Rev Med Inst Mex Seguro Soc 2006; 44 (Supl 2): 43-46 S43

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Importancia de las pruebascruzadas y de la búsquedade anticuerpos

Ruth Bonilla-Zavala

Química FarmacobiólogaBanco Central de Sangre,Centro Médico Nacional

Siglo XXI, InstitutoMexicano del Seguro

Social.

Comunicación con:Ruth Bonilla-Zavala

Tel.: 5571 0430Dirección electrónica:

ruthbz33@hotmail.com

Palabras clave:! prueba de

compatibilidad

Key words:! compatibility

test

Primera versión: 31 de marzo de 2006Versión definitiva: 19 de julio de 2006Aceptado: 27 de julio de 2006

RESUMENLas pruebas cruzadas y la búsqueda de anti-cuerpos son de suma importancia, ya quepermiten que los antígenos y anticuerpospuedan ser detectados y estudiados en ellaboratorio; nos ayudan a prevenir la transfu-sión de sangre incompatible, y proveen alpaciente de máxima seguridad y beneficio.Antes de realizar cada procedimiento es muyimportante contar con un excelente control decalidad, el cual nos permitirá verificar todoslos procesos y etapas que influirán en la de-tección de los anticuerpos. Las pruebas cru-zadas normalmente se llevan a cabo en cuatrofases: lectura rápida, lectura de 37º, lectura37º/Coombs, validación con eritrocitos sen-sibilizados. El medio que rodea la prueba estámuy relacionado con los potenciadores y conla fuerza iónica que favorece la reacción antí-geno-anticuerpo, por lo que debe ser capazde detectar anticuerpos activos a bajas tem-peraturas y diferenciar entre reacciones po-sitivas verdaderas y falsas.La investigación de anticuerpos irregulareslibres en suero se debe realizar por lo me-nos con dos técnicas. Una segunda técnicapuede ser un medio hiperproteico como al-búmina, o enzimas como bromelina o LISS,siendo esta última la más eficaz.

SUMMARYCrossed tests and the search of antibodiesare of extreme importance, since they allowthe detection and laboratory testing of anti-gens and antibodies. They help us to preventthe transfusion with incompatible blood, andto provide the patient with maximum securityand benefit. Before making each procedure,it is very important to count with an excellentcontrol of quality, which allows us to haveunder control all the processes and stagesthat will influence the detection of antibod-ies. Crossed tests are normally carried outin four phases: fast reading, reading of 37º,reading 37º/Coombs, validation with E. Sen-sitized. The means that surround the test areclosely related to the potentiators and the Ion-ic Force that favors the reaction antigen-anti-body, and must be able to detect activeantibodies to low temperatures and to telltrue from false positive feedbacks. The in-vestigation of free irregular serum antibod-ies must be made at least with twotechniques. One second technique can behyperprotein means like albumin, or en-zymes like bromelina or LISS, being this onethe most effective one.

Ottenberg (1908) fue el primero en aplicar eldescubrimiento de Landsteiner de los grupossanguíneos a la práctica transfusional, al com-probar como prueba previa a la transfusión, siel suero del receptor causaba lisis y aglutinaciónde los hematíes del donante.1 El avance científi-co y tecnológico de la inmunohematología haconducido al desarrollo de técnicas molecularesque permiten identificar la presencia o ausencia

de una secuencia genética que codifica para unaproteína específica, así como técnicas de cito-metría de flujo y western blot para evaluar laexpresión de un antígeno en la membrana eri-trocitaria; sin embargo, dentro de los nuevos con-ceptos debemos eliminar pruebas que no sonesenciales, disminuir costos, utilizar protocolossimples y seleccionar adecuadamente los méto-dos, la temperatura, período de incubación y

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sustraídode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.ccihpargidem ed odabordiferentes sustancias que aceleran y modificanla reacción antígeno-anticuerpo: albúmina hu-mana, bovina, bovina polimerizada a 19, 22 y30 por ciento. Enzimas como bromelina, fisina,papaína y tripsina, LISS ( solución de baja fuer-za iónica), columnas de gel, polietilenglicol (PEG),polibreno.2

La prueba de compatibilidad es un ensayoin vitro de lo que puede suceder en el pacienteal recibir la transfusión de un componente san-guíneo, por lo que es de suma importancia, yaque permite que los antígenos y anticuerpospuedan ser detectados y estudiados en el labo-ratorio; también ayuda a prevenir la transfu-sión de sangre incompatible, y provee alpaciente el máximo de seguridad y beneficio.La metodología varía según los recursos delservicio y la urgencia del caso, aunque de acuer-do a la Norma Oficial Mexicana ( NOM-003-SSA-1993 ) siempre debe incluirse la técnicade antiglobulina humana como mínimo. Lastécnicas en medio proteico y con enzimas pro-teolíticas pueden ser útiles para la distinción dela especificidad de un anticuerpo.3

Internacionalmente se hanestablecido los siguientesprocedimientos:

• Solicitud de producto y datos relevantes delreceptor.

