Oleh : Fetreo Negeo P. 105070200111004 Angkatan 2010 Ni...
Transcript of Oleh : Fetreo Negeo P. 105070200111004 Angkatan 2010 Ni...
i
LAPORAN AKHIR PKM-P
DIABETIC WOUND HEALING : EKSTRAK CACING TANAH (Pheretima
aspergillum) SEBAGAI AKSELERATOR PENYEMBUHAN ULKUS
DIABETIK PADA TIKUS MODEL DIABETES MELITUS MELALUI
INDUKSI DENSITAS AKSON SECARA IN VIVO
Oleh :
Fetreo Negeo P. 105070200111004 Angkatan 2010
Ni Putu Jeny M. 105070201111013 Angkatan 2010
Arinda Nur Y. 105070200111010 Angkatan 2010
Dwi Astika Sari 105070201111021 Angkatan 2010
I Wayan Gede S. 115070200111021 Angkatan 2011
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2013
ii
LEMBAR PENGESAHAN
1. Judul Kegiatan : Diabetic Wound Healing : Ekstrak Cacing Tanah
(Pheretima aspergillum) Sebagai Akselerator
Penyembuhan Ulkus Diabetik Pada Tikus Model
Diabetes Melitus Melalui Induksi Densitas Akson
Secara In Vivo
2. Bidang Kegiatan : (√) PKM-P ( ) PKM-M ( ) PKM-KC
( ) PKM-K ( ) PKM-T
3. Ketua Pelaksana Kegiatan
a. Nama Lengkap : Fetreo Negeo Putra
b. NIM : 105070200111004
c. Jurusan : Ilmu Keperawatan
d. Universitas : Universitas Brawijaya
e. Alamat Rumah dan No Telp/HP: RT 20/ RW 03 Ds Buluagung Kec.
Karangan Kab. Trenggalek
085755172513
f. Alamat email : [email protected]
4. Anggota Pelaksana Kegiatan : 4 orang
5. Dosen Pendamping
a. Nama Lengkap dan Gelar : Ns.Heri Kristianto,S.Kep.,M.Kep.Sp.KMB
b. NIDN : 0026118201
c. Alamat Rumah dan No Telp/Hp: Pondok Alam Sigura-gura Blok A2/20
Karang Besuki Malang
085234068944
6. Biaya Kegiatan Total
a. Dikti : Rp. 11.200.000,00
b. Sumber lain : -
7. Jangka Waktu Pelaksanaan : 4 bulan
Menyetujui
Pembantu Dekan I FKUB
dr. Sri Andarini, M.Kes
NIP. 195804141987012001
Pembantu Rektor III
Bidang Kemahasiswaan
Ir. H. RB. Ainurrasjid, MS
NIP. 195506181981031002
Malang, 20 Agustus 2013
Ketua Pelaksana Kegiatan
Fetreo Negeo Putra
NIM. 105070200111004
Dosen Pendamping
Ns. Heri Kristianto, S.Kep., M.Kep.Sp.KMB
NIDN. 0026118201
iii
DIABETIC WOUND HEALING : EKSTRAK CACING TANAH
(PHERETIMA ASPERGILLUM) SEBAGAI AKSELERATOR
PENYEMBUHAN ULKUS DIABETIK PADA TIKUS MODEL DIABETES
MELITUS MELALUI INDUKSI DENSITAS AKSON SECARA IN VIVO
Fetreo Negeo Putra1, Ni Putu Jeny Mardiati
1, Arinda Nur Yunitasari
1,
Dwi AstikaSari1, I Wayan Gede Saraswasta
1, Heri Kristianto
2
1. Ilmu Keperawatan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya
2. Departemen Keperawatan Medikal Bedah FK UB-RSUD dr Saiful Anwar
Abstrak
Latar Belakang: Neuropati merupakan komplikasi serius penyebab ulkus
diabetik pada penderita diabetes melitus (DM). Kondisi ini menyebabkan
kerusakan pada saraf perifer akibat degenerasi akson. Beberapa penelitian
menunjukkan bahwa ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum) mampu
meregenerasi saraf perifer. Kemampuan regenerasi ini melibatkan proliferasi dan
diferensiasi sel schwan dalam mendukung regenerasi akson saraf perifer.
Tujuan: Penelitian ini ditujukan untuk membuktikan pengaruh pemberian ekstrak
cacing tanah (Pheretima aspergillum) terhadap akselerasi penyembuhan ulkus
diabetik melalui induksi densitas akson saraf perifer pada tikus Rattus norvegicus
jantan galur wistar yang diiduksi Diabetes Melitus (DM).
Metode: Penelitian ini menggunakan desain true experimental in vivo dengan
metode Randomized Posttest Only Controlled Group Design. Dalam penelitian ini
terdapat 5 kelompok : kontrol (-) yang diinduksi DM dan diberi perawatan ulkus
diabetik dengan normal saline (NaCl 0,9%), kontrol (+) yang diinduksi DM dan
diberi perawatan ulkus diabetik dengan hidrogel (sodiumcarboxymethylcellulose),
kelompok perlakuan yang diinduksi DM dan diberi perawatan ulkus diabetik
secara topikal, oral, dan topikal-oral. Pengambilan jaringan kulit dilakukan pada
hari ke-21 dan dilakukan pengukuran kontraksi luka dan penghitungan densitas
akson.
