OPTIMIZACION DEL PROCESO DE FERMENTACION PARA PRODUCIR BACILLUS THURINGIENSISORGANISM0 Y MEDIO DE CULTIVO: Clulas de Bacillus thuringiensis. Para la preservacin de la cepa, esta se siembra por estra aproximadamente cada 2 meses en medio LB, a 29 'C por 48 horas. Se inocula con una asada, un matraz Erlenmeyer de 500 ml con 100 ml de medio a29 "C y 200 rpm por 12 horas, usndose el 10% de inoculo en los pasos siguientes. (Luthy P. y ~bersold H.R. 1981).A) FERMENTACIONES A NIVEL MATRAZ DE 500mL. Se llevaron a cabo fermentaciones bajo las siguientes condiciones de cultivo: temperatura a 29 "C, agitacin 200 RPM, y pH de 7.2-7.3 con un volumen de operacin de 100mL. Se hicieron cinticas de crecimiento, tomando muestras a diferentes intervalos de tiempo y se midieron los siguientes parmetros: Densidad ptica (590 nm), pH, muestras al microscopio teidas con cristal violeta para la observacin de clulas vegetativas, esporas y cristal. (Luthy P. y ~bersold H.R. 1981).B) FERMENTACIONES A NIVEL DE FER- MENTADOR DE 2 L. Las fermentaciones se llevaron a cab0 en un fermentador de 2 L. Las condiciones de cultivo fueron las siguientes: temperatura de 29 C, agitacin 800 RPM, con 2 impulsores Rushton, aireacin de 1 VVM, control de pH entre 7.0 y 7.5 durante todo el crecimiento con KOH y H3PO4. Se hicieron cinticas del crecimiento, tomando muestras a diferentes tiempos y midiendo los siguientes parmetros: Densidad 6ptica (590 nm), pH, oxgeno disuelto, mL residuales de KOH y H3PO4 1 N, y observacin al microscopio de muestras teidas con cristal violeta para ver la formacin del cristal, conteo de esporas y clulas vegetativas con la cmara de Neubauer. (Luthy P. y ~bersold H.R. 1981).C) FERMENTACIONES A NIVEL FERMENTADOR DE 14 L. Para este nivel se desarrollaron los experimentos en un fermentador marca NBS, modelo MF14 con 3 impulsores de 6 paletas Tipo Rushton. Las condiciones de cultivo fueron las siguientes: Temperatura 29 " C, agitacin 400 y 600 RPM, aireacin 0.8 y 1.2 VVM y pH controlado a 7.0 y sin control. Se llevaron a cabo cinticas de crecimiento tomando muestras cada dos horas y se midieron los siguientes parmetros: Densidad ptica, pH, oxgeno disuelto y conteo de clulas vegetativas, esporas y bacilos con la cmara de Neubauer. Para ambas fermentaciones se cuantifica el azcar residual por el mtodo del cido 1,2,3 dinitrosalicilico (DNS), (Summer et. a1 1935.) Para realizar la optimizacin del medio de cultivo y condiciones de operacin, se plante una serie de 3 experimentos por medio de un diseo experimental por el mtodo de B. Wilson, donde se variaron 3 componentes del mismo. Se tom como base el medio de cultivo reportado en la tabla 1, el cual se obtuvo en base a una revisin bibliogrfica (6, 14, 15, 16) y a las concentraciones de sales que se requieren para la propagacin de la cepa a nivel laboratorio. Como primer diseo experimental se decidi probar niveles bajos y altos de los siguientes nutrientes: Pur de tomate 10 y 20 g/L, glucosa 25 y 30 g/L y harina de soya 10 y 20 g/L. La respuesta (Velocidad de Crecimiento) se tom como D.O. a 590 nm considerando solamente la fase exponencial (12 horas). 3 Se hizo un segundo diseo experimental 2 en donde se probaron 3 parmetros: agitacin (400 y 600 RPM), aireacin (0.8 y 1.2 VVM) y pH (con control y sin control).MEDIO DE CULTIVO BASEMEDIO DE CULTIVO BASE.g/l