• Identificación y colección de las muestrassanguíneas del receptor.

• Estudios y pruebas del donador.• Determinación del grupo ABO y Rho (D)

del receptor.• Detección de anticuerpos irregulares.• Selección de componentes ABO y Rho (D)

apropiados para el receptor.• Comparación entre resultados actuales y el

historial de las pruebas transfusionales rea-lizadas con anterioridad.2,4

Antes de efectuar cada procedimiento esmuy importante contar con un excelente con-trol de calidad, el cual nos permite verificartodos los procesos y etapas que influirán enla detección de los anticuerpos, con lo quese podrán obtener resultados confiables y se-guros.

Lavado de material

Se debe realizar con detergente neutro apro-piado para laboratorio, éste debe ser exclusi-vo, de tal forma que no debe mezclarse conel material de otras secciones del laborato-rio, ya que los residuos de álcalis y ácidospotentes neutralizan la reacción antígeno-an-ticuerpo, actúan sobre la superficie del eri-trocito eliminando el ácido siálico o inclusodestruyendo los glóbulos rojos, llegándose aconfundir con una reacción hemolítica don-de no la hay.

Material de vidrio

Se deben separar los tubos nuevos de los raya-dos y deteriorados. De tal forma que los nue-vos sirvan para cualquier prueba que utilicesuero de Coombs y los rayados para pruebasde grupo ABO y Rho(D).

Control de células y reactivos

Lavado de eritrocitos

Siempre que se utilicen eritrocitos para cual-quier estudio en un banco de sangre debenser lavados tres veces para enfrentarlos a losanticuerpos, la relación de células/soluciónsalina isotónica óptima será de 1/60 volú-menes repartidos en 3 lavados consecutivos.Algo de vital importancia en el resultado fi-nal es que en cada lavado los eritrocitos de-ben ser removidos totalmente de la pareddel tubo por agitaciones suaves para evitarsu deterioro y posteriormente agregarles lasalina, formando un remolino suficiente paraque todas las células queden resuspendidashomogéneamente en toda la barra de salinaagregada, de no ser posible esto por falta depráctica es recomendable tapar la boca deltubo con parafilm y agitar por inversión.

Lo anterior también es válido para todoslos lavados que se realizan para llevar a prue-ba final de Coombs (salina-Coombs, albúmi-na-Coombs, etc).

La concentración final de eritrocitos a laque debe trabajarse es de 2.5 a 4.0 por ciento.

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sustraídode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.c

Después de lavar todas las células se debe-corroborar que cada una de ellas tenga la mis-ma concentración, ya que una variación entrecada tubo dará resultados diferentes al enfren-tarlas a los anticuerpos en estudio.

Las temperaturas de incubación y los tiem-pos deben ser los adecuados para cada técnica.

Pruebas cruzadas

Las pruebas cruzadas normalmente se llevan acabo en cuatro fases:

Lectura rápida, lectura de 37º, lectura 37º/Coombs, validación con eritrocitos sensibiliza-dos. El medio que rodea la prueba está muyrelacionado con los potenciadores y con la fuer-za iónica que favorece la reacción antígeno-an-ticuerpo, por lo que debe ser capaz de detectaranticuerpos activos a bajas temperaturas y dife-renciar entre reacciones positivas verdaderas yfalsas.

Consta de tres partes: 1. Prueba mayor (D),2. Prueba menor (R), 3. Prueba autotestigo (AT):

1. Prueba mayor (D) o del DONADOR:

a) Sirve para confirmar si existe compatibili-dad ABO entre el receptor y el donador.

b) Detecta anticuerpos en el suero del pacien-te que no se hayan demostrado en la prue-ba de tamizaje (porque el antígenocorrespondiente no estaba presente en lascélulas detectoras o eritrocitos de fenotipoconocido, PANEL).Se utilizan 2 gotas de suero del receptor más1 gota de eritrocitos lavados del donador.