Hasil: Uji ANOVA menunjukkan bahwa pemberian ekstrak cacing tanah
(Pheretima aspergillum) mampu meningkatkan persentase kontraksi luka dan
jumlah densitas akson saraf perifer secara bermakna dengan nilai p=0,013 (p<0,05)
dan p=0,000 (p<0,05). Uji Post Hoc dilakukan untuk melihat kelompok mana yang
berbeda secara bermakna.
Kesimpulan: Pemberian ekstrak tanah (Pheretima aspergillum) dapat
meningkatkan persentase kontraksi luka dan jumlah densitas akson saraf perifer
pada tikus putih (Rattus novergicus) galur Wistar yang diinduksi Diabetes Melitus.
Kata Kunci: Diabetes Melitus, Ulkus Diabetik, Cacing Tanah (Pheretima
aspergillum), Regenerasi Saraf Perifer.
iv
KATA PENGANTAR
Puji syukur bagi Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberi petunjuk dan
hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini dengan judul
Diabetic Wound Healing : Ekstrak Cacing Tanah (Pheretima aspergillum) Sebagai
Akselerator Penyembuhan Ulkus Diabetik Pada Tikus Model Diabetes Melitus
Melalui Induksi Densitas Akson Secara In Vivo.
Topik penelitian ini diangkat setelah melihat kenyataan tingginya kasus
komplikasi kronik yang terjadi pada pasien dengan Diabetes Melitus (DM). Salah
satu komplikasi kronik tersebut adalah terjadinya proses neuropati atau kerusakan
pada jaringan saraf perifer dengan diikuti timbulnya ulkus diabetik. Kondisi ini
pada akhirnya dapat menimbulkan kematian jaringan dan berujung pada tindakan
amputasi yang sangat berpengaruh pada quality of life pasien. Dalam penelitian ini
kami membuat desain akselerator penyembuhan ulkus diabetik melalui induksi
densitas akson yang kami istilahkan dengan nama “Diabetic Wound Healing”.
Penulis menyadari bahwa baik dalam perjalanan penelitian maupun
penyelesaian penelitian ini banyak memperoleh bimbingan dan motivasi dari
berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis menyampaikan rasa
syukur dan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Dr. dr. Karyono Mintaroem, Sp.PA selaku Dekan Fakultas
Kedokteran Universitas Brawijaya.
2. Dr. dr. Kusworini, M. Kes, Sp. PK selaku Ketua Jurusan Ilmu
Keperawatan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.
3. Ns.Heri Kristianto,S.Kep.,M.Kep.Sp.KMB sebagai pembimbing yang
selalu memberi masukan, saran serta bimbingan yang sangat berharga
selama proses penelitian ini.
4. Dr. dr. I Ketut Gede Muliartha, Sp. PA dan dr. Indriati Dwi Rahayu
yang telah memberikan masukan dan saran untuk terselesaikannya
penelitian ini.
5. Pak Satuman, Mas Didin, dan Mas Mijan selaku analis Laboratorium
Faal dan Patologi Anatomi FKUB yang telah membantu kami dalam
melakukan penelitian.
6. Semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian penelitian ini
Akhir kata, penulis berharap semoga penelitian ini dapat menambah
khasanah ilmu pengetahuan dan bermanfaat bagi semua pihak. Penulis menyadari
dalam penyelesaian penelitian ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu,
saran dan kritik yang sifatnya membangun sangat diharapkan oleh penulis demi
tersempurnanya penelitian selanjutnya.
Malang, Agustus 2013
Penulis
1
I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Masalah
Diabetes melitus (DM) telah menempatkan Indonesia di urutan ke-4 dunia
setelah negara India, China dan Amerika dengan jumlah Diabetesi sebesar 8,4 juta
orang dan diperkirakan akan terus meningkat sampai 21,3 juta orang di tahun
2030 (King et al., 2003). Komplikasi menahun DM terdiri atas neuropati 60%,
penyakit jantung koroner 20,5%, ulkus diabetik 15%, retinopati 10%, dan
nefropati 7,1% (Waspadji, 2006). Neuropati baik neuropati sensorik maupun
motorik dan autonomik akan mengakibatkan berbagai perubahan pada kulit dan
otot. Hal ini kemudian menyebabkan terjadinya perubahan distribusi tekanan pada
telapak kaki dan selanjutnya akan mempermudah terjadinya ulkus diabetik
(Hastuti, 2008).
Penyembuhan ulkus diabetik berbeda dengan penyembuhan luka akut
normal. Pada ulkus diabetik terjadi penurunan dan gangguan produksi NGF
(Brem & Canic, 2007). Faktor neurotropik NGF memberikan respon mayor dalam
meregulasi proliferasi, diferensiasi, dan remielin sel schwan (Chen et al., 2007).
Sel schwan berdiferensiasi menjadi selubung mielin dan berproliferasi hingga
bagian distal dari area saraf yang mengalami injuri untuk mendukung
pemanjangan akson (Chang et al., 2011a). Penderita DM apabila kadar glukosa
darah tidak terkendali akan menimbulkan kerusakan jaringan saraf akibat adanya
penimbunan sorbitol dan fruktosa sehingga mengakibatkan akson menghilang
(Waspadji, 2006).
