Obtención industrial de enzimas especificas
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Obtención industrial de enzimas especificas Obtención industrial de enzimas especificas Producción de enzimas de origen microbiano Brandon Rosero López ([email protected]) Universidad del Cauca Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y de la Educación Departamento de Química Popayán 2013 Resumen: La obtención de enzimas específicas están ligadas a unas determinadas características que permiten obtener un buen resultado, Tradicionalmente la obtención de enzimas se realizaba por extracción en tejidos vegetales o animales, pero este procedimiento no garantizaba una especificidad, el residuo obtenido era una mezcla de las enzimas presentes en las células, lo que aumentaba el costo de separación de la enzima de interés, La tendencia industrial es el reemplazo de la forma de obtención de enzimas, ha generado buenas repuestas; La generación de enzimas de origen microbiano tiene grandes ventajas sobre la extracción de enzimas en tejidos animales y vegetales. Introducción La constante aplicación de las enzimas en la industria ha conllevado a una producción que garantice abastecer las necesidades requeridas buscando una producción a menores costos y una producción másespecífica lo que garantizaría la pureza considerable de la enzima. La utilización de enzimas se ha dado desde siglos en la industria de la fermentación como en la cerveza, vino pan y queso, sin conocerse el porqué de su modo de acción, ni mucho menos el porqué de su actividad catalítica. En el siglo pasado Takamine patentó la amilasa producida por fermentación de un hongo y Hasen en 1875 inicio una empresa para la extracción de renina de ternera, iniciando así una nueva rama de la bioquímica la ingeniería enzimática [1] Tradicionalmente las enzimas fueron extraídas de plantas y animales, se estima además que el 75% de las enzimas fueron obtenidas por vía microbiana, y el 25% restante se obtienen de origen vegetal. [2] La Producción de enzimas Las enzimas están presentes en las células, por lo cual resulta conveniente la obtención de estas a partir de tejidos animales y tejidos vegetales, el procedimiento consiste en la trituración de tejidos especializados, ya sea el páncreas o el hígado, formando así una papilla que se tratará con un solvente a baja temperatura, agua, acetona (-20°C), glicerina o alguna solución salina, asegurando así la extracción [3] . (Ver figura 1.) [4]
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Obtención industrial de enzimas especificas
Obtención industrial de enzimas especificas
Producción de enzimas de origen microbiano
Brandon Rosero López ([email protected])
Universidad del Cauca
Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y de la Educación
Departamento de Química
Popayán
2013
Resumen: La obtención de enzimas específicas están ligadas a unas determinadas
características que permiten obtener un buen resultado, Tradicionalmente la obtención de
enzimas se realizaba por extracción en tejidos vegetales o animales, pero este
procedimiento no garantizaba una especificidad, el residuo obtenido era una mezcla de las
enzimas presentes en las células, lo que aumentaba el costo de separación de la enzima de
interés, La tendencia industrial es el reemplazo de la forma de obtención de enzimas, ha
generado buenas repuestas; La generación de enzimas de origen microbiano tiene grandes
ventajas sobre la extracción de enzimas en tejidos animales y vegetales.
Introducción
La constante aplicación de las enzimas en
la industria ha conllevado a una
producción que garantice abastecer las
necesidades requeridas buscando una
producción a menores costos y una
producción másespecífica lo que
garantizaría la pureza considerable de la
enzima.