2. Prueba menor (R) o del RECEPTOR:

a) Detecta anticuerpos irregulares en el suerodel donador y ratifica algún error de clasi-ficación ABO/Rh.Se realiza con 2 gotas de suero o plasmadel donador más 1 gota de eritrocitos delreceptor.

3. Prueba autotestigo (AT):

a) Permite detectar una prueba de antiglobu-lina directa positiva, así como la presencia

de rouleaux y otras anormalidades autoin-munes (AHAI).Se realiza con 1 gota de eritrocitos del re-ceptor más 2 gotas de suero del receptor.

Detección de anticuerpos libres en sue-ro: se realiza enfrentando el suero del pacienteo receptor con eritrocitos de fenotipo conoci-do (PANEL).

La investigación de anticuerpos irregulareslibres en suero se debe realizar por lo menoscon dos técnicas: la primera siempre será lasalina llevada hasta la fase de Coombs, ya queen la mayoría de los casos permite diferenciarla IgM en su fase rápida a 22 y 37 °C de laIgG en la fase de Coombs; y la segunda pue-de ser un medio hiperproteico como albúmi-na, o enzimas como bromelina o LISS, siendoesta última la más eficaz.

Interpretación de detección deanticuerpos y pruebas cruzadas

A) Anticuerpos negativos y prueba cruza-da compatible. Una detección de anticuer-pos negativa no garantiza que el suero seencuentre libre de anticuerpos eritrocitariosclínicamente significativos, sólo indica queno contiene anticuerpos reactivos. Tampo-co una prueba cruzada compatible indicauna supervivencia eritrocitaria normal, porello debe realizarse conjuntamente con untamiz para anticuerpos, o bien diferentestécnicas tanto para anticuerpos como prue-bas cruzadas.5,6

B) La detección de anticuerpos, las prue-bas cruzadas o ambas pueden ser posi-tivas. Lo anterior puede deberse a la presenciade aloanticuerpos, autoanticuerpos, interac-ciones adversas con reactivos y formaciónde rouleaux. Si hay múltiples anticuerpos oun anticuerpo que reacciona con un antíge-no de alta incidencia o si el anticuerpo estápresente en concentraciones muy bajas de-ben usarse técnicas específicas como elusión,absorción o la combinación de las mismas.

C) Prueba cruzada incompatible, anticuer-pos irregulares negativos. Se puede pre-sentar cuando la concentración del

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anticuerpo es muy baja y sólo se detectacon células frescas, también ocurre cuandolas células del panel de eritrocitos de feno-tipo conocido no tienen el antígeno de lapoblación en estudio.

Conclusión

Las pruebas cruzadas y la búsqueda de anti-cuerpos son de suma importancia, ya que per-miten que los antígenos y anticuerpos puedanser detectados y estudiados en el laboratorio;ayudan a prevenir la transfusión de sangre in-compatible y proveen al paciente el máximode seguridad y beneficio. Aunque a primeravista pareciera que se trata de un tema muyconocido para quien realiza las pruebas, esimportante que se tomen en cuenta los pasos yprocedimientos por realizar, con énfasis en elcontrol de calidad. En las pruebas cruzadasincompatibles es crucial el cuidado en todo elestudio del paciente, el protocolo a seguir y lacorrecta interpretación de los resultados; nodebe perderse de vista que en las técnicas bási-cas existen muchas limitaciones, por ello se

combinan varias metodologías para tener unamplio panorama de detección de acuerdo alrango térmico de acción de cada anticuerpo,así como el medio en el cual se pueden poten-ciar o destruir, principalmente cuando existemezcla de los mismos.

Referencias

1. Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M. Bloodtransfusion in clinical medicine. Tenth edition.Oxford, USA United Kingdom: Blackwell Science;1997. p. 632-646.

2. Brecher ME. Technical manual. Fourteenth edition.Bethesda, Maryland: AABB; 2003. p. 379-395.

3. Rodríguez-Moyado H, Quintanar-García E, Mejía-Arregui M. El banco de sangre y la medicinatransfusional. México: Panamericana; 2004. p.239-258.

4. Linares G. Jesús. Inmunohematología y transfusión.Principios y procedimientos. Caracas, Venezuela:Cromotip. 1986. p. 151-177.

5. Cheng MS. Delayed reaction following ABO –incompatible transfusion (letter). Transfusion 1995;35:791.

6. Padget BJ, Hannon JL. Variations in pretransfusionpractices. Immunohematology 2003; 191(1):1-6.