Terapi perawatan ulkus diabetik yang ideal seharusnya dapat menghambat
terjadinya neuropati dengan mempercepat proses regenerasi akson pada saraf
perifer melalui peningkatan NGF. Akan tetapi, sampai saat ini belum ditemukan
perawatan ulkus diabetik dengan kriteria demikian. Ulkus diabetik bila tidak
ditangani dengan tepat akan menimbulkan kecacatan bahkan berujung pada
amputasi. Hal ini sangat berpengaruh pada penurunan quality of life (Bradbury &
Price, 2011).
Pheretima aspergillum atau lebih populer dengan sebutan cacing tanah,
merupakan spesies yang memiliki komposisi senyawa kimia tinggi yaitu protein
(43,31%) yang memiliki fungsi mempercepat regenerasi saraf perifer (Sofyan,
2007). Studi in vitro pada ekstrak Pheretima aspergillum memiliki efek terhadap
regenerasi akson saraf perifer. Ekstrak Pheretima aspergillum menyebabkan
peningkatan signifikan terhadap NGF pada sel PC12 yang berhubungan dengan
protein 43 dan sinapsin I (Chen et al., 2010). Ekstrak Pheretima aspergillum
dapat menstimulasi migrasi sel schwan melalui jalur mitogen-activated protein
kinase (MAPK) (Chang et al., 2011a).
Dari pemaparan data empiris di atas muncul hipotesis bahwa ekstrak
cacing tanah (Pheretima aspergillum) dapat mempercepat proses penyembuhan
ulkus diabetik melalui induksi densitas akson pada saraf perifer. Untuk
membuktikannya diperlukan penelitian dalam mengungkap efek ekstrak cacing
tanah terhadap regenerasi akson saraf perifer pada ulkus diabetik melalui
pendekatan biomolekuler secara in vivo.
1.2 Perumusan Masalah
Apakah ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum) dapat menginduksi
densitas akson ulkus diabetik secara in vivo pada tikus Rattus norvegicus
galur wistar?
2
1.3 Tujuan Program
Tujuan Umum
Membuktikan pengaruh ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum)
terhadap penyembuhan ulkus diabetik pada tikus model diabetes melitus.
Tujuan Khusus
1. Mengukur kontraksi luka pada ulkus diabetik setelah pemberian ekstrak cacing
tanah (Pheretima aspergillum)
2. Menghitung densitas akson pada ulkus diabetik setelah pemberian ekstrak
cacing tanah (Pheretima aspergillum)
1.4 Luaran Yang Diharapkan
Luaran yang diharapkan berupa artikel ilmiah dan paten terkait dengan penerapan
cacing tanah (Pheretima aspergillum) dalam penyembuhan ulkus diabetik pada
penderita diabetes melitus.
1.5 Kegunaan Program
1. Kegunaan Praktis, dapat diketahuinya efek dari kandungan cacing tanah
dalam meningkatkan densitas akson pada ulkus diabetik serta sebagai
referensi dalam mengembangkan penelitian selanjutnya mengenai biota
Indonesia di bidang farmakoonkologi melalui pendekatan biomolekuler.
2. Kegunaan Akademis, dapat dijadikan sebagai dasar teori untuk menambah
wawasan ilmu pengetahuan sekaligus sebagai dasar untuk pengembangan
penelitian selanjutnya dalam bidang kesehatan, khususnya tentang terapi
farmakologi pada ulkus diabetik untuk menghambat proses neuropati.
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Diabetes Melitus
Definisi Diabetes Melitus
Diabetes melitus (DM) merupakan suatu penyakit yang melibatkan hormon
endokrin pankreas, antara lain insulin dan glukagon. Manifestasi utamanya
mencakup gangguan metabolisme lipid, karbohidrat, dan protein yang pada
gilirannya merangsang kondisi hiperglikemia (Nugroho, 2006).
Patogenesis Ulkus Diabetik
Ulkus diabetik adalah salah satu bentuk komplikasi kronik DM berupa luka
terbuka pada permukaan kulit yang dapat disertai adanya kematian jaringan
setempat (Frykberb, 2002). Ulkus diabetik disebabkan adanya tiga faktor yang
sering disebut trias yaitu iskemik (vaskular insufisiensi), neuropati, dan infeksi
(Sapico, 2007). Pada penderita DM apabila kadar glukosa darah tidak terkendali
akan terjadi komplikasi kronik yaitu neuropati yang menimbulkan perubahan
jaringan saraf karena adanya penimbunan sorbitol dan fruktosa sehingga
mengakibatkan akson menghilang, penurunan kecepatan induksi, menurunnya
reflek otot, atrofi otot, keringat berlebihan, kulit kering dan hilang rasa, apabila
Diabetisi tidak hati-hati dapat terjadi trauma yang menyebabkan ulkus diabetik
(Waspadji, 2006).
Perawatan Ulkus Diabetik
Perawatan luka modern menekankan metode moist wound healing atau
menjaga agar luka dalam keadaan lembab. Luka akan menjadi cepat sembuh
apabila eksudat dapat dikontrol, menjaga agar luka dalam keadaan lembab, luka
tidak lengket dengan bahan kompres, terhindar dari infeksi dan permeabel
3
terhadap gas. Tindakan dressing merupakan salah satu komponen penting dalam
mempercepat penyembuhan lesi. Ada beberapa jenis dressing yang sering dipakai
dalam perawatan ulkus diabetik, seperti: hydrogel, hydrocolloid, calcium alginate,
foam, dan sebagainya (Hastuti, 2008).