La utilización de enzimas se ha dado
desde siglos en la industria de la
fermentación como en la cerveza, vino
pan y queso, sin conocerse el porqué de
su modo de acción, ni mucho menos el
porqué de su actividad catalítica. En el
siglo pasado Takamine patentó la amilasa
producida por fermentación de un hongo
y Hasen en 1875 inicio una empresa para
la extracción de renina de ternera,
iniciando así una nueva rama de la
bioquímica la ingeniería enzimática [1]
Tradicionalmente las enzimas fueron
extraídas de plantas y animales, se estima
además que el 75% de las enzimas fueron
obtenidas por vía microbiana, y el 25%
restante se obtienen de origen vegetal. [2]
La Producción de enzimas
Las enzimas están presentes en las
células, por lo cual resulta conveniente la
obtención de estas a partir de tejidos
animales y tejidos vegetales, el
procedimiento consiste en la trituración
de tejidos especializados, ya sea el
páncreas o el hígado, formando así una
papilla que se tratará con un solvente a
baja temperatura, agua, acetona (-20°C),
glicerina o alguna solución salina,
asegurando así la extracción[3]
. (Ver
figura 1.)[4]
Obtención industrial de enzimas especificas
La tendencia industrial ha variado en las
últimas décadas, reemplazando la
obtención a partir de tejidos animales o
vegetales por cultivos de
microorganismos seleccionados que
generan la enzima especifica, para poder
considerar el procedimiento industrial es
necesario comprender las diferentes
etapas. La selección del microorganismo
adecuado para proceso debe cumplir unas
características específicas.
Los microorganismos no deben de ser
patógenos, ni estar asociado a la
producción de toxinas, por ello existe una
reglamentación establecida, FDA (Food
and DrugAdministration), que consideran
a una enzima producida por un
microorganismo generalmente reconocido
como segura (GRAS), si no cumple las
medidas establecidas dicha enzima es
catalogada como un aditivo, lo cual se
penaliza con retrasar la aplicación de un
nuevo desarrollo de 5 a 8 años.[1]
en la
tabla 1 se muestran una lista con ejemplos
de microorganismos GRAS.
Tabla 1.Microorganismo que cumplen
GRAS, se presenta el microorganismo y
su enzima
Obtención industrial de enzimas especificas
Otra característica importante en
principio es preferible que la enzima
producida sea extracelularmente, lo que
garantiza una producción más específica
de la enzima; un extracto de enzima
intracelular, contiene al menos 1500
enzimas y proteínas, mientras que el de
una enzima extracelular contiene solo
unas cuantas. Conviene señalar que la
aplicación de esta característica permite
tener en cuenta el interés enzimático,
evitando también una costosa etapa de
recuperación y purificación.
Para la obtención de altos rendimientos
de enzimas es necesario también algún
tipo de mutación por rayos UV o agentes
nitrogenados, también se debe garantizar
un crecimiento rápido del
microorganismo generando así una
reducción razonable en los costos.
Está claro además que la selección del
microorganismo puede hacerse
igualmente en términos de la enzima
deseada,
Mecanismos de Biosíntesis
La síntesis de enzimática puede
controlarse según el interés que se tenga.
La existencia de diversas formas de
regulación ha permitido el desarrollo de
sistemas de alta productividad, no solo a
través de procesos de mutación, sino
también mediante el manejo del medio en
que se encuentre el microorganismo; los
mecanismos de inducción y de represión
representan al manejo del medio de
crecimiento del microorganismo.
La mayor parte de las enzimas
comerciales son inducibles, es decir que
requieren un sustrato para su síntesis, este
sustrato común mente es denominado
iniciador. Según el modelo de Jacob y
Monod[5]
el inductor permite la síntesis de
la enzima al unirse con el represor que
bloquea al gene operador impidiendo su
transcripción. En la tabla 2 se citan
algunos ejemplo de enzimas inducibles.
Enzima Microorganismo Inductor
Dextrancarasa Leconostoc m Sacarosa
Dextanasa Pecillium f Destranas
α- amilasa BacillusSubtilis Almidon
Matosa
Naringinasa Aspagillusniger Naringina
Invertasa Pullularia p Maltosa
Glucosa
isomerasa
Bacilluscoagulans Xilosa
Pectinasa Aspergillus niger Pectina
Tirosinasa Neuroporacrassa D,L-
Tirosina
Tabla 2. Ejemplos de enzimas inducibles
Los mecanismos de represión en la
síntesis de enzimas permiten la inhibición
de la síntesis de alguna enzima específica,
generalmente inducibles, este proceso es
denominado represión Catabólica, Un
mecanismo menos frecuente de inhibición
lo constituye la retrorrepresión,
mecanismo mediante el cual la síntesis de
enzima se ve reprimida por la presencia
de productos finales de biosíntesis, en la
tabal 3 se muestran ejemplos de de
enzimas sujetas a represión catabólica.
