPALES

A:Orígen 3,29916 3 1,09972 0,84 0,48

B:Epoca 11,5672 1 11,5672 8,80 0,00

INTERACCIONES

AB 9,02911 3 3,0097 2,29 0,09

RESIDUOS 39,4341 30 1,31447

--------------------------------------------------- ---------------------------


--------------------------------------------------- ---------------------------


Cuadro B.6. Análisis de la Varianza para CPT (efectos dobles: Secado y época)

Análisis de la Varianza para CPT - Sumas de Cuadrad os de Tipo III

--------------------------------------------------- ----------------------------


--------------------------------------------------- ----------------------------

EFECTOS PRINCIPALES

A:secado 7,13341 2 3,56671 3,01 0,063

B:Epoca 6,05285 1 6,05285 5,10 0,030

INTERACCIONES

AB 6,7626 2 3,3813 2,85 0,072

RESIDUOS 37,9626 32 1,18633

--------------------------------------------------- ----------------------------


--------------------------------------------------- ----------------------------


Cuadro B.7. Análisis de la Varianza para CAO (efectos dobles: Orígen y época)

Análisis de la Varianza para CAO_EAA - Sumas de Cua drados de Tipo III

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--------------------------------------------------- ----------------------------

EFECTOS PRINCIPALES

A:Orígen 0,584818 3 0 ,194939 0,04 0,988

B:Epoca 82,0344 1 82,0344 17,71 0,000

INTERACCIONES

AB 5,68709 3 1,8957 0,41 0,747

RESIDUOS 138,978 30 4,63259

--------------------------------------------------- ----------------------------


--------------------------------------------------- ----------------------------



--------------------------------------------------- ----------------------------


--------------------------------------------------- ----------------------------

EFECTOS PRINCIPALES

A:Orígen 1,17279 3 0 ,390929 0,04 0,988

B:Epoca 168,674 1 168,674 17,61 0,000

INTERACCIONES

AB 12,0009 3 4,00031 0,42 0,741

RESIDUOS 287,399 30 9,57998

--------------------------------------------------- ----------------------------


--------------------------------------------------- ----------------------------


Cuadro B.8. Análisis de la Varianza para CAO (efectos dobles: Secado y época)

Análisis de la Varianza para CAO_EAA - Sumas de Cua drados de Tipo III

--------------------------------------------------- ---------------------------


--------------------------------------------------- ---------------------------

EFECTOS PRINCIPALES

A:secado 0,141519 2 0, 0707597 0,02 0,97

B:Epoca 83,7061 1 83,7061 26,37 0,00

INTERACCIONES

AB 43,5914 2 21,7957 6,87 0,00

RESIDUOS 101,577 32 3,17427

--------------------------------------------------- ---------------------------


--------------------------------------------------- ---------------------------



--------------------------------------------------- ---------------------------


--------------------------------------------------- ---------------------------

EFECTOS PRINCIPALES

A:Secado 0,295643 2 0 ,147821 0,02 0,97

B:Epoca 172,215 1 172,215 26,21 0,00

INTERACCIONES

AB 90,135 2 45,0675 6,86 0,00

RESIDUOS 210,262 32 6,5707

--------------------------------------------------- ---------------------------


--------------------------------------------------- ---------------------------


Cuadro B.9. Contrastes de hipótesis Contraste Múltiple de Rango para CAO_ET según Epoca (secado tipo cinta)

--------------------------------------------------- --------------------------

Método: 95,0 porcentaje LSD

Epoca Frec. Media Grupos h omogéneos

--------------------------------------------------- --------------------------

FZ 8 33,7122 X

IZ 8 41,2931 X

--------------------------------------------------- --------------------------

Contraste Diferenc ias +/- Límites

--------------------------------------------------- --------------------------

FZ - IZ *-7,58094 2,72145

--------------------------------------------------- --------------------------

* indica una diferencia significativa.

Contraste Múltiple de Rango para CAO_ET según Epoca (secado tubular)

--------------------------------------------------- --------------------------



--------------------------------------------------- --------------------------

FZ 5 34,9045 X

IZ 5 39,981 X

--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------

FZ - IZ *-5,0765 5,04115

--------------------------------------------------- --------------------------


Contraste Múltiple de Rango para CAO_ET según Epoca (secado tipo barbacúa)

--------------------------------------------------- ----------------------------



--------------------------------------------------- ----------------------------

FZ 6 37,1192 X

IZ 6 37,475 X

--------------------------------------------------- ----------------------------


--------------------------------------------------- ----------------------------

FZ - IZ -0,35583 3 2,01446

--------------------------------------------------- ----------------------------


ANEXO 3

Cuadro C.1. Datos de determinación de CPT- Método de Folin-Ciucalteu

Muestra Wi (g) CH(bh) Extracción Lectura

Abs CoPT CPT

(765 nm) (µgEAC/mL) (gEAC %ms) hojas 0,2286 4,8 H1 1 0,309 47,80 22,0

hojas 0,2286 4,8 H1 2 0,312 48,25 22,2

hojas 0,2256 4,8 H2 1 0,309 47,80 22,3

hojas 0,2256 4,8 H2 2 0,310 47,95 22,3

palos 0,2405 5,7 P1 1 0,190 29,96 13,2

palos 0,2405 5,7 P1 2 0,192 30,26 13,3

palos 0,2261 5,7 P2 1 0,206 32,36 15,2

palos 0,2261 5,7 P2 2 0,201 31,61 14,8 Wi: peso de muestra empleada, CH: contenido de humedad (%, base humeda), Abs: absorbancia, CoPT: concentración de polifenoles totales; CPT: contenido de polifenoles totales

Er ror

Código Recuento Media Es tánda

--------------------------------------------------- -----

H 2 22,2 0, 1

P 2 14,125 0, 875

--------------------------------------------------- -----

Total 4 18,1625 2, 35862

Cuadro C.2. Resumen estadístico de CPT de las fracciones de hojas y palos y prueba t CPThojas CPTpalos

--------------------------------------------------- -----

Frecuencia 2 2

Media 22,2 14,125

Varianza 0,02 1,53125

Desviación típica 0,141421 1,23744

Error estándar 0,1 0,875

Mínimo 22,1 13,25

Máximo 22,3 15,0

Comparación de Medias, Prueba t-Student

---------------------

95,0% intervalo de confianza para la media de CPTho jas: 22,2 +/- 1,27062 [20,9294,2

95,0% intervalo de confianza para la media de CPTpa los: 14,125 +/- 11,1179 [3,00707

95,0% intervalos de confianza para la diferencia de medias:

suponiendo varianzas iguales: 8,075 +/- 3,78933 [4,28567,11,8643]

contrastes t de comparación de medias

Hipótesis nula: media1 = media2

Hipótesis alt.: media1 <> media2

suponiendo varianzas iguales: t = 9,16889 P-Valor = 0,0116869

Cuadro C.3. Datos correspondientes a la experiencia de determinación del tiempo de extracción

VA (mL)a t (min)

Peso inicial (g)

Peso final (g) VR (mL) VF (mL)b VRM (mL)

238 10 437 437 140 140 98

238 20 443 443 146 156 82

238 30 441 441 156 166 72

238 50 439 438 136 146 92

238 50 -- -- 167 167 71

238 60 442 442 145 145 93

238 120 431 431 150 160 78 VA: volumen de agua agregado; t: tiempo de extracción; VR: volumen recolectado; VF: volumen final; VRM: volumen de liquido retenido en la muestra; aPara la cantidad de agua agregada, se contempló el contenido de humedad de la muestra. b Volumen final luego de exprimir manualmente la muestra humedecida.

Muestra t (min)

Peso (g, bh)

Abs. CH(% bh)

VE (mL) Dilución CoPT

(µg/mL) g EACc CPT

(g EAC % ms)

1 10 31,5 0,381 4,8 140 1+2 58,25 2,4467 8,156

1 10 31,5 0,382 4,8 140 1+2 58,40 2,4529 8,176

2 20 31,5 0,409 4,8 156 1+2 62,43 2,9219 9,740

2 20 31,5 0,412 4,8 156 1+2 62,88 2,9428 9,809

3 30 31,5 0,266 4,8 166 1+4 41,09 3,4104 11,368

3 30 31,5 0,267 4,8 166 1+4 41,24 3,4228 11,409

5 50 31,5 0,242 4,8 167 1+4 37,51 3,1319 10,440

5 50 31,5 0,241 4,8 167 1+4 37,36 3,1194 10,398

5 50 31,5 0,244 4,8 167 1+4 37,81 3,1568 10,523

5 50 31,5 0,243 4,8 167 1+4 37,66 3,1443 10,481

7 60 31,5 0,253 4,8 170 1+4 39,15 3,3277 11,092

7 60 31,5 0,255 4,8 170 1+4 39,45 3,3531 11,177

7 60 31,5 0,261 4,8 170 1+4 40,34 3,4292 11,431

7 60 31,5 0,264 4,8 170 1+4 40,79 3,4672 11,557

8 120 31,5 0,271 4,8 160 1+4 41,84 3,3469 11,156

8 120 31,5 0,279 4,8 160 1+4 43,03 3,4424 11,475 t: tiempo de extracción; wi: peso de la muestra en base humeda; Abs: absorbancia; CH: contenido de humedad; VE: volumen extraído; CoPT: concentración de polifenoles totales; CPT: contenido de polifenoles totales c Recta de calibración con ácido clorogénico: Abs==0,0067*x-0,0093 siendo x la concentración del patrón ácido clorogénico válida entre 0 y 60 µgEAC/mL.

Cuadro de medias:

Error

Tiempo (min) Recuento Media Estándar

--------------------------------------------------- -

0 1 0,0 0,0

10 2 8,166 0,01

20 2 9,7745 0,0345

30 2 11,3885 0,0205

50 2 10,4605 0,0415

60 2 11,3145 0,1795

120 2 11,3155 0,1595

--------------------------------------------------- -

Total 13 9,603 0,862684

Cuadro C.4. Análisis de regresión no lineal – tiempo de extracción

a)- Modelo de Peleg:

Regresión No líneal---MODELO DE PELEG

-------------------

Variable dependiente: cpt

Variables independientes: t

Función a estimar: t/(k1+k2*t)

Estimaciones del parámetro inicial:

k1 = 0,1

k2 = 0,1

Método de estimación: Marquardt

La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos.

Número de iteracciones: 3

Número de llamadas de funciones: 11

Resultados de la Estimación

--------------------------------------------------- -------------------------

Asintótica 95,0%

Asintótica Intervalos de Confianza

Parámetro Estimado Error Estándar Inferior Superior

--------------------------------------------------- -------------------------

k1 0,351854 0,0796942 0,146993 0,556715

k2 0,0837909 0,0029293 0,0762609 0,0913209

--------------------------------------------------- -------------------------

Análisis de Varianza

--------------------------------------------------- --

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado M edio

--------------------------------------------------- --

Modelo 656,118 2 328,0 59

Residuos 1,28438 5 0,2568 77

--------------------------------------------------- --

Total 657,403 7

Total (Corr.) 100,804 6

R-Cuadrado = 98,7259 porcentaje

R-Cuadrado (adaptado para g.l.) = 98,471 porcentaje

Error Estándar de la Est. = 0,50683

Error absoluto de la Media = 0,310417

Estadístico Durbin-Watson = 3,03595

Autocorrelación residual Lag 1 = -0,53605

Análisis de Residuos

---------------------------------

Estimación Validación

n 7

MSE 0,256877

MAE 0,310417

MAPE

ME -0,0018265

MPE

b)- Modelo Logarítmico:

Regresión No líneal---Modelo Logarítmico

-------------------

Variable dependiente: CPT

Variables independientes: t

Función a estimar: a*LOG(t)+b


a = 0,1

b = 0,1


La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de resi




--------------------------------------------------- -------------------------

Asintótica 95,0%



--------------------------------------------------- -------------------------

a 1,20855 0,39798 0,10358 2,31353

b 6,07394 1,46076 2,01821 10,1297

--------------------------------------------------- -------------------------


--------------------------------------------------- --


--------------------------------------------------- --

Modelo 654,971 2 327,4 86

Residuos 2,43153 4 0,6078 82

--------------------------------------------------- --

Total 657,403 6

Total (Corr.) 8,03719 5


R-Cuadrado (adaptado para g.l.) = 62,1832 porcentaj e





c)- Modelo de Pilosof:

Cuadro C.5. Planilla de cálculo de las cantidades a agregar - Experiencia correspondiente al diseño experimental

Sistema

extractivo

Variables codificadas Variables codificadas WA (g) WB (g)

WD (g)

WE (g) x1 x2 X1 X2

3 -1 -1 6 25 180 45 2,2 131,3 4 -1 1 6 75 180 135 6,6 36,9 5 1 -1 10 25 300 75 3,7 219,8 6 1 1 10 75 300 225 11,0 62,5 7 1,41 0 10,82 50 324,6 162,3 8,0 152,8 8 -1,41 0 5,18 50 155,4 77,7 3,8 72,4 9 0 1,41 8 85,25 240 204,6 10,0 23,9 10 0 -1,41 8 14,75 240 35,4 1,7 201,4 11 0 0 8 50 240 120 5,9 112,6 11 0 0 8 50 240 120 5,9 112,6 11 0 0 8 50 240 120 5,9 112,6 11 0 0 8 50 240 120 5,9 112,6

Datos adicionales y nomanclatura presentados en el cuadro C5:

WA -Cantidad total de liquido a agregar

WB-Cantidad de etanol a agregar WC-Cantidad de agua aportada por la muestra = 1,5 g de agua WD- Cantidad de agua aportada por la solucion etanolica WA= (WMbs)*X1 WB=WA*X2 WE=WA-WB-WC-WD Densidad de etanol (96°) =0,816 g/mL (a 27°C) Humedad de las muestras: 4,7%(bh) Peso de muestra húmeda utilizado en la extracción= WMbh= 31,5 g YM bh Peso de muestra seca utilizado en la extracción= WMbs= 30 g YM bs Nota C1. Modo de cálculo de CPT para extracciones del diseño

Ejemplo para A1a:

1 mL de reacción------Abs------ 67,74µgEAC 100 mL------------------------- x1= 6774 µgEAC 1 mL------------------------------------------ 6774 µgEAC 5 mL (vol dilución)------------------------- x2= 33870 µgEAC 1 mL --------------------------------- 33870 µgEAC 103 mL (Vol recuperado)-------- x3=3,4886 g EAC 30 g hoja seca-------------3,4886 g EAC 100 g hoja seca------------- x4= 11,6287 g EAC

Cuadro C.6. Datos de concentración y contenido de polifenoles totales

Curvas de calibración empleadas: • Acido gálico: Abs=0,0122*X1+0,001 con X1 expresado como µgEAG/mL (R2:0,9994) • Ácido clorogénico: Abs=0,0065*X2+0,0007 con X2 expresado como µgEAC/mL (R2:0,9995) • Abs: absorbancia leída a 765 nm

Muestra: Fracción de hojas Peso de la muestra: 31,5 g (bh) = 30 g (bs)

Sist. Extrac-

tivo

Extra-cción

Mues-tra

Lectu-ra

Abs Dilución 1:x

VR(mL) CoPT (µgEAC/mL)

CPT-EAC (gEAC %ms)

3 A a 1 0,251 8 103 38,51 10,58 3 A a 2 0,251 8 103 38,51 10,58 3 A b 1 0,271 8 103 41,58 11,42 3 A b 2 0,269 8 103 41,28 11,34 4 A a 1 0,289 5 116 44,35 8,58 4 A a 2 0,296 5 116 45,43 8,78 4 A b 1 0,273 5 116 41,89 8,10 4 A b 2 0,278 5 116 42,66 8,25 5 A a 1 0,227 5 224 34,82 13,00 5 A a 2 0,220 5 224 33,74 12,60 5 A b 1 0,225 5 224 34,51 12,88 5 A b 2 0,238 5 224 36,51 13,63 6 A a 1 0,130 5 247 19,89 8,19 6 A a 2 0,131 5 247 20,05 8,25 6 A b 1 0,151 5 247 23,12 9,52 6 A b 2 0,168 5 247 25,74 10,60 7 A a 1 0,199 5 260 30,51 13,22 7 A a 2 0,198 5 260 30,35 13,15 7 A b 1 0,194 5 260 29,74 12,89 7 A b 2 0,192 5 260 29,43 12,75 8 A a 1 0,236 10 88 36,20 10,62 8 A a 2 0,236 10 88 36,20 10,62 8 A b 1 0,193 10 88 29,58 8,68 8 A b 2 0,193 10 88 29,58 8,68 9 A a 1 0,141 5 194 21,58 6,98 9 A a 2 0,142 5 194 21,74 7,03 9 A b 1 0,150 5 194 22,97 7,43 9 A b 2 0,151 5 194 23,12 7,48 10 A a 1 0,252 5 164 38,66 10,57 10 A a 2 0,249 5 164 38,20 10,44 10 A b 1 0,241 5 164 36,97 10,10

Continúa

Continuación cuadro C.6 10 A b 2 0,236 5 164 36,20 9,89 11 A a 1 0,317 5 180 48,66 14,60 11 A a 2 0,320 5 180 49,12 14,74 11 A b 1 0,339 5 180 52,05 15,61 11 A b 2 0,348 5 180 53,43 16,03 11 A a 1 0,274 5 179 42,05 12,54 11 A a 2 0,276 5 179 42,35 12,64 11 A b 1 0,286 5 179 43,89 13,09 11 A b 2 0,288 5 179 44,20 13,19 11 A a 1 0,270 5 175 41,43 12,08 11 A a 2 0,270 5 175 41,43 12,08 11 A b 1 0,300 5 175 46,05 13,43 11 A b 2 0,305 5 175 46,82 13,65 11 A a 1 0,301 5 175 46,20 13,48 11 A a 2 0,305 5 175 46,82 13,65 11 A b 1 0,307 5 175 47,12 13,74 11 A b 2 0,309 5 175 47,43 13,83 3 B a 1 0,236 8 115 36,20 11,10 3 B a 2 0,237 8 115 36,35 11,15 3 B b 1 0,229 8 115 35,12 10,77 3 B b 2 0,231 8 115 35,43 10,87 4 B a 1 0,247 5 123 37,89 7,77 4 B a 2 0,254 5 123 38,97 7,99 4 B b 1 0,264 5 123 40,51 8,30 4 B b 2 0,265 5 123 40,66 8,34 5 B a 1 0,233 5 238 35,74 14,18 5 B a 2 0,232 5 238 35,58 14,12 5 B b 1 0,223 5 238 34,20 13,57 5 B b 2 0,219 5 238 33,58 13,32 6 B a 1 0,162 5 251 24,82 10,38 6 B a 2 0,159 5 251 24,35 10,19 6 B b 1 0,164 5 251 25,12 10,51 6 B b 2 0,161 5 251 24,66 10,32 7 B a 1 0,180 5 270 27,58 12,41 7 B a 2 0,182 5 270 27,89 12,55 7 B b 1 0,184 5 270 28,20 12,69 7 B b 2 0,185 5 270 28,35 12,76 8 B a 1 0,193 10 94 29,58 9,27 8 B a 2 0,195 10 94 29,89 9,37 8 B b 1 0,206 10 94 31,58 9,90 8 B b 2 0,202 10 94 30,97 9,70 9 B a 1 0,132 5 197 20,20 6,63