2.2 Cacing Tanah (Pheretima aspergillum) Taksonomi
Cacing tanah (Pheretima aspergillum) atau yang sering disebut dengan
earthworm memiliki taksonomi sebagai berikut: (Santoso, 2002)
Kingdom : Animalia
Sub-kingdom : Metazoa
Filum : Annelida
Kelas : Oligochaeta
Famili : Megascolecidae
Genus : Pheretima
Species : Pheretima aspergilum Gambar 1. Pheretima aspergillum
Morfologi
Ukuran tubuh Pheretima aspergillum dapat mencapai 30cm dengan diameter
mencapai 10mm. Cacing tanah jenis ini segmennya mencapai 95 - 150 segmen.
Klitelumnya terletak pada segmen 14-16. Tubuhnya berbentuk gilik panjang dan
silindris berwarna kemerahan. Cacing ini hidup didalam liang tanah yang lembab,
subur dan suhunya tidak terlalu dingin. Untuk pertumbuhannya yang baik, cacing
ini memerlukan tanah yang sedikit asam sampai netral atau pH 6 - 7,2 (Santoso,
2002).
Kandungan Protein
Kandungan protein pada Pheretima sebesar 43,31%. Protein pada cacing
tanah selain berupa protein struktural juga berupa enzim dan metalloprotein.
Protein tersebut tersusun dari semua asam amino esensial (Sofyan, 2007).
2.3 Densitas Akson
Sistem saraf terbagi menjadi sistem saraf pusat dan sistem saraf perifer,
dimana terdapat perbedaan struktur anatomi dan kemampuan regenerasi.
Regenerasi akson merupakan hasil dari aktivitas sel schwan yang menyediakan
aktivitas penting bagi regenerasi saraf perifer (Chang et al.,2011a). Terdapat tiga
respon mayor yang meregulasi proliferasi, diferensiasi, dan remielin sel schwan
yaitu faktor neurotropik, protein extracellular matrix (ECM), dan hormon. Salah
satu faktor neurotropik tersebut adalah nerve growth factor (NGF) (Chen et al.,
2007). NGF adalah molekul alami dalam tubuh yang merangsang pertumbuhan
dan diferensiasi simpatik dan saraf sensorik (Muangman et al., 2009).
Neurotropic signaling NGF diperantarai oleh dua tipe reseptor yaitu
tropomyosine kinase receptors (Trk) khususnya TrkA yang selektif mengikat
NGF dan p75NTR
. Setelah berikatan dengan reseptornya, NGF akan mengaktivasi
phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) dan selanjutnya mendukung pertumbuhan
akson (Chen et al., 2007). Ekstrak Pheretima aspergillum dapat menginduksi
insulin-like growth factor-1 (IGF-1) dan P13K. IGF-1 merupakan hormon
polipeptide yang disintesa oleh proliferasi sel schwan sebagai respon terhadap
growth hormone untuk menstimulasi pertumbuhan saraf perifer. IGF-1
melindungi neuron pada saraf perifer dari apoptosis dengan mengaktivasi jalur
P13K (Chang et al., 2011b).
4
III. METODE PENDEKATAN
3.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan desain true experimental in vivo dengan metode
Randomized Post-test Only Controlled Group Design.
3.2 Variabel Penelitian
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah perawatan ulkus diabetik yang
dibagi dalam beberapa kelompok. Kelompok 1: Kontrol Negatif (tikus DM yang
diberi perawatan ulkus dengan normal saline/ NaCl 0,9%). Kelompok 2: Kontrol
Positif (tikus DM yang diberi perawatan ulkus dengan hidrogel). Kelompok
Perlakuan 1 (tikus DM yang diberi perawatan ulkus dengan ekstrak cacing tanah
secara oral pada konsentrasi 100 mg/ml). Kelompok Perlakuan 2 (tikus DM yang
diberi perawatan ulkus dengan ekstrak cacing tanah secara topikal pada dosis 100
mg/kgBB). Kelompok Perlakuan 3 (tikus DM yang diberi perawatan ulkus dengan
ekstrak cacing tanah secara oral dan topikal pada konsentrasi 100mg/m dan dosis
100mg/kgBB).
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah: (a) persentase kontraksi luka dan
(b) densitas (kepadatan) akson saraf perifer
3.2 Subyek dan Sample
Sampel penelitian adalah tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar jantan,
berusia 10-12 minggu, berat badan 150-200 gram. Perhitungan besarnya
pengulangan pada sampel adalah sebagai berikut (Hidayat, 2009):
(np-1) – (p-1) ≥ 16 (p: jumlah perlakuan, n: jumlah ulangan), p=5 sehingga
(5n-1) – (5-1) ≥ 16
n ≥ 4,2 Dibulatkan ke atas menjadi 5 pengulangan
3.3 Metode Penelitian
Ekstraksi Pheretima aspergillum
Cacing tanah 500 gram dikeringkan dengan suhu 50o
C kemudian
dihancurkan dengan cara ditumbuk atau dihaluskan dengan blender dan disaring
untuk memisahkan partikel yang relative besar dan tepung bahan. Tepung bahan
yang diperoleh selanjutnya diekstrak dengan metode maserasi (Chang et al.,
2011a). Timbang tepung bahan yang akan diekstrak. Masukkan kedalam baker
glas dan tuangkan pelarut dengan perbandingan (1:3) 1 kg bahan dalam 3 liter
pelarut etanol 70%. Rendam bahan dan diamkan pada suhu kamar selama minimal
2x24 jam kemudian saring bahan menggunakan kertas saring whatman no 40.