Enzima Microorganismo Represor
Invertaza Neurisporacrassa Glucosa-
fructosa
Lactasa Eschericchiacoli Glucosa
Destransac
arasa
Leuconostoc m. Sacarosa
Celobiasa Tricodermaviride Celobiosa
Proteasa Bacillussubtillis Glucosa
Catalasa Rhodotorula Glucosa
α-Amilasa Bacillus s. Fructosa
Tabla 3. Ejemplos de enzimas sujetas a
represión catabólica
Obtención industrial de enzimas especificas
La productividad enzimática se puede
mejorar también a través de un
mejoramiento genético, para evitar
algunos de los problemas mencionados
por ejemplo si la enzima que necesitamos
es inducible, y el inductor es de costo
elevado, la obtención de organismo
mutantes con necesidades reducidas o
nulas de inductor podría ser la solución al
problema, si la enzima está sujeta a
retrorrepresión, el evitar la presencia de
productos finales en el medio de cultivo
garantizaría que este fenómeno no se
presente, la eliminación de los productos
finales se puede hacer mediante diálisis o
ultrafiltración, o también la obtención de
mutantes no sujetos a represión por
productos finales evitaría la
retroprodución.
Características generales de los procesos
de fermentación
Como parte fundamental del proceso vital
de los microorganismos estos, creces, se
reproducen, y segregan productos
bioquímicos complejos, en donde este
último proceso es el de mayor interés. La
industria de procesos bioquímicos están
relacionadas con la fermentación, desde
el punto de vista bioquímico,
fermentación es el nombre dado
usualmente a la clase general de cambios
químicos producidos en compuestos
orgánicos (sustratos) por actividad de los
organismos vivientes.
Los procesos de fermentación típicos se
llevan a cabo esencialmente en
recipientes denominados fermentadores,
que están controlados por efectores
internos y externos, Los efectores
internos están representados por la
dotación genética que posee el
microorganismo considerado y por su
mecanismo de de regulación metabólica,
como ya se ha nombrado estos factores
pueden ser modificados genéticamente.
Los efectores externos, están
caracterizados por su naturaleza física o
química, los efectores externos físicos
están asociados a temperatura, agitación,
aireación, presión, etc. Si hay una
variación de alguna de estas condiciones
también existirá la existirá una variación
notable sobre el proceso de fermentación.
Los efectos externos químicos están
representados por pH, componentes del
medio de crecimientos, oxigeno.
Cabe señalar, que la eficiencia de la
obtención de la enzima viene dada en
función de los efectores, tanto internos
como externos, describamos los externos.
El crecimiento del microorganismo y la
producción de la enzima deben regularse
con los efectores externos, si regulamos la
temperatura en la cual los
microorganismos tienen un máximo de
crecimiento debemos también garantizar
que la temperatura sea la adecuada
también para la estabilidad de una cierta
enzima, lo conlleva a una optimización
con objeto de encontrar la temperatura de
proceso adecuada para una máxima
producción y preservación de la enzima
durante la fermentación. Por lo que es
común encontrar temperaturas de máxima
producción de enzimas inferiores a las de
máximo crecimiento del microorganismo.
Por ejemplo podemos citar un caso
interesante como el de la α-amilasa de
Bacilluscoagulans: la enzima producida
a 55°C es de 9 a 10 veces más estable a
90°C que la enzima producida a 35°C, al
final del proceso la temperatura es
disminuida rápidamente, en caso de
producción de enzimas termolábiles[6]
. En
términos de pH es necesario distinguir
entre cuatro valores, que no
necesariamente coinciden:
Obtención industrial de enzimas especificas
El pH de máximo crecientito del
microorganismo productor
El pH de máxima producción de
enzima
pH de máxima estabilidad de la
enzima
El pH de máxima actividad
enzimática
Además de favorecer el rendimiento de la
producción de la enzima estos parámetros
de pH también sirven para evitar cambios
que puedan afectar la actividad de la
enzima, hay casos donde no
necesariamente estos parámetros puedan
coincidir, por ejemplo la subtilisina de
Bacilluslicheniformises estable a un pH
de 5 a10 unidades, y tiene una óptima
actividad entre 9 y 11 unidades y la
máxima producción se obtiene entre 6.5 y
6.8, [6]
, Por otro lado es interesan ver que
aunque no sea estrictamente un método
de purificación, existen tratamientos
térmicos y de pH que son aplicados al
final de un proceso fermentativo con el
fin de eliminar actividades enzimáticas
contaminantes menos estables que la
enzima de interés.