KH2P046.8

MgS04.7H2O0.12

ZnS04. 7H2O0.014

MnS04.H2O0.0016

FeS04.7H2 O0.028

CaC12 .4H2 O0.11

Bacto-triptona7.0

Glucosa3.0

Ajustar el pH, con KOH 3 N, a 7.2. Los medios se esterilizan a 121C durante 15 minutos.(Arcas J; Yantorno 0. y Ertola R. 1987).RESULTADOS Y DISCUSION DEL MEDIO DE CULTIVO BASEPara el medio de cultivo base reportado en mate- riales y mtodos, el tiempo de crecimiento y producci6n del cristal era hasta de 56 horas y el rendimiento bajo durante 1as 48 horas de crecimiento (5x10~ espJm1); biomasa de 1.4 g/L. (peso seco). Adems la glucosa no se consume totalmente durante las 56 horas de crecimiento, por lo que se piensa que hay una asincrnia en el proceso de esporulacin, alargndose. La optimizacin del medio de cultivo y condiciones de operaci6n, se plante6 como se describe en la seccin de materiales y mtodos. Se probaron niveles altos y bajos de los siguientes nutrientes: Pur de tomate, glucosa y harina de soya. Se decidi utilizar el pur de tomate como sustituto del licor de maz, harina de pescado, o extracto de levadura (son los que reporta la bibliografa como fuente de nitrgeno), debido a que estos ltimos son difciles de conseguir y son costosos. El pur de tomate se consigue fcil y es de bajo costo. En cuanto al uso de la harina de soya, se encontr en reportes de la Universidad de Nuevo Len, que utilizando cepas similares, han encontrado producciones elevadas de bioinsecticidas. (Arcas J; Yantorno 0. y Ertola R. 1987).El medio ptimo de produccin para Bacillus thuringiensis, fue el siguiente:

MEDIO BE CULTNO PTIMOComponenteg/l

Glucosa 5.0

Harina de soya6.0

Pur de tomate40

KH2P042.5

CaC031.0

MgS04-7H2O0.00011

MnS04-H2O0.04

FeS04-7H2O0.028

CaC12-4H2O0.030

Ajustar el pH, con NaOH 1 N. a 7.0. Los medios se esterilizan a 121C durante 15 minutos (15lb de presin).Se obtuvieron los siguientes resultados, Tabla 1, donde se vara la agitacin, aireacin y el control del pH. El anlisis de los resultados nos permite llegar a las siguientes conclusiones, Tabla 2. a) Cuando se analizan los efectos promedio, se observa que hay ms significancia sobre la agitacin, lo cual nos indica que hay que subir ms los RPM. Cuando se analiza la aireacin se ve que hay ms significancia sobre este que en el pH que es el que menor significancia tiene, segn el efecto promedio. b) La interaccin de 2 factores nos dice que hay mayor significancia entre la agitacin y la aireacin. La agitacin y el control de pH tienen poco efecto sobre el estudio, as mismo que la aireacin y el control de pH. c) Finalmente; cuando se estudia la interaccin de 3 factores, se alcanza a notar que la combinacin de los 3 parmetros no tienen mucha significancia entre si sobre el estudio realizado.(Arcas J; Yantorno 0. y Ertola R. 1987).

*Respuesta: esporas/mL a las 24 horas de fermentacin. En esta tabla se puede ver que se tienen mejores resultados cuando se trabaja a 600 rpm.

E1 = Velocidad de agitacin. E2= Velocidad de aireacin. E3 = pH control sin control. Efectos promedio: Efecto que se tiene sobre la variable de lo que se est midiendo. Interaccin de 2 factores: Es la combinacin que existe entre dos variables. Interaccin de 3 factores: Es la combinacin entre las variables.

(Arcas J; Yantorno 0. y Ertola R. 1987).

Bibliografa: -Luthy P. y ~bersold H.R. (1981). The entomocidal toxins of Bacillus thuringiensis. Pharmacol. Ther. 13, 257. Arcas J; Yantorno 0. y Ertola R. (1987). Effect of high concen- tration of nutrients on Bacillus thuringiensis. Cultures. Biotech- nol. Lett. 9, 105-110.