Continúa

Continuación cuadro C.6 9 B a 2 0,130 5 197 19,89 6,53 9 B b 1 0,140 5 197 21,43 7,04 9 B b 2 0,144 5 197 22,05 7,24 10 B a 1 0,216 5 168 33,12 9,27 10 B a 2 0,222 5 168 34,05 9,53 10 B b 1 0,241 5 168 36,97 10,35 10 B b 2 0,233 5 168 35,74 10,01 11 B a 1 0,243 5 175 37,28 10,87 11 B a 2 0,251 5 175 38,51 11,23 11 B b 1 0,255 5 175 39,12 11,41 11 B b 2 0,257 5 175 39,43 11,50 11 B a 1 0,258 5 178 39,58 11,74 11 B a 2 0,265 5 178 40,66 12,06 11 B b 1 0,264 5 178 40,51 12,02 11 B b 2 0,264 5 178 40,51 12,02 11 B a 1 0,271 5 181 41,58 12,54 11 B a 2 0,271 5 181 41,58 12,54 11 B b 1 0,302 5 181 46,35 13,98 11 B b 2 0,301 5 181 46,20 13,94 11 B a 1 0,272 5 180 41,74 12,52 11 B a 2 0,275 5 180 42,20 12,66 11 B b 1 0,294 5 180 45,12 13,54 11 B b 2 0,300 5 180 46,05 13,81

SE: Sistema extractivo; VR: volumen recuperado

Cuadro C.7. Resumenes estadísticos y gráficos de dispersión

Para: a)-Contenido de polifenoles totales (CPT; g EAC %ms) y b)-Concentración de polifenoles totales (CoPT; µg EAC / mL). Extracciones correspondientes al diseño experimental

a)- CPT (g EAC %ms)

Sistema

Extractivo Recuento Media Error Estándar

--------------------------------------------------- ------------

3 2 11,0 0, 0

4 2 8,25 0, 15

5 2 13,4 0, 4

6 2 9,7 0, 6

7 2 12,8 0, 2

8 2 9,6 0, 0

9 2 7,05 0, 15

10 2 10,05 0, 25

11 8 13,0375 0, 40

b)- CoPT (µg EAC /mL)

Sistema

Extractivo Recuento Media E rror Estándar

--------------------------------------------------- ----------------------

3 2 37,875 2, 095

4 2 41,545 2, 035

5 2 34,835 0, 055

6 2 23,47 1, 27

7 2 29,01 1, 0

8 2 31,7 1, 19

9 2 21,62 0, 73

10 2 36,24 1, 27

11 8 43,9213 1, 32669

Nota C.2. Modo de cálculo de CAO para extracciones del diseño

Ejemplo de cálculo: Volumen de extracto original (zz mL)---------m g YMH 1mL--------------------------------------------------x=x1 VD=Volumen de dilución-----------------------x1 100µL=0,1 mL------------------------------------x=x2 100 g YMH-------------------------(100-CH) gYMS x2-------------------------------------x=x3 g YMS x3 g YMS---------------------xµgEAA/1000000(µg/g) 100 g YMS-------------------x=CAO

Cuadro C.8. Datos de capacidad antioxidante

Curvas de calibración empleadas:

• Ácido Ascórbico: R(%)=-3,9898*(uequivalentes a AA)+99,996 • Trolox: R(%)=-2,7675*(uequivalenes a T) + 99,054

Absorbancia leída a 517 nm Muestra: Fracción de hojas Peso de la muestra: w= 31,5 g (bh) = 30 g (bs)

CAO

E w Vor (mL)

VD (mL) A(t=0) A

(t=120) X R(%) gEAA gET CAO-EAA

CAO-ET

A1 31,5 103 300 1,055 0,518 50,42 49,16 12,77 18,03 13,16 18,58 B1 31,5 115 275 1,032 0,515 50,13 49,97 12,57 17,74 13,25 18,71 A2 31,5 116 180 1,055 0,467 45,47 44,33 13,98 19,77 9,74 13,77 B2 31,5 123 200 1,030 0,517 50,32 50,26 12,49 17,63 10,25 14,46 A3 31,5 224 170 1,032 0,565 54,98 54,80 11,35 15,99 14,42 20,30 B3 31,5 238 170 1,032 0,529 51,49 51,32 12,23 17,25 16,50 23,27 A4 31,5 247 92 1,032 0,524 51,00 50,84 12,35 17,42 9,36 13,20 B4 31,5 251 100 1,026 0,492 47,89 48,02 13,06 18,44 10,93 15,43 A5 31,5 260 136 1,005 0,461 44,88 45,94 13,58 19,19 16,01 22,63 B5 31,5 270 154 1,029 0,535 52,07 52,05 12,04 16,98 16,70 23,55 A6 31,5 88 330 1,032 0,544 52,94 52,77 11,86 16,72 11,49 16,19 B6 31,5 94 300 1,026 0,466 45,37 45,49 13,69 19,36 12,88 18,20 A7 31,5 194 118 1,032 0,542 52,75 52,58 11,91 16,79 9,09 12,82 B7 31,5 197 114 1,029 0,532 51,78 51,76 12,12 17,09 9,07 12,80 A8 31,5 164 220 1,029 0,479 46,63 46,62 13,41 18,95 16,13 22,80 B8 31,5 168 196 1,030 0,519 50,51 50,45 12,45 17,56 13,67 19,28 A9 31,5 180 220 1,032 0,568 55,27 55,10 11,28 15,88 14,89 20,98 B9 31,5 175 200 1,029 0,496 48,28 48,27 12,99 18,35 15,17 21,42 A10 31,5 179 220 1,029 0,549 53,43 53,41 11,70 16,49 15,37 21,66 B10 31,5 178 210 1,029 0,509 49,54 49,53 12,68 17,90 15,80 22,31 A11 31,5 175 220 1,029 0,531 51,68 51,66 12,14 17,12 15,59 21,98 B11 31,5 181 218 1,026 0,551 53,62 53,76 11,61 16,37 15,28 21,53 A12 31,5 175 240 1,055 0,522 50,81 49,54 12,67 17,89 17,75 25,06 B12 31,5 180 218 1,029 0,523 50,90 50,89 12,34 17,40 16,14 22,77 E: extracto; Ai: corresponde al extracto del sistema extractivo i; Bi: corresponde a la replica del extracto del sistema extractivo i. w: peso (g); Vor: Volumen Original; VD: Volumen de dilución; A: Absorbancia; t: tiempo (min); CAO-EAA: capacidad antioxidante expresada en g EAA %ms; CAO-ET: capacidad antioxidante expresada en g ET %ms; EAA: equivalentes a ácido ascórbico; ET: equivalentes a Trolox

Nota C.3. Modo de cálculo del contenido de cafeína (CC) para extracciones del diseño Ejemplo de cálculo para A1: 1000 mL-------------------------------0,95 g CAF Vrecuperado=103 mL------------- x=0,09785 g CAF 31,5 g YMHUM-----30 g YM SECA-----------0,09785 g CAF 100 g Ymseca-----------x=0,3261 g CAF

Cuadro C.9. Datos de contenido de cafeína

Sistema extractivo Extracción Área gCAF/L Vrecuperado (mL)

CC (gCAF/100

g ms) 3 A 86300 0,95 103 0,326

4 A 83700 0,92 116 0,356

5 A 53800 0,59 224 0,441

6 A 41100 0,45 247 0,371

7 A 35700 0,39 260 0,338

8 A 90100 0,99 88 0,290

9 A 56300 0,62 194 0,401

10 A 57300 0,63 164 0,344

11 A 60700 0,67 180 0,402

11 A 64200 0,70 179 0,418

11 A 67900 0,74 175 0,432

11 A 64900 0,71 175 0,414

3 B 85000 0,93 115 0,357

4 B 78700 0,86 123 0,353

5 B 54200 0,59 238 0,473

6 B 50600 0,56 251 0,469

7 B 43900 0,48 270 0,432

8 B 87500 0,96 94 0,301

9 B 58700 0,64 197 0,420

10 B 59400 0,65 168 0,364

11 B 92800 0,65 175 0,379

11 B 66500 0,73 178 0,433

11 B 66200 0,72 181 0,434

11 B 68100 0,75 180 0,450

Resumen estadístico y gráfico de dispersion para Contenido de cafeína (CC; g CAF %ms). Extracciones correspondientes al diseño experimental

Sistema

Extractivo Recuento Media Error Est ándar

--------------------------------------------------- ------

3 2 0,3415 0,0155

4 2 0,3545 0,0015

5 2 0,457 0,016

6 2 0,42 0,049

7 2 0,385 0,047

8 2 0,2955 0,0055

9 2 0,4105 0,0095

10 2 0,354 0,01

11 8 0,42025 0,0078 53

Gráfico de Dispersión-CC

Sistema Extractivo

CC

0,28

0,32

0,36

0,4

0,44

0,48

3 4 5 6 7 8 9 10 11

Cuadro C.10. Datos empleados para el análisis de regresión y de correlación Variables independientes: x1: relación líquido a sólido (g líquido/g sólido seco); x2: concentración de etanol (% p/p)

x1 x2 CoPT CPT CAO-ET CC CAO-EAA 6 25 39,97 11,0 18,6 0,326 13,2 6 25 35,78 11,0 18,7 0,357 13,2 6 75 43,58 8,4 13,8 0,356 9,7 6 75 39,51 8,1 14,5 0,353 10,2

10 25 34,89 13,0 20,3 0,441 14,4 10 25 34,78 13,8 23,3 0,473 16,5 10 75 22,20 9,10 13,2 0,371 9,4 10 75 24,74 10,3 15,4 0,469 10,9

10,82 50 30,01 13,0 22,6 0,338 16,0 10,82 50 28,01 12,6 23,5 0,432 16,7 5,18 50 32,89 9,6 16,2 0,290 11,5 5,18 50 30,51 9,6 18,2 0,301 12,9

8 85,25 22,35 7,2 12,8 0,401 9,1 8 85,25 20,89 6,9 12,8 0,420 9,1 8 14,75 37,51 10,3 20,7 0,344 14,7 8 14,75 34,97 9,8 19,3 0,364 13,7 8 50 43,10 12,9 21,0 0,402 14,9 8 50 38,58 11,3 21,4 0,379 15,2 8 50 43,12 12,9 21,7 0,418 15,4 8 50 40,32 12,0 22,3 0,433 15,8 8 50 43,93 12,8 22,2 0,432 15,7 8 50 43,93 13,3 21,5 0,434 15,3 8 50 46,89 13,7 25,1 0,414 17,7 8 50 43,78 13,1 22,8 0,450 16,1

Cuadro C.11. Análisis de correlación para los pares de variables a)CPT-CAO_EAA; b)CPT-CAO_ET; c)CPT-CC; d)CAO_EAA-CAO_ET; e)- CAO_EAA-CC; f) CAO_ET-CC

a)CPT-CAO_EAA

Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X-----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: CPTVariable independiente: CAO_EAA----------------------------------------------------------------------------- Error EstadísticoParámetro Estimación estándar T P-Valor-----------------------------------------------------------------------------Ordenada 1,1588 0,909843 1,27362 0,2161Pendiente 0,726822 0,0655112 11,0946 0,0000-----------------------------------------------------------------------------

Análisis de la Varianza-----------------------------------------------------------------------------Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Cociente-F P-Valor-----------------------------------------------------------------------------Modelo 87,543 1 87,543 123,09 0,0000Residuo 15,6466 22 0,711208-----------------------------------------------------------------------------Total (Corr.) 103,19 23

Coeficiente de Correlación = 0,92107R-cuadrado = 84,8371 porcentajeR-cuadrado (ajustado para g.l.) = 84,1478 porcentajeError estándar de est. = 0,843331Error absoluto medio = 0,690136Estadístico de Durbin-Watson = 1,54187 (P=0,0816)Autocorrelación residual en Lag 1 = 0,225283

b)CPT-CAO_ET

Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X-----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: CPTVariable independiente: CAO_ET----------------------------------------------------------------------------- Error EstadísticoParámetro Estimación estándar T P-Valor-----------------------------------------------------------------------------Ordenada 1,16477 0,908778 1,28169 0,2133Pendiente 0,514712 0,0463655 11,1012 0,0000-----------------------------------------------------------------------------



c)CPT-CC

Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X-----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: CPTVariable independiente: CC----------------------------------------------------------------------------- Error EstadísticoParámetro Estimación estándar T P-Valor-----------------------------------------------------------------------------Ordenada 3,86118 3,10468 1,24367 0,2267Pendiente 18,4115 7,86393 2,34126 0,0287-----------------------------------------------------------------------------



d)CAO_EAA-CAO_ET

Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X-----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: CAO_EAAVariable independiente: CAO_ET----------------------------------------------------------------------------- Error EstadísticoParámetro Estimación estándar T P-Valor-----------------------------------------------------------------------------Ordenada 0,0111562 0,0468619 0,238066 0,8140Pendiente 0,708015 0,00239088 296,132 0,0000-----------------------------------------------------------------------------



e) CAO_ET-CC

Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X-----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: CAO_ETVariable independiente: CC----------------------------------------------------------------------------- Error EstadísticoParámetro Estimación estándar T P-Valor-----------------------------------------------------------------------------Ordenada 9,79669 5,86848 1,66937 0,1092Pendiente 24,1306 14,8644 1,62338 0,1188-----------------------------------------------------------------------------



f)- CAO_EAA-CC

Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X-----------------------------------------------------------------------------Variable dependiente: CAO_EAAVariable independiente: CC----------------------------------------------------------------------------- Error EstadísticoParámetro Estimación estándar T P-Valor-----------------------------------------------------------------------------Ordenada 6,94207 4,15516 1,67071 0,1089Pendiente 17,0984 10,5247 1,62459 0,1185-----------------------------------------------------------------------------



Cuadro C.12. Análisis de mínima diferencia significativa (LSD, 95%)

Para las variables: a)-CoPT (µg EAC/mL); b)-CPT (g EAC %ms); c)-CAO-EAA (g EAA %ms); d)-CAO-ET (g ET %ms); e)-CC (g CAF %ms)

a)-CoPT (µg EAC/mL)

--------------------------------------------------- ------------------------

Variable: CoPT

Sistema

extractivo Frec. Media Grupos h omogéneos

--------------------------------------------------- ------------------------

9 2 21,62 X

6 2 23,47 X

7 2 29,01 X

8 2 31,7 XX

5 2 34,835 XX

10 2 36,24 XX

3 2 37,875 XX

4 2 41,545 XX

11 8 42,9563 X

--------------------------------------------------- ------------------------

Contraste Diferenc ias +/- Límite

--------------------------------------------------- ------------------------

3 - 4 -3,67 4,72184

3 - 5 3,04 4,72184

3 - 6 *14,405 4,72184

3 - 7 *8,865 4,72184

3 - 8 *6,175 4,72184

3 - 9 *16,255 4,72184

3 - 10 1,635 4,72184

3 - 11 *-5,08125 3,73294

4 - 5 *6,71 4,72184

4 - 6 *18,075 4,72184

4 - 7 *12,535 4,72184

4 - 8 *9,845 4,72184

4 - 9 *19,925 4,72184

4 - 10 *5,305 4,72184

4 - 11 -1,41125 3,73294

5 - 6 *11,365 4,72184

5 - 7 *5,825 4,72184

5 - 8 3,135 4,72184

5 - 9 *13,215 4,72184

5 - 10 -1,405 4,72184

5 - 11 *-8,12125 3,73294

6 - 7 *-5,54 4,72184

6 - 8 *-8,23 4,72184

6 - 9 1,85 4,72184

6 - 10 *-12,77 4,72184

6 - 11 *-19,4863 3,73294

7 - 8 -2,69 4,72184

7 - 9 *7,39 4,72184

7 - 10 *-7,23 4,72184

7 - 11 *-13,9463 3,73294

8 - 9 *10,08 4,72184

8 - 10 -4,54 4,72184

8 - 11 *-11,2563 3,73294

9 - 10 *-14,62 4,72184

9 - 11 *-21,3363 3,73294

10 - 11 *-6,71625 3,73294

--------------------------------------------------- ------------------------


b)-CPT (g EAC %ms)

--------------------------------------------------- -------------------------

Variable: CPT

Sistema

extractivo Frec. Media Grupos ho mogéneos

--------------------------------------------------- -------------------------

9 2 7,05 X

4 2 8,25 X

8 2 9,6 X

6 2 9,7 X

10 2 10,05 XX

3 2 11,0 X

11 8 12,75 X

7 2 12,8 X

5 2 13,4 X

--------------------------------------------------- -------------------------


--------------------------------------------------- -------------------------

3 - 4 *2,75 1,27591

3 - 5 *-2,4 1,27591

3 - 6 *1,3 1,27591

3 - 7 *-1,8 1,27591

3 - 8 *1,4 1,27591

3 - 9 *3,95 1,27591

3 - 10 0,95 1,27591

3 - 11 *-1,75 1,00869

4 - 5 *-5,15 1,27591

4 - 6 *-1,45 1,27591

4 - 7 *-4,55 1,27591

4 - 8 *-1,35 1,27591

4 - 9 1,2 1,27591

4 - 10 *-1,8 1,27591

4 - 11 *-4,5 1,00869

5 - 6 *3,7 1,27591

5 - 7 0,6 1,27591

5 - 8 *3,8 1,27591

5 - 9 *6,35 1,27591

5 - 10 *3,35 1,27591

5 - 11 0,65 1,00869

6 - 7 *-3,1 1,27591

6 - 8 0,1 1,27591

6 - 9 *2,65 1,27591

6 - 10 -0,35 1,27591

6 - 11 *-3,05 1,00869

7 - 8 *3,2 1,27591

7 - 9 *5,75 1,27591

7 - 10 *2,75 1,27591

7 - 11 0,05 1,00869

8 - 9 *2,55 1,27591

8 - 10 -0,45 1,27591

8 - 11 *-3,15 1,00869

9 - 10 *-3,0 1,27591

9 - 11 *-5,7 1,00869

10 - 11 *-2,7 1,00869

--------------------------------------------------- -------------------------


c)-CAO-EAA (g EAA %ms)

--------------------------------------------------- --------------------------

Variable: CAO_EAA

Sistema

extractivo Frec. Media Grupos hom ogéneos

--------------------------------------------------- --------------------------

9 2 9,1 X

4 2 9,95 X

6 2 10,15 X

8 2 12,2 X

3 2 13,2 XX

10 2 14,2 XX

5 2 15,45 XX

11 8 15,7625 X

7 2 16,35 X

--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------

3 - 4 *3,25 1,7798

3 - 5 *-2,25 1,7798

3 - 6 *3,05 1,7798

3 - 7 *-3,15 1,7798

3 - 8 1,0 1,7798

3 - 9 *4,1 1,7798

3 - 10 -1,0 1,7798

3 - 11 *-2,5625 1,40705

4 - 5 *-5,5 1,7798

4 - 6 -0,2 1,7798

4 - 7 *-6,4 1,7798

4 - 8 *-2,25 1,7798

4 - 9 0,85 1,7798

4 - 10 *-4,25 1,7798

4 - 11 *-5,8125 1,40705

5 - 6 *5,3 1,7798

5 - 7 -0,9 1,7798

5 - 8 *3,25 1,7798

5 - 9 *6,35 1,7798

5 - 10 1,25 1,7798

5 - 11 -0,3125 1,40705

6 - 7 *-6,2 1,7798

6 - 8 *-2,05 1,7798

6 - 9 1,05 1,7798

6 - 10 *-4,05 1,7798

6 - 11 *-5,6125 1,40705

7 - 8 *4,15 1,7798

7 - 9 *7,25 1,7798

7 - 10 *2,15 1,7798

7 - 11 0,5875 1,40705

8 - 9 *3,1 1,7798

8 - 10 *-2,0 1,7798

8 - 11 *-3,5625 1,40705

9 - 10 *-5,1 1,7798

9 - 11 *-6,6625 1,40705

10 - 11 *-1,5625 1,40705

--------------------------------------------------- --------------------------


d)-CAO-ET (g ET %ms)