La influencia de los efectores internos y
externos sobre el comportamiento de una
célula microbiana se puede representar
esquemáticamente como la muestra la
figura 2.
Figura 2. Representación
esquemática.[7]
Esquema general de los procesos
industriales
En la figura 3 se representa gráficamente
cada uno de los aspectos que requiere el
proceso industrial, existen 4 etapas:
primero está la propagación de cultivos,
esta etapa inicia en el laboratorio y
generalmente comienza en un tubo de
ensayo que contiene el repique del
microorganismo de interés, en la segunda
etapa se inicia la fermentación, con el
material obtenido anteriormente, se
siembra en el tanque inocuolo, de este se
pasa posteriormente al fermentador, la
tercera etapa comprende las operaciones y
procesos de ceración y purificación de los
productos, estas etapas comprenden en
forma general y sucesivamente:
a) Separación de insolubles por filtración,
centrifugación, o decantación;
b) separacionesprimarias por extracción,
absorción, adsorción, ultrafiltración;
c) purificaciónpor extracción líquido-
líquido, o extracción a dos fases
acuosas,o cromatografíade afinidad, y
finalmente d) aislamiento del producto.
La etapa cuatro comprende el tratamiento
deefluentes: si bien no tiene una relación
directa con el producto, que es la razón de
ser de la industria de fermentación,
representa una etapa imprescindible
porque es fundamental controlar la
calidad del efluente que sale de la fábrica
y que es enviado generalmente a un curso
de agua, sea un canal, arroyo, un río o al
mar. En la figura 4 también se representa
un esquema mas detallado.
Obtención industrial de enzimas especificas
Figura 3. Esquema general de los procesos de fermentación.[7]
Obtención industrial de enzimas especificas
Figura 4. Diagrama de flujo para manufactura de enzimas extracelulares.[8]
Obtención industrial de enzimas especificas
Algunos ejemplos de producción
industrial de enzimas
Amilasas
El almidón, polímero de glucosa, es
después de la celulosa el polisacárido más
abundante en la naturaleza y materia
prima para una gran diversidad de
productos de la industria alimentaria.
Existen diversas enzimas involucradas en
su formación y constituyen
probablemente el sector alimentario de
mayor desarrollo en los últimos 15 años
en lo que a tecnología enzimática para el
sector alimentario de refiere. A
continuación se describen las principales
características de amilasas de origen
microbiano
α-amilasa
Son producidas principalmente por
bacterias y hongos y pueden ser
clasificadas por su actividad: licuefacción
o sacarificación. En el segundo caso se
llegan a producir cantidades importantes
de azucares (glucosa, maltosa y
maltotriosa), mientas que en el primero se
desdobla el almidón, disminuyendo
rápidamente la viscosidad, formando
maltohexosa como producto más
pequeño. En e general Bacillus es la
fuente bacteriana de mayor importancia
comercial de dos de ellos: B.
amyloliquefaciens y B. licheniformis. La
enzima del primero fue la primera en
aparecer en el mercado, mientas que la
alfa amilasa de b. licheniformis es
actualmente la mas empleada por su alta
termoestabilidad.
Pectinasas
Por pectinasas se denominan a un
complejo de enzimas que se clasifican de
acuerdo con el sustrato ( pectina o ac.