Evaporasi untuk menghilangkan sisa pelarut. Oven sisa pelarut yang masih tersisa
pada suhu 40oC hingga benar-benar tidak mengandung pelarut. Hasil ekstraksi
berbentuk pasta sebanyak 36 gram.
Induksi Diabetes Melitus
Tikus diinduksi DM dengan injeksi Streptozotocin (STZ) intraperitonial
single dose 40mg/kgBB dalam pelarut buffer sitrat 0,1 M pH 4.5 setelah
sebelumnya dipuasakan selama 12 jam. Tiga hari setelah injeksi STZ, glukosa
darah diukur melalui vena ekor dengan menggunakan glukometer (Multi-check,
NESCO, Taiwan) dan tikus dengan glukosa darah diatas 200 mg/dL dinyatakan
sebagai diabetik (Zangiabadi et al., 2011). Tikus di tunggu selama 4 minggu
setelah induksi DM untuk proses neuropati (Kappelle et al., 1993)
Pembuatan Ulkus Diabetik
Tikus dianastesi ketamine intraperitoneal dengan dosis 25 mg/kgBB,
kemudian difiksasi dalam posisi pronasi. Bulu daerah punggung dicukur, lalu
5
dilakukan desinfeksi dengan alkohol 70%. Pembuatan ulkus diabetik melalui luka
eksisi berukuran 1,5x1,5 cm pada kulit dengan menggunakan pisau bedah pada
epidermis hingga hipodermis/lapisan subkutan (ulkus derajat 2) (Li et al., 2011).
Perawatan Ulkus Diabetik
Perawatan ulkus diabetik dilakukan 1 kali sehari selama 21 hari (Juranek et
al., 2013). Teknik perawatan secara topikal menggunakan teknik steril dengan
perawatan luka tertutup kasa untuk mencegah terjadinya infeksi. Teknik
perawatan secara oral menggunakan sonde. Pemberian ekstrak topikal
menggunakan konsentrasi 100 mg/ml sedangkan pemberian ekstrak oral
menggunakan dosis 100 mg/kgBB (Chang et al., 2011a; Liu et al., 2013).
Pembuatan Preparat Jaringan Kulit
Tikus dieutanasia dengan inhalasi ether pada hari ke-21. Kulit pada daerah
ulkus dan sekitarnya dieksisi menggunakan pisau bedah mencapai batas lapisan
otot. Jaringan direndam dalam larutan fiksatif formalin 10% selama 24 jam,
selanjutnya dilakukan pembuatan preparat jaringan kulit. Pengeringan dilakukan
untuk menghilangkan air dari potongan jaringan dengan cara merendam berturut-
turut secara bertahap dalam larutan etanol (70% sampai 100%). Larutan kemudian
diganti dengan larutan xylene. Setelah jaringan dipenuhi dengan larutan, jaringan
dimasukkan dalam parafin cair di dalam oven pada suhu 58-600
C. Blok keras
yang berisi jaringan kemudian diiris longitudinal dengan pisau baja atau pisau
kaca mikrotom setebal 10 µm (Junqueira & Carneiro, 2004).
Pengukuran Kontraksi Luka
Ulkus diabetik didokumentasikan menggunakan digital camera 16 Mpixel.
Luas luka yang tidak sembuh setelah perawatan luka selama 21 hari diukur
menggunakan program AutoCAD 2009. Kontraksi luka dihitung dengan
menggunakan rumus: persentase kontraksi luka = [(luas luka awal – luas luka
yang tidak sembuh) / luas luka awal] x 100% (Li et al., 2011).
Penghitungan Densitas Akson
Preparat jaringan kulit dipulas dengan menggunakan impregnasi perak (silver
impregnation) (Switzer, 2000 ; Grant, Hollander, & Aldskogius, 2004). Jaringan
terlebih dahulu dibasahi dengan aquades, kemudian homogenasi 5 tetes reagen
potassium permanganate dengan 5 tetes reagen acid activation buffer dan teteskan
selama 5 menit kemudian bilas dengan aquades. Untuk seterusnya teteskan reagen
sesuai urutan kemudian bilas dengan aquades. Reagen tersebut adalah oxalic acid
selama 3 menit, iron ammonium sulphate selama 2 menit, ammoniacal buffer
selama 2 menit, formic aldehyde buffer selama 2 menit, sodium thiosulphate
selama 4 menit, kemudian bilas dengan air mengalir selama 5 menit. Dehidrasi
dengan segera, bersihkan dengan xylol, dan rekatkan (mounting) dengan balsam
serta tutup dengan coverslip. Hasil pemulasan impregnasi perak adalah berwarna
hitam untuk serabut saraf (nervous fibers) (Diapath, 2013). Migrasi serabut saraf
diamati disekitar folikel rambut (Gagnon et al., 2011). Slide kulit hasil
pemeriksaan Silver diamati menggunakan program Scan Dot Slide OlyVIA.