--------------------------------------------------- -------------------------

Variable: CAO_ET

Sistema


--------------------------------------------------- -------------------------

9 2 12,8 X

4 2 14,15 X

6 2 14,3 X

8 2 17,2 X

3 2 18,65 XX

10 2 20,0 XX

5 2 21,8 XX

11 8 22,25 X

7 2 23,05 X

--------------------------------------------------- -------------------------


--------------------------------------------------- -------------------------

3 - 4 *4,5 2,58923

3 - 5 *-3,15 2,58923

3 - 6 *4,35 2,58923

3 - 7 *-4,4 2,58923

3 - 8 1,45 2,58923

3 - 9 *5,85 2,58923

3 - 10 -1,35 2,58923

3 - 11 *-3,6 2,04696

4 - 5 *-7,65 2,58923

4 - 6 -0,15 2,58923

4 - 7 *-8,9 2,58923

4 - 8 *-3,05 2,58923

4 - 9 1,35 2,58923

4 - 10 *-5,85 2,58923

4 - 11 *-8,1 2,04696

5 - 6 *7,5 2,58923

5 - 7 -1,25 2,58923

5 - 8 *4,6 2,58923

5 - 9 *9,0 2,58923

5 - 10 1,8 2,58923

5 - 11 -0,45 2,04696

6 - 7 *-8,75 2,58923

6 - 8 *-2,9 2,58923

6 - 9 1,5 2,58923

6 - 10 *-5,7 2,58923

6 - 11 *-7,95 2,04696

7 - 8 *5,85 2,58923

7 - 9 *10,25 2,58923

7 - 10 *3,05 2,58923

7 - 11 0,8 2,04696

8 - 9 *4,4 2,58923

8 - 10 *-2,8 2,58923

8 - 11 *-5,05 2,04696

9 - 10 *-7,2 2,58923

9 - 11 *-9,45 2,04696

10 - 11 *-2,25 2,04696

--------------------------------------------------- -------------------------


e)-CC (g CAF %ms)

--------------------------------------------------- --------------------------

Variable: CC

Sistema


--------------------------------------------------- --------------------------

8 2 0,2955 X

3 2 0,3415 XX

10 2 0,354 XXX

4 2 0,3545 XXX

7 2 0,385 XXX

9 2 0,4105 XXX

6 2 0,42 XX

11 8 0,42025 XX

5 2 0,457 X

--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------

3 - 4 -0,013 0,0653758

3 - 5 *-0,1155 0,0653758

3 - 6 *-0,0785 0,0653758

3 - 7 -0,0435 0,0653758

3 - 8 0,046 0,0653758

3 - 9 *-0,069 0,0653758

3 - 10 -0,0125 0,0653758

3 - 11 *-0,07875 0,0516841

4 - 5 *-0,1025 0,0653758

4 - 6 *-0,0655 0,0653758

4 - 7 -0,0305 0,0653758

4 - 8 0,059 0,0653758

4 - 9 -0,056 0,0653758

4 - 10 0,0005 0,0653758

4 - 11 *-0,06575 0,0516841

5 - 6 0,037 0,0653758

5 - 7 *0,072 0,0653758

5 - 8 *0,1615 0,0653758

5 - 9 0,0465 0,0653758

5 - 10 *0,103 0,0653758

5 - 11 0,03675 0,0516841

6 - 7 0,035 0,0653758

6 - 8 *0,1245 0,0653758

6 - 9 0,0095 0,0653758

6 - 10 *0,066 0,0653758

6 - 11 -0,00025 0,0516841

7 - 8 *0,0895 0,0653758

7 - 9 -0,0255 0,0653758

7 - 10 0,031 0,0653758

7 - 11 -0,03525 0,0516841

8 - 9 *-0,115 0,0653758

8 - 10 -0,0585 0,0653758

8 - 11 *-0,12475 0,0516841

9 - 10 0,0565 0,0653758

9 - 11 -0,00975 0,0516841

10 - 11 *-0,06625 0,0516841

--------------------------------------------------- --------------------------


Gráficos de medias con barras de intervalos de LSD (NC: 95%)

Cuadro C.13. Análisis de regresión no lineal

Variables independientes:

• x1: relación líquido a sólido (g líquido/g sólido seco)

• x2: concentración de etanol (% p/p)

Estimaciones del parámetro inicial: A0=a1=a2=a11=a12=a22=0,1

a)-Variable dependiente: CoPT


--------------------------------------------------- -----------------------

Asintótica 95,0%

Asintótica Intervalos de Confian

Parámetro Estimado Error Estándar Inferior Superi

--------------------------------------------------- -----------------------

A0 -72,5398 21,8926 -118,535 -26,5

a1 22,6242 4,70881 12,7313 32,5

a2 1,39119 0,290072 0,781767 2,000

a11 -1,27668 0,279136 -1,86312 -0,6902

a22 -0,00931755 0,00178647 -0,0130708 -0,00556

a12 -0,075175 0,0281291 -0,134272 -0,01607

--------------------------------------------------- -----------------------


--------------------------------------------------- --


--------------------------------------------------- --

Modelo 31654,8 6 5275 ,8

Residuos 284,848 18 15,82 49

--------------------------------------------------- --

Total 31939,6 24

Total (Corr.) 1391,85 23






Autocorrelación residual Lag 1 = 0,429595


---------------------------------


n 24

MSE 15,8249

MAE 2,66214

MAPE 8,08994

ME -1,52239E-9

MPE -1,08303

b)-Variable dependiente: CPT


--------------------------------------------------- -------------------------

Asintótica 95,0%



--------------------------------------------------- -------------------------

A0 -7,90009 3,85039 -15,9895 0,189301

a1 3,14182 0,828167 1,4019 4,88174

a2 0,292915 0,0510167 0,185733 0,400097

a11 -0,148759 0,0490934 -0,2519 -0,045617

a22 -0,00308474 0,000314198 -0,00374485 -0,00242464

a12 -0,00475 0,00494723 -0,0151438 0,00564377

--------------------------------------------------- -------------------------


--------------------------------------------------- --


--------------------------------------------------- --

Modelo 3035,9 6 505,9 83

Residuos 8,81104 18 0,4895 02

--------------------------------------------------- --

Total 3044,71 24

Total (Corr.) 103,19 23








---------------------------------


n 24

MSE 0,489502

MAE 0,490352

MAPE 4,44619

ME -2,92232E-10

MPE -0,265535

c)-Variable dependiente: CAO-ET


--------------------------------------------------- -------------------------

Asintótica 95,0%



--------------------------------------------------- -------------------------

A0 -17,9844 7,4789 -33,697 -2,27176

a1 6,7751 1,60861 3,39553 10,1547

a2 0,52074 0,0990935 0,312552 0,728928

a11 -0,331323 0,0953577 -0,531663 -0,130984

a22 -0,0051183 0,000610289 -0,00640048 -0,00383613

a12 -0,015 0,00960937 -0,0351886 0,00518859

--------------------------------------------------- -------------------------


--------------------------------------------------- --


--------------------------------------------------- --

Modelo 9186,91 6 1531, 15

Residuos 33,2424 18 1,84 68

--------------------------------------------------- --

Total 9220,15 24

Total (Corr.) 330,5 23








---------------------------------


n 24

MSE 1,8468

MAE 0,908939

MAPE 4,88052

ME -5,07228E-10

MPE -0,34309

d)-Variable dependiente: CAO-EAA


--------------------------------------------------- -------------------------

Asintótica 95,0%



--------------------------------------------------- -------------------------

A0 -12,6333 5,20803 -23,575 -1,69161

a1 4,79299 1,12018 2,43958 7,1464

a2 0,364721 0,069005 0,219746 0,509696

a11 -0,235006 0,0664035 -0,374515 -0,0954971

a22 -0,00361661 0,000424983 -0,00450947 -0,00272375

a12 -0,01025 0,00669161 -0,0243086 0,00380858

--------------------------------------------------- -------------------------


--------------------------------------------------- --


--------------------------------------------------- --

Modelo 4613,15 6 768,8 58

Residuos 16,12 18 0,8955 53

--------------------------------------------------- --

Total 4629,27 24

Total (Corr.) 165,716 23








---------------------------------


n 24

MSE 0,895553

MAE 0,633139

MAPE 4,81589

ME -3,87948E-10

MPE -0,33179

e)-Variable dependiente: CC


--------------------------------------------------- -------------------------

Asintótica 95,0%



--------------------------------------------------- -------------------------

A0 -0,404449 0,191104 -0,805944 -0,00295374

a1 0,159975 0,0411038 0,0736192 0,246331

a2 0,00402778 0,00253208 -0,00129193 0,00934748

a11 -0,00801365 0,00243662 -0,0131328 -0,00289449

a22 -0,0000174862 0,0000155943 -0 ,0000502488 0,0000152763

a12 -0,00025 0,000245542 - 0,000765866 0,000265867

--------------------------------------------------- -------------------------


--------------------------------------------------- --


--------------------------------------------------- --

Modelo 3,71911 6 0,6198 52

Residuos 0,0217048 18 0,001205 82

--------------------------------------------------- --

Total 3,74082 24

Total (Corr.) 0,0607178 23








---------------------------------


n 24

MSE 0,00120582

MAE 0,0230383

MAPE 5,89603

ME -1,14717E-10

MPE -0,569322

ANEXO 4

Cuadro D.1. Datos del ácido clorogénico como patrón estándar y análisis de regresión lineal

Concentración (µg/mL) Lecturas

Absorbancia (765nm)

0 1 0,005 0 2 0,005 0 1 0,005 0 2 0,004

10 1 0,085 10 2 0,087 20 1 0,154 20 2 0,152 30 1 0,219 30 2 0,219 40 1 0,281 40 2 0,284 50 1 0,345 50 2 0,345

Análisis de Regresión - Modelo Lineal Y = a + b*X-M uestras: polvos-secadero spray

--------------------------------------------------- --------------------------

Variable dependiente: Absorbancia (765nm)

Variable independiente: concentración de ácido clor ogénico (ug/mL)

--------------------------------------------------- --------------------------

Error Estadíst ico


--------------------------------------------------- --------------------------

Ordenada 0,0104063 0,00250443 4,15 513 0,0013

Pendiente 0,00681438 0,0000893464 76,2 692 0,0000

--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------


--------------------------------------------------- --------------------------

Modelo 0,212278 1 0,2122 78 5816,98 0,0000

Residuo 0,000437913 12 0,00003649 27

--------------------------------------------------- --------------------------

Total (Corr.) 0,212715 13



R-cuadrado (ajustado para g.l.) = 99,777 porcentaje





Nota D.1. Modo de cálculo de CPT para experiencias de secado

Ejemplo para calcular CPTP correspondientes al polvo S1:

Ejemplo para calcular CPTP* correspondientes al polvo S2:

Cuadro D.2. Datos crudos de contenido de polifenoles totales de los polvos -Experiencia de secado

Polvo CH w E L Abs µg EAC CPTP SS*

Sólidos de YM CPTP*

s1 7,7 0,5008 a 1 0,243 34,21 37,00 23,05 91,11 40,61 s1 7,7 0,5008 a 2 0,249 35,09 37,95 23,05 91,11 41,66 s1 7,7 0,5003 b 1 0,249 35,09 37,99 23,05 91,11 41,70 s1 7,7 0,5003 b 2 0,252 35,53 38,47 23,05 91,11 42,23 s2 7,03 0,5016 a 1 0,194 27,00 28,95 33,05 63,54 45,56 s2 7,03 0,5016 a 2 0,194 27,00 28,95 33,05 63,54 45,56 s2 7,03 0,5005 b 1 0,195 27,15 29,17 33,05 63,54 45,91 s2 7,03 0,5005 b 2 0,201 28,03 30,12 33,05 63,54 47,40 s3 3,66 0,5008 a 1 0,261 36,85 38,19 23,05 91,11 41,92 s3 3,66 0,5008 a 2 0,269 38,03 39,41 23,05 91,11 43,26 s3 3,66 0,5048 b 1 0,268 37,88 38,95 23,05 91,11 42,75 s3 3,66 0,5048 b 2 0,267 37,74 38,80 23,05 91,11 42,58 s4 4,45 0,5014 a 1 0,198 27,59 28,79 33,05 63,54 45,31 s4 4,45 0,5014 a 2 0,199 27,74 28,95 33,05 63,54 45,56 s4 4,45 0,5048 b 1 0,201 28,03 29,06 33,05 63,54 45,73 s4 4,45 0,5048 b 2 0,199 27,74 28,75 33,05 63,54 45,25 s5 3,16 0,5016 a 1 0,239 33,62 34,60 28,05 74,87 46,22 s5 3,16 0,5016 a 2 0,241 33,91 34,91 28,05 74,87 46,63 s5 3,16 0,5072 b 1 0,235 33,03 33,62 28,05 74,87 44,91 s5 3,16 0,5072 b 2 0,237 33,32 33,92 28,05 74,87 45,31 s6 10,59 0,5037 a 1 0,209 29,21 32,43 28,05 74,87 43,31 s6 10,59 0,5037 a 2 0,21 29,35 32,59 28,05 74,87 43,53 s6 10,59 0,5014 b 1 0,221 30,97 34,54 28,05 74,87 46,14 s6 10,59 0,5014 b 2 0,22 30,82 34,38 28,05 74,87 45,92 s7 7,09 0,5072 a 1 0,189 26,26 27,87 35,10 59,83 46,58 s7 7,09 0,5072 a 2 0,187 25,97 27,56 35,10 59,83 46,06 s7 7,09 0,5059 b 1 0,193 26,85 28,57 35,10 59,83 47,74 s7 7,09 0,5059 b 2 0,194 27,00 28,72 35,10 59,83 48,01 s8 4,02 0,5054 a 1 0,307 43,62 44,96 21,00 100,00 44,96 s8 4,02 0,5054 a 2 0,308 43,76 45,11 21,00 100,00 45,11 s8 4,02 0,5045 b 1 0,303 43,03 44,43 21,00 100,00 44,43 s8 4,02 0,5045 b 2 0,303 43,03 44,43 21,00 100,00 44,43 s9 3,57 0,5048 a 1 0,238 33,47 34,38 28,05 74,87 45,92 s9 3,57 0,5048 a 2 0,237 33,32 34,23 28,05 74,87 45,72 s9 3,57 0,5064 b 1 0,236 33,18 33,97 28,05 74,87 45,37 s9 3,57 0,5064 b 2 0,236 33,18 33,97 28,05 74,87 45,37 s10 3,45 0,5018 a 1 0,233 32,74 33,78 28,05 74,87 45,12 s10 3,45 0,5018 a 2 0,233 32,74 33,78 28,05 74,87 45,12 s10 3,45 0,5023 b 1 0,231 32,44 33,45 28,05 74,87 44,68 s10 3,45 0,5023 b 2 0,232 32,59 33,60 28,05 74,87 44,88 s11 5,64 0,508 a 1 0,229 32,15 33,53 28,05 74,87 44,79 s11 5,64 0,508 a 2 0,227 31,85 33,23 28,05 74,87 44,38 s11 5,64 0,5041 b 1 0,229 32,15 33,79 28,05 74,87 45,14 s11 5,64 0,5041 b 2 0,231 32,44 34,10 28,05 74,87 45,55 s12 4,29 0,5054 a 1 0,236 33,18 34,29 28,05 74,87 45,81 s12 4,29 0,5054 a 2 0,237 33,32 34,45 28,05 74,87 46,01 Continúa

Continuación s12 4,29 0,5025 b 1 0,234 32,88 34,19 28,05 74,87 45,66 s12 4,29 0,5025 b 2 0,235 33,03 34,34 28,05 74,87 45,87 s13 3,62 0,5076 a 1 0,233 32,74 33,46 28,05 74,87 44,69 s13 3,62 0,5076 a 2 0,237 33,32 34,06 28,05 74,87 45,49 s13 3,62 0,5071 b 1 0,235 33,03 33,79 28,05 74,87 45,13 s13 3,62 0,5071 b 2 0,234 32,88 33,64 28,05 74,87 44,93 w: peso de la muestra (g); CH: contenido de humedad (%bh); E: extracto; L: N° de lectura; Abs: absorbancia; CPTP: contenido de polifenoles totales (g EAC %ms); SS*: sólidos solubles totales YM: sólidos de yerba mate; CPTP*: contenido de polifenoles totales libre de maltodextrina (g EAC %ms lm)

Cuadro D.3. Resúmen de datos de contenido de polifenoles totales de los polvos

CPTP*

(g EAC %ms lm) CPTP

(%EAC %ms) Muestra Replica Media Error Estándar Media Error Estándar

s1 2 41,6 0,42 37,9 0,38

s2 2 46,1 0,55 29,3 0,35

s3 2 42,6 0,04 38,8 0,04

s4 2 45,5 0,03 28,9 0,02

s5 2 45,8 0,66 34,3 0,49

s6 2 44,7 1,31 33,5 0,98

s7 2 47,1 0,78 28,2 0,47

s8 2 44,7 0,30 44,7 0,30

s9 2 45,6 0,23 34,1 0,17

s10 2 45,0 0,17 33,7 0,13

s11 2 45,0 0,38 33,7 0,28

s12 2 45,8 0,07 34,3 0,05

s13 2 45,1 0,03 33,7 0,02

Nota D.2. Modo de cálculo de la capacidad antioxidante

Ejemplo de cálculo de CAO (g Epatrón % ms)

Ejemplo de cálculo de CAO* (g Epatrón %ms lm)

Cuadro D.4. Datos crudos de capacidad antioxidante de los polvos -Experiencia de secado