Péctico), del tipo de reacción y del
mecanismo, incluyéndose además a la
pectinesterasa. Los productos comerciales
provienen generalmente de Aspergillus
niger.[8]
Celulasas (EC 3.2.1.4)
La celulosa es rápidamente hidrolizada en
la naturaleza por organismos aeróbicos
del suelo, particularmente por los hongos
que degradan la madera. Los organismos
anaeróbicos del rumen y del intestino son
responsables de la digestibilidad de la
celulosa en los animales rumiantes y en
los herbívoros.
Invertasa (EC 3.2.1.26)
Hidrolizan el residuo terminal no reductor
de b Dfructofuranósidos. El principal
sustrato es la sacarosa,pero también
pueden hidrolizar rafinosa para dar
fructosay melibiosa. La enzima también
tiene actividadfructotransferasa.
El pH óptimo es 4.5, pero se logra un
80% de actividaden el rango entre 3.5 .
4.5. Tienen actividad máximaentre 50-60
0C. El efecto de la concentración de
sustratoes de particular relevancia, ya que
la máxima actividadse logra con
concentraciones de sacarosa del 5-10%. A
concentración de sacarosa del 70% la
actividad es solo de 25% del máximo.
La invertasa es de gran importancia en la
industria dealimentos porque la hidrólisis
de la sacarosa forma jarabesmás dulces,
los monosacáridos formados por laacción
de la invertasa son más solubles que la
sacarosay por lo tanto no cristalizan en
los jarabes concentrados.
Obtención industrial de enzimas especificas
En [4] se citan más ejemplos de diferentes
enzimas.
Conclusiones
Respecto a los procesos de
obtención de enzimas, el
fermantativo tiene una serie de
ventajas sobre el de extracción de
tejidos animales y vegetales; entre
estas ventajas se pueden
mencionar, la alta velocidad de
sintensis,, el elevado rendimiento
de conversión de sustrato
Los microorganismos productores
de enzimas no pueden ser
patógenos y, preferiblemente,
deben excretar la enzima
producida al medio de cultivo
(enzimas extracelulares)
La Purificación de enzimas se
puede llevar acabo por una serie
de operaciones, entre las que se
pueden mencionar: la
precipitación de la enzima por
fuerza iónica(salado de enzimas),
precipitación por solvente
orgánico miscible (liquido-
liquido), separación por ultra
filtración, diálisis, y cromatografía
de adsorción.
Un proceso de fermentación típico
es esencialmente un proceso que
se lleva a cabo en un recipiente
llamado fermentador o en general,
biorreactor, mediante el cual
determinados sustratos que
componen el medio de cultivo son
transforma dos por acción
microbiana en metabolitos y
biomasa. El microorganismo va
aumentando en su concentración
en el transcurso del proceso al
mismo tiempo que el medio se va
modificando y se forman
productos nuevos como
consecuencia de las actividades
catabólicas y anabólicas.
Bibliografía
[1] Garibay, G. Quintero, R. López, M;
Biotecnología alimentaria, Editorial
Limusa S.A. México, D.F. 2004, pág. 577.
[2] Hernández, A. Microbiología
industrial 1ª Ed, Editorial: EUNED,
Costa Rica, San José, 2003, pág. 206
[3] Las enzimas en los alimentos. Su
importancia en la química y en la
tecnología de alimentos: http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/c
iencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth0
2/(consultado: 27/03/2013)
[4] Carrera J. Producción y aplicación
de enzimas industriales, Universidad del
Cauca, Colombia, Popayán Cauca, n1.
29 noviembre 2002, pág.2
[5] Garibay, G. Quintero, R. López, M;
Biotecnología alimentaria, Editorial
Limusa S.A. México, D.F. 2004, pág. 580.
[6] Garibay, G. Quintero, R. López, M;
Biotecnología alimentaria, Editorial
Limusa S.A. México, D.F. 2004, pág. 587
[7] Aspectos generales de los procesos de
fermentación:http://www.science.oas.org/S
imbio/mbio_ind/cap2_mi.pdf(consultado:
29/03/2013)
[8]Garibay, G. Quintero, R. López, M;
Biotecnología alimentaria, Editorial
Limusa S.A. México, D.F. 2004, pág. 594.