Kemudian jumlah akson dihitung dengan pembesaran 20x obyektif pada tiap slide
dari masing-masing tikus sebanyak 10 lapang pandang kemudian dirata-rata.
Prosedur Pengumpulan dan Analisa Data
Hasil pengukuran tikus kontrol dan perlakuan dianalisa secara statistik dengan
menggunakan program SPSS 18.0 for Windows XP dengan tingkat kebermaknaan
0,05 (p=0,05) dan taraf kepercayaan 95% (α = 0,05). Langkah-langkah uji
6
hipotesis adalah uji normalitas data, uji homogenitas varian, uji One-way ANOVA
dan Post hoc test (Dahlan, 2004).
IV. PELAKSANAAN PROGRAM
4.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fisiologi dan Patologi
Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Laboratorium Ekologi
Fakultas MIPA Universitas Brawijaya, serta Laboratorium Teknik Kimia
Politeknik Malang, dengan lama penelitian selama 4 bulan.
4.2 Tahapan Pelaksanaan/Jadwal Faktual Pelaksanaan
Kegiatan Waktu
Bulan 1 Bulan 2 Bulan 3 Bulan 4
Mengurus ethical clearance
Mengurus perijinan laboratorium
Belanja alat dan bahan penelitian
Perawatan dan adaptasi tikus
Proses ekstraksi cacing tanah
Induksi Diabetes Melitus
Pembuatan ulkus diabetik
Perawatan ulkus diabetik
Histo PA jaringan kulit
Pengukuran variabel
Analisa data
Penyusunan laporan akhir
4.3 Instrumen Pelaksanaan
Ekstraksi Pheretima aspergillum
Alat: baker glas, timbangan analitik, kertas saring whatman no.40, oven,
blender. Bahan: cacing tanah (Pheretima aspergillum), etanol 70%.
Induksi Diabetes Melitus
Alat: spuit 1 cc, handscoon, blood lancet, glukometer, timbangan berat badan.
Bahan: Streptozotocin (STZ), pelarut buffer sitrat 0,1 M pH 4.5.
Pembuatan Ulkus Diabetik
Alat: meja operasi kecil, set bedah minor, alat cukur, duk steril, penggaris,
timbangan berat badan. Bahan: anastesi ketamine, alkohol 70%.
Perawatan Ulkus Diabetik
Alat: spuit 3 cc, set rawat luka steril (handscoon, kasa, kom, pinset anatomis
dan sirugis, lidi kapas, gunting anatomis), masker, bengkok, underpad, sonde.
Bahan: normal salin (NaCl 0,9%), hidrogel, ekstrak Pheretima aspergillum
Pembuatan Preparat Jaringan
Alat: meja operasi kecil, peralatan bedah minor, botol kecil tertutup,
mikrotom, obyek glas. Bahan: anastesi ether, jaringan kulit, formalin 10%,
alkohol 70%, 90%, 100%, xylene, parafin cair.
Pengukuran Kontraksi Luka
Alat: digital camera 16 Mpixel, penggaris, program AutoCAD 2009.
Penghitungan Densitas Akson
Alat: program Scan Dot Slide OlyVia, coverslip. Bahan: silver staining kit,
xylol, balsam
7
4.4 Rekapitulasi Rancangan dan Realisasi Biaya
No Uraian Kegiatan Total Anggaran
(Rp)
Total Realisasi
(Rp)
1 Proses ekstraksi 300.000 440.000
2 Penyediaan sample dan perawatan 2.250.000 2.227.200
3 Induksi Diabetes Melitus 2.250.000 2.630.227
4 Perawatan ulkus diabetes 1.500.000 1.360.350
5 Pembuatan preparat 1.500.000 1.341.000
6 Pengukuran densitas akson 3.200.000 3.003.933
7 Lain – lain 200.000 195.000
Total (Pemasukan dan Pengeluaran) 11.200.000 11.197.710
V. HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1 Hasil Penelitian
Hasil Pengukuran Persentase Kontraksi Luka
Tabel 1. Persentase Kontraksi Luka
Kelompok Mean + SD
1 Kontrol (-) 81,30 + 8,02
2 Kontrol (+) 90,80 + 4,09
3 Ekstrak Topikal
100 mg/ml
91,66 + 5,25
4 Ekstrak Oral 100
mg/kgBB
91,10 + 2,68
5 Ekstrak Topikal-
Oral 100 mg/ml
dan 100 mg/kgBB
93,52 + 4,71
Grafik 1. Menunjukkan rata-rata persentase kontraksi luka pada tikus dengan
ulkus diabetik. Uji ANOVA didapatkan nilai p=0,013 (p<0,05) yang
menunjukkan ada beda antar kelompok. Uji Post Hoc Bonferroni menunjukkan
perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol (-) dengan kelompok
perlakuan yang diberikan ekstrak topikal-oral (p=0,015).