Polvo CH (%bh) W D

dilución 1:x E L

Absorbancia Concentración del DPPH

%R µgEAA µg-ET A0 A120 C0 C120

s1 7,7 0,5008 50 25 a 1 1,079 0,310 104,88 30,22 28,82 17,88 25,38

s1 7,7 0,5008 50 25 a 2 1,079 0,299 104,88 29,16 27,80 18,14 25,75

s1 7,7 0,5032 50 25 b 1 1,079 0,305 104,88 29,74 28,35 18,00 25,55

s1 7,7 0,5032 50 25 b 2 1,079 0,307 104,88 29,93 28,54 17,95 25,48

s2 7,03 0,5041 50 25 a 1 1,079 0,460 104,88 44,79 42,70 14,39 20,36

s2 7,03 0,5041 50 25 a 2 1,079 0,435 104,88 42,36 40,39 14,97 21,20

s2 7,03 0,5047 50 25 b 1 1,079 0,454 104,88 44,20 42,15 14,53 20,56

s2 7,03 0,5047 50 25 b 2 1,079 0,461 104,88 44,88 42,79 14,37 20,33

s3 3,66 0,5029 50 25 a 1 1,079 0,284 104,88 27,70 26,41 18,49 26,25

s3 3,66 0,5029 50 25 a 2 1,079 0,268 104,88 26,15 24,93 18,86 26,78

s3 3,66 0,5058 50 25 b 1 1,079 0,303 104,88 29,54 28,17 18,04 25,61

s3 3,66 0,5058 50 25 b 2 1,079 0,299 104,88 29,16 27,80 18,14 25,75

s4 4,45 0,5030 50 25 a 1 1,079 0,464 104,88 45,17 43,07 14,30 20,23

s4 4,45 0,5030 50 25 a 2 1,079 0,461 104,88 44,88 42,79 14,37 20,33

s4 4,45 0,5036 50 25 b 1 1,079 0,473 104,88 46,05 43,90 14,09 19,93

s4 4,45 0,5036 50 25 b 2 1,079 0,469 104,88 45,66 43,53 14,18 20,06

s5 3,16 0,5041 50 25 a 1 1,079 0,353 104,88 34,40 32,80 16,88 23,94

s5 3,16 0,5041 50 25 a 2 1,079 0,359 104,88 34,98 33,35 16,74 23,74

s5 3,16 0,5071 50 25 b 1 1,079 0,332 104,88 32,36 30,85 17,37 24,64

s5 3,16 0,5071 50 25 b 2 1,079 0,321 104,88 31,29 29,83 17,63 25,01

s6 10,59 0,5030 50 25 a 1 1,079 0,404 104,88 39,35 37,52 15,69 22,24

s6 10,59 0,5030 50 25 a 2 1,079 0,399 104,88 38,86 37,05 15,81 22,40

s6 10,59 0,5056 50 25 b 1 1,079 0,385 104,88 37,50 35,76 16,14 22,87

s6 10,59 0,5056 50 25 b 2 1,079 0,380 104,88 37,02 35,30 16,25 23,04

s7 7,09 0,5097 50 25 a 1 1,079 0,458 104,88 44,59 42,52 14,44 20,43

s7 7,09 0,5097 50 25 a 2 1,079 0,462 104,88 44,98 42,89 14,35 20,30

s7 7,09 0,5055 50 25 b 1 1,079 0,482 104,88 46,92 44,74 13,88 19,63

s7 7,09 0,5055 50 25 b 2 1,079 0,485 104,88 47,21 45,02 13,81 19,53

s8 4,02 0,5032 50 25 a 1 1,087 0,225 105,66 21,97 20,79 19,90 28,28

s8 4,02 0,5032 50 25 a 2 1,087 0,205 105,66 20,03 18,96 20,36 28,94

s8 4,02 0,5020 50 25 b 1 1,087 0,234 105,66 22,84 21,62 19,69 27,98

s8 4,02 0,5020 50 25 b 2 1,087 0,228 105,66 22,26 21,07 19,83 28,18

s9 3,57 0,5042 50 25 a 1 1,087 0,403 105,66 39,25 37,15 15,79 22,37

s9 3,57 0,5042 50 25 a 2 1,087 0,426 105,66 41,49 39,26 15,26 21,60

s9 3,57 0,5012 50 25 b 1 1,087 0,371 105,66 36,15 34,21 16,53 23,43

s9 3,57 0,5012 50 25 b 2 1,087 0,349 105,66 34,01 32,19 17,03 24,16

s10 3,45 0,5041 50 25 a 1 1,087 0,376 105,66 36,63 34,67 16,41 23,26

s10 3,45 0,5041 50 25 a 2 1,087 0,383 105,66 37,31 35,31 16,25 23,03

s10 3,45 0,5050 50 25 b 1 1,087 0,418 105,66 40,71 38,53 15,44 21,87

s10 3,45 0,5050 50 25 b 2 1,087 0,381 105,66 37,12 35,13 16,30 23,10

s11 5,64 0,5064 50 25 a 1 1,087 0,409 105,66 39,83 37,70 15,65 22,17

s11 5,64 0,5064 50 25 a 2 1,087 0,399 105,66 38,86 36,78 15,88 22,50

s11 5,64 0,5027 50 25 b 1 1,087 0,370 105,66 36,05 34,12 16,55 23,46

s11 5,64 0,5027 50 25 b 2 1,087 0,386 105,66 37,60 35,59 16,18 22,93

s12 4,29 0,5046 50 25 a 1 1,087 0,339 105,66 33,04 31,27 17,26 24,49

s12 4,29 0,5046 50 25 a 2 1,087 0,357 105,66 34,79 32,92 16,85 23,90

s12 4,29 0,5023 50 25 b 1 1,087 0,350 105,66 34,11 32,28 17,01 24,13

Continúa

Continuación

s12 4,29 0,5023 50 25 b 2 1,087 0,358 105,66 34,88 33,01 16,83 23,86

s13 3,62 0,5086 50 25 a 1 1,087 0,350 105,66 34,11 32,28 17,01 24,13

s13 3,62 0,5086 50 25 a 2 1,087 0,348 105,66 33,91 32,10 17,06 24,19

s13 3,62 0,5067 50 25 b 1 1,087 0,347 105,66 33,82 32,00 17,08 24,23

s13 3,62 0,5067 50 25 b 2 1,087 0,355 105,66 34,59 32,74 16,90 23,96 CH: contenido de humedad (%ms), w: peso de la muestra en polvo (g); D: volumen de dilución (mL); A0: absorbancia a tiempo inicial; A120: absorbancia a 120 min; E: extracto; L: N° de lectura; C0: concentración de DPPH a tiempo inicial; C120: concentración de DPPH a 120 min.

Cálculo de capacidad antioxidante por 100 g de sólidos de yerba mate secos (libres de maltodextrina)

Polvo CAO

Sólidos de YM %ms CAO*

g EAA %ms g ET %ms g EAA %ms lm g ET %ms lm

s1 48,35 68,63 91,11 53,07 75,33 s1 49,05 69,63 91,11 53,83 76,42 s1 48,44 68,75 91,11 53,16 75,47 s1 48,31 68,57 91,11 53,03 75,27 s2 38,39 54,31 63,54 60,42 85,47 s2 39,94 56,54 63,54 62,86 88,98 s2 38,71 54,78 63,54 60,93 86,21 s2 38,28 54,16 63,54 60,25 85,23 s3 47,69 67,72 91,11 52,35 74,33 s3 48,65 69,10 91,11 53,40 75,85 s3 46,29 65,70 91,11 50,80 72,12 s3 46,52 66,05 91,11 51,07 72,50 s4 37,19 52,61 63,54 58,53 82,80 s4 37,37 52,87 63,54 58,82 83,21 s4 36,60 51,77 63,54 57,61 81,47 s4 36,84 52,11 63,54 57,99 82,02 s5 43,22 61,30 74,87 57,74 81,88 s5 42,87 60,79 74,87 57,26 81,20 s5 44,21 62,73 74,87 59,05 83,79 s5 44,86 63,67 74,87 59,92 85,04 s6 43,62 61,80 74,87 58,27 82,55 s6 43,95 62,27 74,87 58,70 83,17 s6 44,62 63,24 74,87 59,60 84,47 s6 44,94 63,70 74,87 60,03 85,09 s7 38,11 53,92 59,83 63,70 90,13 s7 37,87 53,57 59,83 63,29 89,54 s7 36,94 52,24 59,83 61,75 87,31 s7 36,76 51,97 59,83 61,44 86,86 s8 51,49 73,19 100,00 51,49 73,19 s8 52,69 74,91 100,00 52,69 74,91 s8 51,08 72,59 100,00 51,08 72,59 s8 51,44 73,10 100,00 51,44 73,10 s9 40,59 57,51 74,87 54,21 76,81

Continúa

Continuación s9 39,22 55,54 74,87 Eliminado eliminado s9 42,74 60,60 74,87 57,09 80,94 s9 44,06 62,49 74,87 58,85 83,47 s10 42,15 59,75 74,87 56,30 79,81 s10 41,73 59,15 74,87 55,74 79,01 s10 39,59 56,07 74,87 Eliminado eliminado s10 41,78 59,22 74,87 55,80 79,10 s11 40,94 57,99 74,87 54,68 77,46 s11 41,54 58,86 74,87 55,49 78,62 s11 43,61 61,83 74,87 58,25 82,59 s11 42,64 60,43 74,87 56,95 80,72 s12 44,69 63,39 74,87 59,69 84,68 s12 43,61 61,85 74,87 58,25 82,61 s12 44,23 62,74 74,87 59,08 83,80 s12 43,75 62,04 74,87 58,44 82,87 s13 43,38 61,53 74,87 57,94 82,18 s13 43,50 61,70 74,87 58,10 82,41 s13 43,72 62,01 74,87 58,39 82,83 s13 43,25 61,33 74,87 57,76 81,92

Cuadro D.5. Resumen de datos de Capacidad Antioxidante de los polvos

Mues-tra

Recu-ento

CAO CAO*

(g EAA %ms) (g ET %ms) (g EAA %ms lm) (g ET %ms lm)

Media Error Standard Media

Error Standard Media

Error Standard Media

Error Standard

s1 2 48,5 0,16 68,9 0,24 53,27 0,18 75,62 0,25

s2 2 38,8 0,34 54,9 0,48 61,11 0,52 86,47 0,75

s3 2 47,3 0,88 67,1 1,27 51,90 0,97 73,70 1,39

s4 2 37,0 0,28 52,3 0,40 58,24 0,44 82,37 0,63

s5 2 43,8 0,75 62,1 1,08 58,49 0,99 82,98 1,43

s6 2 44,3 0,50 62,8 0,72 59,15 0,66 83,82 0,96

s7 2 37,4 0,57 52,9 0,82 62,54 0,95 88,46 1,37

s8 2 51,7 0,42 73,4 0,60 51,67 0,41 73,44 0,60

s9 2 42,0 1,41 59,5 2,02 56,09 1,88 79,51 2,69

s10 2 41,9 0,08 59,3 0,12 55,91 0,11 79,25 0,15

s11 2 42,2 0,94 59,8 1,35 56,34 1,26 79,85 1,80

s12 2 44,1 0,08 62,5 0,12 58,86 0,10 83,49 0,15

s13 2 43,5 0,02 61,6 0,03 58,05 0,03 82,33 0,04

Cuadro D.6. Datos crudos de Solubilidad de los polvos (a 25°C)-Experiencia de secado

Polvo Muestra Peso(g bh) Humedad Peso seco (g) Peso Crisol (PC) PC + Ms 105 Solubilidad Solubilidad (%) S1 1 2,0044 7,7046 1,8500 49,8928 50,7555 0,93 93,3

S1 2 2,0000 7,7046 1,8459 49,5829 - - -

S2 1 2,0034 7,0332 1,8625 49,4009 50,2983 0,96 96,4

S2 2 2,0004 7,0332 1,8597 48,0119 48,9181 0,97 97,5

S3 1 1,9993 3,6600 1,9261 46,5868 47,4935 0,94 94,1

S3 2 2,0042 3,6600 1,9308 48,2963 49,1991 0,94 93,5

S4 1 2,0001 4,4464 1,9112 46,6348 47,5219 0,93 92,8

S4 2 2,0007 4,4464 1,9117 43,8294 44,7381 0,95 95,1

S5 1 1,9992 3,1565 1,9361 44,9031 45,8158 0,94 94,3

S5 2 1,9993 3,1565 1,9362 48,3078 49,2538 0,98 97,7

S6 1 2,0006 10,5904 1,7887 49,0666 49,9289 0,96 96,4

S6 2 1,9994 10,5904 1,7877 50,2593 51,1247 0,97 96,8

S7 1 1,9992 7,0950 1,8574 50,3065 51,1866 0,95 94,8

S7 2 2,0000 7,0950 1,8581 50,4392 51,3291 0,96 95,8

S8 1 2,0022 0,0000 2,0022 48,2643 49,1758 0,91 91,0

S8 2 2,0005 0,0000 2,0005 49,0365 49,9451 0,91 90,8

S9 1 2,0028 3,5692 1,9313 48,3000 49,2243 0,96 95,7

S9 2 1,9984 3,5692 1,9271 48,7960 49,7141 0,95 95,3

S10 1 2,0016 3,4512 1,9325 47,3342 48,2445 0,94 94,2

S10 2 1,9974 3,4512 1,9285 50,0112 50,9191 0,94 94,2

S11 1 2,0015 5,6436 1,8885 46,3384 47,2385 0,95 95,3

S11 2 2,0007 5,6436 1,8878 51,4424 52,3336 0,94 94,4 S12 1 1,9967 4,2929 1,9110 48,2906 - - -

S12 2 2,0032 4,2929 1,9172 49,4848 50,3589 0,91 91,2

S13 1 2,0018 3,6228 1,9293 48,5115 49,4185 0,94 94,0

S13 2 1,9999 3,6228 1,9274 50,0592 50,9738 0,95 94,9

Cuadro D.7. Resumen de datos de solubilidad de los polvos

Solubilidad (S; %)

Muestra Réplica Media Error Standard

S1 1 93 0,00 S2 2 97 0,55 S3 2 94 0,30 S4 2 94 1,15 S5 2 96 1,70 S6 2 97 0,20 S7 2 95 0,50 S8 2 91 0,10 S9 2 96 0,20 S10 2 94 0,00 S11 2 95 0,45 S13 2 94 0,45 S9-13 (promediado) 95 0,48

Cuadro D.8. Datos usados para el análisis de superficie de respuesta (con variables independientes codificadas)

Polvo x1 x2 CPTP CAO-EAA CAO-ET S s1 -1 -1 37,90 48,5 68,9 93,3

s2 -1 1 29,30 38,8 54,9 97,0

s3 1 -1 38,80 47,3 67,1 93,8

s4 1 1 28,90 37,0 52,3 94,0

s5 1,41 0 34,30 43,8 62,1 96,0

s6 -1,41 0 33,50 44,3 62,8 96,6

s7 0 1,41 28,20 37,4 52,9 95,3

s8 0 -1,41 44,70 51,7 73,4 90,9

s9 0 0 34,14 42,0 59,5 95,5

s10 0 0 33,65 42,0 59,5 94,2

s11 0 0 33,66 42,2 59,8 94,9

s12 0 0 34,32 44,1 62,5 94,5

s13 0 0 33,74 43,5 61,6 --

Cuadro D.9. Análisis de superficie de respuesta

Variables: a)- variable dependiente: contenido de polefenoles totales de los polvos (CPTP; g EAC %ms); b)- variable dependiente: capacidad antioxidante (CAO-EAA; g EAA %ms); c)- variable dependiente: capacidad antioxidante (CAO-ET; gET %ms); d)- variable dependiente: Solubilidad (S; %).

a)- variable dependiente: contenido de polefenoles totales de los polvos (CPTP; g EAC %ms)

Regresión No líneal

-------------------

Variable dependiente: CPTP

Variables independientes:

x1

x2

Función a estimar: A0+a1*x1+a2*x2+a11*x1^2+a22*x2^2+ a12*x1*x2


A0 = 0,1

a1 = 0,1

a2 = 0,1

a11 = 0,1

a22 = 0,1

a12 = 0,1


La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos.




---------------------------------------------------- ------------------------

Asintótica 95,0%



---------------------------------------------------- ------------------------

A0 33,9075 0,4674 32,8022 35,0127

a1 0,204107 0,370066 -0,670961 1,07918

a2 -5,2362 0,370066 -6,11127 -4,36113

a11 -0,370328 0,397958 -1,31135 0,570695

a22 0,912304 0,397958 -0,0287192 1,85333

a12 -0,325 0,522573 -1,56069 0,910691

---------------------------------------------------- ------------------------


---------------------------------------------------- -

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Me dio

---------------------------------------------------- -

Modelo 15467,8 6 2577,9 6

Residuos 7,6463 7 1,0923 3

---------------------------------------------------- -

Total 15475,4 13

Total (Corr.) 234,492 12


R-Cuadrado (adaptado para g.l.) = 94,4101 porcentaje






---------------------------------


n 13

MSE 1,09233

MAE 0,568978

MAPE 1,5343

ME 3,98003E-8

MPE -0,0350083

b)- variable dependiente: capacidad antioxidante (CAO-EAA; g EAA %ms)


-------------------

Variable dependiente: CAO (gEAA %ms)

Variables independientes (CODIFICADAS): x1; x2

Función a estimar: A0+a1*x1+a2*x2+a11*x1^2+a22*x2^2 +a12*x1*x2

Estimaciones del parámetro inicial: A0 = 0,1=a1=a2 =a11=a22=a12=0,1


La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de




--------------------------------------------------- ------------------------

Asintótica 95,0%

Asintótica Intervalos de Confianz

Parámetro Estimado Error Estándar Inferior Superio

--------------------------------------------------- ------------------------

A0 42,7634 0,490596 41,6033 43,923

a1 -0,464507 0,388431 -1,383 0,45398

a2 -5,03536 0,388431 -5,95385 -4,1168

a11 0,292772 0,417707 -0,694951 1,280

a22 0,544268 0,417707 -0,443455 1,5319

a12 -0,15 0,548507 -1,44702 1,1470

--------------------------------------------------- ------------------------


--------------------------------------------------- --


--------------------------------------------------- --

Modelo 24554,0 6 4092, 34

Residuos 8,42406 7 1,203 44

--------------------------------------------------- --

Total 24562,5 13

Total (Corr.) 214,863 12








---------------------------------


n 13

MSE 1,20344

MAE 0,75256

MAPE 1,74987

ME 5,00924E-8

MPE -0,0354625

c)- variable dependiente: capacidad antioxidante (CAO-ET; gET %ms)

Variable dependiente: CAO (gET %ms)

Variables independientes: x1; x2


Estimaciones del parámetro inicial: A0=a1=a2=a11=a2 2=a12=0,1


La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados




--------------------------------------------------- ----------------------

Asintótica 95,0%

Asintótica Intervalos de Confia

Parámetro Estimado Error Estándar Inferior Super

--------------------------------------------------- ----------------------

A0 60,5848 0,700658 58,928 62,2

a1 -0,675384 0,554749 -1,98716 0,636

a2 -7,23465 0,554749 -8,54642 -5,92

a11 0,431868 0,59656 -0,978777 1,84

a22 0,783963 0,59656 -0,626682 2,19

a12 -0,2 0,783365 -2,05237 1,65

--------------------------------------------------- ----------------------


--------------------------------------------------- --


--------------------------------------------------- --

Modelo 49325,3 6 8220, 88

Residuos 17,1825 7 2,454 64

--------------------------------------------------- --

Total 49342,5 13

Total (Corr.) 443,468 12








---------------------------------


n 13

MSE 2,45464

MAE 1,07029

MAPE 1,75854

ME 7,09433E-8

MPE -0,0361757

d)- variable dependiente: Solubilidad (S; %)


-------------------

Variable dependiente: S (%)

Variables independientes: x1; x2


Estimaciones del parámetro inicial: A0=a1=a2=a11=a1 2=a22=0,1


La estimación se detuvo debido a la convergencia de las estimaciones del parámetro.




--------------------------------------------------- -------------------------

Asintótica 95,0%



--------------------------------------------------- -------------------------

A0 94,7755 0,29083 94,0639 95,4872

a1 -0,419498 0,205956 -0,923456 0,0844595

a2 1,26677 0,205956 0,762811 1,77073

a11 0,722906 0,230884 0,157953 1,28786

a22 -0,886671 0,230884 -1,45162 -0,321718

a12 -0,875 0,290832 -1,58664 -0,163357

--------------------------------------------------- -------------------------


--------------------------------------------------- --


--------------------------------------------------- --

Modelo 107569,0 6 17928 ,2

Residuos 2,03 6 0,3383 33

--------------------------------------------------- --

Total 107571,0 12

Total (Corr.) 29,6067 11








---------------------------------


n 12

MSE 0,338333

MAE 0,356562

MAPE 0,376964

ME 1,52381E-7

MPE -0,00193406

Cuadro D.10. Estimación de errores del análisis de superficie de respuesta Para: a)- variable dependiente: contenido de polefenoles totales de los polvos (CPTP; g EAC %ms); b)- variable dependiente: capacidad antioxidante (CAO-EAA; g EAA %ms); c)- variable dependiente: capacidad antioxidante (CAO-ET; gET %ms); d)- variable dependiente: Solubilidad (S; %)

a)- variable dependiente: contenido de polefenoles totales de los polvos (CPTP; g EAC %ms)

CPTP Ypred Ypred-Yexp (Ypred-Yexp)2 ABS(YpreYexp)/Yexp (Yexp-Yprom)2

39,2 1,30 1,69 0,03 13,1

29,3 0,03 0,00 0,00 24,4

40,2 1,37 1,89 0,04 21,2

29,1 0,20 0,04 0,01 28,6

33,5 -0,81 0,65 0,02 0,0

32,9 -0,60 0,36 0,02 0,6

28,3 0,15 0,02 0,01 36,6

43,1 -1,63 2,66 0,04 110,2

33,9 -0,23 0,05 0,01 0,0

33,9 0,25 0,06 0,01 0,3

33,9 0,24 0,06 0,01 0,3

33,9 -0,41 0,17 0,01 0,0

33,9 0,17 0,03 0,00 0,2

sumatorias 0,05 7,70 0,20 235,57

Np=6 N: número de datos exp 13

R2 0,967

χ2 1,099

RMSE 0,769

MPE 1,537

b)- variable dependiente: capacidad antioxidante (CAO-EAA; g EAA %ms)

CAO-EAA

Ypred Ypred-Yexp (Ypred-Yexp)2 ABS(Ypre-Yexp)/Yexp (Yexp-Yprom)2

49,0 0,41 0,17 0,01 27,8

39,2 0,35 0,12 0,01 19,7

48,3 1,03 1,07 0,02 16,2

38,0 0,95 0,90 0,03 39,3

42,7 -1,10 1,21 0,03 0,3

44,0 -0,28 0,08 0,01 1,0

36,7 -0,67 0,45 0,02 34,2

50,9 -0,73 0,53 0,01 70,7

42,8 0,77 0,59 0,02 1,6

42,8 0,81 0,66 0,02 1,7

42,8 0,58 0,34 0,01 1,2

42,8 -1,31 1,71 0,03 0,6

42,8 -0,70 0,49 0,02 0,0

Sumatorias 0,12 8,32 0,23 214,30


R2 0,961

χ2 1,189

RMSE 0,800

MPE 1,737

c)- variable dependiente: capacidad antioxidante (CAO-ET; gET %ms)

CAO-ET

Ypred Ypred-Yexp (Ypred-Yexp)2 ABS(Ypre-Yexp)/Yexp (Yexp-Yprom)2

69,5 0,62 0,38 0,01 57,0

55,4 0,49 0,24 0,01 40,9

68,6 1,42 2,01 0,02 33,6

53,7 1,35 1,82 0,03 81,1

60,5 -1,63 2,66 0,03 0,6

62,4 -0,36 0,13 0,01 2,0

51,9 -0,98 0,97 0,02 70,9

72,3 -1,10 1,22 0,02 146,5

60,6 1,06 1,12 0,02 3,3

60,6 1,12 1,25 0,02 3,5

60,6 0,81 0,65 0,01 2,5

60,6 -1,92 3,69 0,03 1,3

60,6 -1,06 1,12 0,02 0,1

sumatorias -0,19 17,25 0,23 443,30


R2 0,961

χ2 2,464

RMSE 1,152

MPE 1,756

d)- variable dependiente: Solubilidad (S; %)

S Ypred Ypred-Yexp (Ypred-Yexp)2 ABS(Ypre-Yexp)/Yexp (Yexp-Yprom)2

92,9 -0,41 0,17 0,00 1,8

97,2 0,22 0,05 0,00 5,3

93,8 0,00 0,00 0,00 0,7

94,6 0,63 0,40 0,01 0,5

95,6 -0,38 0,14 0,00 1,8

96,8 0,20 0,04 0,00 3,8

94,8 -0,50 0,25 0,01 0,4

91,2 0,33 0,11 0,00 14,1

94,8 -0,72 0,52 0,01 0,7

94,8 0,58 0,33 0,01 0,2

94,8 -0,07 0,01 0,00 0,0

94,8 0,33 0,11 0,00 0,0

sumatorias 0,20 2,13 0,05 29,44


R2 0,92762222

χ2 0,35513363

RMSE 0,42138678

MPE 0,38576537

Cuadro D.11. Datos crudos de determinación de humedad (CH, %bh)

Muestra NºCrisol Peso Crisol Crisol + Mh Crisol + Ms Peso Mh Peso Ms CH (%bh)

S1 29 19,0094 21,0153 20,8608 2,0059 1,8514 7,7023

21 18,9833 20,9893 20,8347 2,0060 1,8514 7,7069

S2 22 18,6367 20,6370 20,4961 2,0003 1,8594 7,0439

23 18,1001 20,1008 19,9603 2,0007 1,8602 7,0225

S3 28 19,2766 21,2726 21,1982 1,9960 1,9216 3,7275

27 19,1006 21,1075 21,0354 2,0069 1,9348 3,5926

S4 859 36,3850 38,3806 38,2934 1,9956 1,9084 4,3696

860 37,5366 39,5352 39,4448 1,9986 1,9082 4,5232

S5 815 36,9073 38,9037 38,8408 1,9964 1,9335 3,1507

24 18,2105 20,2185 20,1550 2,0080 1,9445 3,1624

S6 21 18,9826 20,4032 20,2518 1,4206 1,2692 10,6575

27 19,1017 20,5157 20,3669 1,4140 1,2652 10,5233

S7 25 18,5081 20,5064 20,3657 1,9983 1,8576 7,0410

26 19,0716 21,0747 20,9315 2,0031 1,8599 7,1489

S8 842 36,8387 38,8381 38,7574 1,9994 1,9187 4,0362

858 36,3960 38,3956 38,3155 1,9996 1,9195 4,0058

S9 841 36,7338 38,7349 38,6614 2,0011 1,9276 3,6730

852 37,4838 39,4835 39,4142 1,9997 1,9304 3,4655

S10 836 36,4564 38,4583 38,3907 2,0019 1,9343 3,3768

849 38,1236 40,1233 40,0528 1,9997 1,9292 3,5255

S11 828 36,8941 38,8895 38,7777 1,9954 1,8836 5,6029

844 37,0971 39,1044 38,9903 2,0073 1,8932 5,6843

S12 831 36,1797 38,1717 38,0872 1,9920 1,9075 4,2420

816 36,4399 38,4427 38,3557 2,0028 1,9158 4,3439

S13 5 13,5446 14,5162 14,4806 0,9716 0,9360 3,6641

28 19,2768 20,1898 20,1571 0,9130 0,8803 3,5816 Mh: muestra húmeda; Ms: muestra seca; CH: contenido de humedad

Resumen de resultados de la determinación del contenido de humedad (CH, %bh)

Desviación Estándar

Error Estándar NºMuestra Recuento Promedio

S1 2 7,7 0,00325269 0,0023 S2 2 7,03 0,0151321 0,0107 S3 2 3,66 0,0953887 0,06745 S4 2 4,45 0,108612 0,0768 S5 2 3,15 0,00827315 0,00585 S6 2 10,56 0,0948937 0,0671 S7 2 7,09 0,0762968 0,05395 S8 2 4,02 0,021496 0,0152 S9-13 10 4,12 0,865548 0,27371

Cuadro D.12. Datos crudos de determinación de densidad bruta (db; g/mL) Muestra Peso (g) Volumen (mL) Densidad CV %

S1 1,9994 6,9 0,2898 0,8290 S1 1,9998 6,8 0,2941

S1 2,0014 6,9 0,2901 S2 2,0004 5,9 0,3391

1,5746 S2 2,0041 6,1 0,3285 S2 2,0021 6,0 0,3337 S3 2,0008 8,7 0,2300

1,3833 S3 1,9977 8,9 0,2245 S3 1,9994 8,9 0,2247 S4 2,0004 6,3 0,3175

1,4460 S4 2,0054 6,5 0,3085 S4 1,9984 6,4 0,3123 S5 2,0004 7,0 0,2858

1,6661 S5 2,0015 7,0 0,2859 S5 1,9993 7,2 0,2777 S6 1,9986 4,4 0,4542

0,0551 S6 1,9984 4,4 0,4542 S6 2,0004 4,4 0,4546 S7 2,0007 5,7 0,3510

1,7707 S7 2,0010 5,6 0,3573 S7 2,0001 5,5 0,3637

S8/2 1,9999 7,9 0,2532 1,2257 S8/2 2,0009 8,1 0,2470

S8/2 1,9995 8,0 0,2499 S9 1,9976 7,7 0,2594

1,8613 S9 2,0005 8,0 0,2501 S9 2,0030 7,9 0,2535 S10 1,9990 8,0 0,2499

2,5254 S10 2,0008 8,3 0,2411 S10 1,9998 8,4 0,2381 S11 1,9981 8,0 0,2498

1,2612 S11 1,9992 8,1 0,2468 S11 1,9996 7,9 0,2531 S12 1,9969 6,9 0,2894

1,6054 S12 2,0009 7,1 0,2818 S12 1,9967 7,1 0,2812 S13 1,9977 7,3 0,2737

1,4633 S13 2,0022 7,5 0,2670 S13 2,0004 7,5 0,2667

CV(%): coeficiente de variación

Resumen de resultados de la determinación de la densidad (db; g/mL)

X1 X2 Muestra N° replicas Densidad

Media Error Standard 200 2,05 S1 3 0,291 0,001 200 12,05 S2 3 0,334 0,003 240 2,05 S3 3 0,226 0,002 240 12,05 S4 3 0,313 0,003

248,2 7,05 S5 3 0,283 0,003 191,8 7,05 S6 3 0,454 0,000 220 14,10 S7 3 0,357 0,004 220 0,00 S8 3 0,250 0,002 220 7,05 S9 3 0,254 0,003 220 7,05 S10 3 0,243 0,004 220 7,05 S11 3 0,250 0,002 220 7,05 S12 3 0,284 0,003 220 7,05 S13 3 0,269 0,002

s9-13 prom

0,260 0,007

Cuadro D.13. Análisis de correlación entre contenido de humedad (CH) y densidad (db)

MUESTRA N° de replicas db (g/L) CH (%bh) S1 3 0,291 7,7 S2 3 0,334 7,03 S3 3 0,226 3,66 S4 3 0,313 4,45 S5 3 0,283 3,16 S6 3 0,454 10,59 S7 3 0,357 7,09

S8/2 3 0,250 4,02 S9 3 0,254 3,57 S10 3 0,243 3,45 S11 3 0,250 5,64 S12 3 0,284 4,29 S13 3 0,269 3,62

s9-13 prom

0,260 4,114


--------------------------------------------------- ---------------------

Variables: CH (%bh) y db (g/mL)

--------------------------------------------------- ---------------------

Error Estadíst ico


--------------------------------------------------- ---------------------

Ordenada -3,82477 1,73134 -2,20 913 0,0493

Pendiente 30,9853 5,79468 5,3 472 0,0002

--------------------------------------------------- ---------------------


--------------------------------------------------- ---------------------

Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado medio Cociente-F P-

--------------------------------------------------- ---------------------

Modelo 43,2682 1 43,26 82 28,59 0

Residuo 16,646 11 1,513 27

--------------------------------------------------- ---------------------

Total (Corr.) 59,9142 12








Cuadro D.14. Determinación de parámetros de color X1 X2 Polvo Muestra L* a* b* 200 2,05 s1 s1 58,44 -1,13 24,95 200 2,05 s1 s1 58,50 -1,04 24,97 200 2,05 s1 s1 58,56 -1,20 24,98 200 12,05 s2 s2 58,70 -1,30 24,63 200 12,05 s2 s2 58,62 -1,35 24,55 200 12,05 s2 s2 58,54 -1,34 24,47 240 2,05 s3 s3 60,56 -1,86 25,33 240 2,05 s3 s3 60,58 -1,94 25,34 240 2,05 s3 s3 60,55 -1,94 25,31 240 12,05 s4 s4 62,45 -2,28 24,87 240 12,05 s4 s4 62,46 -2,22 24,85 240 12,05 s4 s4 62,48 -2,28 24,81

248,2 7,05 s5 s5 58,92 -1,84 24,63 248,2 7,05 s5 s5 58,86 -1,91 24,56 248,2 7,05 s5 s5 59,00 -1,76 24,49 191,8 7,05 s6 s6 50,19 1,17 24,10 191,8 7,05 s6 s6 50,10 1,06 24,10 191,8 7,05 s6 s6 49,99 1,04 24,10 220 14,10 s7 s7 59,85 -1,92 24,83 220 14,10 s7 s7 59,76 -1,93 24,87 220 14,10 s7 s7 59,68 -2,02 24,88 220 0,00 s8 s8 58,59 -1,34 24,96 220 0,00 s8 s8 58,60 -1,23 24,98 220 0,00 s8 s8 58,50 -1,32 24,96 220 7,05 s9 s9 60,82 -2,47 24,56 220 7,05 s9 s9 60,72 -2,56 24,60 220 7,05 s9 s9 61,06 -2,55 24,81 220 7,05 s10 s10 61,54 -2,01 25,19 220 7,05 s10 s10 61,52 -2,12 25,22 220 7,05 s10 s10 61,49 -1,98 25,23 220 7,05 s11 s11 61,75 -1,97 25,15 220 7,05 s11 s11 61,77 -1,93 25,17 220 7,05 s11 s11 61,77 -1,99 25,16 220 7,05 s12 s12 58,20 -1,64 24,83 220 7,05 s12 s12 58,18 -1,77 24,84 220 7,05 s12 s12 58,06 -1,73 24,87

Resumen de resultados de la determinación de los parámetros de color

Muestra L* a* b* s1 58,50±0,035 -1,12±0,046 24,97±0,01 s2 58,62±0,046 -1,33±0,015 24,55±0,05 s3 60,56±0,009 -1,91±0,027 25,33±0,01 s4 62,46±0,009 -2,26±0,02 24,84±0,02 s5 58,93±0,041 -1,84±0,043 24,56±0,04 s6 50,09±0,058 1,09±0,04 24,10±0,00 s7 59,76±0,049 -1,96±0,032 24,86±0,01 s8 58,56±0,032 -1,30±0,034 24,97±0,01

s9-12 60,57±0,434 -2,06±0,09 24,97±0,07

Cuadro D.15. Datos crudos de determinación de ganancia de humedad de los diferentes polvos, almacenados a 22 °C y 84,34% de humedad relativa.

0h 12 h 24 h 48 h 72 h 120 h 168 h Muestra Frasco p(f+tapa) p(polvo) P(F+tapa+muestra)

S1 44 4,4562 1,0028 5,4590 5,5376 5,5908 5,6404 5,6831 5,7057 5,7433 S1 32 3,9277 1,0570 4,9847 5,0491 5,0994 5,1599 5,1913 5,2346 5,2633 S1 10 4,0353 1,0645 5,0998 5,1713 5,2169 5,2732 5,3050 5,3490 5,3782 S2 16 4,3881 1,0055 5,3936 5,4696 5,5382 5,5652 5,5856 5,6176 5,6538 S2 22 5,2432 1,0175 6,2607 6,3233 6,3677 6,4186 6,4460 6,4859 6,511 S2 26 4,3380 1,0121 5,3501 5,4188 5,4668 5,5134 5,5168 5,5590 5,5875 S3 20 4,2905 1,0180 5,3085 5,3902 5,4358 5,4841 5,5135 5,5545 5,5835 S3 24 4,2479 1,0162 5,2641 5,3459 5,3983 5,4485 5,4808 5,5236 5,5713 S3 46 4,2718 1,0128 5,2846 5,3613 5,4141 5,4665 5,4951 5,5337 5,5635 S4 42 4,3436 1,0104 5,3540 5,4186 5,467 5,5148 5,5203 5,5619 5,5883 S4 45 4,0897 1,0056 5,0953 5,1802 5,2283 5,2733 5,2772 5,3203 5,3459 S4 35 4,4479 1,0193 5,4672 5,5365 5,5841 5,6292 5,6549 5,6873 5,7133 S5 17 5,1307 1,0104 6,1411 6,2170 6,2619 6,3196 6,3389 6,3778 6,4057 S5 11 4,1393 1,0056 5,1449 5,2217 5,2724 5,3213 5,3503 5,3809 5,4123 S5 48 4,4190 1,0193 5,4383 5,5520 5,5769 5,6239 5,6549 5,6810 5,7107 S6 36 5,0569 1,0396 6,0965 6,1521 6,1969 6,2538 6,2809 6,3175 6,3516 S6 33 3,9832 1,0659 5,0491 5,1051 5,1562 5,2162 5,2158 5,2615 5,2927 S6 15 4,4463 1,1657 5,6120 5,6623 5,7124 5,7791 5,8111 5,8501 5,9165 S7 18 4,0051 1,0030 5,0081 5,0758 5,1474 5,1789 5,2030 5,2364 5,2603 S7 52 3,9219 1,0018 4,9237 4,9956 5,0414 5,0884 5,0896 5,1338 5,1618 S7 13 4,5441 1,0025 5,5466 5,6196 5,6674 5,7116 5,7436 5,7941 5,8016 S8 19 4,5223 1,0090 5,5313 5,6082 5,6597 5,7111 5,7420 5,7824 5,8111 S8 27 4,0877 1,0283 5,1160 5,1966 5,2422 5,2953 5,3268 5,3757 5,4021 S8 21 3,9985 1,0091 5,0076 5,0842 5,1326 5,1878 5,2182 5,2620 5,2880 S11 34 4,0085 1,0470 5,0555 5,1268 5,1776 5,2272 5,2847 5,2898 5,3173 S11 7 4,1443 1,0477 5,1920 5,2525 5,2955 5,3417 5,3702 5,4092 5,4359 S11 1 4,3930 1,0170 5,4100 5,4866 5,5364 5,5880 5,6177 5,6532 5,5889

Cuadro D.16. Planilla de cálculo de higroscopicidad (HG, %) Muestra X1 X2 HG(12h) HG(%)

S1 200 2,05 0,0786 7,8 S1 200 2,05 0,0644 6,1 S1 200 2,05 0,0715 6,7 S2 200 12,05 0,0760 7,6 S2 200 12,05 0,0626 6,2 S2 200 12,05 0,0687 6,8 S3 240 2,05 0,0817 8,0 S3 240 2,05 0,0818 8,0 S3 240 2,05 0,0767 7,6 S4 240 12,05 0,0646 6,4 S4 240 12,05 0,0849 8,4 S4 240 12,05 0,0693 6,8 S5 248,2 7,05 0,0759 7,5 S5 248,2 7,05 0,0768 7,6 S5 248,2 7,05 0,1137 ----- S6 191,8 7,05 0,0556 5,3 S6 191,8 7,05 0,0560 5,3 S6 191,8 7,05 0,0503 4,3 S7 220 14,10 0,0677 6,7 S7 220 14,10 0,0719 7,2 S7 220 14,10 0,0730 7,3 S8 220 0,00 0,0769 7,6 S8 220 0,00 0,0806 7,8 S8 220 0,00 0,0766 7,6 S11 220 7,05 0,0713 6,8 S11 220 7,05 0,0605 5,8 S11 220 7,05 0,0766 7,5

Resumen de resultados para Higroscopicidad (HG; %)

HG (%) Muestra Recuento Valor medio Error Estándar

S1 3 6,9 0,50 S2 3 6,9 0,41 S3 3 7,9 0,13 S4 3 7,2 0,61 S5 3 8,8 1,22 S6 3 5,0 0,33 S7 3 7,1 0,19 S8 3 7,7 0,07 S9 3 6,7 0,49

Cuadro D.17. Valores medios de ganancia en peso

Función: G(t)=P(t)-P(t=0) (en g agua/g ms) a partir de tres replicas para el modelado de la cinética de adsorción-Análisis de ajuste de modelos.