Hasil Penghitungan Densitas Akson
Tabel 2. Jumlah Densitas Akson
Kelompok Mean + SD
1 Kontrol (-) 0 + 0
2 Kontrol (+) 0,2 + 0,45
3 Ekstrak Topikal
100 mg/ml
15,6 + 4,78
4 Ekstrak Oral 100
mg/kgBB
4,8 + 1,92
5 Ekstrak Topikal-
Oral 100 mg/ml
dan 100 mg/kgBB
6,8 + 3,63
Grafik 2. Jumlah Densitas Akson
Grafik 1. Persentase Kontraksi Luka
8
Pada pemulasan impregnasi perak (silver impregnation) dan pengamatan
dengan program Scan Dot Slide OlyVIA pada perbesaran 20x obyektif dapat
dihitung jumlah densitas (kepadatan) akson pada jaringan kulit (Gambar 2).
Grafik 2. Menunjukkan rata-rata jumlah densitas akson. Uji ANOVA didapatkan
nilai p=0,000 (p<0,05) yang menunjukkan ada beda antar kelompok. Uji Post Hoc
Games-Howell menunjukkan perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol
(kontrol negatif dan kontrol positif) dengan kelompok perlakuan yang diberikan
ekstrak topikal dan ekstrak oral.
5.2 Pembahasan
Efektifitas Pemberian Ekstrak Cacing tanah (Pheretima aspergillum) dalam
Mempercepat Penyembuhan Ulkus Diabetik
Pada penelitian ini, pemberian ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum)
dapat meningkatkan persentase kontraksi luka secara bermakna (p=0,013). Hasil
penelitian ini membuktikan bahwa terjadi proses penyembuhan pada ulkus
diabetik. Penyembuhan luka secara makroskopis ditandai dengan peningkatan
kontraksi luka (Li et al., 2011). Pada penelitian ini perbedaan secara bermakna
terjadi antara kelompok kontrol (-) dengan kelompok perlakuan topikal-oral. Hal
ini menunjukkan pemberian ekstrak secara oral memiliki efek sistemik yang
mendukung pemberian ekstrak secara topikal terhadap proses akselerasi
penyembuhan ulkus diabetik. Efektifitas Pemberian Ekstrak Cacing tanah (Pheretima aspergillum) dalam
Menginduksi Densitas Akson Saraf Perifer
Pada penelitian ini, pemberian ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum)
dapat meningkatkan densitas akson saraf perifer secara bermakna (p=0,000). Hasil
penelitian ini membuktikan bahwa terjadi proses proliferasi dan migrasi sel
schwann pada daerah ulkus diabetik. Proliferasi dan migrasi sel schwan
merupakan proses penting yang mendukung regenerasi akson saraf perifer.
Ekstrak Pheretima aspergillum menstimulasi migrasi sel schwan melalui jalur
mitogen-activated protein kinase (MAPK) (Chang et al., 2011a). Ekstrak
Pheretima aspergillum mampu menginduksi insulin-like growth factor-1 (IGF-1)
yang merupakan hormon polipeptide yang disintesa oleh proliferasi sel schwan
sebagai respon terhadap growth hormone untuk menstimulasi pertumbuhan saraf
perifer (Chang et al., 2011b).
Gambar 2. Densitas akson
saraf perifer pada jaringan
kulit dengan pemulasan
perak. Kontrol negatif (1),
Kontrol Positif (2),
Perlakuan topikal 100 mg/ml
(3), Perlakuan oral 100
mg/kgBB (4), Perlakuan
topikal-oral 100 mg/ml dan
100 mg/kgBB (5). Scale
bars=20µm
9
V. KESIMPULAN DAN SARAN
6.1 Kesimpulan
Kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian ini adalah:
Pemberian ekstrak tanah (Pheretima aspergillum) dapat meningkatkan
persentase kontraksi luka dan densitas akson saraf perifer pada tikus putih
jantan (Rattus novergicus) galur Wistar yang diinduksi Diabetes Melitus.
6.2 Saran
Saran dari penelitian ini adalah:
1. Diperlukan penelitian lebih lanjut terkait keadaan densitas akson saraf perifer
hingga fase remodelling untuk memperkuat hasil penelitian ini.
2. Perlu dilakukan eksplorasi dosis dan penelitian lebih lanjut terkait formulasi
ekstrak cacing (Pheretima aspergillum) secara topikal, oral, dan topikal-oral
untuk mengetahui terapeutic window terutama pada pemberian oral.
3. Penelitian pengembangan diperlukan terkait perawatan ekstrak cacing tanah
(Pheretima aspergillum) pada jenis ulkus diabetik dengan komplikasi infeksi
atau gangrene yaitu pada ulkus derajat 3 atau derajat 4.
VI. DAFTAR PUSTAKA
Bradbury, Sarah & Patricia Price. 2011. The Impact of Diabetic Foot Ulcer Pain
on Patient Quality of Life. Wound UK Vol 7 No.4
Brem, Harold & Marjana Tomic-Canic. 2007. Cellular and Molecular Basis of
Wound Healing in Diabetes. The American Society for Clinical Investigation
Vol. 177 (5):1219-1222
Chang, Yung-Ming et al. 2011a. RSC96 Schwann Cell Proliferation and Survival
Induced by Dilong through P13K/Akt Signaling Mediated by IGF-1. Evidence-
Based Complementary and Alternative Medicine, Article ID 216148. Hindawi
Publishing Corporation
Chang, Yung-Ming et al. 2011b. Schwann Cell Migration Induced by Earthworm
Extract via Activation of PAs and MMP2/9 Mediated through ERK1/2 and p38.
Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Article ID 395458.
Hindawi Publishing Corporation
Chen, Chao-Tsung et al. 2010. Earthworm Extracts Facilitate PC12 Cell
Differentiation and Promote Axonal Sprouting in Peripheral Nerve Injury. Am.
J. Chin. Med. 38, 547. DOI: 10.1142/S0192415X10008044
Chen, Zu-Lin,Wei-Ming Yu, & Sidney Strickland. 2007. Peripheral Regeneration.
The Annual Review of Neuroscience 30:209-33. Rockefeller University
Dahlan, S. M. 2004. Seri Statistik: Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan; Uji
Hipotesis dengan Menggunakan SPSS Program 12 Jam. Jakarta: Arkans
Diapath S.p.A. 2013. Diapath Special Stains Handbook.
http://www.diapath.com/diapath-special-stains.aspx diakses pada tanggal 10
Mei 2013.
Frykberb Robert G. 2002. Risk Factor, Pathogenesis and Management of
Diabetic Foot Ulcers. Lowa: Des Moines University
Gagnon, Vicky et al. 2011. Hair Follicles Guide Nerve Migration In Vitro and In
Vivo in Tissue-Engineered Skin. Journal of Investigative Dermatology 131,
1375–1378; doi:10.1038/jid.2011.34
10
Grant G, Hollander H, & Aldskogius H. 2004. Suppressive Silver Methods : A
Tool For Identifying Axotomy-Induced Neuron Degeneration. Brain Res Bull.
Jan 15;62(4):261-9
Hastuti. 2008. Faktor-Faktor Risiko Ulkus Diabetika Pada Penderita Diabetes
Melitus. Semarang :Universitas Diponegoro. http://eprints.undip.ac.id/18866/
diakses 7 Oktober 2012
Hidayat AAA. 2009. Metode Penelitian Keperawatan dan Teknik Analisis Data.
Jakarta: Salemba Medika
Junqueira, Luiz Carlos & Jose Carneiro. 2004. Histologi Dasar: Teks dan Atlas.
Jakarta: EGC
Juranek, Judyta K et al. 2013. RAGE Deficiency Improves Postinjury Sciatic
Nerve Regeneration in Type 1 Diabetic Mice. American Diabetes Association,
Vol 62 : 931-934
Kappelle et al. 1993. Amelioration by The Ca2+
Antagonist, Nimodipine of An
Existing Neuropathy in The Streptozotocin-Induced, Diabetic Rats. J
Pharmacol 108: 780-785
King, H., Aubert, R.E., & Herman, W.H. 2003. Diabetes Care. 21:1414
Li, Kun et al. 2011. Tannin Extract From Immature Fruits of Terminalia Chebula
Fructuz Retz. Promote Cutaneous Wound Healing In Rats. BMC
Complementary and Alternative Medicine. 11:86
Liu, Chung Hsiang et al. 2013. Effect of Oral Administration of Pheretima
Aspergillum (Earthworm) In Rats With Cerebral Infarction Induced By
Middle-Cerebral Artery Occlusion. African Journal of Traditional,
Complementary & Alternative Medi Vol. 10 Issue 1, p66
Muangman, P et al. 2009. Nerve growth factor accelerates wound healing in
diabetic mice. Wound Repair and Regeneration,12:44–52
Nugrogo, Agung E. 2006. Hewan Percobaan Diabetes Melitus : Patologi Dan
Mekanisme Aksi Diabetogenik. Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi,
Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada
Prihatman, Kemal. 2000. Budidaya Cacing Tanah. Proyek Pengembangan
Ekonomi Masyarakat Pedesaan, Bappenas. http://www.ristek.go.id diakses 27
Agustus 2012
Santoso, Marcus Adrian. 2002. Identifikasi Ekstrak Cacing Tanah Lumbricus
rubellus dan Pheretima aspergillum yang Memiliki Efek Antipiretik pada Tikus
Putih. FMIPA-IPB. Pdf
Sapico, F. L. 2007. Food Ulcer in Patients with Diabetes Mellitus. Journal of
American Podiatric Medical Association Vol 79, Issue 482-485
Sofyan, Sashadi. 2007. Karakteristik Dan Pertumbuhan Cacing Tanah Lokal
Pada Media Mengandung Limbah Tanaman Pisang Serta Jerami Padi.
Universitas Brawijaya Malang
Switzer R.C. 2000. Application of Silver Degeneration Stains For Neurotoxicity
Testing. Toxicol Pathol. Jan-Feb;28(1):70-83.
Waspadji S. 2006. Komplikasi Kronik Diabetes : Mekanisme Terjadinya,
Diagnosis dan Strategi pengelolaan. Ilmu Penyakit Dalam, Jilid III, Edisi
keempat, Jakarta: Penerbit FK UI
Zangiabadi, Nasser et al. 2011. Effects of Melatonin in Prevention of Neuropathy
in STZ-Induced Diabetic Rats. American Journal of Pharmacology and
Toxicology 6 (2): 59-67, ISSN 1557-4962