G(t)=P(t)-P(t=0)

t (h) s1 s2 s3 s4 s5 s6 s7 s8 s9 0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

12 0,07 0,17 0,08 0,07 0,09 0,05 0,07 0,08 0,07 24 0,12 0,22 0,13 0,12 0,13 0,10 0,13 0,13 0,12 48 0,18 0,26 0,18 0,17 0,18 0,16 0,17 0,18 0,17 72 0,21 0,28 0,21 0,18 0,21 0,18 0,19 0,21 0,21

120 0,25 0,32 0,25 0,22 0,24 0,22 0,23 0,26 0,23 168 0,28 0,35 0,29 0,24 0,27 0,27 0,25 0,28 0,23 456 0,34 0,39 0,35 0,29 0,32 0,33 0,29 0,35 0,32 480 0,34 0,40 0,35 0,29 0,34 0,33 0,29 0,35 0,32 528 0,34 0,40 0,36 0,31 0,33 0,33 0,30 0,35 0,33

Cuadro D.16. Análisis de Regresión No Lineal empleado en el modelado de la cinética de adsorción y gráficos de ajuste de los modelos Variable dependiente: G(t)=P(t)-P(t=0), g Agua/g ms). Estimaciones iniciales de parámetros: a = 0,1, b = 0,1, K1= 0,1 y K2 = 0,1. Funciones a estimar: Modelo LOG: G=a*LOG10(t)+b ; Modelo de Peleg: G= t / (k1 +k2*t)

Modelo Logarítmico-muestra S1: Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados. Número de iteraciones: 4. Número de llamadas de la función: 13 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior a 0,167437 0,00468421 0,15636 0,178513 B -0,105002 0,00991126 -0,128439 -0,0815659 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,583067 2 0,291534 Residuo 0,000432631 7 0,0000618045 Total 0,5835 9 Total (Corr.) 0,0794 8 R-Cuadrada = 99,4551 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,3773 porciento Error estándar del est. = 0,00786158 Error medio absoluto = 0,00595425 Modelo Logarítmico-muestra S2: Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados. Número de iteraciones: 4. Número de llamadas de la función: 13 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior a 0,139801 0,0042042 0,12986 0,149743 b 0,0247231 0,0088956 0,00368833 0,045758

Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,919951 2 0,459976 Residuo 0,000348506 7 0,0000497866 Total 0,9203 9 Total (Corr.) 0,0554 8 R-Cuadrada = 99,3709 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,2811 porciento Error estándar del est. = 0,00705596 Error medio absoluto = 0,00483894 Modelo Logarítmico-muestra S3: Método de estimación: Marquardt La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados. Número de iteraciones: 4. Número de llamadas de la función: 13 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior A 0,171647 0,00343853 0,163516 0,179778 B -0,105817 0,00727554 -0,123021 -0,088613 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,620767 2 0,310383 Residuo 0,000233126 7 0,0000333037 Total 0,621 9 Total (Corr.) 0,0832222 8 R-Cuadrada = 99,7199 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,6799 porciento Error estándar del est. = 0,00577093 Error medio absoluto = 0,00320606 Modelo Logarítmico-muestra S4: Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados. Número de iteraciones: 4. Número de llamadas de la función: 13 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior A 0,138017 0,00418317 0,128125 0,147908 B -0,0716351 0,00885112 -0,0925647 -0,0507055 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,450555 2 0,225277 Residuo 0,000345029 7 0,0000492899 Total 0,4509 9 Total (Corr.) 0,054 8 R-Cuadrada = 99,3611 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,2698 porciento Error estándar del est. = 0,00702068 Error medio absoluto = 0,00572986 Modelo Logarítmico-muestra S5:

Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados. Número de iteraciones: 4.Número de llamadas de la función: 13 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior a 0,150661 0,00380809 0,141656 0,159665 B -0,0729921 0,00805748 -0,0920451 -0,0539392 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,558614 2 0,279307 Residuo 0,000285929 7 0,000040847 Total 0,5589 9 Total (Corr.) 0,0642222 8 R-Cuadrada = 99,5548 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,4912 porciento Error estándar del est. = 0,00639117 Error medio absoluto = 0,00451704 Modelo Logarítmico-muestra S6: Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados. Número de iteraciones: 4. Número de llamadas de la función: 13 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior a 0,175497 0,00521069 0,163176 0,187818 b -0,139228 0,0110252 -0,165299 -0,113158 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,517965 2 0,258982 Residuo 0,000535346 7 0,0000764781 Total 0,5185 9 Total (Corr.) 0,0872889 8 R-Cuadrada = 99,3867 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,2991 porciento Error estándar del est. = 0,00874517 Error medio absoluto = 0,00565701 Modelo Logarítmico-muestra S7: Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados. Número de iteraciones: 4. Número de llamadas de la función: 13 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior a 0,133393 0,00587166 0,119509 0,147277 b -0,0588668 0,0124238 -0,0882444 -0,0294892 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,45972 2 0,22986 Residuo 0,000679777 7 0,000097111 Total 0,4604 9 Total (Corr.) 0,0508 8 R-Cuadrada = 98,6619 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 98,4707 porciento

Error estándar del est. = 0,00985449 Error medio absoluto = 0,00755867 Modelo Logarítmico-muestra S8: Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados. Número de iteraciones: 4. Número de llamadas de la función: 13 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior a 0,168707 0,00341266 0,160637 0,176777 b -0,100928 0,00722079 -0,118003 -0,0838539 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,61307 2 0,306535 Residuo 0,000229631 7 0,0000328044 Total 0,6133 9 Total (Corr.) 0,0804 8 R-Cuadrada = 99,7144 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,6736 porciento Error estándar del est. = 0,00572751 Error medio absoluto = 0,00400022 Modelo Logarítmico-muestra S9: Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados. Número de iteraciones: 4. Número de llamadas de la función: 13 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior a 0,153798 0,00607878 0,139424 0,168172 b -0,0916167 0,012862 -0,122031 -0,0612029 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,511071 2 0,255536 Residuo 0,000728579 7 0,000104083 Total 0,5118 9 Total (Corr.) 0,0673556 8 R-Cuadrada = 98,9183 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 98,7638 porciento Error estándar del est. = 0,0102021 Error medio absoluto = 0,00586716 Modelo de Peleg -muestra S1: Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos. Número de iteraciones: 11. Número de llamadas de la función: 35 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior k1 145,606 4,40989 135,437 155,775 k2 2,6613 0,0267855 2,59954 2,72307 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,583328 2 0,291664 Residuo 0,00017193 8 0,0000214912 Total 0,5835 10 Total (Corr.) 0,12981 9 R-Cuadrada = 99,8676 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,851 porciento Error estándar del est. = 0,00463586

Error medio absoluto = 0,00349474 Modelo de Peleg -muestra S2: Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos. Número de iteraciones: 11. Número de llamadas de la función: 35 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior k1 55,4736 6,78881 39,8185 71,1287 k2 2,48656 0,0702923 2,32447 2,64866 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,917482 2 0,458741 Residuo 0,00281786 8 0,000352233 Total 0,9203 10 Total (Corr.) 0,14189 9 R-Cuadrada = 98,0141 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 97,7658 porciento Error estándar del est. = 0,0187679 Error medio absoluto = 0,0143073 Modelo de Peleg -muestra S3: Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados. Número de iteraciones: 12. Número de llamadas de la función: 37 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior k1 144,938 8,5353 125,255 164,62 k2 2,56245 0,0508323 2,44523 2,67966 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,620299 2 0,31015 Residuo 0,000700557 8 0,0000875696 Total 0,621 10 Total (Corr.) 0,137 9 R-Cuadrada = 99,4886 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,4247 porciento Error estándar del est. = 0,00935786 Error medio absoluto = 0,00632452 Modelo de Peleg -muestra S4: Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos. Número de iteraciones: 12. Número de llamadas de la función: 38 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior k1 147,846 11,9022 120,399 175,292 k2 3,12156 0,0787294 2,94001 3,30311 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,450019 2 0,22501 Residuo 0,000880827 8 0,000110103 Total 0,4509 10 Total (Corr.) 0,09369 9 R-Cuadrada = 99,0598 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 98,9423 porciento Error estándar del est. = 0,010493 Error medio absoluto = 0,00768996

Modelo de Peleg -muestra S5: Método de estimación: Marquardt La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos. Número de iteraciones: 12 Número de llamadas de la función: 38 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior k1 131,018 10,1957 107,506 154,529 k2 2,81297 0,0681186 2,65589 2,97005 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,557887 2 0,278944 Residuo 0,00101278 8 0,000126598 Total 0,5589 10 Total (Corr.) 0,11369 9 R-Cuadrada = 99,1092 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 98,9978 porciento Error estándar del est. = 0,0112516 Error medio absoluto = 0,00788131 Modelo de Peleg -muestra S6: Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos. Número de iteraciones: 11. Número de llamadas de la función: 35 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior k1 194,618 10,1284 171,262 217,974 k2 2,63933 0,0517238 2,52005 2,7586 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,517995 2 0,258997 Residuo 0,000505364 8 0,0000631705 Total 0,5185 10 Total (Corr.) 0,13041 9 R-Cuadrada = 99,6125 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,564 porciento Error estándar del est. = 0,00794799 Error medio absoluto = 0,00570312 Modelo de Peleg -muestra S7: Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos. Número de iteraciones: 11. Número de llamadas de la función: 35 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior k1 131,046 7,22075 114,395 147,697 k2 3,17037 0,0518081 3,0509 3,28984 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,460003 2 0,230002 Residuo 0,000396596 8 0,0000495745 Total 0,4604 10

Total (Corr.) 0,09176 9 R-Cuadrada = 99,5678 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,5138 porciento Error estándar del est. = 0,00704091 Error medio absoluto = 0,00424397 Modelo de Peleg -muestra S8: Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a convergencia de los parámetros estimados. Número de iteraciones: 12. Número de llamadas de la función: 37 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior k1 141,37 7,40424 124,296 158,445 k2 2,60004 0,045133 2,49597 2,70412 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,612761 2 0,306381 Residuo 0,000538564 8 0,0000673205 Total 0,6133 10 Total (Corr.) 0,13369 9 R-Cuadrada = 99,5972 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 99,5468 porciento Error estándar del est. = 0,00820491 Error medio absoluto = 0,00595865 Modelo de Peleg -muestra S9: Método de estimación: Marquardt. La estimación se detuvo debido a la convergencia de la suma de cuadrados de residuos. Número de iteraciones: 12. Número de llamadas de la función: 38 Resultados de la Estimación Intervalo Confianza a 95,0% Error Estándar Asintótico Parámetro Estimado Asintótico Inferior Superior k1 152,717 16,5203 114,621 190,813 k2 2,86149 0,101821 2,62669 3,09629 Análisis de Varianza Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Modelo 0,509903 2 0,254951 Residuo 0,00189748 8 0,000237185 Total 0,5118 10 Total (Corr.) 0,1118 9 R-Cuadrada = 98,3028 porciento R-Cuadrada (ajustada por g.l.) = 98,0906 porciento Error estándar del est. = 0,0154008 Error medio absoluto = 0,0103629

Cuadro D.18. Datos obtenidos a partir de la determinación de humedad para isotermas

Sal Muestra Replica PF PF + Mh P Mh PF + Ms P Ms 1 S1 1 30,0030 30,9734 0,9704 30,9437 0,9407

1 S1 2 31,1290 32,0686 0,9396 32,0432 0,9142

1 S1 3 28,1813 29,1432 0,9619 29,1162 0,9349

1 S3 1 26,2824 27,0473 0,7649 27,0268 0,7444

1 S3 2 33,4471 34,1265 0,6794 34,1107 0,6636

1 S3 3 32,1985 32,8481 0,6496 32,8332 0,6347

2 S1 1 32,2699 33,2368 0,9669 33,1783 0,9084

2 S1 2 30,5320 31,5605 1,0285 31,5074 0,9754

2 S1 3 30,9785 32,0245 1,0460 31,974 0,9955

2 S3 1 45,6932 46,7730 1,0798 46,7181 1,0249

2 S3 2 30,7615 31,5513 0,7898 31,5104 0,7489

2 S3 3 29,5057 30,5317 1,0260 30,4773 0,9716

3 S1 1 32,9210 34,1219 1,2009 33,9952 1,0742

3 S1 2 29,4955 30,5475 1,0520 30,4386 0,9431

3 S1 3 33,7078 34,4505 0,7427 34,3711 0,6633

3 S3 1 45,5405 46,5603 1,0198 46,4418 0,9013

3 S3 2 29,6185 30,5894 0,9709 30,4882 0,8697

3 S3 3 31,3372 32,0016 0,6644 31,9335 0,5963

4 S1 1 45,3794 46,1540 0,7746 46,0578 0,6784

4 S1 2 34,7663 35,5786 0,8123 35,4813 0,715

4 S1 3 32,3725 33,3911 1,0186 33,2697 0,8972

4 S3 1 32,5126 33,2229 0,7103 33,1371 0,6245

4 S3 2 30,5421 31,2794 0,7373 31,1888 0,6467

4 S3 3 29,4663 30,3086 0,8423 30,2101 0,7438

5 S1 1 31,8649 33,2896 1,4247 33,1167 1,2518

5 S1 2 28,2011 29,4654 1,2643 29,3044 1,1033

5 S1 3 28,3917 29,4714 1,0797 29,3358 0,9441

5 S3 1 29,7752 30,4015 0,6263 30,3188 0,5436

5 S3 2 29,3826 30,3048 0,9222 30,1899 0,8073

5 S3 3 40,0884 40,8133 0,7249 40,7035 0,6151

6 S1 1 30,3628 30,9332 0,5704 30,8183 0,4555

6 S1 2 33,2121 33,7748 0,5627 33,6613 0,4492

6 S1 3 31,7779 32,4550 0,6771 32,3215 0,5436

6 S3 1 34,6965 35,1636 0,4671 35,0727 0,3762

6 S3 2 29,3924 29,6860 0,2936 29,6291 0,2367

6 S3 3 29,6248 29,9305 0,3057 29,8722 0,2474

7 S1 1 28,7808 29,3992 0,6184 29,2722 0,4914

7 S1 2 29,7107 30,2161 0,5054 30,1141 0,4034

7 S1 3 31,4875 32,0714 0,5839 31,9485 0,461

7 S3 1 30,1737 30,6801 0,5064 30,5786 0,4049

7 S3 2 28,5688 29,1385 0,5697 29,0292 0,4604

Continúa

Continuación

7 S3 3 36,4300 37,0374 0,6074 36,9109 0,4809

8 S1 1 28,7333 29,2207 0,4874 29,0851 0,3518

8 S1 2 32,3760 33,0181 0,6421 32,8387 0,4627

8 S1 3 29,8696 30,2903 0,4207 30,1764 0,3068

8 S3 1 34,6861 35,0462 0,3601 34,9448 0,2587

8 S3 2 33,0056 33,5026 0,4970 33,3675 0,3619

8 S3 3 29,5983 29,9057 0,3074 29,8198 0,2215 1 S7 1 34,6979 38,0454 3,3475 37,8935 3,1956

1 S7 2 30,3630 34,1760 3,8130 34,0013 3,6383

1 S7 3 40,0887 44,5223 4,4336 44,3213 4,2326

1 S8 1 30,1742 32,0592 1,8850 31,9902 1,8160

1 S8 2 29,5108 31,1263 1,6155 31,0664 1,5556

1 S8 3 29,6269 30,7816 1,1547 30,7426 1,1157

1 S9 1 31,4880 34,0805 2,5925 33,9904 2,5024

1 S9 2 32,2739 35,0642 2,7903 34,9669 2,6930

1 S9 3 33,0060 34,9349 1,9289 34,8616 1,8556

2 S7 1 31,8655 35,9112 4,0457 35,6634 3,7979

2 S7 2 28,3939 32,9919 4,5980 32,7027 4,3088

2 S7 3 32,5143 35,9741 3,4598 35,7526 3,2383

2 S8 1 32,3761 34,5869 2,2108 34,4330 2,0569

2 S8 2 28,5690 30,6243 2,0553 30,4850 1,9160

2 S8 3 29,7764 31,8712 2,0948 31,7227 1,9463

2 S9 1 29,6201 32,5186 2,8985 32,3478 2,7277

2 S9 2 28,2031 30,2762 2,0731 30,1576 1,9545

2 S9 3 33,2138 35,3297 2,1159 35,2058 1,9920

3 S7 1 32,3731 36,6538 4,2807 36,2321 3,8590

3 S7 2 33,4550 37,0944 3,6394 36,7650 3,3100

3 S7 3 28,7212 31,7505 3,0293 31,4786 2,7574

3 S8 1 29,3936 31,5564 2,1628 31,3480 1,9544

3 S8 2 31,7791 33,8022 2,0231 33,6229 1,8438

3 S8 3 33,7080 36,2486 2,5406 36,0088 2,3008

3 S9 1 31,3384 33,4882 2,1498 33,3375 1,9991

3 S9 2 30,0087 32,6505 2,6418 32,4209 2,4122

3 S9 3 30,7652 32,7866 2,0214 32,6308 1,8656

4 S7 1 29,8700 34,8614 4,9914 34,3448 4,4748

4 S7 2 29,7113 34,0364 4,3251 33,5906 3,8793

4 S7 3 31,3102 35,0181 3,7079 34,6390 3,3288

4 S8 1 36,0842 38,3040 2,2198 38,0346 1,9504

4 S8 2 30,5440 33,8174 3,2734 33,4226 2,8786

4 S8 3 32,9224 35,1919 2,2695 34,9200 1,9976

4 S9 1 30,5339 34,4135 3,8796 33,9738 3,4399

4 S9 2 29,4955 32,3410 2,8455 32,0169 2,5214

4 S9 3 34,7675 38,3972 3,6297 37,9852 3,2177

Continúa

Continuación

5 S7 1 36,0832 40,4238 4,3406 39,9325 3,8493

5 S7 2 33,7079 37,3708 3,6629 36,9793 3,2714

5 S7 3 31,7774 35,9626 4,1852 35,5238 3,7464

5 S8 1 29,8689 32,2059 2,3370 31,9555 2,0866

5 S8 2 33,2128 35,0075 1,7947 34,7997 1,5869

5 S8 3 31,3378 33,7829 2,4451 33,4977 2,1599

5 S9 1 29,7762 33,1845 3,4083 32,8336 3,0574

5 S9 2 29,5078 33,4832 3,9754 33,0929 3,5851

5 S9 3 31,8644 36,7980 4,9336 36,3391 4,4747

6 S7 1 28,7812 32,9020 4,1208 32,4325 3,6513

6 S7 2 29,6193 33,6462 4,0269 33,1811 3,5618

6 S7 3 32,5134 36,5166 4,0032 36,0747 3,5613

6 S8 1 31,4882 33,6183 2,1301 33,2781 1,7899

6 S8 2 30,5324 32,6932 2,1608 32,3575 1,8251

6 S8 3 32,3759 34,2916 1,9157 33,9960 1,6201

6 S9 1 33,0053 35,5836 2,5783 35,2343 2,2290

6 S9 2 28,5697 31,8788 3,3091 31,4508 2,8811

6 S9 3 30,0080 33,0439 3,0359 32,6976 2,6896

7 S7 1 30,5435 34,7481 4,2046 34,1533 3,6098

7 S7 2 40,0906 44,5896 4,4990 43,9405 3,8499

7 S7 3 28,3934 31,6125 3,2191 31,1419 2,7485

7 S8 1 30,1746 32,4241 2,2495 31,9839 1,8093

7 S8 2 30,3638 32,3678 2,0040 32,0054 1,6416

7 S8 3 32,3733 34,1536 1,7803 33,8048 1,4315

7 S9 1 34,7677 38,3999 3,6322 37,8500 3,0823

7 S9 2 29,6271 33,7389 4,1118 33,1031 3,4760

7 S9 3 32,2775 34,8877 2,6102 34,4635 2,1860

8 S7 1 32,9216 34,8307 1,9091 34,4311 1,5095

8 S7 2 29,7112 30,9475 1,2363 30,6642 0,9530

8 S7 3 29,3937 31,0778 1,6841 30,7188 1,3251

8 S8 1 28,2026 29,9538 1,7512 29,5057 1,3031

8 S8 2 31,3096 32,9286 1,6190 32,5372 1,2276

8 S8 3 34,6987 36,9100 2,2113 36,3981 1,6994

8 S9 1 33,4546 36,1498 2,6952 35,4940 2,0394

8 S9 2 30,7662 33,5936 2,8274 32,9683 2,2021

8 S9 3 29,4954 31,6822 2,1868 31,2037 1,7083

Cuadro D.19. Datos de contenido de humedad de equilibrio (CHe; g agua / g ms) –Experiencia de isotermas

CHe (g agua / g ms)

Muestras

220 °C;

14,1 %MD

220 °C;

0 %MD

220 °C;

7,05 %MD

200 °C;

2,05 %MD

240 °C;

2,05 %MD

Sal Sal HR (%) aw S7 S8 S9 S1 S3 1 ClLi 11,30 0,1130 0,048 0,038 0,036 0,032 0,028

1 ClLi 11,30 0,1130 0,048 0,039 0,036 0,028 0,024

1 ClLi 11,30 0,1130 0,047 0,035 0,040 0,029 0,023

2 Cl2Mg 32,78 0,3278 0,065 0,075 0,063 0,064 0,054

2 Cl2Mg 32,78 0,3278 0,067 0,073 0,061 0,054 0,055

2 Cl2Mg 32,78 0,3278 0,068 0,076 0,062 0,051 0,056

3 Mg(NO3)2 52,89 0,5289 0,109 0,107 0,075 0,118 0,131

3 Mg(NO3)2 52,89 0,5289 0,100 0,097 0,095 0,115 0,116

3 Mg(NO3)2 52,89 0,5289 0,099 0,104 0,084 0,120 0,114

5 Cl2Co 64,92 0,6492 0,128 0,120 0,115 0,138 0,152

5 Cl2Co 64,92 0,6492 0,120 0,131 0,109 0,146 0,142

5 Cl2Co 64,92 0,6492 0,117 0,132 0,103 0,144 0,179

7 ClNa 75,29 0,7529 0,165 0,243 0,178 0,258 0,251

7 ClNa 75,29 0,7529 0,169 0,221 0,183 0,253 0,237

7 ClNa 75,29 0,7529 0,171 0,244 0,194 0,267 0,263

8 ClK 84,34 0,8434 0,265 0,344 0,322 0,385 0,392

8 ClK 84,34 0,8434 0,297 0,319 0,284 0,388 0,373

8 ClK 84,34 0,8434 0,271 0,301 0,280 0,371 0,388

Análisis de regresión no lineal-Modelado de las isotermas de adsorción. (Aclaración: Para el ajuste de los modelos, se utilizó el valor medio de CHe correspondiente a cada muestra).

a-Modelo de GAB para la muestra S8

R e g r e s i ó n N o l í n e a l

- - - - - - - - - - - - - - - - - - -

V a r i a b l e d e p e n d i e n t e : s 8 ( 2 ° a n a l i s i s )

V a r i a b l e s i n d e p e n d i e n t e s :

a w

F u n c i ó n a e s t i m a r : ( x m * C * k * a w ) / ( ( 1 - k * a w ) * ( 1 - k * a w + C * k * a w ) )

E s t i m a c i o n e s d e l p a r á m e t r o i n i c i a l :

x m = 0 , 0 5

C = 1 , 0

k = 0 , 9

M é t o d o d e e s t i m a c i ó n : M a r q u a r d t

L a e s t i m a c i ó n s e d e t u v o d e b i d o a l a c o n v e r g e n c i a d e l a s u m a d e

N ú m e r o d e i t e r a c c i o n e s : 7

N ú m e r o d e l l a m a d a s d e f u n c i o n e s : 3 0

R e s u l t a d o s d e l a E s t i m a c i ó n

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

A s i n t

A s i n t ó t i c a I n t e r v a l o

P a r á m e t r o E s t i m a d o E r r o r E s t á n d a r I n f e r i o r

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

x m 0 , 0 5 7 1 1 7 2 0 , 0 1 0 9 9 5 1 0 , 0 2 2 1 2 5 9

C 1 0 , 0 3 2 3 1 3 , 3 4 5 7 - 3 2 , 4 3 9 7

k 0 , 9 8 2 3 1 8 0 , 0 3 7 7 8 1 2 0 , 8 6 2 0 8 1

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

A n á l i s i s d e V a r i a n z a

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

F u e n t e S u m a d e C u a d r a d o s G l C u a d r a d o M e d i o

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

M o d e l o 0 , 1 9 1 6 3 0 , 0 6 3 8 6 6 8

R e s i d u o s 0 , 0 0 1 1 2 3 5 3 3 0 , 0 0 0 3 7 4 5 0 9

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

T o t a l 0 , 1 9 2 7 2 4 6

T o t a l ( C o r r . ) 0 , 0 5 7 7 2 4 5

R - C u a d r a d o = 9 8 , 0 5 3 6 p o r c e n t a j e

R - C u a d r a d o ( a d a p t a d o p a r a g . l . ) = 9 6 , 7 5 6 p o r c e n t a j e

E r r o r E s t á n d a r d e l a E s t . = 0 , 0 1 9 3 5 2 2

E r r o r a b s o l u t o d e l a M e d i a = 0 , 0 1 0 5 1 5 5

E s t a d í s t i c o D u r b i n - W a t s o n = 2 , 9 3 3 5 5

A u t o c o r r e l a c i ó n r e s i d u a l L a g 1 = - 0 , 4 7 9 9 3 2

A n á l i s i s d e R e s i d u o s

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

E s t i m a c i ó n V a l i d a c i ó n

n 6

M S E 0 , 0 0 0 3 7 4 5 0 9

M A E 0 , 0 1 0 5 1 5 5

M A P E 7 , 4 5 1 5 6

M E - 0 , 0 0 0 2 6 6 8 7 9

M P E - 0 , 5 1 4 0 9 7

b-Modelo de GAB para la muestra S9 R e g r e s i ó n N o l í n e a l

- - - - - - - - - - - - - - - - - - -



a w



x m = 0 , 0 5

C = 1 , 0

k = 0 , 9






- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

A s i n t



- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

x m 0 , 0 4 0 6 3 9 8 0 , 0 0 3 0 4 5 0 9 0 , 0 3 0 9 4 9

C 3 4 , 1 0 6 9 4 6 , 5 5 0 4 - 1 1 4 , 0 3 7

k 1 , 0 2 3 9 2 0 , 0 1 2 6 3 3 8 0 , 9 8 3 7 1 5

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

M o d e l o 0 , 1 4 5 3 5 4 3 0 , 0 4 8 4 5 1 3

R e s i d u o s 0 , 0 0 0 2 1 4 9 8 3 3 0 , 0 0 0 0 7 1 6 6 0 9

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

T o t a l 0 , 1 4 5 5 6 9 6

T o t a l ( C o r r . ) 0 , 0 4 5 9 8 0 8 5


R - C u a d r a d o ( a d a p t a d o p a r a g . l . ) = 9 9 , 2 2 0 8 p o r c e n t a j e

E r r o r E s t á n d a r d e l a E s t . = 0 , 0 0 8 4 6 5 2 8

E r r o r a b s o l u t o d e l a M e d i a = 0 , 0 0 4 5 5 5 1 5


A u t o c o r r e l a c i ó n r e s i d u a l L a g 1 = - 0 , 4 7 5 4 4


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


n 6

M S E 0 , 0 0 0 0 7 1 6 6 0 9

M A E 0 , 0 0 4 5 5 5 1 5

M A P E 4 , 1 7 0 3 4

M E - 0 , 0 0 0 1 1 5 5 8 8

M P E - 0 , 2 7 5 0 7

c-Modelo de GAB para la muestra S3 R e g r e s i ó n N o l í n e a l

- - - - - - - - - - - - - - - - - - -



a w



x m = 0 , 0 4

C = 1 , 0

k = 0 , 9


L a e s t i m a c i ó n s e d e t u v o d e b i d o a l a c o n v e r g e n c i a d e l a s e s t i m




- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

A s i n

A s i n t ó t i c a I n t e r v a l

P a r á m e t r o E s t i m a d o E r r o r E s t á n d a r I n f e r i o

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

x m 0 , 0 7 5 2 4 5 5 0 , 0 1 0 3 4 6 4 0 , 0 4 2 3 1 8

C 2 , 5 6 4 5 2 1 , 0 6 7 7 6 - 0 , 8 3 3 5 5

k 0 , 9 7 2 1 0 9 0 , 0 2 1 6 0 3 7 0 , 9 0 3 3 5

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

M o d e l o 0 , 2 5 2 7 8 8 3 0 , 0 8 4 2 6 2 8

R e s i d u o s 0 , 0 0 0 1 8 1 6 3 7 3 0 , 0 0 0 0 6 0 5 4 5 6

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

T o t a l 0 , 2 5 2 9 7 6

T o t a l ( C o r r . ) 0 , 0 8 8 9 5 9 3 5






A u t o c o r r e l a c i ó n r e s i d u a l L a g 1 = - 0 , 8 5 1 7 9


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


n 6

M S E 0 , 0 0 0 0 6 0 5 4 5 6

M A E 0 , 0 0 5 0 0 5 8 7

M A P E 6 , 8 3 4 4 4

M E 0 , 0 0 0 3 0 1 5 4 3

M P E 1 , 8 8 9 7 9

d-Modelo de GAB para la muestra S1 R e g r e s i ó n N o l í n e a l

- - - - - - - - - - - - - - - - - - -



a w



x m = 0 , 0 5

C = 1 , 0

k = 0 , 9






- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

A s i n t



- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

x m 0 , 0 7 2 0 9 2 1 0 , 0 2 0 1 4 1 7 0 , 0 0 7 9 9 2 1 3

C 2 , 7 4 9 3 2 , 4 8 9 7 9 - 5 , 1 7 4 3 3

k 0 , 9 7 9 0 3 7 0 , 0 4 3 4 0 8 8 0 , 8 4 0 8 9 1

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

M o d e l o 0 , 2 4 9 8 0 5 3 0 , 0 8 3 2 6 8 5

R e s i d u o s 0 , 0 0 0 8 4 5 5 9 3 0 , 0 0 0 2 8 1 8 6 3

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

T o t a l 0 , 2 5 0 6 5 1 6

T o t a l ( C o r r . ) 0 , 0 8 8 2 8 9 5 5








- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


n 6

M S E 0 , 0 0 0 2 8 1 8 6 3

M A E 0 , 0 0 9 9 6 0 5 8

M A P E 1 0 , 8 6 6 9

M E 0 , 0 0 0 6 7 6 8 0 2

M P E 3 , 3 9 0 0 9

e-Modelo de GAB para la muestra S7. En este caso los datos tuvieron que ser linealizados de la forma: aw/X=b1+b2*aw+b3*aw^2 con: xm= (1/(b2^2-4*b1*b3))^0,5; c= -2/(b2*xm-1); k= b3+xm/((1/c)-1)

S7

Sal aw CHe aw/Che

1 0,1130 0,048 2,371

2 0,3278 0,067 4,917

3 0,5289 0,103 5,152

5 0,6492 0,122 5,336

7 0,7529 0,168 4,473

8 0,8434 0,278 3,037

A n á l i s i s d e R e g r e s i ó n P o l i n o m i a l

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

V a r i a b l e d e p e n d i e n t e : s 7 n

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

E r r o r E s t a d í

P a r á m e t r o E s t i m a c i ó n E s t á n d a r T

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

C O N S T A N T E 0 , 3 0 5 0 3 3 0 , 4 5 6 7 6 2 0 , 6

a w 2 0 , 4 8 6 7 2 , 1 9 2 6 5 9 ,

a w ^ 2 - 2 0 , 2 0 0 5 2 , 2 4 2 3 2 - 9 ,

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

A n á l i s i s d e l a V a r i a n z a

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

F u e n t e S u m a d e C u a d r a d o s G L C u a d r a d o s M e d i o s

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

M o d e l o 7 , 2 3 4 2 7 2 3 , 6 1 7 1 4

R e s i d u o 0 , 2 4 7 7 2 4 3 0 , 0 8 2 5 7 4 6

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

T o t a l ( C o r r . ) 7 , 4 8 2 5

R - c u a d r a d o = 9 6 , 6 8 9 1 p o r c e n t a j e

R - c u a d r a d o ( a j u s t a d o p a r a d . f . ) = 9 4 , 4 8 1 8 p o r c e n t a j e

E r r o r E s t á n d a r d e l a E s t . = 0 , 2 8 7 3 5 8

E r r o r a b s o l u t o m e d i o = 0 , 1 7 1 6 8 3

E s t a d í s t i c o D u r b i n - W a t s o n = 2 , 6 1 2 0 3 ( P = 0 , 0 0 2 6 )

a u t o c o r r e l a c i ó n d e r e s i d u o s e n L a g 1 = - 0 , 3 6 9 6 9 6

Resultado:

Constantes S7

b1 0,305

b2 20,487

b3 -20,201

xm 0,05

c 71,10

k 0,97

R2 0,9668 Estos valores de Xm, c y k se usaron como valores iniciales para volver a iterar:

Xm 0,049

C 23,21

K 0,972

R2 0,990

f-Modelo de BET para la muestra S8 R e g r e s i ó n N o l í n e a l

- - - - - - - - - - - - - - - - - - -



a w

F u n c i ó n a e s t i m a r : x m * C * a w * ( 1 - ( n - 1 ) * ( a w ^ n ) + n * ( a w ^ ( n + 1 ) ) ) / ( ( 1 - a w ) * ( 1


x m = 0 , 0 1

C = 8 , 0

n = 1 5 , 0


L a e s t i m a c i ó n s e d e t u v o d e b i d o a l a c o n v e r g e n c i a d e l a s u m a d e c u a d

N ú m e r o d e i t e r a c c i o n e s : 1 8



- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

A s i n t ó t i c a

A s i n t ó t i c a I n t e r v a l o s d e


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

x m 0 , 0 5 3 8 9 0 2 0 , 0 0 6 6 1 8 1 7 0 , 0 3 2 8 2 8 2

C 1 2 , 7 6 5 3 1 7 , 6 3 1 4 - 4 3 , 3 4 5 9

n 2 2 , 8 8 7 3 5 0 , 2 8 0 2 - 1 3 7 , 1 2 7

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

M o d e l o 0 , 1 9 1 6 4 7 3 0 , 0 6 3 8 8 2 5

R e s i d u o s 0 , 0 0 1 0 7 6 6 1 3 0 , 0 0 0 3 5 8 8 7 1

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

T o t a l 0 , 1 9 2 7 2 4 6

T o t a l ( C o r r . ) 0 , 0 5 7 7 2 4 5








- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


n 6

M S E 0 , 0 0 0 3 5 8 8 7 1

M A E 0 , 0 1 0 2 2 4 3

M A P E 6 , 8 4 7 1 4

M E - 0 , 0 0 0 0 6 2 6 2 3 7

M P E - 0 , 7 4 4 5 1

g-Modelo de BET para la muestra S9


- - - - - - - - - - - - - - - - - - -



a w



x m = 0 , 0 1

C = 2 0 , 0

n = 1 0 , 0






- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -




- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

x m 0 , 0 4 4 9 0 8 3 0 , 0 0 2 6 4 9 8 2 0 , 0 3 6 4 7 5 4

C 1 7 , 6 9 5 6 1 8 , 2 8 9 4 - 4 0 , 5 0 9 6

n 1 1 , 1 5 7 7 1 , 8 6 8 9 3 5 , 2 0 9 8 9

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

M o d e l o 0 , 1 4 5 1 9 4 3 0 , 0 4 8 3 9 7 9

R e s i d u o s 0 , 0 0 0 3 7 5 2 2 5 3 0 , 0 0 0 1 2 5 0 7 5

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

T o t a l 0 , 1 4 5 5 6 9 6

T o t a l ( C o r r . ) 0 , 0 4 5 9 8 0 8 5

R - C u a d r a d o = 9 9 , 1 8 4 p o r c e n t a j e







- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


n 6

M S E 0 , 0 0 0 1 2 5 0 7 5

M A E 0 , 0 0 6 0 5 7 0 8

M A P E 5 , 7 3 8 1 2

M E - 0 , 0 0 0 4 8 7 6 6 3

M P E - 0 , 5 7 6 1 0 6

h-Modelo de BET para la muestra S1:


- - - - - - - - - - - - - - - - - - -



a w



x m = 0 , 0 1

C = 1 , 0

n = 1 5 , 0


L a e s t i m a c i ó n s e d e t u v o d e s p u é s d e a l c a n z a r l a s m á x i m a s i t e r a c c i o n e


N ú m e r o d e l l a m a d a s d e f u n c i o n e s : 1 5 3


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -




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x m 0 , 0 6 5 6 5 9 6 0 , 0 0 9 5 2 8 6 5 0 , 0 3 5 3 3 5 2

C 3 , 4 9 7 2 8 2 , 8 5 1 3 8 - 5 , 5 7 7 1

n 2 3 , 5 0 5 2 4 4 , 8 2 1 - 1 1 9 , 1 3 5

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

M o d e l o 0 , 2 4 9 8 3 9 3 0 , 0 8 3 2 7 9 7

R e s i d u o s 0 , 0 0 0 8 1 1 9 1 3 3 0 , 0 0 0 2 7 0 6 3 8

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

T o t a l 0 , 2 5 0 6 5 1 6

T o t a l ( C o r r . ) 0 , 0 8 8 2 8 9 5 5








- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


n 6

M S E 0 , 0 0 0 2 7 0 6 3 8

M A E 0 , 0 1 0 0 6 1 8

M A P E 1 0 , 1 5 2 8

M E 0 , 0 0 0 3 9 7 2 1 4

M P E 2 , 0 0 7 2 7

i-Modelo de BET para la muestra S3


- - - - - - - - - - - - - - - - - - -



a w



x m = 0 , 1

C = 1 , 0

n = 1 5 , 0






- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -




- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

x m 0 , 0 6 6 4 0 3 5 0 , 0 0 6 5 4 0 9 2 0 , 0 4 5 5 8 7 3

C 3 , 4 6 8 9 9 1 , 6 1 3 1 3 - 1 , 6 6 4 7 3

n 2 0 , 9 6 4 5 3 4 , 6 2 7 5 - 8 9 , 2 3 5 9

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

M o d e l o 0 , 2 5 2 7 7 3 0 , 0 8 4 2 5 6 5

R e s i d u o s 0 , 0 0 0 2 0 0 4 0 8 3 0 , 0 0 0 0 6 6 8 0 2 5

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

T o t a l 0 , 2 5 2 9 7 6

T o t a l ( C o r r . ) 0 , 0 8 8 9 5 9 3 5



E r r o r E s t á n d a r d e l a E s t . = 0 , 0 0 8 1 7 3 2 8


E s t a d í s t i c o D u r b i n - W a t s o n = 3 , 6 4 7 7



- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


n 6

M S E 0 , 0 0 0 0 6 6 8 0 2 5

M A E 0 , 0 0 5 3 6 9 6 4

M A P E 5 , 7 7 3 5 9

M E 0 , 0 0 0 1 2 7 3 2 9

M P E 0 , 0 2 4 9 6 0 3

Cuadro D.20. Cálculo de errores-Modelado de las isotermas de adsorción Tabla de medias usadas en el cálculo de errores

Sal aw S7 S8 S9 S1 S3 1,00 0,113 0,048 0,037 0,037 0,030 0,025

2,00 0,3278 0,067 0,075 0,062 0,056 0,055

3,00 0,5289 0,103 0,103 0,085 0,118 0,120

5,00 0,6492 0,122 0,128 0,109 0,143 0,158

7,00 0,7529 0,168 0,236 0,185 0,259 0,250

8,00 0,8434 0,278 0,321 0,295 0,381 0,384

y promedio 0,131 0,150 0,129 0,165 0,165

Constantes de GAB

Xm 0,049 0,057 0,041 0,072 0,075

C 23,21 10,03 34,11 2,75 2,56

K 0,9712 0,982 1,024 0,979 0,9721

Constantes de BET

X 0,044 0,054 0,045 0,065 0,066 C 14,45 12,76 17,69 3,49 3,47 N 13,98 22,89 11,16 23,5 20,96

Muestra S7 Modelo GAB Modelo BET

(yex-ypre) (yex-ypre)2 ABS (yex-ypre) (yex-yprom)2 (yex-ypre) (yex-ypre)2

ABS (yex-ypre) (yex-yprom)2

0,007 0,000 0,144 0,007 0,016 0,000 0,326 0,007

0,001 0,000 0,013 0,004 0,009 0,000 0,140 0,004

0,006 0,000 0,057 0,001 0,015 0,000 0,144 0,001

-0,008 0,000 0,063 0,000 0,002 0,000 0,013 0,000

-0,011 0,000 0,066 0,001 -0,001 0,000 0,005 0,001

0,009 0,000 0,034 0,022 0,006 0,000 0,021 0,022

sumatorias 0,000 0,377 0,035 sumatorias 0,001 0,649 0,035

R2 0,990 R2 0,983

MPE 6,285 MPE 10,818




0,002 0,000 0,045 0,013 0,000 0,000 0,010 0,013

0,005 0,000 0,070 0,006 0,005 0,000 0,073 0,006

-0,006 0,000 0,058 0,002 -0,004 0,000 0,044 0,002

-0,021 0,000 0,166 0,000 -0,020 0,000 0,156 0,000

0,025 0,001 0,105 0,007 0,024 0,001 0,102 0,007

-0,004 0,000 0,012 0,029 -0,007 0,000 0,023 0,029


R2 0,980 R2 0,981 MPE 7,577 MPE 6,795




-0,001 0,000 0,015 0,008 0,002 0,000 0,059 0,009

0,004 0,000 0,059 0,004 0,002 0,000 0,032 0,005

-0,003 0,000 0,031 0,001 -0,006 0,000 0,071 0,002

-0,012 0,000 0,106 0,000 -0,014 0,000 0,124 0,000

0,008 0,000 0,041 0,003 0,012 0,000 0,066 0,002

-0,004 0,000 0,013 0,019 -0,001 0,000 0,004 0,020


R2 0,994 R2 0,990

MPE 4,407 MPE 5,943




0,009 0,000 0,304 0,018 0,007 0,000 0,240 0,018

-0,004 0,000 0,064 0,012 -0,005 0,000 0,081 0,012

0,006 0,000 0,052 0,002 0,008 0,000 0,066 0,002

-0,021 0,000 0,146 0,000 -0,018 0,000 0,124 0,000

0,017 0,000 0,065 0,009 0,020 0,000 0,077 0,009

-0,002 0,000 0,006 0,047 0,000 0,000 0,000 0,047


R2 0,990 R2 0,990

MPE 10,621 MPE 9,814




0,005 0,000 0,191 0,020 0,002 0,000 0,088 0,020

-0,005 0,000 0,091 0,012 -0,007 0,000 0,122 0,012

0,008 0,000 0,063 0,002 0,009 0,000 0,074 0,002

-0,008 0,000 0,050 0,000 -0,005 0,000 0,032 0,000

0,006 0,000 0,022 0,007 0,008 0,000 0,034 0,007

0,001 0,000 0,002 0,048 0,000 0,000 0,001 0,048


R2 0,998 R2 0,997

MPE 6,982 MPE 5,823 Nota D.3. Modo de cálculo de fracción de agua (ww; g agua/g totales) y fracción de sólidos secos (ws; g solidos secos/g totales); empleados en el modelado de temperatura de transición vítrea.

Dato: CHbs=11,2% entonces: (100 +11,2)g---------------------11,2 g agua

100 g sólidos secos-----------x=100*11,2/111,2 = 10,0719 %

Entonces ww=10,0719/100=0,1007

ws=1-ww=1-0,1007= 0,8993 g sólidos secos/g totales

ws=1-(CHbs/(100 + CHbs))

Cuadro D.21. Datos de contenidos de humedad (CH), y fracciones de agua (ww) y de sólidos secos (ws), basados en nota D.3.

Muestra PPF PPF+MH PPF+MS MH MS CH(bh) CH(bs) ww ws

sal3-muestra9 32,3726 32,8535 32,7997 0,4809 0,4271 0,112 0,13 0,112 0,888

sal2-muestra9 30,3626 31,0879 31,0358 0,7253 0,6732 0,07 0,08 0,072 0,928

sal1-muestra9 29,6202 30,26 30,2329 0,6398 0,6127 0,04 0,04 0,042 0,958

sal3-muestra8 33,2121 34,1507 34,0479 0,9386 0,8358 0,11 0,12 0,110 0,890

sal2-muestra8 29,4655 30,3397 30,2659 0,8742 0,8004 0,08 0,09 0,084 0,916

sal1-muestra8 31,1345 31,6836 31,6579 0,5491 0,5234 0,05 0,05 0,047 0,953

sal3-muestra7 44,1681 45,3796 45,2634 1,2115 1,0953 0,10 0,11 0,096 0,904

sal2-muestra7 29,777 30,6788 30,6186 0,9018 0,8416 0,07 0,07 0,067 0,933

sal1-muestra7 29,8701 30,8855 30,8407 1,0154 0,9706 0,04 0,05 0,044 0,956

sal3-muestra3 45,52 46,3312 46,2369 0,8112 0,7169 0,12 0,13 0,116 0,884

sal2-muestra3 40,0902 40,5724 40,5311 0,4822 0,4409 0,09 0,09 0,086 0,914

sal1-muestra3 29,3852 30,1169 30,0821 0,7317 0,6969 0,05 0,05 0,048 0,952

sal3-muestra1 31,3097 32,4231 32,3013 1,1134 0,9916 0,11 0,12 0,109 0,891

sal2-muestra1 28,5253 29,3855 29,319 0,8602 0,7937 0,08 0,08 0,077 0,923

sal1-muestra1 30,7647 31,7031 31,6538 0,9384 0,8891 0,05 0,06 0,053 0,947 PPF: peso del pocillo; PPF+MH: peso del pocillo más peso de la muestra húmeda; PPF+MS: peso del pocillo mas peso de la muestra seca; MH: muestra húmeda; MS: muestra seca.

Cuadro D22. Datos de lecturas de temperaturas de transición vítrea

Para transición vítrea (Tg; os: onset; mp: midpoint) y actividad acuosa muestras de mate soluble puro y formulado con diferentes porcentajes de maltodextrina (%MD); obtenidas a diferentes temperaturas de entrada de aire (Ti).

X1 (Ti;°C)

X2 (%MD; %p/v)

Muestra Sal aw aw del

desecador (25°C)

Tg os (°C) Tg mp (°C)

220 7,05 9 3 0,555 0,5289 14,87 28,40 220 0,00 8 3 0,528 0,5289 15,38 35,92 220 14,10 7 3 0,52 0,5289 27,60 39,82 200 2,05 3 3 0,513 0,5289 12,18 22,77 240 2,05 1 3 0,524 0,5289 31,60 40,39 220 7,05 9 2 0,461 0,3278 31,39 37,10 220 0,00 8 2 0,44 0,3278 30,83 37,28 220 14,10 7 2 0,469 0,3278 36,25 41,26 200 2,05 3 2 0,425 0,3278 29,02 35,29 240 2,05 1 2 0,436 0,3278 34,53 41,67 220 7,05 9 1 0,411 0,113 42,88 47,33 220 0,00 8 1 0,416 0,113 39,20 43,61 220 14,10 7 1 0,443 0,113 52,09 60,54 200 2,05 3 1 0,406 0,113 42,82 46,97 240 2,05 1 1 0,404 0,113 47,04 51,17

Cuadro D.23. Resumen de datos empleados en el modelado de la ecuación de Gordon y Taylor

Muestra X1 (°C) X2 (%MD) aw muestra Tgos ww ws 8 220 0 0,528 15,38 0,11 0,89

8 220 0 0,44 30,83 0,08 0,92

8 220 0 0,416 39,20 0,05 0,95

9 220 7,05 0,555 14,87 0,11 0,89

9 220 7,05 0,461 31,39 0,07 0,93

9 220 7,05 0,411 42,88 0,04 0,96

7 220 14,1 0,52 27,60 0,10 0,90

7 220 14,1 0,469 36,25 0,07 0,93

7 220 14,1 0,443 52,09 0,04 0,96

3 200 2,05 0,513 12,18 0,12 0,88

3 200 2,05 0,425 29,02 0,09 0,91

3 200 2,05 0,406 42,82 0,05 0,95

1 240 2,05 0,524 31,60 0,11 0,89

1 240 2,05 0,436 34,53 0,08 0,92

1 240 2,05 0,404 47,04 0,05 0,95

Cuadro D.24. Análisis de regresión no lineal-Modelo de Gordon y Taylor

a-Modelado G-T para muestra S8

V a r i a b l e d e p e n d i e n t e : T g o s ( ° C ) p a r a m u e s t r a s d e l p o l v o 8


w s

w w

F u n c i ó n a e s t i m a r : ( w s * T g s + k * w w * ( - 1 3 5 ) ) / ( w s + k * w w )


T g s = 0 , 1

k = 0 , 1






- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

A s i n



- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

T g s 6 3 , 1 5 5 8 , 3 3 8 7 - 4 2 , 7 9 8

k 2 , 4 6 6 0 5 0 , 5 8 9 3 7 6 - 5 , 0 2 2 6

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

M o d e l o 2 7 1 2 , 9 5 2 1 3 5 6 , 4 7

R e s i d u o s 1 0 , 7 2 6 6 1 1 0 , 7 2 6 6

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

T o t a l 2 7 2 3 , 6 7 3

T o t a l ( C o r r . ) 2 9 2 , 0 5 1 2



E r r o r E s t á n d a r d e l a E s t . = 3 , 2 7 5 1 6

E r r o r a b s o l u t o d e l a M e d i a = 1 , 7 8 0 6 2




- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


n 3

M S E 1 0 , 7 2 6 6

M A E 1 , 7 8 0 6 2

M A P E 7 , 1 1 5 8 4

M E - 0 , 0 0 4 5 2 1 8 5

M P E - 1 , 3 5 4 9 1

b-Modelado G-T para muestra S9


- - - - - - - - - - - - - - - - - - -

V a r i a b l e d e p e n d i e n t e : T g o s ( ° C ) p a r a p o l v o 9


w s

w w



T g s = 0 , 1

k = 0 , 1






- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

A s i n



- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

T g s 6 1 , 9 5 4 3 1 , 9 0 9 7 7 3 7 , 6 8 8

k 2 , 5 1 4 4 4 0 , 1 4 7 0 2 2 0 , 6 4 6 3 4

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

M o d e l o 3 0 4 4 , 2 3 2 1 5 2 2 , 1 1

R e s i d u o s 0 , 9 1 4 7 8 3 1 0 , 9 1 4 7 8 3

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

T o t a l 3 0 4 5 , 1 4 3

T o t a l ( C o r r . ) 3 9 6 , 4 9 7 2



E r r o r E s t á n d a r d e l a E s t . = 0 , 9 5 6 4 4 3

E r r o r a b s o l u t o d e l a M e d i a = 0 , 5 2 1 2 3 1




- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


n 3

M S E 0 , 9 1 4 7 8 3

M A E 0 , 5 2 1 2 3 1

M A P E 2 , 0 0 5 5 1

M E - 0 , 0 0 1 8 6 7 4 9

M P E - 0 , 3 5 0 9 5 7

c-Modelado G-T para muestra S7


- - - - - - - - - - - - - - - - - - -

V a r i a b l e d e p e n d i e n t e : T g o s ( ° C ) p a r a p o l v o 7


w s

w w



T g s = 0 , 1

k = 0 , 1






- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

A s i n



- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

T g s 6 9 , 9 9 3 7 5 , 4 8 0 7 3 0 , 3 5 4 3 5

k 2 , 4 2 7 7 1 0 , 4 1 8 2 8 2 - 2 , 8 8 7 0

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

M o d e l o 4 7 8 2 , 7 2 2 3 9 1 , 3 5

R e s i d u o s 6 , 4 8 9 6 1 6 , 4 8 9 6

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

T o t a l 4 7 8 9 , 1 9 3

T o t a l ( C o r r . ) 3 0 8 , 4 9 6 2



E r r o r E s t á n d a r d e l a E s t . = 2 , 5 4 7 4 7

E r r o r a b s o l u t o d e l a M e d i a = 1 , 3 8 5 0 7




- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


n 3

M S E 6 , 4 8 9 6

M A E 1 , 3 8 5 0 7

M A P E 3 , 8 9 4 4 8

M E 0 , 0 0 3 5 4 5 2 4

M P E 0 , 0 8 3 3 8 2 1

Cuadro D.25. Cálculo de errores-Modelado de Gordon y Taylor

Muestra S8 (220°C; 0 %MD) sal Aw y exp ypred yexp-ypred yexp-ypred)^2 ABS(yexp-ypred) (yexp-yprom)^2

3 0,555 15,38 17,04 -1,657 2,745 0,108 171,348

2 0,528 30,83 26,44 4,387 19,248 0,142 5,570

1 0,520 39,2 41,75 -2,549 6,496 0,065 115,133

sumatorias 28,489 0,315 292,051

R2 0,902

MPE 10,502

Muestra S9 (220°C; 7,05 %MD) sal Aw y exp ypred yexp-ypred yexp-ypred)^2 ABS(yexp-ypred) (yexp-yprom)^2

3 0,555 14,87 14,58 0,292 0,085 0,020 220,325

2 0,528 31,39 29,87 1,519 2,307 0,048 2,811

1 0,52 42,88 42,24 0,638 0,406 0,015 173,361

sumatorias 2,799 0,083 396,497

R2 0,993

MPE 2,764

Muestra S7 (220°C; 14,1 %MD) sal Aw y exp ypred yexp-ypred yexp-ypred)^2 ABS(yexp-ypred) (yexp-yprom)^2

3 0,555 27,60 28,01 -0,410 0,168 0,015 466,981

2 0,528 36,25 39,66 -3,412 11,645 0,094 148,936

1 0,52 52,09 49,34 2,753 7,579 0,053 9,623

sumatorias 19,392 0,162 625,540

R2 0,969

MPE 5,395

Cuadro D.26. Datos empleados en el ANOVA de efecto simple del factor X2 (%MD) sobre la Tgs predicha por el modelo de Gordon y Taylor. Muestra-sal X1 X2 Tgs predicha 8-3 220 0 61,0

8-2 220 0 --

8-1 220 0 60,3

9-3 220 7,05 62,3

9-2 220 7,05 63,8

9-1 220 7,05 62,7

7-3 220 14,1 69,5

7-2 220 14,1 66,0

7-1 220 14,1 73,1 Tabla ANOVA para Tgspred según X2 (%MD; %p/v)


--------------------------------------------------- -------------------------

Fuente Sumas de cuad. Gl Cuadrado Medio Cociente-F P-Val

--------------------------------------------------- -------------------------

Entre grupos 112,1 2 56,05 02 10,51 0,016

Intra grupos 26,6583 5 5,331 67

--------------------------------------------------- -------------------------

Total (Corr.) 138,759 7

Como pv resultó menor a 0,05, hay diferencias significativas entre las medias de Tgs predichas entre los niveles del factor X2. Contraste Múltiple de Rango para Tgspred según X2 ( % MD; %p/v)

--------------------------------------------------- -----------------------------


X2 Frec. Media Grupos h omogéneos

--------------------------------------------------- -----------------------------

0 2 60,65 X

7,05 3 62,9333 X

14,1 3 69,5333 X

--------------------------------------------------- -----------------------------


--------------------------------------------------- -----------------------------

0 - 7,05 -2,28333 5,41843

0 - 14,1 *-8,88333 5,41843

7,05 - 14,1 *-6,6 4,84639

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